CN101210260A - 新霉素的清洁发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种新霉素的清洁发酵工艺,所述新霉素的清洁发酵工艺为:以弗氏链霉菌为生产菌株,在传统的微生物发酵生产新霉素的工艺基础上,对补糖液组成、补料速率控制以及发酵过程对其它参数的修正改进。本发明的工艺科学合理,不仅能够提高发酵产物的浓度,同时还能降低放罐残糖浓度,实现可使单位新霉素产量的淀粉单耗显著下降,同时排放COD污染量减少近50%,达到了清洁生产的目的。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,更具体涉及一种新霉素的清洁发酵工艺。
背景技术
近年来,新霉素被作为一种饲料添加剂广泛应用。由于国内外饲料添加剂的使用量大,应用范围广,所以展示了很好的前景。近几年国内外市场对新霉素的需求有大幅度增长的趋势。开发新霉素,提高生产水平,具有广阔的市场前景和显著的经济效益。目前,国内企业生产新霉素的发酵水平(120小时周期)约8000单位/mL,提取率约70%;国外新霉素的发酵水平(120小时周期)可达11000单位/mL,提取率达85%左右。这表明,国内新霉素的生产与国际水平还具一定的距离。同时由于国内外新霉素发酵主要追求发酵水平的提高,而不考虑发酵过程糖类物质的单耗和放罐时残糖浓度的控制,从而造成了新霉素发酵过程带来的污染物排放的居高不下,其中放罐残糖浓度有时可达到3%-3.5%以上。这类生产工艺的是一个粗放的、基质浓度大幅度变化的工艺,导致发酵过程营养物质不能实施按需供给,扰乱了微生物的正常代谢,造成了生产效率的低下(产物新霉素浓度低)和原材料的浪费(初始配方和补料液组成不合理,补料过多,放罐残糖浓度过高)。这不仅增加了生产成本,降低了产率,而且造成了排放物对环境的污染。
传统工艺中,整个新霉素发酵过程pH波动较大,总糖浓度偏高,放罐残糖浓度为2.5~3.0%,有时达到3.0%以上。高浓度的总糖和间歇补料的冲击造成了菌体生长的不正常,同时由于氨氮浓度的粗放控制,影响了产物的生成,产抗期的产物浓度增长速率较低,最终产物浓度低。
同时由于对总糖、还原糖浓度和氨氮浓度的粗放控制以及间歇补料导致菌体生长受到冲击,其外在表现为菌体的比生长速率无序变化,造成了新霉素产生菌的生长和代谢的紊乱,使新霉素的比生成速率在代谢的最关键时期(30~105h)仅为1.0g·g-1·h-1左右。
传统工艺十分强调大量补糖的必要性。盲目的大量补加淀粉水解糖液,导致在产物合成期,仍存在多次菌体大量增殖的过程,降低了产物合成速率。同时,由于微生物不能利用多糖,生物反应器中累积了大量微生物不可利用的多糖,该部分多糖随废水排放,造成环境的污染和资源的浪费。
发明内容
本发明的目的是提供一种新霉素的清洁发酵工艺,该工艺科学合理,不仅能够提高发酵产物的浓度,同时还能降低放罐残糖浓度,实现可使单位新霉素产量的淀粉单耗显著下降,同时排放COD污染量减少近50%,达到了清洁生产的目的。
本发明的新霉素的清洁发酵工艺,其特征在于:所述新霉素的清洁发酵工艺为:以弗氏链霉菌为生产菌株,在传统的微生物发酵生产新霉素的工艺基础上,对补糖液组成、补料速率控制以及发酵过程对其它参数的修正改进。
本发明的显著特点如下:
(1)对于大多数工业微生物发酵过程,淀粉等多糖类底物是菌体生长和产物合成的最主要碳源。发酵培养基中的淀粉经过加热糊化和α-淀粉水解酶的水解处理,转变为以低聚糖为主的糖类底物混合物。在新霉素的发酵过程中,由于微生物分泌的胞外淀粉酶的水解作用,淀粉经过加热糊化和α-淀粉水解酶的水解处理形成的低聚糖有可能进一步降解为单糖和二糖为微生物所利用。
(2)本发明的新霉素发酵新工艺,可用高DE值淀粉糖化液或采用葡萄糖作为补料介质,在发酵过程中根据菌体对可发酵性糖的需求进行连续补料。应用该方案后,一方面使发酵过程糖的利用率得以提高,另一方面还使残糖浓度大大降低。
(3)从新霉素发酵过程碳源、氮源的累积消耗来看,除发酵初期较短的一段时间外,整个发酵过程碳源的消耗基本上呈线性增长,即使在发酵后期,碳源的消耗仍然维持在比较高的水平。这与新工艺中使用葡萄糖作为补料介质从而能够维持比较匀速的碳源消耗也是有关的。而氮源的消耗在发酵前80小时维持在相对比较恒定的速率,在此之后快速下降,但在这一阶段的消耗速率的下降先于产物合成速率的下降。
(4)根据以上对新霉素发酵过程特性、淀粉酶活力变化规律分析以及发酵动力学的研究结果,建立了新霉素发酵新工艺,并对发酵过程进行了优化控制。新工艺实施后新霉素发酵过程取得了明显效果。
(5)本发明建立了补糖、补氮、补水、pH程序机制的控制系统,实现了新霉素发酵过程的连续补料操作,使生物反应器中的可发酵性糖浓度控制在预定的最佳的浓度范围,保证了微生物新霉素合成速率保持在较优的水平。发酵120h,放罐效价从原有的8000u·ml-1提高到11000u·ml-1以上。
(6)本发明抓住发酵稳定期发酵液中淀粉酶活力极低,而补糖液DE值过低,微生物无法利用的矛盾,改用高DE值糖液进行补料,提高了微生物对糖利用效率,大幅度降低了发酵液残糖浓度,使之从原有的2.5~3.0%下降为1.3~1.5%。发酵液残糖下降幅度达到了预定指标。该指标的实现可使单位新霉素产量的淀粉单耗显著下降,同时排放COD污染量减少近50%,达到了清洁生产的目的。
附图说明
图1是以还原糖表征的酶活力的变化示意图。其中,纵坐标表示的是酶活力(Enzymatic Activity),单位是g.L-1.h-1,横坐标表示时间(Time),单位是小时(h)。
具体实施方式
对补糖液组成的改进为将原来的补充低DE值淀粉水解液改进为用高DE值淀粉糖化液或采用葡萄糖作为补料介质。
补料速率控制为:对发酵过程的温度、pH、溶氧浓度、总糖、还原糖浓度、氨氮浓度参数进行全程监控,16h起之后每隔8h取样测定以上各参数,考虑蒸发导致的发酵液损失,在30h以后以流加形式持续补水,补加速率以抵消蒸发体积为准,整个发酵周期为120h左右。
所述发酵过程对其它参数的修正改进为:
(1)温度:发酵温度0~105h为36±0.5℃,105~115h为36~38℃,115h至放罐为38℃的温度程序控制;
(2)pH:发酵过程0~80h将pH控制在6.8~6.9之间。80~105h将pH控制在7.0以内,105~120h将pH控制在6.8~7.0;
(3)溶氧浓度:在对数期逐渐加大通气量和提高搅拌转速直至设备满负载运行;
(4)总糖、还原糖浓度:因此发酵过程对总糖不进行控制,仅控制最终的放罐残糖量;还原糖的控制策略为:80h以前为1.5~2.2%之间;80~105h为0.8~1.5%;105h以后不补加糖,从而降低120h时的放罐残糖量;
(5)氨氮浓度:将氨氮的控制范围定为130~140mg·100ml-1。
新霉素的清洁发酵工艺的发酵罐为5~10吨罐。
发酵液中微生物可利用糖(单糖和二糖)的浓度主要取决于发酵培养基得淀粉水解酶预处理程度,以及发酵过程中微生物分泌的胞外淀粉酶表观活性以及菌体对可发酵性糖的消耗速率。用还原糖滴定法测酶活力的结果如图1所示。可以看出,在0~5h,酶活力较低,为0.05g·L-1·h-1以下,此时菌体生长处于迟滞期;在对数生长期,5~30h,酶活力迅速从0.05g·L-1·h-1增加到0.32g·L-1·h-1。30h后菌体生长稳定,维持在最大菌体浓度,酶活力也趋于稳定,维持在0.11g·L-1·h-1左右。到90h后,菌体开始出现部分自溶,菌体浓度下降,酶活力降低,到106h时,酶活力只有0.06g·L-1·h-1,以后持续下降。纵观整个发酵过程的酶活力变化,在菌体生长过程中,酶活力随菌体浓度的增大而增大,在产物合成阶段,酶活力稳定在0.11g·L-1·h-1左右,转化总糖为还原糖的能力较为稳定。
根据发酵过程酶活力的测定结果,可以明显看出:(1)相对于新霉素合成过程中糖的消耗速率(1.0~1.5g·L-1·h-1),整个新霉素发酵过程的胞外淀粉酶的活力是很低的,最高仅达到0.32g·L-1·h-1,不足于完成对以淀粉为补料介质的水解工作;(2)新霉素产生菌的胞外水解酶活力极低,难以将补料液中非可发酵性糖的其它淀粉质充分降解为微生物可利用的单糖和二糖,这导致新霉素传统发酵工艺中非还原糖的大量积累,使放罐残糖过高。所以在新霉素发酵新工艺中,可用高DE值淀粉糖化液或采用葡萄糖作为补料介质,在发酵过程中根据菌体对可发酵性糖的需求进行连续补料。应用该方案后,一方面使发酵过程糖的利用率得以提高,另一方面还使残糖浓度大大降低。
针对新霉素传统生产工艺低产、高成本、高污染物排放的缺陷,确定了新霉素新型生产工艺,并进行了小试实验。新工艺包括对培养基配方的调整、补糖策略和补硫酸铵策略的优化,以及发酵过程其它参数的修正。
测定了发酵全过程的发酵液中胞外淀粉酶活力,定性并定量地分析了新霉素发酵过程中可发酵性糖生成的速率。找出原有工艺中大量补加低DE值淀粉水解液的失误的根源,为新霉素发酵新工艺的建立提供了优化的依据。
本发明参照下面的实施例进行详细说明,但不限于此。
实施例
在60000L发酵罐中新霉素发酵过程的新工艺的应用
对发酵过程的温度、pH、溶氧等参数进行全程监控。16h起之后每隔8h取样测定以上各参数。考虑蒸发导致的发酵液损失,在30h以后以流加形式持续补水,补加速率以抵消蒸发体积为准。整个发酵周期为120h左右。新工艺对补糖液组成、补料速率控制、pH程序控制等工艺条件进行了改进。建立了以补糖控制、补硫酸铵控制和pH控制系统。确定了较为完善的控制模式。
以60000L发酵罐的新霉素发酵为根据,对新霉素发酵过程各参数进行控制,以及对新霉素发酵工艺进行最终确定如下:
1、温度
发酵温度0~105h为36±0.5℃,105~115h为36~38℃,115h至放罐为38℃的温度程序控制。
2、pH
根据新霉素小试发酵的实验结果,当pH较低菌体的呼吸强度受抑制,对数期最为明显,当pH低于6.5时溶氧浓度迅速上升;pH高于7.5时新霉素生成速率下降。因此发酵过程0~80h将pH控制在6.8~6.9之间。80~105h将pH控制在7.0以内,105~120h将pH控制在6.8~7.0。
3、溶氧浓度
对新霉素发酵,该菌株是强需氧型的放线菌,细胞的生长、维持和抗生素生物合成等代谢活动均需要氧的参与。在对数生长期和产物合成期,即使在现有设备满负载运行条件下(通气速率达1.0VVM,搅拌转速150r·min-1),溶氧浓度仍处于一个较低的水平。因此,对60000L发酵罐,采用的策略为在对数期逐渐加大通气量和提高搅拌转速直至设备满负载运行。
4、总糖、还原糖浓度
根据新霉素发酵结果,还原糖浓度在0.8~3.0%范围内不会明显影响新霉素的生成,而当还原糖浓度低于0.4%时新霉素的生成停止。总糖在延滞期消耗缓慢,在对数期和产物合成期总糖以较为恒定的速率消耗,因此发酵过程对总糖不进行控制,仅控制最终的放罐残糖量;还原糖的控制策略为:80h以前为1.5~2.2%之间;80~105h为0.8~1.5%;105h以后不补加糖,从而降低120h时的放罐残糖量。
5、氨氮浓度
根据新霉素发酵结果,氨氮浓度在100~160mg·100ml-1范围内对新霉素的合成无明显的影响,氨氮浓度低于10mg时会出现停止合成新霉素。考虑到氨氮的消耗速率较快,将氨氮的控制范围定为130~140mg·100ml-1。
实施新工艺后,菌体的生长期和产物的合成期可以严格分开,在30h前菌体高速生长后菌体浓度维持在比较稳定的水平,同时从30h开始,产物的合成一直维持在一个比较高的速率(2.25g·g-1·h-1),大大高于原有工艺的1.0g·g-1·h-1。
从新霉素发酵过程碳源、氮源的累积消耗来看,除发酵初期较短的一段时间外,整个发酵过程碳源的消耗基本上呈线性增长,即使在发酵后期,碳源的消耗仍然维持在比较高的水平。这与新工艺中使用葡萄糖作为补料介质从而能够维持比较匀速的碳源消耗也是有关的。而氮源的消耗在发酵前80小时维持在相对比较恒定的速率,在此之后快速下降,但在这一阶段的消耗速率的下降先于产物合成速率的下降。
根据以上对新霉素发酵过程特性、淀粉酶活力变化规律分析以及发酵动力学的研究结果,建立了新霉素发酵新工艺,并对发酵过程进行了优化控制。新工艺实施后新霉素发酵过程取得了明显效果。
Claims (5)
1.一种新霉素的清洁发酵工艺,其特征在于:所述新霉素的清洁发酵工艺为:以弗氏链霉菌为生产菌株,在传统的微生物发酵生产新霉素的工艺基础上,对补糖液组成、补料速率控制以及发酵过程对其它参数的修正改进。
2.根据权利要求1所述的新霉素的清洁发酵工艺,其特征在于:所述对补糖液组成的改进为将原来的补充低DE值淀粉水解液改进为用高DE值淀粉糖化液或采用葡萄糖作为补料介质。
3.根据权利要求1所述的新霉素的清洁发酵工艺,其特征在于:所述补料速率控制为:对发酵过程的温度、pH、溶氧浓度、总糖、还原糖浓度、氨氮浓度参数进行全程监控,16h起之后每隔8h取样测定以上各参数,考虑蒸发导致的发酵液损失,在30h以后以流加形式持续补水,补加速率以抵消蒸发体积为准,整个发酵周期为120h左右。
4.根据权利要求1所述的新霉素的清洁发酵工艺,其特征在于:所述发酵过程对其它参数的修正改进为:
(1)温度:发酵温度0~105h为36±0.5℃,105~115h为36~38℃,115h至放罐为38℃的温度程序控制;
(2)pH:发酵过程0~80h将pH控制在6.8~6.9之间;80~105h将pH控制在7.0以内,105~120h将pH控制在6.8~7.0;
(3)溶氧浓度:在对数期逐渐加大通气量和提高搅拌转速直至设备满负载运行;
(4)总糖、还原糖浓度:因此发酵过程对总糖不进行控制,仅控制最终的放罐残糖量;还原糖的控制策略为:80h以前为1.5~2.2%之间;80~105h为0.8~1.5%;105h以后不补加糖,从而降低120h时的放罐残糖量;
(5)氨氮浓度:将氨氮的控制范围定为130~140mg·100ml-1。
5.根据权利要求4所述的新霉素的清洁发酵工艺,其特征在于:所述新霉素的清洁发酵工艺的发酵罐为5~10吨罐。
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