CN102747113A - 一种高浓度发酵生产2-酮基-d-葡萄糖酸的工艺 - Google Patents
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Abstract
一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，发酵容器中培养具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐类的微生物，以葡萄糖作为发酵培养基中的碳源进行发酵培养，灭菌前的pH5.5-7.0；发酵培养基由以下质量体积百分比的物质组成：葡萄糖10%-32%，玉米浆0.1%-1%，氢氧化钙1%-5%，泡敌0.02-0.08%，溶剂为水。发酵初始采用氢氧化钙调节pH成本更低，发酵中后期利用液氨或氨水更精确地调控发酵液pH值，使之维持在微生物最适生长及产酸环境中，同时补充氮源，提高菌体产酸能力及产酸浓度，提高发酵转化率和产量，缩短发酵周期，发酵液品质高，杂质少，便于提取和纯化，同时减少硫酸钙废渣的排放，形成的副产物为硫酸铵，可作为肥料使用。
Description
技术领域
本发明属于食品添加剂的盐类合成前体2-酮基-D-葡萄糖酸的制备领域，特别涉及一种高浓度发酵制备2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐的工艺。
背景技术
2-酮基-D-葡萄糖酸是目前工业化大规模生产的有机酸之一，是食品抗氧化剂D-异抗坏血酸钠及D-异抗坏血酸合成的前体。2-酮基-D-葡萄糖酸的生产方法主要有酶法、化学合成法和发酵法等3种。由于生产成本等方面因素，目前在工业生产中多采用细菌发酵的间接发酵技术。
目前在工业生产中，2-酮基-D-葡萄糖酸均采用发酵法生产，以D-葡萄糖为原料进行。方法存在以下缺点：由于底物及产物在达到一定浓度时的反馈抑制作用，阻碍了生产菌将葡萄糖转化为2-酮基-D-葡萄糖酸生化反应的顺利进行，致使发酵周期长、生产效率低；另外发酵过程中需添加大量CaCO3等作为pH 缓冲剂，发酵母液杂质含量大，粘度高，提取纯化困难，同时产生大量废渣，严重污染环境。因此对传统2-酮基-D-葡萄糖酸发酵工艺的改进已经成为亟待解决的问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服传统方法发酵周期长、产物浓度低、发酵母液杂质含量大，提取纯化困难，同时产生大量废渣，污染环境等问题，提供一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺。
为了解决上述技术问题采用以下技术方案：一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，发酵容器中培养具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐类的微生物，以葡萄糖作为发酵培养基中的碳源进行发酵培养，灭菌前的pH 5.5-7.0；发酵培养基由以下质量体积百分比的物质组成：葡萄糖10%-32%，玉米浆0.1 %-1% ，氢氧化钙 1%-5%，泡敌0.02-0.08%，溶剂为水。
所述的葡萄糖质量体积百分比为25%。
所述的葡萄糖其中40%作为底料、60%作为补料；作为补料的葡萄糖一次性加入或者连续流加方式加入；发酵培养的温度为28-42℃；发酵培养的压为0.02~0.12Mpa；发酵培养的通气量为0.2-2.0v/v/m；当发酵液中氢氧化钙耗尽后，流加液氨或20~30%氨水中和发酵过程中产生的2-酮基-D-葡萄糖酸，维持发酵过程的pH为4.5-8.0；葡萄糖浓度低于0.1%时停止发酵，对发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐进行回收。
优选：维持发酵过程的pH为6.0，发酵培养的温度为34℃，发酵培养的压为0.06Mpa，发酵培养的通气量为0.8v/v/m，
采用连续流加方式加入葡萄糖发酵工艺时，发酵液中葡萄糖浓度下降至6-2%时，开始流加葡萄糖。
优选：维持发酵液中葡萄糖浓度在3%。
所述的具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐类的微生物为荧光假单胞杆菌或球状节杆菌。
本发明中所指的质量体积百分比都是指每100毫升溶液中所含溶质的克数。
本工艺中，发酵培养基中的碳源为葡萄糖，氮源为玉米浆及流加的液氨或氨水。发酵培养基中，所用的玉米浆中干物质质量百分含量为40%左右，若使用其他浓度的玉米浆，可进行相应计算后确定其培养基的组成。泡敌的量只要控制培养基中的泡沫量适宜即可。适用于本发明的微生物很多，分别属于假单胞菌属（Pseudomonas）、欧文氏菌属（Erwinia）、沙雷氏菌属（Serratia）、葡萄糖杆菌属（Glueconobacter）、醋杆菌属（Acetobacter）、产碱菌属（Alcaligenes）等。本发明主要使用了荧光假单胞杆菌（Pseudomonas fluorescens）、球状节杆菌（Arthrobacter globiformis）。
本发明相对现有技术有如下优点：发酵初始采用氢氧化钙调节pH成本更低，发酵中后期利用液氨或氨水更精确地调控发酵液pH值，使之维持在微生物最适生长及产酸环境中，同时补充氮源，提高菌体产酸能力及产酸浓度，提高发酵转化率和产量，缩短发酵周期，发酵液品质高，杂质少，便于提取和纯化，同时减少硫酸钙废渣的排放，形成的副产物为硫酸铵，可作为肥料使用。
具体实施方式
以下以具体实施例来说明本发明的技术方案，但本发明的保护范围不限于此：
实施例1
一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，种子培养采用5L自控发酵罐，种子培养基配方为，以下均为质量体积百分比：葡萄糖 2%，玉米浆 0.1%，KH2PO3 0.2%，尿素 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，泡敌0.05%；灭菌前pH 6.8。将荧光假单胞杆菌K1005菌悬液接入约3L上述种子培养基中，控制搅拌转速400r/m，罐温33.5℃，罐压0.04MPa，通气量0.5 V/V/m，培养20h。
发酵采用50L自控发酵罐，发酵培养基配方如下：葡萄糖 15%（其中40%作为底料，60%作为补料），玉米浆0.1%，氢氧化钙 2% ，泡敌0.05%，溶剂为水；灭菌前pH5.5。将底料葡萄糖配成溶液和玉米浆、氢氧化钙分别于120℃灭菌30min，并于38℃混合，将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中形成发酵液。作为补料的葡萄糖配成10L溶液，120℃灭菌30min，冷却后采用流加方式加入。发酵8小时，氢氧化钙耗尽，开始流加20%氨水，控制发酵pH4.5。发酵10小时，流加加入作为补料的葡萄糖，控制流加速度以维持发酵液中葡萄糖含量在3%左右。控制搅拌转速350r/m，罐温28℃，罐压0.02MPa，通气量0.4v/v/m，培养34h，生产的2-酮基-D-葡萄糖酸浓度达14.8%，发酵转化率（mol/mol，以葡萄糖酸根计）达92.8%。
实施例2
一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，种子培养同实施例1。
发酵采用50L自控发酵罐，发酵培养基配方如下：葡萄糖 24%（其中40%作为底料，60%作为补料），玉米浆0.5%，氢氧化钙 2% ，泡敌0.05%，溶剂为自来水；灭菌前pH6.5。将底料葡萄糖配成溶液和玉米浆、氢氧化钙分别于120℃灭菌30min，并于38℃混合，将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中形成发酵液。作为补料的葡萄糖配成11L溶液，120℃灭菌30min，冷却后采用流加方式加入。发酵9.5小时，氢氧化钙耗尽，开始流加25%氨水，控制发酵pH6.0。发酵12小时，流加加入补料的葡萄糖，控制流加速度以维持发酵液中葡萄糖含量在3%左右。控制搅拌转速380r/m，罐温34℃，罐压0.04MPa，通气量0.8v/v/m，培养39h。生产的2-酮基-D-葡萄糖酸浓度达23.5%发酵转化率（mol/mol，以葡萄糖酸根计）达93.2%。
实施例3
一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，种子培养同实施例1，菌种为球状节杆菌K1022。
发酵采用50L自控发酵罐，发酵培养基配方如下：葡萄糖 32%（其中40%作为底料，60%作为补料），玉米浆1%，氢氧化钙3% ，泡敌0.06%，溶剂为水；灭菌前pH7.0。将底料葡萄糖配成溶液和玉米浆、氢氧化钙分别于120℃灭菌30min，并于38℃混合，将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中。作为补料的葡萄糖配成12L溶液，120℃灭菌30min，冷却后采用流加方式加入。发酵10小时，氢氧化钙耗尽，开始流加30%氨水，控制发酵pH8.0。发酵13小时，流加加入补料的葡萄糖，控制流加速度以维持发酵液中葡萄糖含量在3%左右。控制搅拌转速400r/m，罐温38℃，罐压0.06MPa，通气量1.2v/v/m，培养43h。生产的2-酮基-D-葡萄糖酸浓度达31.3%，发酵转化率（mol/mol，以葡萄糖酸根计）达92.9%。
对照例1
一种发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的普通工艺，种子培养采用5L自控发酵罐，种子培养基配方为：葡萄糖 2%，玉米浆 1%，KH2PO3 0.2%，尿素 0.2%，MgSO4·7H2O 0.05%，泡敌0.05%；灭菌前pH 6.8。将荧光假单胞杆菌K1005菌悬液接入约3L上述种子培养基中，控制搅拌转速400r/m，罐温33.5℃，罐压0.04MPa，通气量0.5 V/V/m，培养20h。
发酵采用50L自控发酵罐，发酵培养基配方如下：葡萄糖 18%（其中40%作为底料，60%作为补料），玉米浆1.5%，轻质碳酸钙 6% ，泡敌0.05%；灭菌前pH6.5。将底料葡萄糖配成溶液和玉米浆、碳酸钙分别于120℃灭菌30min，并于40℃混合，将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中。作为补料的葡萄糖配成10L溶液，120℃灭菌30min，冷却后采用流加方式加入。待发酵液葡萄糖浓度下降至3%，开始流加补料的葡萄糖，控制流加速度以维持发酵液中葡萄糖含量在3%左右。控制搅拌转速400r/m，罐温34℃，罐压0.04MPa，通气量1.0v/v/m，培养48h。生产的2-酮基-D-葡萄糖酸浓度为16.8%，，发酵转化率（mol/mol，以葡萄糖酸根计）为88.38%。
对照例2
一种发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的普通工艺，种子培养同对照例1，菌种为球状节杆菌K1022。
发酵采用50L自控发酵罐，发酵培养基配方如下：葡萄糖 18%（其中40%作为底料，60%作为补料），玉米浆1.5%，轻质碳酸钙 6% ，泡敌0.05%；灭菌前pH6.0。将底料葡萄糖配成溶液和玉米浆、碳酸钙分别于120℃灭菌30min，并于40℃混合，将前述培养好的种液接入约20L发酵培养基中。作为补料的葡萄糖配成10L溶液，120℃灭菌30min，冷却后采用流加方式加入。待发酵液葡萄糖浓度下降至3%，开始流加补料的葡萄糖，控制流加速度以维持发酵液中葡萄糖含量在3%左右。控制搅拌转速400r/m，罐温34℃，罐压0.04MPa，通气量1.0v/v/m，培养50h。生产的2-酮基-D-葡萄糖酸浓度为17.2%，发酵转化率（mol/mol，以葡萄糖酸根计）为89.2%。
对照例1、2采用现有工艺，利用轻质碳酸钙一次性加入培养基中调节PH，控制PH不精确，不利于生产菌产酸，所以转化率较低。实施例1、2、3采用本发明的工艺，即培养基中采用部分氢氧化钙先期调节PH，等用完后再流加氨水，起到精确调节PH、增加氮源从而更利于生产菌的生长及产酸的作用，转化率相对高些。
Claims (6)
1.一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在于：发酵容器中培养具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐类的微生物，以葡萄糖作为发酵培养基中的碳源进行发酵培养，灭菌前的pH 5.5-7.0；发酵培养基由以下质量体积百分比的物质组成：葡萄糖10%-32%，玉米浆0.1 %-1% ，氢氧化钙 1%-5%，泡敌0.02-0.08%，溶剂为水。
2.根据权利要求1所述的一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在于：葡萄糖质量体积百分比为25%。
3.根据权利要求1所述的一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在于：所述的葡萄糖其中40%作为底料、60%作为补料；作为补料的葡萄糖一次性加入或者连续流加方式加入；发酵培养的温度为28-42℃；发酵培养的压为0.02~0.12Mpa；发酵培养的通气量为0.2-2.0v/v/m；当发酵液中氢氧化钙耗尽后，流加液氨或20~30%氨水中和发酵过程中产生的2-酮基-D-葡萄糖酸，维持发酵过程的pH为4.5-8.0；葡萄糖浓度低于0.1%时停止发酵，对发酵液中2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐进行回收。
4.根据权利要求3所述的一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在于：维持发酵过程的pH为6.0，发酵培养的温度为34℃，发酵培养的压为0.06Mpa，发酵培养的通气量为0.8v/v/m，
根据权利要求3所述的一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在于：采用连续流加方式加入葡萄糖发酵工艺时，发酵液中葡萄糖浓度下降至6-2%时，开始流加葡萄糖。
5.根据权利要求5所述的一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在于：维持发酵液中葡萄糖浓度在3%。
6.根据权利要求1所述的一种高浓度发酵生产2-酮基-D-葡萄糖酸的工艺，其特征在于：所述的具有转化葡萄糖为2-酮基-D-葡萄糖酸或其盐类的微生物为荧光假单胞杆菌或球状节杆菌。
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