CN113607784A - 一种燕麦发酵提取物制备过程的监测方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了一种燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，所述方法包括：以燕麦为发酵底物，先接种厌氧菌进行厌氧发酵，获得发酵液，再向所述发酵液中接种好氧菌进行好氧发酵，获得所述燕麦发酵提取物；其中，采用电子鼻对好氧发酵过程中发酵罐的尾气中的氧消耗速率、溶氧浓度和乙醇浓度进行监测和调控，以控制发酵液中乙醇生成浓度不高于310ppm。本申请通过实时反馈控制补糖速率来控制乙醇积累的方法，实现了燕麦双菌发酵过程中补糖速率与乙醇含量的在线精确控制，当控制乙醇在特定含量范围下，能够显著促进燕麦发酵提取物中氨基酸、谷胱甘肽、总酚、皂苷及黄酮等组分的含量。
Description
技术领域
本申请涉及生物发酵技术领域，具体涉及一种燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，以及利用该方法制备获得的燕麦发酵提取物。
背景技术
燕麦是禾本科草本植物，是我国重要的农作物之一。研究表明，燕麦具有良好的生物活性和药用价值，可用于食品、饲料、医药、化妆品和工业原料等方面。
然而，燕麦中所含有的上述活性物质广泛存在于种子颗粒中，并与淀粉和大分子蛋白等融合在一起，单纯的水提取效果非常差，尤其是其中的大分子淀粉和蛋白质的存在，降低了燕麦提取物作为化妆品原料的稳定性，并具有潜在的致敏性。为了促进燕麦提取物中功效成分的合成，将燕麦进行益生菌发酵制备燕麦发酵提取物，这样不仅可以提升燕麦中的功效成分的溶出度，还可得到益生菌分泌或胞内合成的功效代谢物。
现有技术中为了更好的提取燕麦中的活性物质，通常采用酶解处理的方法，例如加入淀粉酶、蛋白酶等，但酶解后得到的提取物中分解得到的糊精和淀粉糖类物质难于分离出来，影响应用性能。申请人的在先申请提供了一种通过用菌发酵的方式提取燕麦提取物的方法，然而在该方法中，由于供氧水平、补糖速率、菌体呼吸代谢、溶氧浓度的变化都会引起乙醇浓度的生成和积累，乙醇浓度的合成及积累进而反馈抑制了酿酒酵母胞内氨基酸和谷胱甘肽含量的积累，因此该方法获得的燕麦提取物中各种活性成分的含量仍有待提高。
发明内容
为了解决上述问题，本申请旨在建立燕麦发酵过程中乙醇含量实时动态检测，以及与补糖速率、溶氧浓度、设备搅拌转速等之间的反馈控制模型，用于燕麦发酵提取物的制备过程乙醇含量的精确控制，提升燕麦发酵提取物中组分的含量。一种气体传感器在线检测并反馈补糖速率的燕麦发酵提取物制备方法。
一方面，本申请提供了一种燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，所述方法包括：
以燕麦为发酵底物，先接种厌氧菌进行厌氧发酵，获得发酵液，再向所述发酵液中接种好氧菌进行好氧发酵，获得所述燕麦发酵提取物；
其中，对好氧发酵过程中发酵罐的尾气中的氧消耗速率、溶氧浓度和乙醇浓度进行监测和调控，以控制发酵液中乙醇生成浓度不高于310ppm。
进一步地，进行监测和调控的方法包括：
当监测到乙醇浓度＞310ppm时，如果溶氧浓度＜40％且氧消耗速率＜60mmol/L/h，则增加转速，否则暂停补糖；
当监测到乙醇浓度＜310ppm时，
如果溶氧浓度＜40％且氧消耗速率＞60mmol/L/h，则降低补糖，
如果溶氧浓度＞50％且氧消耗速率＞60mmol/L/h，则降低转速，
如果溶氧浓度＜40％且氧消耗速率＜60mmol/L/h，则增加转速，
否则增加补糖。
进一步地，采用电子鼻对经过除水处理后的发酵罐尾气进行检测。
进一步地，所述好氧发酵过程中，控制发酵液的溶氧浓度不低于45％，残糖不高于0.5g/L，氧消耗速率在60±4.5mmol/L/h。
进一步地，所述发酵底物采用含有质量浓度3％～5％燕麦的燕麦发酵培养液；和/或，
所述厌氧菌包括双歧杆菌，并采用OD600值大于8的双歧杆菌菌液，接种量8％-11％；和/或，
所述好氧菌包括酵母菌，并采用OD600值大于100的酵母菌菌液，接种量14％-16％。
进一步地，所述双歧杆菌采用金双歧杆菌Bifidobacterium HLXZ006，所述酵母菌采用酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae HLGJ4809。
进一步地，所述双歧杆菌菌液和/或所述酵母菌菌液采用二级种子培养获得。
进一步地，所述燕麦发酵培养液的制备方法包括：
将燕麦粉用纯化水分散后加热到100℃-105℃糊化后，于82℃-90℃下用液化酶200-400U/L液化并添加辅料配制发酵培养基，120℃-130℃下灭菌处理30分钟；
优选的，所述辅料含量包括：酵母浸粉0.4％-0.6％，蛋白胨0.3％-0.6％，磷酸氢二铵0.4％-0.6％，消泡剂0.01％-0.03％。
进一步地，所述步骤一中厌氧发酵的步骤包括：
向燕麦发酵培养液中通入无菌氮气并使溶氧浓度降到0.6％以下，将双歧杆菌接种到所述发酵培养基中，控制发酵温度37.5℃～38.5℃，pH 5.0～5.6，并通过补糖控制乳酸含量在不高于8g/L，发酵时长45～50小时。
进一步地，所述步骤二中好氧发酵的步骤包括：
以已完成厌氧发酵的发酵液为底物，切换通入无菌空气并将溶氧达到饱和，接种酵母菌，控制发酵温度27℃～29℃，pH 5.8～6.0。
另一方面，本申请还提供了上述方法制备获得的燕麦发酵提取物，所述燕麦发酵提取物中，氨基酸含量不低于2000mg/L，谷胱甘肽含量不低于1500mg/L，黄酮含量不低于150mg/L。
可以理解的是，本申请所述“电子鼻”又称为气味扫描仪，采用的是现有技术中提供的电子鼻检测设备及系统。该设备为多通道检测装置，可同时对多台发酵罐进行在线检测，监测得到的信号转换成电压数值信号后，进入数据采集和分析系统。其工作原理为：电子鼻含有16个气敏传感器，这些传感器的敏感膜材料是半导体氧化物SnO2，当待测气体与陶瓷膜接触时，涂在陶瓷膜表面的SnO2敏感膜的电阻随着待测气体的种类和浓度的不同而变化。当空气掠过敏感膜表面时，空气中的氧气与敏感膜中游离的负电子通过电子亲和力结合，形成一个势垒，这个势垒会导致气敏传感器的电阻变大，一般会达到几万到几十万欧姆。当待测气体经过敏感膜表面时，还原性气体的自由电子与O2结合，使势垒减小，导致气敏传感器的电阻变小。根据欧姆定律，在电压保持不变的情况下，与传感器串联的电阻两端的电压会随电阻变化而发生改变。
通过本申请能够带来如下有益效果：
1、本申请提供的燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，采用向燕麦底物中先接种双歧杆菌进行厌氧发酵，再以完成厌氧发酵的发酵液作为新的底物接种酵母菌进行好氧发酵的方式处理燕麦，并在利用酵母菌进行好氧发酵的过程中，利用电子鼻对尾气中的乙醇浓度进行在线检测，实时反馈乙醇浓度，并通过数据采集和分析系统对乙醇浓度进行多种方式的调控，实验表明，电子鼻在线测定的乙醇含量与离线气相测定的结果有很好的相关性，电子鼻可用于燕麦发酵过程培养液中乙醇含量的在线检测；
2、本申请提供的燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，进一步根据电子鼻检测得到的结果对好氧发酵过程进行调控，由于在发酵过程中供氧水平、补糖速率、菌体呼吸代谢、溶氧浓度的变化都会引起乙醇浓度的生成和积累，而乙醇浓度的合成及积累会反馈抑制了酿酒酵母胞内氨基酸和谷胱甘肽含量的积累，因此通过测得乙醇浓度结合氧消耗速率(OUR)、溶氧(DO)进行过程控制的系统评测，根据相关参数的评测模型，实现反馈控制发酵液中的乙醇浓度，实验表明，采用本申请提供的调控方法，可以将乙醇的含量始终控制在310ppm以下，而在本申请提供的发酵方法中，当控制乙醇含量在310ppm以下时，能够显著促进燕麦发酵提取物中氨基酸、谷胱甘肽、总酚、皂苷及黄酮等组分的含量。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1是系统在线检测乙醇浓度、杨消耗速率(OUR)、溶氧(DO)与反馈控制示意图；
图2是电子鼻和气相色谱检测燕麦发酵好氧阶段乙醇浓度的变化曲线图；
图3是不同补糖控制模式下(常规控制和优化控制)过程杨消耗速率(OUR)的变化曲线图；
图4是不同补糖控制模式下(常规控制和优化控制)过程乙醇浓度的变化曲线图。
具体实施方式
为了更清楚的阐释本申请的整体构思，下面以实施例的方式对本发明的整体方案进行详细说明。在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员来说显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
如未特殊说明，下述实施例中各原料组分均可通过商业途径购得，所使用的实验仪器均为实验室常规实验仪器，性能测试方法为本领域已知测试方法。
其中，所涉及的实验仪器包括：海国强生化装备有限责任公司15L和50L发酵罐；舜宇恒平尾气质谱仪及分析软件；722型紫外一可见分光光度计；旋转式摇床，电子鼻检测仪。
其中，下述实施例中的菌种采用华东理工大学国家生化工程技术中心提供的金双歧杆菌Bifidobacterium HLXZ006和酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae HLGJ4809。
在接种前，金双歧杆菌采用二级种子培养，具体步骤为：
一级摇瓶种子培养：保藏的甘油管种子按照1％的接种量接种到装有50ml的种子培养瓶中，培养温度37℃，厌氧培养箱操作，厌氧培养36-48小时，OD值达到3.0～5.0以上；
二级种子罐中培养：以1.5-3.0％的接种量接种到种子罐中，氮气保护下厌氧培养，培养温度37℃，转速150转，厌氧培养36-48小时，OD值达到8.0以上即可；培养过程中，用氨水间歇式调控pH值在5.5左右，并当糖浓度降到0.4g/L时开始补糖，控制补糖速率为0.2g/L/h，启动补糖8小时后调整到0.3g/L/h，当OD值达到10.0时，降低补糖速率为0.1g/L/h，通过调整补糖速率控制培养过程中乳酸含量不高于12g/L。
金双歧种子培养基组分：蛋白胨1.8％，酵母浸粉0.8％，葡萄糖0.5％，磷酸氢二钾0.2％，柠檬酸三铵0.2％，乙酸钠0.5％，硫酸镁0.02％，硫酸锰0.004％，半胱氨酸0.1％，吐温0.1％。上述培养基在121℃下灭菌处理30分钟。
在接种前，酿酒酵母采用二级种子培养，具体步骤为：
一级摇瓶种子培养：接种单菌落(或甘油管)种子到的装液量为50ml的250ml三角摇瓶中，220转/分，28℃培养18-24小时，OD值高于25即可；
二级种子罐中培养：温度28℃，pH6.0，通气量1080L/h，转速起步300rpm；当溶氧回升时，开始流加葡萄糖，其中葡萄糖流加速率为：起步流加速率1g/L/h，4小时后调整到2g/L/h，8小时后调整到3g/L/h，12小时后调整到4g/L/h；通过调节补糖速率和转速来控制溶氧不低于25％-60％，培养周期24小时，当OD值大于100时，可作为移种标准，若生长过快，可通过降低温度来控制与发酵一致的移种时间。
酿酒酵母种子培养基：蛋白胨3％，酵母粉3％，葡萄糖0.5％，培养过程中需要补糖和氨水进行调PH在6.0。
发酵培养基：燕麦粉3.5％，酵母浸粉1.0％，蛋白胨1.5％，磷酸氢二铵1.0％，消泡剂0.02％；并将该发酵培养基置于121℃下灭菌处理30分钟。
葡萄糖测定方法：西尔曼酶膜传感器。
生物量测定方法：离线测定采用湿体积法，将10mL发酵液置于离心管，3000rpm离心15min，将离心上清倒入量筒，根据上清的体积计算出发酵液的体积。效价测定：采用国家药典方法。
pH、DO在线测定方法：采用Mettler Toledo耐高温电极进行在线测定。
温度测定方法：铂温度电极在线测定。
进气和尾气中氧和二氧化碳的测定方法:采用舜宇恒平尾气质谱仪对发酵过程中的进气和尾气进行实时在线采集分析。
氧消耗速率OUR和二氧化碳生成速率CER测定方法：OUR和CER的计算通过对发酵尾气的分析数据计算得到。
实施例1
本实施例提供了一种燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，具体包括如下步骤：
步骤一、厌氧发酵过程：
将燕麦粉碎至100目以上，获得燕麦粉，用常温纯化水溶解混合分散，100℃糊化5分钟左右，然后降温到85℃，加入液化酶300U/L液化30分钟，并配以辅料配制发酵培养基，121℃下灭菌处理30分钟；
向发酵培养基中补充无菌葡萄糖液，控制初始葡萄糖浓度为5g/L，并置于发酵罐中，向发酵罐中通入氮气以将发酵培养基中的溶解氧赶出，指导溶氧电极显示值到0.6％以下，将长好的金双歧杆菌种子培养液按照10％接种量接种到发酵罐中，控制温度在37.5～38.5℃，发酵罐转速150rpm，发酵过程中通过通氮气保持一定罐压和厌氧培养条件，并用氨水间歇式控制pH为5.5(例如当pH低于4.3时进行一次性调节到5.5)；当糖浓度降到0.4g/L时，开始补糖，控制补糖速率为0.2g/L/h，直到发酵液OD值达到10.0时，将补糖速率降低到0.1g/L/h，通过调整补糖速率，控制乳酸含量在5.8±0.8g/L，厌氧发酵时长为48h。
步骤二、好氧发酵阶段：
当上述发酵液在厌氧发酵指标达到后，将发酵罐进气的氮气切换成无菌空气，控制通气比0.5～0.6vvm，将溶氧回升到100％，增加液糖补加量将发酵液中的葡萄糖浓度提升到5g/L；将长好的酿酒酵母菌种子培养液按照15％接种量接种到发酵罐中，控制发酵温度27.5-28.5℃，初始转速250rpm；其中，酿酒酵母有氧发酵阶段初期，pH将呈现上升趋势，当pH降到5.8氨水自动控制在5.8-6.0；
通过调整转速和通气速率控制有氧发酵阶段的溶氧浓度不低于45％，控制过程中残糖控制不高于0.5g/L，并通过补糖速率控制发酵过程中氧消耗速率(OUR)在60±4.5mmol/L/h，当残留糖浓度降到0.4g/L，开始补糖，补糖速率为起步流加速率2g/L/h，2小时后调整到2.5g/L/h，4小时后调整到4g/L/h，6小时后调整到5g/L/h，12小时后调整到4g/L/h，过程中当发酵液OD值达到115-120时，将补糖速率控制在2.5-3.0g/L/h，直到发酵总周期到96小时。
在上述好氧发酵中，采用以下方法对其过程进行监测和调控：
在实验过程中，发酵罐的尾气经除水处理后直接进入电子鼻进行检测，电子鼻为四通道检测装置，可同时对4台发酵罐进行在线检测，监测得到的信号转换成电压数值信号后，进入数据采集和分析系统。
利用电子鼻进行有氧发酵的发酵液中乙醇生成浓度的检测，并结合氧消耗速率(OUR)、溶氧(DO)进行过程控制的系统评测，根据相关参数的评测模型，实施转速与补糖速率的系统调控，实现反馈控制发酵液中的乙醇浓度。
其中，在好氧发酵过程中根据电子鼻监测到的乙醇浓度进行调控的具体方法如下：
当监测到乙醇浓度＞310ppm时：如果溶氧浓度＜40％且氧消耗速率＜60mmol/L/h，则增加转速，否则暂停补糖；
当监测到乙醇浓度＜310ppm时：
如果溶氧浓度＜40％且氧消耗速率＞60mmol/L/h，则降低补糖，
如果溶氧浓度＞50％且氧消耗速率＞60mmol/L/h，则降低转速，
如果溶氧浓度＜40％且氧消耗速率＜60mmol/L/h，则增加转速，
否则增加补糖。
利用上述方法能够根据乙醇含量在线检测结果，建立乙醇浓度、OUR和溶氧浓度三者之间的联动控制模型，具体流程图如图1所示。
对好氧阶段的发酵液进行乙醇浓度检测，其中，实施例1是利用电子鼻在线监测尾气中乙醇的响应值，根据标定好的响应电压值与液体中乙醇浓度的模型关系，计算得到实时的乙醇浓度变化曲线。对比方法是采取每间隔6小时进行取样操作，将样本用气相进行乙醇浓度的测定，所得结果如图2所示。
根据图2中的对比结果显示，电子鼻在线测定的乙醇含量与离线气相测定的结果有很好的相关性，因此，电子鼻可用于燕麦发酵过程培养液中乙醇含量的在线检测。
对比例1
对比例1和实施例1的发酵方法大致相同，区别仅在于，在好氧发酵阶段未针对乙醇浓度进行调控。
分别对实施例1和对比例1的发酵过程中菌体的氧消耗速率(OUR)和乙醇浓度变化进行检测分析，所得结果分别如图3和图4所示。
由图3和图4中的结果可知，实施例1控制模式相比对比例1过程中乙醇浓度能够得到较好的控制，而且在该控制模式下，整个好氧发酵过程中菌体的氧消耗速率维持平稳。而常规底物糖控制模式下，80小时后菌体的氧消耗速率显著下降，菌体活力明显降低。这可能与乙醇浓度高引起的细胞呼吸代谢抑制有关。并且，实施发酵过程中补糖速率、设备搅拌转速等之间的反馈控制，将发酵液中乙醇的含量控制不超过310ppm。
将实施例1和对比例1的发酵液分别进行滤膜过滤提取处理后，所得燕麦发酵提取液中，活性组分以及含量如表1所示。
表1 对比例1与实施例1燕麦发酵提取物组分对比
由表1中的结果可知，在实施例1中，氨基酸、谷胱甘肽、总酚、皂苷和黄酮等的含量明显优于对比例1。而且，在优化控制模式下菌体的代谢活力得以维持，单位体积糖消耗量显著降低，有效避免了好氧发酵过程中乙醇积累对菌体代谢的抑制。因此，该控制模型可用于燕麦发酵提取物的制备过程乙醇浓度和补糖速率的精确控制，提升燕麦发酵提取物中组分的含量。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求范围之内。
Claims (10)
1.一种燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，其特征在于，所述方法包括：
以燕麦为发酵底物，先接种厌氧菌进行厌氧发酵，获得发酵液，再向所述发酵液中接种好氧菌进行好氧发酵，获得所述燕麦发酵提取物；
其中，对好氧发酵过程中发酵罐的尾气中的氧消耗速率、溶氧浓度和乙醇浓度进行监测和调控，以控制发酵液中乙醇生成浓度不高于310ppm。
2.根据权利要求1所述的燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，其特征在于，进行监测和调控的方法包括：
当监测到乙醇浓度＞310ppm时，如果溶氧浓度＜40％且氧消耗速率＜60mmol/L/h，则增加转速，否则暂停补糖；
当监测到乙醇浓度＜310ppm时，
如果溶氧浓度＜40％且氧消耗速率＞60mmol/L/h，则降低补糖，
如果溶氧浓度＞50％且氧消耗速率＞60mmol/L/h，则降低转速，
如果溶氧浓度＜40％且氧消耗速率＜60mmol/L/h，则增加转速，
否则增加补糖。
3.根据权利要求1所述的燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，其特征在于，采用电子鼻对经过除水处理后的发酵罐尾气进行检测。
4.根据权利要求1所述的燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，其特征在于，所述好氧发酵过程中，控制发酵液的溶氧浓度不低于45％，残糖不高于0.5g/L，氧消耗速率在60±4.5mmol/L/h。
5.根据权利要求1所述的燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，其特征在于，所述发酵底物采用含有质量浓度3％～5％燕麦的燕麦发酵培养液；和/或，
所述厌氧菌包括双歧杆菌，并采用OD600值大于8的双歧杆菌菌液，接种量8％-11％；和/或，
所述好氧菌包括酵母菌，并采用OD600值大于100的酵母菌菌液，接种量14％-16％。
6.根据权利要求5所述的燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，其特征在于，所述双歧杆菌采用金双歧杆菌Bifidobacterium HLXZ006，所述酵母菌采用酿酒酵母Saccharomycescerevisiae HLGJ4809。
7.根据权利要求5所述的燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，其特征在于，所述双歧杆菌菌液和/或所述酵母菌菌液采用二级种子培养获得。
8.根据权利要求5所述的燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，其特征在于，所述燕麦发酵培养液的制备方法包括：
将燕麦粉用纯化水分散后加热到100℃-105℃糊化后，于82℃-90℃下用液化酶200-400U/L液化并添加辅料配制发酵培养基，120℃-130℃下灭菌处理30分钟；
优选的，所述辅料含量包括：酵母浸粉0.4％-0.6％，蛋白胨0.3％-0.6％，磷酸氢二铵0.4％-0.6％，消泡剂0.01％-0.03％。
9.根据权利要求5所述的燕麦发酵提取物制备过程的监测方法，其特征在于，所述步骤一中厌氧发酵的步骤包括：
向燕麦发酵培养液中通入无菌氮气并使溶氧浓度降到0.6％以下，将双歧杆菌接种到所述发酵培养基中，控制发酵温度37.5℃～38.5℃，pH 5.0～5.6，并通过补糖控制乳酸含量在不高于8g/L，发酵时长45～50小时；和/或，
所述步骤二中好氧发酵的步骤包括：
以已完成厌氧发酵的发酵液为底物，切换通入无菌空气并将溶氧达到饱和，接种酵母菌，控制发酵温度27℃～29℃，pH 5.8～6.0。
10.如权利要求1-9任一所述方法制备获得的燕麦发酵提取物，所述燕麦发酵提取物中，氨基酸含量不低于2000mg/L，谷胱甘肽含量不低于1500mg/L，黄酮含量不低于150mg/L。
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