CN1621512A - 乙醇反馈控制流加的酵母高密度发酵方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明乙醇反馈控制流加的酵母高密度发酵方法及其应用，涉及一种高密度培养酵母细胞以及生产酵母代谢产物的方法。用乙醇浓度监测仪在线监测发酵液中的乙醇浓度，将发酵液乙醇浓度范围控制在最佳控制浓度；所用酵母为酿酒酵母、产朊假丝酵母或热带假丝酵母；优化的培养基组成为：葡萄糖、酵母粉、麦汁、磷酸氢二铵、硫酸镁、蛋白胨、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、Zn2+、Fe2+、Cu2+和Mn2+。是通过乙醇浓度反馈控制流加，用于高密度培养酵母细胞以及通过酵母细胞生产目标产品。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种高密度培养酵母细胞以及生产酵母代谢产物的方法。是通过乙醇浓度反馈控制流加，用于高密度培养酵母细胞以及通过酵母细胞生产目标产品。
(二)背景技术
酵母是生物产品发酵的主要载体微生物之一，也是重组基因工程产品经常采用的宿主细胞。为提高生产过程的经济性和产品的市场竞争力，生物技术研究者不断创造更经济、更有效的方法，优化生产过程，实现高生产率。酵母细胞的高密度培养是提高酵母表达产品生产水平的重要手段。由于微生物细胞自身生理特性以及设备、培养条件等因素的限制，细胞的高密度培养并不容易实现，需要对生产过程进行优化调控。在酵母发酵中，由于Crabtree效应以及高浓度基质对细胞生长和产物积累的抑制作用，为获得高的细胞密度，一般采用流加培养技术，也就是根据具体发酵过程的特点，按照一定的加料策略向发酵罐中不断补充营养物质直至发酵结束。
补料策略的优化是流加技术的核心内容，也是高密度培养能否实现的关键。流加方式可分为两大类：无反馈控制的流加操作和反馈控制流加操作。无反馈控制的流加，营养物的流加速率按预定的方式进行，有恒速流加、指数流加、恒生长速率流加等。这种流加方式较为简单，对设备的要求不高，但往往效果欠佳。由于微生物发酵的复杂性，采用反馈控制流加操作效果较好，也就是根据发酵过程中某些过程参数的变化来及时调节营养物的流加速率，使营养的提供更符合微生物自身的代谢规律，给微生物提供较优的生长和代谢环境，充分发挥菌种目的产物的合成潜力，从而有效地提高发酵水平。
微生物发酵中通常用于反馈控制的参数有溶氧(DO)、pH、呼吸熵(RQ)、乙醇浓度、残糖浓度等，用作反馈控制的参数必须能够实现在线监测。Fan-Chiang Yang等[Bioprocess Engineering 18(1998)79-82]在酿酒酵母的流加培养中以DO为反馈控制参数，采取恒DO策略，以DO参数的变化来判断发酵罐中是否出现基质匮乏，使细胞培养密度达到了110g/L。Takou Yano等[J of Ferment and Bioeng.，1991，71(1)：35-39]将指数流加和控制DO相结合的方法，应用于面包酵母的流加培养过程，将溶氧变化与基质的流加速率相关联，使生物量达到60g/L以上。Jana等[Journal of Biotechnology 80(2000)55-62]采用反馈RQ控制流加培养重组酵母细胞，生产可溶性人N-脱糖基重组β-1，4-半乳糖转移酶。采用优化的RQ值反馈控制流加培养重组酵母，可同时提高生物量及酶产量。但是以RQ为控制参数，发酵罐必须配备尾气分析装置，在线分析尾气中的氧和二氧化碳浓度，而且RQ值必须能够较好地与细胞的生理代谢状态相关联。同样，以残糖浓度为反馈控制参数的流加发酵[Mendoza-Vega等，FEMS Microbiol.Rev.15(1994)，369-410]，发酵罐必须要配备在线葡萄糖分析仪。由于这些仪器价格较贵，致使设备投资费用增大而难以普及。乙醇是酵母葡萄糖代谢的产物，就酵母发酵而言，乙醇浓度是一个很重要的参数，它与酵母的生长、代谢状态紧密关联，而且以不同的机制影响着各种代谢产物的积累。在谷胱甘肽发酵中，Alfafara等[Biotechnology andBioengineering，Vol.41，493-501(1993)]将乙醇传感器与气相色谱相连，监测排气中的乙醇浓度，采用模糊逻辑控制器控制乙醇浓度，使细胞在谷胱甘肽合成阶段不产乙醇，并结合控制比生长速率以及适时添加半胱氨酸，以利于谷胱甘肽的积累。该方法不能直接检测发酵液中的乙醇浓度，需要经过复杂的数学关联处理才能计算出发酵液中的乙醇浓度。Sakato等[Biotechnology and Bioengineering，Vol.40，904-912(1992)]采用前馈/反馈控制系统以及在线检测排气中氧浓度和乙醇浓度，调节补糖速度，使酵母同时消耗糖和乙醇，经过60小时发酵，细胞密度达到64g/L。Alfafara和Sakato等监测的都是排气中的乙醇浓度，而且最终细胞密度都低于100g/L。用乙醇浓度监测仪在线监测发酵液中的乙醇浓度，应用于酵母细胞的高密度发酵，尚未见报道。
(三)发明内容
本发明提出了在线监测发酵液中的乙醇浓度，反馈控制流加的酵母高密度发酵方法。该方法是通过在线监测发酵液中的乙醇浓度，将发酵液乙醇浓度范围控制在最佳控制浓度来实现的。
通常，乙醇浓度反馈控制流加的酵母高密度发酵方法，是采用优化的培养基配方，以乙醇浓度为反馈控制参数，向发酵罐中流加营养物质葡萄糖水溶液，通过调节营养物的流加速率，生产酵母细胞以及酵母代谢产物，本发明的技术特征在于：
(1)乙醇浓度监测仪在线监测发酵液中的乙醇浓度，将发酵液乙醇浓度范围控制在最佳控制浓度；
(2)酵母为酿酒酵母、产朊假丝酵母或热带假丝酵母；
(3)优化的培养基组成中包括：葡萄糖、酵母粉、麦汁、磷酸氢二铵、硫酸镁、蛋白胨、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、Zn2+、Fe2+、Cu2+和Mn2+。
本发明的方法应用于产朊假丝酵母高密度发酵生产酵母细胞，发酵液乙醇最佳控制浓度为5～7g/L；葡萄糖水溶液浓度为650g/L；优化的培养基组成：葡萄糖60g/L、酵母粉15g/L、麦汁40g/L、磷酸氢二铵10g/L、硫酸镁5g/L、蛋白胨10g/L、磷酸氢二钾20g/L、磷酸二氢钾12g/L、Zn2+10ppm、Fe2+6ppm、Cu2+6ppm和Mn2+6ppm；发酵结束时细胞密度达到135g/L(干重)。
本发明的方法应用于高密度培养热带假丝酵母生产酵母细胞，发酵液乙醇最佳控制浓度为7～9g/L；葡萄糖水溶液浓度为650g/L；优化的培养基组成：葡萄糖73g/L、酵母粉9g/L、麦汁28g/L、磷酸氢二铵9g/L、硫酸镁6g/L、蛋白胨8g/L、磷酸氢二钾16g/L、磷酸二氢钾18g/L、Zn2+13ppm、Fe2+4ppm、Cu2+4ppm、Mn2+4ppm；发酵结束时细胞密度达到126g/L(干重)。
本发明的方法应用于高密度培养酿酒酵母细胞，发酵液乙醇最佳控制浓度为5～7g/L；葡萄糖水溶液浓度为650g/L；优化的培养基组成：葡萄糖80g/L、酵母粉18g/L、麦汁40g/L、磷酸氢二铵9g/L、硫酸镁3g/L、蛋白胨10g/L、磷酸氢二钾12g/L、磷酸二氢钾12g/L、Zn2+10ppm、Fe2+6ppm、Cu2+6ppm、Mn2+6ppm；发酵结束时细胞密度达到143g/L(干重)。
本发明的方法应用于高密度培养产朊假丝酵母生产谷胱甘肽，发酵液乙醇最佳控制浓度为20～23g/L；葡萄糖水溶液浓度为600g/L；优化的培养基组成：葡萄糖40g/L、酵母粉7g/L、麦汁16g/L、磷酸氢二铵6g/L、硫酸镁3g/L、蛋白胨5g/L、磷酸氢二钾7g/L、磷酸二氢钾7g/L、Zn2+7ppm、Fe2+2ppm、Cu2+2ppm、Mn2+2ppm；发酵结束时细胞密度达到104g/L(干重)，谷胱甘肽总量为1680mg/L。
本发明的方法应用于高密度培养热带假丝酵母生产谷胱甘肽，发酵液乙醇最佳控制浓度为22～25g/L；葡萄糖水溶液浓度为700g/L；优化的培养基组成：葡萄糖60g/L、酵母粉13g/L、麦汁30g/L、磷酸氢二铵9g/L、硫酸镁4g/L、蛋白胨10g/L、磷酸氢二钾12g/L、磷酸二氢钾12g/L、Zn2+12ppm、Fe2+4ppm、Cu2+4ppm、Mn2+4ppm；发酵结束时细胞密度达到123g/L(干重)，谷胱甘肽总量为1830mg/L。
本发明的方法应用于高密度培养酿酒酵母生产谷胱甘肽，发酵液乙醇最佳控制浓度为18～20g/L；葡萄糖水溶液浓度为600g/L；优化的培养基组成：葡萄糖50g/L、酵母粉20g/L、麦汁10g/L、磷酸氢二铵7g/L、硫酸镁6g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾10g/L、磷酸二氢钾20g/L、Zn2+15ppm、Fe2+2ppm、Cu2+2ppm、Mn2+2ppm；发酵结束时细胞密度达到137g/L(干重)，谷胱甘肽总量为1872mg/L。
本发明的方法应用于高密度培养酿酒酵母生产麦角固醇，发酵液乙醇最佳控制浓度为15～17g/L；葡萄糖水溶液浓度为650g/L；优化的培养基组成：葡萄糖40g/L、酵母粉20g/L、麦汁14g/L、磷酸氢二铵6g/L、硫酸镁6g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾20g/L、磷酸二氢钾20g/L、Zn2+7ppm、Fe2+2ppm、Cu2+2ppm、Mn2+2ppm；发酵结束时细胞密度达到93g/L(干重)，总麦角固醇量为1302mg/L。
众所周知，酵母可以碳水化合物(如多种单糖及寡糖)和非碳水化合物等作为碳源和能源，能以无机氮源(主要是硫酸铵及磷酸铵)、尿素、各种氨基酸为营养物质。除碳源和氮源外，酵母生长还需要磷、镁、硫、及微量的锌、铜、铁等，需要生物素、泛酸等维生素。根据酵母细胞的营养需求，本发明所用的酵母发酵培养基从常用的微生物培养基组成物质中选择以下物质组成，葡萄糖、酵母粉、麦汁、磷酸氢二铵、硫酸镁、蛋白胨、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、Zn2+、Fe2+、Cu2+和Mn2+，然后通过均匀试验设计、正交试验设计优化培养基中各组份的配比，得到适用于细胞高密度培养的优化培养基配方。发酵结束，酵母细胞密度达到93～143g/L(干重)，说明优化培养基中碳、氮、磷的比例合理，无机离子的浓度适宜，而且酵母粉、麦汁和蛋白胨中含有丰富的维生素、氨基酸以及生长因子，有利于酵母生长和产物积累，充分发挥菌种的代谢潜力。优化的培养基是实现高密度培养的第一步。适宜的发酵培养基是细胞生长和合成目的产物的保证。
本发明采用乙醇浓度监测仪对发酵液中的乙醇浓度进行在线监测。乙醇监测探头安装在发酵罐内，插入发酵液中，能够准确快速地监测发酵罐中乙醇浓度的变化情况。本发明直接检测发酵液中的乙醇浓度，因此更能准确反映实际的发酵状况，有利于提高控制效果。
酵母发酵过程中必然会产生乙醇，乙醇的过量产生会降低基质的得率系数，减少生物量，抑制目的产物的生成。要根据代谢过程的具体特点合理调控乙醇的产生，控制发酵液中的乙醇维持在一个适宜浓度是达到细胞高密度培养的关键。本发明的方法采用乙醇浓度监测仪，在线监测发酵液中的乙醇浓度，以乙醇浓度为反馈控制参数，通过合理控制发酵液中的乙醇浓度，及时调节营养物质的流加速率。在发酵进行到某时刻，当乙醇浓度下降至最佳控制浓度时，调节葡萄糖的流加速率，当乙醇浓度上升时，减小流加速率，当乙醇浓度下降时，增大流加速率，维持发酵液中的乙醇浓度在最佳控制浓度，发酵结束时，酵母细胞密度最高可达143g/L(干重)。本发明实现酵母细胞的高密度培养，将此酵母高密度培养技术应用于谷胱甘肽以及麦角固醇等的生产，可以大幅提高产物的生产水平。
本发明的优点在于：
1、直接监测发酵液中的乙醇浓度，较之监测排气中乙醇浓度的方法，该法更准确、直接、简便；
2、针对不同的发酵体系，将发酵液中的乙醇控制在一个适宜的浓度，即乙醇的最佳控制浓度。乙醇浓度是反映细胞生理状态的一个重要参数，以此为反馈控制参数效果较好。
3、应用于酿酒酵母高密度培养，细胞密度达到93～143g/L(干重)；应用于产朊假丝酵母高密度培养，细胞密度达到104～135g/L(干重)；应用于热带假丝酵母高密度培养，细胞密度达到123～136g/L(干重)
本发明用通用式发酵罐培养酵母，操作步骤如下：
1、发酵罐上安装各种传感电极(pH电极、溶氧电极、温度电极、消泡电极)和乙醇浓度监测仪(例如，美国Yellow Spring的YSI2730监测和控制系统或国产的FC2002乙醇浓度监测仪)，乙醇监测探头插入发酵液中；
2、按照优化培养基配方在所用的发酵罐中配制一定量的培养基，在120℃下30分钟实罐灭菌；
3、在补料罐中配制一定浓度的流加葡萄糖水溶液，在120℃下30分钟实罐灭菌；
4、制备种子：以发酵配方配制种子培养基，分装摇瓶，在120℃下30分钟灭菌；斜面接种，待种子生长到对数中后期准备接种；
5、按10％的接种量接入发酵罐，搅拌转速在200～500转/分，通风比为1.0～1.5VVM，30℃下开始发酵；
6、在线监测发酵液中的乙醇浓度，并以此为反馈控制参数，通过调节营养物的流加速率，控制乙醇浓度在最佳控制浓度；
7、待产量达到预定指标时停止发酵。
(四)具体实施方式
实施例1：高密度培养产朊假丝酵母生产酵母细胞
使用30L通用式发酵罐发酵。配制9L发酵培养基(培养基配方：葡萄糖60g/L，酵母粉15g/L，麦汁40g/L，磷酸氢二铵10g/L，硫酸镁5g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氢二钾20g/L，磷酸二氢钾12g/L，Zn2+10ppm，Fe2+、Cu2+、Mn2+各6ppm)，实罐灭菌。待培养基温度降至30℃后接种，调节通风比为1.2VVM，搅拌转速为400转/分，开始发酵。从11.5小时开始流加浓度为650g/L的葡萄糖水溶液，发酵进行至15.4小时，乙醇浓度降至6g/L，此时根据乙醇浓度调节流加速率，当乙醇浓度上升时，减小流加速率，当乙醇浓度下降时，增大流加速率，发酵液中的乙醇浓度维持在5～7g/L。经过33小时发酵，生物量达到135g/L(干重)。
实施例2：高密度培养热带假丝酵母生产酵母细胞
使用50L通用式发酵罐发酵。配制18L发酵培养基(培养基配方：葡萄糖73g/L，酵母粉9g/L，麦汁28g/L，磷酸氢二铵9g/L，硫酸镁6g/L，蛋白胨8g/L，磷酸氢二钾16g/L，磷酸二氢钾18g/L，Zn2+13ppm，Fe2+、Cu2+、Mn2+各4ppm)，实罐灭菌。待培养基温度降至30℃后接种，调节通风比为1.2VVM，搅拌转速为300转/分，开始发酵。从12小时开始流加浓度为650g/L的葡萄糖水溶液，发酵进行至17.1小时，乙醇浓度降至8g/L，此时根据乙醇浓度调节流加速率，当乙醇浓度上升时，减小流加速率，当乙醇浓度下降时，增大流加速率，发酵液中的乙醇浓度维持在7～9g/L。经过36小时发酵，生物量达到126g/L(干重)。
实施例3：高密度培养酿酒酵母细胞
使用150L通用式发酵罐发酵。配制50L发酵培养基(培养基配方：葡萄糖80g/L，酵母粉18g/L，麦汁40g/L，磷酸氢二铵9g/L，硫酸镁3g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氢二钾12g/L，磷酸二氢钾12g/L，Zn2+10ppm，Fe2+、Cu2+、Mn2+各6ppm)，实罐灭菌。待培养基温度降至30℃后接种，调节通风比为1.1VVM，搅拌转速为200转/分，开始发酵。从13小时开始流加浓度为650g/L的葡萄糖水溶液，发酵进行至18小时，乙醇浓度降至6g/L，此时根据乙醇浓度调节流加速率，当乙醇浓度上升时，减小流加速率，当乙醇浓度下降时，增大流加速率，发酵液中的乙醇浓度维持在5～7g/L。经过42小时发酵，生物量达到143g/L(干重)。
实施例4：高密度培养产朊假丝酵母生产谷胱甘肽
使用5L通用式发酵罐发酵。配制1.6L发酵培养基(培养基配方：葡萄糖40g/L，酵母粉7g/L，麦汁16g/L，磷酸氢二铵6g/L，硫酸镁3g/L，蛋白胨5g/L，磷酸氢二钾7g/L，磷酸二氢钾7g/L，Zn2+7ppm，Fe2+、Cu2+、Mn2+各2ppm)，实罐灭菌。待培养基温度降至30℃后接种，调节通风比为1.5VVM，搅拌转速为500转/分，开始发酵。发酵液中的乙醇浓度开始逐步上升，达最高点后逐步下降，11小时降至21g/L，此时开始流加浓度为600g/L的葡萄糖水溶液，根据乙醇浓度的变化情况改变流加速率，当乙醇浓度上升时，减小流加速率，当乙醇浓度下降时，增大流加速率，维持发酵液中的乙醇浓度在20～23g/L，发酵38小时，生物量达到104g/L(干重)，谷胱甘肽总量为1680mg/L。
实施例5：高密度培养热带假丝酵母生产谷胱甘肽
使用30L通用式发酵罐发酵。配制10L发酵培养基(培养基配方：葡萄糖60g/L，酵母粉13g/L，麦汁30g/L，磷酸氢二铵9g/L，硫酸镁4g/L，蛋白胨10g/L，磷酸氢二钾12g/L，磷酸二氢钾12g/L，Zn2+12ppm，Fe2+、Cu2+、Mn2+各4ppm)实罐灭菌。待培养基温度降至30℃后接种，调节通风比为1.3VVM，搅拌转速为400转/分，开始发酵。发酵12.3小时，此时发酵液中的乙醇浓度为降至24g/L，开始流加浓度为700g/L的葡萄糖水溶液，调节流加速率，维持发酵液中的乙醇浓度在22～25g/L，发酵41小时，生物量达到123g/L(干重)，谷胱甘肽总量为1830mg/L。
实施例6：高密度培养酿酒酵母生产谷胱甘肽
使用100L通用式发酵罐发酵。配制30L发酵培养基(培养基配方：葡萄糖50g/L，酵母粉20g/L，麦汁10g/L，磷酸氢二铵7g/L，硫酸镁6g/L，蛋白胨3g/L，磷酸氢二钾10g/L，磷酸二氢钾20g/L，Zn2+15ppm，Fe2+、Cu2+、Mn2+各2ppm)实罐灭菌。待培养基温度降至30℃后接种，调节通风比为1.0VVM，搅拌转速为300转/分，开始发酵。发酵13小时，此时发酵液中的乙醇浓度为降至19g/L，开始流加浓度为600g/L的葡萄糖水溶液，调节流加速率，维持发酵液中的乙醇浓度在18～20g/L，发酵46小时，生物量达到137g/L(干重)，谷胱甘肽总量为1872mg/L。
实施例7：高密度培养酿酒酵母生产麦角固醇
使用20L通用式发酵罐发酵。配制6L发酵培养基(培养基配方：葡萄糖40g/L，酵母粉20g/L，麦汁14g/L，磷酸氢二铵6g/L，硫酸镁6g/L，蛋白胨3g/L，磷酸氢二钾20g/L，磷酸二氢钾20g/L，Zn2+7ppm，Fe2+、Cu2+、Mn2+各2ppm)实罐灭菌。待培养基温度降至30℃后接种，调节通风比为1.5VVM，搅拌转速为400转/分，开始发酵。从10小时开始流加浓度为650g/L的葡萄糖水溶液，发酵进行至13.2小时，乙醇浓度降至16g/L，此时根据乙醇浓度调节流加速率，当乙醇浓度上升时，减小流加速率，当乙醇浓度下降时，增大流加速率，发酵液中的乙醇浓度维持在15～17g/L。经过42小时发酵，生物量达到93g/L(干重)，总麦角固醇量为1302mg/L。
Claims (8)
1、一种乙醇浓度反馈控制流加的酵母高密度发酵方法，是采用优化的培养基配方，以乙醇浓度为反馈控制参数，向发酵罐中流加营养物质葡萄糖水溶液，通过调节营养物的流加速率，生产酵母细胞以及酵母代谢产物，其特征在于：
(1)用乙醇浓度监测仪在线监测发酵液中的乙醇浓度，将发酵液乙醇浓度范围控制在最佳控制浓度；
(2)酵母为酿酒酵母、产朊假丝酵母或热带假丝酵母；
(3)优化的培养基组成中包括：葡萄糖、酵母粉、麦汁、磷酸氢二铵、硫酸镁、蛋白胨、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、Zn2+、Fe2+、Cu2+和Mn2+。
2、根据权利要求1所述的方法，应用于产朊假丝酵母高密度发酵生产酵母细胞，发酵液乙醇最佳控制浓度为5～7g/L；葡萄糖水溶液浓度为650g/L；优化的培养基组成：葡萄糖60g/L、酵母粉15g/L、麦汁40g/L、磷酸氢二铵10g/L、硫酸镁5g/L、蛋白胨10g/L、磷酸氢二钾20g/L、磷酸二氢钾12g/L、Zn2+ 10ppm、Fe2+ 6ppm、Cu2+ 6ppm和Mn2+ 6ppm；发酵结束时细胞密度达到135g/L(干重)。
3、根据权利要求1所述的方法，应用于高密度培养热带假丝酵母生产酵母细胞，发酵液乙醇最佳控制浓度为7～9g/L；葡萄糖水溶液浓度为650g/L；优化的培养基组成：葡萄糖73g/L、酵母粉9g/L、麦汁28g/L、磷酸氢二铵9g/L、硫酸镁6g/L、蛋白胨8g/L、磷酸氢二钾16g/L、磷酸二氢钾18g/L、Zn2+ 13ppm、Fe2+ 4ppm、Cu2+ 4ppm、Mn2+ 4ppm；发酵结束时细胞密度达到126g/L(干重)。
4、根据权利要求1所述的方法，应用于高密度培养酿酒酵母细胞，发酵液乙醇最佳控制浓度为5～7g/L；葡萄糖水溶液浓度为650g/L；优化的培养基组成：葡萄糖80g/L、酵母粉18g/L、麦汁40g/L、磷酸氢二铵9g/L、硫酸镁3g/L、蛋白胨10g/L、磷酸氢二钾12g/L、磷酸二氢钾12g/L、Zn2+ 10ppm、Fe2+ 6ppm、Cu2+ 6ppm、Mn2+ 6ppm；发酵结束时细胞密度达到143g/L(干重)。
5、根据权利要求1所述的方法，应用于高密度培养产朊假丝酵母生产谷胱甘肽，发酵液乙醇最佳控制浓度为20～23g/L；葡萄糖水溶液浓度为600g/L；优化的培养基组成：葡萄糖40g/L、酵母粉7g/L、麦汁16g/L、磷酸氢二铵6g/L、硫酸镁3g/L、蛋白胨5g/L、磷酸氢二钾7g/L、磷酸二氢钾7g/L、Zn2+ 7ppm、Fe2+ 2ppm、Cu2+ 2ppm、Mn2+ 2ppm；发酵结束时细胞密度达到104g/L(干重)，谷胱甘肽总量为1680mg/L。
6、根据权利要求1所述的方法，应用于高密度培养热带假丝酵母生产谷胱甘肽，发酵液乙醇最佳控制浓度为22～25g/L；葡萄糖水溶液浓度为700g/L；优化的培养基组成：葡萄糖60g/L、酵母粉13g/L、麦汁30g/L、磷酸氢二铵9g/L、硫酸镁4g/L、蛋白胨10g/L、磷酸氢二钾12g/L、磷酸二氢钾12g/L、Zn2+ 12ppm、Fe2+ 4ppm、Cu2+ 4ppm、Mn2+ 4ppm；发酵结束时细胞密度达到123g/L(干重)，谷胱甘肽总量为1830mg/L。
7、根据权利要求1所述的方法，应用于高密度培养酿酒酵母生产谷胱甘肽，发酵液乙醇最佳控制浓度为18～20g/L；葡萄糖水溶液浓度为600g/L；优化的培养基组成：葡萄糖50g/L、酵母粉20g/L、麦汁10g/L、磷酸氢二铵7g/L、硫酸镁6g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾10g/L、磷酸二氢钾20g/L、Zn2+ 15ppm、Fe2+ 2ppm、Cu2+ 2ppm、Mn2+ 2ppm；发酵结束时细胞密度达到137g/L(干重)，谷胱甘肽总量为1872mg/L。
8、根据权利要求1所述的方法，应用于高密度培养酿酒酵母生产麦角固醇，发酵液乙醇最佳控制浓度为15～17g/L；葡萄糖水溶液浓度为650g/L；优化的培养基组成：葡萄糖40g/L、酵母粉20g/L、麦汁14g/L、磷酸氢二铵6g/L、硫酸镁6g/L、蛋白胨3g/L、磷酸氢二钾20g/L、磷酸二氢钾20g/L、Zn2+ 7ppm、Fe2+ 2ppm、Cu2+ 2ppm、Mn2+ 2ppm；发酵结束时细胞密度达到93g/L(干重)，总麦角固醇量为1302mg/L。
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