CN118064474B - 一种阿魏酸生产菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
一种阿魏酸生产菌株及其构建方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种阿魏酸生产菌株及其构建方法与应用，所述菌株缺失了metJ基因，上调了metE、metK、luxS、mtn基因，异源表达了来源于Rhodotorulaglutinis的RgTal基因、来源于Klebsiella pneumoniae的KpHpaBC基因和来源于Arabidopsis thaliana的Atcomt基因，并携带了高拷贝质粒pETark，具有良好的阿魏酸合成能力，可以葡萄糖为碳源，采用发酵法高效稳定的从头合成阿魏酸，无需添加酪氨酸底物，无需添加额外的甲基供体，对自身合成的甲基利用率高，生产成本低，菌株稳定性高，无有毒代谢副产物生成，具有很高的经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及发酵工程技术生产领域，尤其是一种阿魏酸生产菌株及其构建方法与应用。
背景技术
阿魏酸（Ferulic acid)，是一种天然的甲基化酚酸，在麦麸、米糠等谷物类食品原料中含量较多。由于对自由基有着显著的抗氧化活性，阿魏酸常被用作紫外线诱导的皮肤损伤等的预防剂，同时，阿魏酸还具有降血脂、抗菌消炎、防癌等作用，因此，被广泛应用于医药、食品、日化等各个领域，有着巨大的发展潜力。
目前，生物提取法---碱水解提取谷物麸皮是生产阿魏酸的主要途径，然而，生物提取法有着生长周期长、阿魏酸收益率低、受环境影响大以及提取成本高等缺点；化学合成法可以提供比植物提取法更高的产量，但这一过程会产生污染，且还存在着能耗高、产率低、副产物多等问题。微生物方法为植物提取法和化学合成法提供了一种有前途的替代方法，微生物发酵法是以葡萄糖作为微生物生长的能量来源，微生物从头合成对香豆酸，无需添加底物，减少了生产成本，发酵过程条件温和，具有工业化生产的潜力。
生物体中阿魏酸有两条不同的生物合成途径。其中一条途径是由苯丙氨酸解氨酶催化苯丙氨酸脱氨基生成肉桂酸，再经肉桂酸4-羟化酶催化肉桂酸生成对香豆酸，然后在4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶作用下生成咖啡酸，最后在3-O-甲基转移酶的作用下生成阿魏酸。另一条途径是以酪氨酸为底物，经过连续的脱氨和羟基化修饰生成咖啡酸，再经3-O甲基转移酶的作用下生成阿魏酸。该合成途径具有反应路径短、催化效率高等优点，因此通常采用这条路径在微生物中合成阿魏酸。
然而目前，以酪氨酸为底物在微生物中合成阿魏酸的过程受到甲基供给不足等问题的影响，产量并不理想。咖啡酸是阿魏酸的前体物，但大肠杆菌本身无法合成阿魏酸，因此，基于咖啡酸生产菌株HY06（中国专利申请文件CN202410275934.X中所述菌株HY06）研发一种高甲基利用效率的阿魏酸基因工程菌具有重要的生产实践价值。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种阿魏酸生产菌株。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述阿魏酸生产菌株的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述阿魏酸生产菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种质粒，为质粒pETark，所述质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示。
优选的，上述质粒，异源表达了来源于Rhodotorulaglutinis的RgTal基因、来源于Klebsiella pneumoniae的KpHpaBC基因和来源于Arabidopsis thaliana的Atcomt基因。
优选的，上述质粒，携带复制起始位点、卡那霉素抗性基因、T7启动子、终止子等质粒元件，同时携带了来源于Rhodotorulaglutinis的RgTal基因、来源于Klebsiellapneumoniae的KpHpaBC基因和来源于Arabidopsis thaliana的Atcomt基因，均选用T7启动子强化转录。
优选的，上述质粒的构建方法，具体步骤如下：
（1）选用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的ClonExpress®快速克隆技术进行过表达质粒的构建：选取克隆位点，利用反向PCR技术扩增得到pET28a线性载体，利用ClonExpress®重组酶将pET28a线性载体与克隆片段T7-RgTal连接得到新的质粒pET-1;
（2）选用相同质粒构建方法将T7启动子启动表达的KpHpaBC基因构建到质粒pET-1中表达得到pET-2；
（3）选用相同质粒构建方法将T7启动子启动表达的Atcomt基因构建到质粒pET-2中表达得到pETark。
一种阿魏酸生产菌株，为菌株S.YR09，缺失了metJ基因，上调了metE、metK、luxS、mtn基因，异源表达了来源于Rhodotorulaglutinis的RgTal基因、来源于Klebsiellapneumoniae的KpHpaBC基因和来源于Arabidopsis thaliana的Atcomt基因，所述生产菌携带了高拷贝质粒pETark。
优选的，上述阿魏酸生产菌株，以咖啡酸工程菌HY06作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的metJ基因；利用trc启动子强化了metE基因转录，并整合到基因组yghE基因位点；利用trc启动子强化了metK基因转录强度，并整合到基因组yjgX基因位点；利用trc启动子强化了luxS基因转录，并整合到基因组yjiV基因位点；利用trc启动子强化了mtn基因转录强度，并整合到基因组yjiP基因位点；利用T7启动子强化了来源于Rhodotorulaglutinis的RgTal基因转录，并整合到基因组yedS基因位点；利用trc启动子强化了Klebsiellapneumoniae的KpHpaBC基因转录，并整合到基因组yncI基因位点；利用T7启动子强化了Arabidopsis thaliana的Atcomt基因转录，并整合到基因组ybfL基因位点。
优选的，上述阿魏酸生产菌株，所述trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示，T7启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，metJ基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，metE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，metK基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，luxS基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，mtn基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，RgTal基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO.8所示，KpHpaBC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，Atcomt基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示，pETark质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示。
上述阿魏酸生产菌株的构建方法，主要分为如下4个模块：
（1）底盘菌改造：敲除蛋氨酸调节因子metJ基因，上调了metE、metK、luxS、mtn基因的转录水平，引入来源于Rhodotorulaglutinis的酪氨酸解氨酶RgTal基因，引入来源于Klebsiella pneumoniae的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶KpHpaBC基因，引入来源于Arabidopsis thaliana的3-O-甲基转移酶Atcomt基因；
（2）优化甲基供给系统：敲除了metJ基因提高了SAM循环中酶的活性和前体物供应，提高了SAM循环中关键酶metE、metK、luxS、mtn基因的转录水平，提供了充足的甲基供体，提高了SAM的供应水平；
（3）pETark质粒系统：pETark质粒携带复制起始位点、卡那霉素抗性基因、T7启动子、终止子等质粒元件，同时携带了来源于Rhodotorulaglutinis的RgTal基因、来源于Klebsiella pneumoniae的KpHpaBC基因和来源于Arabidopsis thaliana的Atcomt基因，均选用T7启动子强化转录；
（4）引入酪氨酸合成阿魏酸的外源途径：RgTal基因所转录翻译的酪氨酸解氨酶、KpHpaBC基因所转录翻译的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶以及Atcomt基因所转录翻译的3-O-甲基转移酶作为酪氨酸合成阿魏酸的关键酶，选用pETark质粒作为工具质粒过表达RgTal基因、KpHpaBC基因以及Atcomt基因。
上述阿魏酸生产菌株在发酵生产阿魏酸方面的应用。
优选的，上述阿魏酸生产菌株的应用，在适宜发酵条件下以所述阿魏酸生产菌株在培养基中发酵得到阿魏酸，培养基可以包括但不限于：碳源、氮源、无机盐、维生素等；发酵条件包括发酵温度、发酵pH、发酵溶氧条件、发酵压力、发酵时间等。所述培养基均可通过常规方法获得并用于阿魏酸生产，发酵条件可以调整以期适应菌株生产特性。
优选的，上述阿魏酸生产菌株的应用，具体步骤如下：
①斜面培养：菌种接种在带有卡那霉素的斜面培养基上，32℃培养12-16h，固体斜面培养基选用通用LB培养基；
②种子培养：以灭菌过后的蒸馏水将斜面上活化后的菌体洗脱并转移到5 L机械搅拌式发酵罐中开始种子培养，同时加入0.1%的卡那霉素溶液（即2 L培养基中加入2 mL浓度为50g/L的卡那霉素母液），使用5 L机械搅拌式发酵罐，培养温度为34℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在6.4±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为40%，当OD600nm为18时达到接种要求；
③发酵培养：使用机械搅拌式发酵罐，发酵接种量为20%，加入0.1%的卡那霉素母液（即2 L培养基中加入2 mL浓度为50g/L的卡那霉素母液）和0.1%的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）母液（即2L培养基中加入2 mL浓度为24g/L的IPTG母液），培养温度为34℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在6.4±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，通过流加80%（质量体积分数）葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5g/L，发酵周期为50h。
优选的，上述阿魏酸生产菌株的应用，采用的种子培养基为：葡萄糖20-30g/L，酵母粉4-5g/L，蛋白胨2-3g/L，MgSO4·7H2O 0.5-1g/L，KH2PO41.5-2g/L，硫酸铵1-1.2g/L，生物素0.3-0.5mg/L，谷氨酸2-3g/L，蛋氨酸（甲硫氨酸）0.2-0.3g/L，柠檬酸2-3g/L，其余为水。
优选的，上述阿魏酸生产菌株的应用，采用的发酵培养基为：葡萄糖10-15g/L，酵母粉4-5g/L，蛋白胨1.5-2g/L，MgSO4·7H2O 1.5-2g/L，KH2PO42-3g/L，硫酸铵1.2-1.5g/L，生物素0.2-0.3mg/L，谷氨酸2-3g/L，蛋氨酸（甲硫氨酸）0.8-1g/L，柠檬酸2-3g/L，FeSO4·7H2O 15-20mg/L，MnSO4·H2O 8-10mg/L，核黄素10mg/L，其余为水。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
优选的，上述阿魏酸生产菌株的应用，在进行发酵培养时，随糖液流加PLP（磷酸吡哆醛）、氯化胆碱、甜菜碱以及核黄素，具体为：每升80%(质量体积分数）葡萄糖溶液中添加6mgPLP、1.5g氯化胆碱、1g甜菜碱以及20mg核黄素（即PLP 6mg/L糖液，氯化胆碱1.5g/L糖液，甜菜碱1g/L糖液，核黄素20mg/L糖液）。
有益效果：
上述阿魏酸生产菌株，缺失了metJ基因，上调了metE、metK、luxS、mtn基因，异源表达了来源于Rhodotorulaglutinis的RgTal基因、来源于Klebsiella pneumoniae的KpHpaBC基因和来源于Arabidopsis thaliana的Atcomt基因，并携带了高拷贝质粒pETark，具有良好的阿魏酸合成能力，可以葡萄糖为碳源，采用发酵法高效稳定的从头合成阿魏酸，无需添加酪氨酸底物，无需添加额外的甲基供体，对自身合成的甲基利用率高，生产成本低，菌株稳定性高，无有毒代谢副产物生成，具有很高的经济效益，有着优秀的工业应用前景。具体来讲：
（1）通过敲除蛋氨酸调节因子metJ基因，上调了SAM循环中蛋氨酸合酶metE基因、蛋氨酸腺苷转移酶metK基因、S-核糖基半胱氨酸裂解酶luxS基因以及腺苷同型半胱氨酸核苷酶mtn基因的转录水平，提供了充足的甲基供体，提高了甲基化反应水平。
（2）引入来源于Rhodotorulaglutinis的酪氨酸解氨酶RgTal基因，引入来源于Klebsiella pneumoniae的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶KpHpaBC基因，引入来源于Arabidopsis thaliana的3-O-甲基转移酶Atcomt基因，并使用pETark质粒，通过使用构建在质粒上的T7启动子过表达来源于Rhodotorulaglutinis的酪氨酸解氨酶RgTal基因与来源于Klebsiella pneumoniae的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶KpHpaBC基因，使用质粒自带的T7启动子过表达来源于Arabidopsis thaliana的3-O-甲基转移酶Atcomt基因，引入了咖啡酸生成阿魏酸的生物合成途径，使得大肠杆菌可从头直接合成阿魏酸，并且大大提高了酪氨酸合成阿魏酸途径中关键酶的转录水平，同时，由于需要添加卡那霉素，减少了实际生产中染菌的可能。
（3）酪氨酸解氨酶的解氨能力限制了酪氨酸转化为咖啡酸的能力，咖啡酸作为阿魏酸的前体物，因此，分别在ycdN假基因位点使用trc启动子过表达RgTal基因，在ycgH、yedS假基因位点使用T7启动子过表达RgTal基因，并在高拷贝质粒pETark使用T7启动子过表达RgTal基因，大大提高了酪氨酸解氨酶RgTal基因的转录水平，一个trc启动子、两个T7启动子和构建在pETark质粒上的T7启动子作为最直接、最有效以及最优的过表达酪氨酸解氨酶的启动子组合，提高了酪氨酸转化为咖啡酸的能力，为阿魏酸的合成提供了充足的前体物质。
（4）在甲基供体充足、前体物咖啡酸充足的情况下，3-O-甲基转移酶限制了咖啡酸转化为阿魏酸的能力，作为整个反应的关键酶，选择在ybfL假基因位点使用T7启动子过表达Atcomt基因，并在高拷贝质粒pETark使用质粒自带的T7启动子过表达Atcomt基因，一个T7启动子和pETark自带的T7启动子作为最直接、最有效以及最优的过表达3-O-甲基转移酶的启动子组合，大大提高了3-O-甲基转移酶Atcomt基因的转录水平，提高了咖啡酸转化为阿魏酸的能力。
附图说明
图1为质粒pETark结构示意图。
图2为阿魏酸生产菌株从头合成途径基因改造过程图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
实施例中涉及到的卡那霉素母液浓度为50g/L，卡那霉素抗性工作浓度为50mg/L；IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）母液浓度为0.1mol/L，即24g/L，工作浓度为0.1mmol/L，即24mg/L。
实施例中所用的出发菌株为咖啡酸生产菌株HY06，为中国专利申请文件CN202410275934.X（公开号：CN117866867A，公开日：2024-04-12）实施例7中所述菌株HY06，相应启动子和基因等见序列表，涉及到的菌株构建过程中用到的引物见表1。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
| 引物名称 | 序列号 | 引物序列（5’-3’） |
| metJ-U-S | SEQ ID NO.12 | CCGGTAAAGTTATAGGTGCTGG |
| metJ-U-A | SEQ ID NO.13 | TTCATCGGTGAGGTATTCGCCGCTCCATTCAGC |
| metJ-D-S | SEQ ID NO.14 | GCGGCGAATACCTCACCGATGAACGCACG |
| metJ-D-A | SEQ ID NO.15 | GCTGAGGATCAGCAGCCTG |
| pGRB-metJ-s | SEQ ID NO.16 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTGAACAAGTCAAAAAGATTAGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-metJ-a | SEQ ID NO.17 | TTCTAGCTCTAAAACTAATCTTTTTGACTTGTTCAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yghE-U-S | SEQ ID NO.18 | GTCAGGCACTGGCGAAAGAT |
| yghE-U-A | SEQ ID NO.19 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACGCAAGCCATAAACCCACA |
| yghE-D-S | SEQ ID NO.20 | CTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATTTCCGACATCGAAATGCGT |
| yghE-D-A | SEQ ID NO.21 | AGGCGTTGTTGTGGCAGATT |
| metE-S | SEQ ID NO.22 | GTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGACAATATTGAATCACACCCTCGG |
| metE-A | SEQ ID NO.23 | CAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACCCCCGACGCAAGTTCTG |
| pGRB-yghE-s | SEQ ID NO.24 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGCTGAAAAAATATCGCCCACGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-yghE-a | SEQ ID NO.25 | TTCTAGCTCTAAAACGTGGGCGATATTTTTTCAGCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yjgX-U-S | SEQ ID NO.26 | GGAAGTCAACGGGTTATGCGG |
| yjgX-U-A | SEQ ID NO.27 | CCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAAAAATCACCACGAATACCAGAATCG |
| yjgX-D-S | SEQ ID NO.28 | CCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATACAGTGTCTTCCCTGAGCCG |
| yjgX-D-A | SEQ ID NO.29 | GGCGAAGGATACCATCAAGCTG |
| metK-S | SEQ ID NO.30 | GTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGCAAAACACCTTTTTACGTCC |
| metK-A | SEQ ID NO.31 | CAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACTTCAGACCGGCAGCATC |
| pGRB-yjgX-s | SEQ ID NO.32 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTCGCGACCACCGTAACTGGCGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-yjgX-a | SEQ ID NO.33 | TTCTAGCTCTAAAACGCCAGTTACGGTGGTCGCGAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yjiV-U-S | SEQ ID NO.34 | TGTGACTGTGGAAGCCCTGT |
| yjiV-U-A | SEQ ID NO.35 | GTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAATTCGGGCTGTCCCTTGTC |
| yjiV-D-S | SEQ ID NO.36 | GGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGTGGCACCTGAATGACGAAC |
| yjiV-D-A | SEQ ID NO.37 | TACGCTTAATGCAGCAACAGTGGTT |
| luxS-S | SEQ ID NO.38 | TAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCCGTTGTTAGATAGCTTCACA |
| luxS-A | SEQ ID NO.39 | CAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGCTAGATGTGCAGTTCCTGCAACT |
| pGRB-yjiV-s | SEQ ID NO.40 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGCGTAGTCGAAATTCTCAGCGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-yjiV-a | SEQ ID NO.41 | TTCTAGCTCTAAAACGCTGAGAATTTCGACTACGCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yjiP-U-S | SEQ ID NO.42 | GCCATACCGCCAGCAAGATAG |
| yjiP-U-A | SEQ ID NO.43 | GTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGCAGATATTCCCCTTTCCACCG |
| yjiP-D-S | SEQ ID NO.44 | GGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGACGGATGACAAACGCAAAGC |
| yjiP-D-A | SEQ ID NO.45 | AAAGGCGGATTTTTACTGTGGA |
| mtn-S | SEQ ID NO.46 | GTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAAAATCGGCATCATTGGTGC |
| mtn-A | SEQ ID NO.47 | CAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAGCCATGTGCAAGTTTCTGCAC |
| pGRB-yjiP-s | SEQ ID NO.48 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTCTTTGTCGATGAAAAATTGCGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-yjiP-a | SEQ ID NO.49 | TTCTAGCTCTAAAACGCAATTTTTCATCGACAAAGACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yedS-U-S | SEQ ID NO.50 | CATTGATACCCCCTATGTTTCCGC |
| yedS-U-A | SEQ ID NO.51 | CTTAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGACCCTATAGTGAGTCGTATTACTTTGAAACCGATACGGGCATATG |
| yedS-D-S | SEQ ID NO.52 | CTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGTGCGACCTACTACTTCAACAAAAAC |
| yedS-D-A | SEQ ID NO.53 | CAAGTGGCTTCAATGATTTTAGACC |
| RgTal-S | SEQ ID NO.54 | CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCGCCGCGCCCGACGAG |
| RgTal-A | SEQ ID NO.55 | CAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTAGGCTAACATTTTCAGCAGCACG |
| pGRB-yedS-s | SEQ ID NO.56 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGATATGCTGCCAGAATTTGGGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-yedS-a | SEQ ID NO.57 | TTCTAGCTCTAAAACCCAAATTCTGGCAGCATATCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yncI-U-S | SEQ ID NO.58 | GGGCAACTCTTCGGGTTAGATG |
| yncI-U-A | SEQ ID NO.59 | CTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAATGTAGGCGTTAAAGCAAAGATG |
| yncI-D-S | SEQ ID NO.60 | CTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATTTGGGTGTTAGATGTAAAAATGAATG |
| yncI-D-A | SEQ ID NO.61 | GCAATGACGTCTTTATCATCTGAAG |
| KpHpaBC-S | SEQ ID NO.62 | TATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAAACCGGAAGATTTTCGCG |
| KpHpaBC-A | SEQ ID NO.63 | CAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACACCGCCACTTCCATTTCC |
| pGRB-yncI-s | SEQ ID NO.64 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTTACAGGACGCACTGTGGAGGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-yncI-a | SEQ ID NO.65 | TTCTAGCTCTAAAACCTCCACAGTGCGTCCTGTAAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| ybfL-U-S | SEQ ID NO.66 | GTATCCCAGGGAAAGATCACGT |
| ybfL-U-A | SEQ ID NO.67 | GTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAATGGCAATCACGCATCCAGT |
| ybfL-D-S | SEQ ID NO.68 | GGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATATGATAAGGTATTCAAGGCAGGG |
| ybfL-D-A | SEQ ID NO.69 | TCATCTGAAGAATGGTAGTCAAGCA |
| Atcomt-S | SEQ ID NO.70 | GTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGGCAGCACCGCGGAAA |
| Atcomt-A | SEQ ID NO.71 | GATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACAGTTTTTTCAGCAGTTCAATCAGG |
| pGRB-ybfL-s | SEQ ID NO.72 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGATTTCACGTTTGAATGGAAGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-ybfL-a | SEQ ID NO.73 | TTCTAGCTCTAAAACTTCCATTCAAACGTGAAATCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| RgTal-pet-S | SEQ ID NO.74 | CTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGGCGCCGCGCCCGACGAG |
| RgTal-pet-A | SEQ ID NO.75 | CAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTAGGCTAACATTTTCAGCAGCACG |
| KpHpaBC-pet-S | SEQ ID NO.76 | CACTATAGGGTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGAAACCGGAAGATTTTCGCG |
| KpHpaBC-pet-A | SEQ ID NO.77 | CTCAAGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTACACCGCCACTTCCATTTCC |
| Atcomt-pet-S | SEQ ID NO.78 | CTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGGGCAGCACCGCGGAAA |
| Atcomt-pet-A | SEQ ID NO.79 | TCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGCTTTTACAGTTTTTTCAGCAGTTCAATCAGG |
如图2所示，阿魏酸生产菌株S.YR09的构建主要包括如下4个模块：
(1)底盘菌改造：以咖啡酸工程菌HY06为出发菌株，敲除蛋氨酸调节因子metJ基因；上调了metE、metK、luxS、mtn基因的转录水平，引入来源于Rhodotorulaglutinis的酪氨酸解氨酶RgTal基因，引入来源于Klebsiella pneumoniae的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶KpHpaBC基因，引入来源于Arabidopsis thaliana的3-O-甲基转移酶Atcomt基因。
（2）优化甲基供给系统：敲除了metJ基因加强了SAM循环，提高metE、metK、luxS、mtn基因的转录水平，提供了充足的甲基供体，提高了SAM的供应水平。
（3）pETark质粒系统：pETark质粒携带复制起始位点、卡那霉素抗性基因、T7启动子、终止子等质粒元件，同时携带了来源于Rhodotorulaglutinis的RgTal基因、来源于Klebsiella pneumoniae的KpHpaBC基因和来源于Arabidopsis thaliana的Atcomt基因，均选用T7启动子强化转录。
（4）引入酪氨酸合成阿魏酸的外源途径：RgTal基因所转录翻译的酪氨酸解氨酶、KpHpaBC基因所转录翻译的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶以及Atcomt基因所转录翻译的3-O-甲基转移酶作为酪氨酸合成阿魏酸的关键酶，选用pETark质粒作为工具质粒过表达RgTal基因、KpHpaBC基因以及Atcomt基因。
上述基因操作采用的基因编辑方法参照文献（Li Y，Lin Z，Huang C，et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genomeediting. Metabolic Engineering，2015，31：13-21.），本发明涉及到的专业名词，若无特别备注，均可在该文章中得到解释。本发明所指的“敲除”是指将目的基因失活，“引入”是指将外源基因与启动子、终止子连接后插入到工程菌基因组中。
实施例1
本实施例旨在说明菌株S.YR09的具体构建步骤。特别的，实施例中若有同类型基因操作方法，则仅提供1次，并做注释，不再多加赘述。
①敲除metJ基因：以E.coliW3110基因组为模板，分别以metJ-U-S、metJ-U-A和metJ-D-S、metJ-D-A，通过pcr扩增得到上、下游同源臂，接着，以上下游同源臂为模板，以metJ-U-S、metJ-D-A为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以pGRB-metJ-s、pGRB-metJ-a为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到metJ-pGRB；制备咖啡酸工程菌电转化感受态细胞，将重叠片段与metJ-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株S.YR01。
②在yghE假基因位点引入metE基因并过表达：以大肠杆菌W3110基因组为模板，分别以yghE-U-S、yghE-U-A和yghE-D-S、yghE-D-A，通过pcr扩增得到上、下游同源臂，以E.coliW3110基因组为模板，以metE-S、metE-A为引物，通过pcr扩增得到目的基因片段；接着，以上下游同源臂、目的基因片段为模板，以yghE-U-S、yghE-D-A为引物，通过重叠pcr扩增得到重叠片段；以pGRB-yghE-s、pGRB-yghE-a为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到yghE-pGRB；制备S.YR01电转化感受态细胞，将目的片段与yghE-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株S.YR02。
③在yjgX假基因位点引入metK基因并过表达：具有②中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为yjgX-U-S、yjgX-U-A、yjgX-D-S、yjgX-D-A、pGRB-yjgX-s、pGRB-yjgX-a、metK-S、metK-A。感受态细胞为S.YR02，获得菌株S.YR03。
④在yjiV假基因位点引入luxS基因并过表达：具有②中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为yjiV-U-S、yjiV-U-A、yjiV-D-S、yjiV-D-A、pGRB-yjiV-s、pGRB-yjiV-a、luxS-S、luxS-A。感受态细胞为S.YR03，获得菌株S.YR04。
⑤在yjiP假基因位点引入mtn基因并过表达：具有②中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为yjiP-U-S、yjiP-U-A、yjiP-D-S、yjiP-D-A、pGRB-yjiP-s、pGRB-yjiP-a、mtn-S、mtn-A。感受态细胞为S.YR04，获得菌株S.YR05。
⑥在yedS假基因位点引入RgTal基因并过表达：具有②中相同操作方法，不同之处在于，使用Rhodotorulaglutinis基因组获得目的基因片段，所用引物为yedS-U-S、yedS-U-A、yedS-D-S、yedS-D-A、pGRB-yedS-s、pGRB-yedS-a、RgTal-S、RgTal-A。感受态细胞为S.YR05，获得菌株S.YR06。
⑦在yncI假基因位点引入KpHpaBC基因并过表达：具有②中相同操作方法，不同之处在于，使用Klebsiella pneumoniae基因组获得目的基因片段，所用引物为yncI-U-S、yncI-U-A、yncI-D-S、yncI-D-A、pGRB-yncI-s、pGRB-yncI-a、KpHpaBC-S、KpHpaBC-A。感受态细胞为S.YR06，获得菌株S.YR07。
⑧在ybfL假基因位点引入Atcomt基因并过表达：具有②中相同操作方法，不同之处在于，使用Arabidopsis thaliana基因组获得目的基因片段，所用引物为ybfL-U-S、ybfL-U-A、ybfL-D-S、ybfL-D-A、pGRB-ybfL-s、pGRB-ybfL-a、Atcomt-S、Atcomt-A。感受态细胞为S.YR07，获得菌株S.YR08。
⑨转化pETark质粒得到工程菌S.YR09：将完整质粒pETark转化进入S.YR08感受态细胞的，转化方法为电转化（也可以采用化学转化等方法）得到工程菌S.YR09。
实施例2
本实施例旨在说明质粒pETark的构建方法，具体步骤如下：
分别以Rhodotorula glutinis基因组为模板，以RgTal-pet-S、RgTal-pet-A为引物，扩增得到RgTal基因；以Klebsiella pneumoniae基因组为模板，以KpHpaBC-pet-S、KpHpaBC-pet-A为引物，扩增得到KpHpaBC基因；以Arabidopsis thaliana基因组为模板，以Atcomt-pet-S、Atcomt-pet-A为引物，扩增得到Atcomt基因片段。
将基因片段与质粒线性化载体通过ClonExpress®重组酶（也可以是其他任意重组酶）连接，即可得到完整质粒，完整质粒如图1所示。本实施例中选用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的ClonExpress®快速克隆技术进行过表达质粒的构建。
实施例3
本实施例旨在说明工程菌S.YR09在5L机械搅拌式发酵罐中的发酵应用，具体步骤为：
①斜面培养：菌种接种在带有卡那霉素的斜面培养基上，32℃培养12-16h，固体斜面培养基选用通用LB培养基（0.5%的酵母粉、1%的蛋白胨、1%的氯化钠、2%酵母粉）。
②种子培养：以灭菌过后的蒸馏水将斜面上活化后的菌体洗脱并转移到5 L机械搅拌式发酵罐中开始种子培养，同时加入0.1%的卡那霉素母液（即2 L培养基中加入2 mL卡那霉素母液），使用5 L机械搅拌式发酵罐，培养温度为34℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在6.4±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为40%，当OD600nm为18时达到接种要求；采用的种子培养基为：葡萄糖30g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨3g/L，MgSO4·7H2O1g/L，KH2PO42g/L，硫酸铵1.2g/L，生物素0.5mg/L，谷氨酸3g/L，蛋氨酸（甲硫氨酸）0.3g/L，柠檬酸3g/L，其余为水。
③发酵培养：使用5 L机械搅拌式发酵罐，发酵接种量为20%，加入0.1%的卡那霉素母液（即2 L培养基中加入2 mL卡那霉素母液）和0.1%的IPTG（异丙基-β-D-硫代半乳糖苷）母液（即2L培养基中加入2 mL IPTG母液），培养温度为34℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在6.4±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，通过流加80%（质量体积分数）葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5g/L，发酵周期为50h；采用的发酵培养基为：葡萄糖15g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，KH2PO43g/L，硫酸铵1.5g/L，生物素0.3mg/L，谷氨酸3g/L，蛋氨酸（甲硫氨酸）1g/L，柠檬酸3g/L，FeSO4·7H2O20mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，核黄素10mg/L，其余为水。
在进行发酵培养时，随糖液流加PLP（磷酸吡哆醛）、氯化胆碱、甜菜碱以及核黄素，具体为：每升80%(质量体积分数）葡萄糖溶液中，添加6mgPLP、1.5g氯化胆碱、1g甜菜碱以及20mg核黄素，即PLP 6mg/L糖液，氯化胆碱1.5g/L糖液，甜菜碱1g/L糖液，核黄素20mg/L糖液。
实验以野生型E.coliW3110为对照组，经过50h发酵验证，野生型E.coli W3110未能生产阿魏酸，工程菌S.YR09积累了13.6g/L阿魏酸，是目前报道中阿魏酸最高产量，也证明了本发明所述菌株的有效性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种阿魏酸生产菌株，其特征在于：以CN202410275934.X实施例7中所述菌株HY06作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的metJ基因；利用trc启动子强化了metE基因转录，并整合到基因组yghE基因位点；利用trc启动子强化了metK基因转录强度，并整合到基因组yjgX基因位点；利用trc启动子强化了luxS基因转录，并整合到基因组yjiV基因位点；利用trc启动子强化了mtn基因转录强度，并整合到基因组yjiP基因位点；利用T7启动子强化了来源于Rhodotorulaglutinis的RgTal基因转录，并整合到基因组yedS基因位点；利用trc启动子强化了Klebsiella pneumoniae的KpHpaBC基因转录，并整合到基因组yncI基因位点；利用T7启动子强化了Arabidopsis thaliana的Atcomt基因转录，并整合到基因组ybfL基因位点，所述生产菌携带了质粒pETark，所述质粒pETark的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示。
2.根据权利要求1所述的阿魏酸生产菌株，其特征在于：所述trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，T7启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，metJ基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，metE基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，metK基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，luxS基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，mtn基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，RgTal基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.8所示，KpHpaBC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，Atcomt基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示。
3.权利要求1或2所述阿魏酸生产菌株的构建方法，其特征在于：主要分为如下4个模块：
（1）底盘菌改造：敲除蛋氨酸调节因子metJ基因，上调了metE、metK、luxS、mtn基因的转录水平，引入来源于Rhodotorulaglutinis的酪氨酸解氨酶RgTal基因，引入来源于Klebsiella pneumoniae的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶KpHpaBC基因，引入来源于Arabidopsis thaliana的3-O-甲基转移酶Atcomt基因；
（2）优化甲基供给系统：敲除了metJ基因提高了SAM循环中酶的活性和前体物供应，提高了SAM循环中关键酶metE、metK、luxS、mtn基因的转录水平，提供了充足的甲基供体，提高了SAM的供应水平；
（3）pETark质粒系统：pETark质粒携带复制起始位点、卡那霉素抗性基因、T7启动子、终止子等质粒元件，同时携带了来源于Rhodotorulaglutinis的RgTal基因、来源于Klebsiella pneumoniae的KpHpaBC基因和来源于Arabidopsis thaliana的Atcomt基因，均选用T7启动子强化转录；
（4）引入酪氨酸合成阿魏酸的外源途径：RgTal基因所转录翻译的酪氨酸解氨酶、KpHpaBC基因所转录翻译的4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶以及Atcomt基因所转录翻译的3-O-甲基转移酶作为酪氨酸合成阿魏酸的关键酶，选用pETark质粒作为工具质粒过表达RgTal基因、KpHpaBC基因以及Atcomt基因。
4.权利要求1或2所述阿魏酸生产菌株在发酵生产阿魏酸方面的应用。
5.根据权利要求4所述的阿魏酸生产菌株的应用，其特征在于：具体步骤如下：
①斜面培养：菌种接种在带有卡那霉素的斜面培养基上，32℃培养12-16h，固体斜面培养基为LB培养基；
②种子培养：以灭菌过后的蒸馏水将斜面上活化后的菌体洗脱并转移到机械搅拌式发酵罐中开始种子培养，同时加入0.1%的卡那霉素溶液，使用机械搅拌式发酵罐，培养温度为34℃，通过自动流加氨水溶液维持培养pH在6.4±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为40%，当OD600nm为18时达到接种要求；
③发酵培养：使用机械搅拌式发酵罐，发酵接种量为20%，加入0.1%的卡那霉素母液和0.1%的IPTG母液，培养温度为34℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在6.4±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，通过流加葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5g/L，发酵周期为50h。
6.根据权利要求5所述的阿魏酸生产菌株的应用，其特征在于：采用的种子培养基为：葡萄糖20-30g/L，酵母粉4-5g/L，蛋白胨2-3g/L，MgSO4·7H2O 0.5-1g/L，KH2PO41.5-2g/L，硫酸铵1-1.2g/L，生物素0.3-0.5mg/L，谷氨酸2-3g/L，蛋氨酸0.2-0.3g/L，柠檬酸2-3g/L，其余为水。
7.根据权利要求5所述的阿魏酸生产菌株的应用，其特征在于：采用的发酵培养基为：葡萄糖10-15g/L，酵母粉4-5g/L，蛋白胨1.5-2g/L，MgSO4·7H2O 1.5-2g/L，KH2PO42-3g/L，硫酸铵1.2-1.5g/L，生物素0.2-0.3mg/L，谷氨酸2-3g/L，蛋氨酸0.8-1g/L，柠檬酸2-3g/L，FeSO4·7H2O 15-20mg/L，MnSO4·H2O 8-10mg/L，核黄素10mg/L，其余为水。
8.根据权利要求5所述的阿魏酸生产菌株的应用，其特征在于：在进行发酵培养时，随糖液流加PLP、氯化胆碱、甜菜碱以及核黄素，具体为：每升80%葡萄糖溶液中添加6mgPLP、1.5g氯化胆碱、1g甜菜碱以及20mg核黄素。
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