CN118086346B - 一种羟基酪醇生产菌株及其构建方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种羟基酪醇生产菌株及其构建方法与应用，所述菌株缺失了tyrR、tyrB、 feaB基因，引入了T7 RNAP基因，上调了aroG fbr 、 tyrA fbr 、talB基因，所述生产菌携带了质粒pET‑HT‑1，所述质粒异源表达了来源于Saccharomyes cerevisiae SCY4741的ARO10 D331V 和ADH6基因，以及来源于Klebsiella pneumoniae的hpaBC基因；随后对其发酵过程中的VB1添加量进行优化，以维持苯丙酮酸脱羧酶的辅酶供应，提高了羟基酪醇合成效率。所述菌株HT‑8能够高效利用葡萄糖从头合成羟基酪醇，为该产物的工业化规模生产奠定了坚实基础。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程与发酵工程技术领域，尤其是一种羟基酪醇生产菌株及其构建方法与应用。
背景技术
羟基酪醇主要存在于橄榄植物，具有抗癌和抗氧化作用。现阶段羟基酪醇的生产方式为天然提取法和化学合成法。其中天然提取法的效率低，工艺繁琐，对环境污染大；化学合成法需要昂贵的催化剂，价格昂贵，条件严格。微生物发酵法因其具有生产原料安全、成本低廉、过程简单、易于工业化等优势，成为代替目前生产方法的首选，酵母菌、谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌等菌种常作为此方法的底盘细胞发酵工业产物。其中大肠杆菌因其遗传背景清晰、基因编辑方法完善，易于培养等优点，成为微生物直接发酵法生产乳清酸的最好选择。然而，大肠杆菌体内的羟基酪醇的代谢途径冗长，关键酶的表达效果弱且碳损严重，不利于羟基酪醇的合成积累。因此，探究高效的羟基酪醇生产菌株及羟基酪醇合成途径是现阶段亟待解决的技术问题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于提供一种羟基酪醇生产菌株。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述羟基酪醇生产菌株的构建方法。
本发明所要解决的另一技术问题在于提供上述羟基酪醇生产菌株的应用。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种质粒，为质粒pET-HT-1，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示。
优选的，上述质粒，以PET28a(+)质粒基因组为模板，携带复制起始位点、卡那霉素抗性、T7启动子、核糖体结合位点和终止子等质粒元件，敲除了阻遏蛋白基因lacI，同时携带了来源于Saccharomyes cerevisiaeSCY4741的ARO10 D331V 和ADH6基因，以及来源于Klebsiella pneumoniae的hpaBC基因，基因均选用T7启动子强化转录。
优选的，上述质粒，苯丙酮酸脱羧酶基因ARO10 D331V 基因的核苷酸序列如序列表SEQID NO.8所示，乙醇脱氢酶基因ADH6基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，4-羟基苯乙酸-3-单加氧酶基因hpaBC的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示， T7启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示，终止子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.14所示，PET28a(+)质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示。
一种羟基酪醇生产菌株，为菌株HT-8，缺失了tyrR、tyrB、feaB基因，引入了T7 RNAP基因，上调了aroG fbr 、tyrA fbr 、talB基因，所述生产菌携带了上述质粒pET-HT-1，所述质粒异源表达了来源于Saccharomyes cerevisiaeSCY4741的ARO10 D331V 和ADH6基因，以及来源于Klebsiella pneumoniae的hpaBC基因。
优选的，上述羟基酪醇生产菌株，以E.coliW3110作为底盘菌株，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除了菌株基因组上的转录调控因子基因tyrR、芳香族氨基酸转氨酶基因tyrB、苯乙醛脱氢酶基因feaB；利用xylF启动子强化T7 RNA聚合酶基因T7 RNAP转录，并整合到基因组ycdN基因位点；利用trc启动子强化DAHP合成酶基因aroG fbr 转录强度，并整合到基因组yeeL基因位点；利用trc启动子强化预苯酸脱氢酶基因tyrA fbr 转录强度，并整合到基因组yeeP基因位点；利用trc启动子强化转醛缩酶基因talB转录强度，并整合到基因组yjiP基因位点。
优选的，上述羟基酪醇生产菌株，所述E.coli W3110作为出发菌株为E.coli W3110 ATCC 27325。
优选的，上述羟基酪醇生产菌株，所述转录调控因子基因tyrR的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，芳香族氨基酸转氨酶基因tyrB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，苯乙醛脱氢酶基因feaB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，T7 RNA聚合酶基因T7 RNAP基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，DAHP合成酶基因aroG fbr 基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，预苯酸脱氢酶基因tyrA fbr 基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，转醛缩酶基因talB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.7所示，xylF启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示，trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.12所示。
上述羟基酪醇生产菌株的构建方法，在出发菌株E.coli W3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
（1）底盘菌改造：
敲除反馈抑制蛋白基因：tyrR；
敲除羟基酪醇分解途径基因：tyrB、feaB；
引入了T7 RNAP基因，上调了aroG fbr 、tyrA fbr 、talB基因；
（2）pET-HT-1质粒系统：将质粒pET-HT-1转化进入步骤（1）得到的感受态细胞。
上述步骤（2）中pET-HT-1质粒携带复制起始位点、卡那霉素抗性、T7启动子、核糖体结合位点和终止子等质粒元件，敲除了阻遏蛋白基因lacI，该质粒高效表达了来源于Saccharomyes cerevisiaeSCY4741的ARO10 D331V 和ADH6基因，以及来源于Klebsiella pneumoniae的hpaBC基因，其中，ARO10 D331V 、ADH6基因和hpaBC基因均选用T7启动子强化转录。
上述羟基酪醇生产菌株在发酵生产羟基酪醇方面的应用。
优选的，上述羟基酪醇生产菌株的应用，在培养基中进行发酵培养，培养基包括但不限于碳源、氮源、无机盐、维生素等；发酵条件包括发酵温度、发酵pH、发酵溶氧条件、发酵压力、发酵时间等。
优选的，上述羟基酪醇生产菌株的应用，使用机械搅拌式发酵罐进行培养，具体步骤如下：
①斜面培养：取羟基酪醇生产菌株接种在斜面培养基上，32℃培养12-16h，斜面培养基选用通用LB固体培养基；
②种子培养：培养温度为32-34℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在6.4±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，当OD600nm为15时达到接种要求；
③发酵培养：发酵接种量为20%，培养温度为32-34℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在6.4±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，通过流加80%葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5 g/L，当OD600为20-30时添加木糖，发酵周期为48h。
优选的，上述羟基酪醇生产菌株的应用，所述步骤②中采用的种子培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，KH2PO42g/L，硫酸铵1g/L，FeSO4.7H2O10mg/L，其余为水。
优选的，上述羟基酪醇生产菌株的应用，所述步骤③采用的发酵培养基为：MgSO4.7H2O 1g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨2g/L，硫酸铵1g/L，KH2PO43g/L，谷氨酸2g/L，甲硫氨酸0.5g/L，FeSO4.7H2O 20-30mg/L，MnSO410-15mg/L，木糖5g/L，VB11-9mg/L，其余为水。
优选的，上述羟基酪醇生产菌株的应用，所述发酵培养基中VB1的添加量为5.0mg/L。
上述培养基均可采用标准方法制备获得。
有益效果：
上述羟基酪醇生产菌株，能够高效利用葡萄糖为碳源从头合成羟基酪醇，无需添加酪氨酸、多巴胺等昂贵底物，具有良好的羟基酪醇合成能力，且生产成本低、发酵周期短、菌株性能稳定，该菌株缺失了tyrR、tyrB、feaB基因，引入了T7 RNAP基因，上调了aroG fbr 、 tyrA fbr 、talB基因，所述生产菌携带了质粒pET-HT-1，所述质粒异源表达了来源于Saccharomyes cerevisiaeSCY4741的ARO10 D331V 和ADH6基因，以及来源于Klebsiella pneumoniae的hpaBC基因，所述菌株将关键酶利用质粒系统表达，可以实现对目标基因的高水平定向表达，具有较高的羟基酪醇合成效率；发酵应用过程中对发酵过程中VB1的添加量进行优化，一方面能够保证苯丙酮酸脱羧酶的催化需求，维持苯丙酮酸脱羧酶的辅酶供应，提高羟基酪醇合成效率，另一方面能够避免高浓度VB1辅酶因子造成的资源浪费，有效提高了羟基酪醇的合成效率，具有优秀的工业应用前景。具体来说：
（1）通过敲除tyrR、tyrB、feaB基因，减少了羟基酪醇途径的分解；
（2）通过上调aroG fbr 、tyrA fbr 、talB基因，加强了羟基酪醇途径的碳通量；
（3）pET-HT-1质粒系统敲除了阻遏蛋白基因lacI，因此不需要另外添加诱导剂IPTG，在工业化生产中具有生产成本低这一明显优势；该质粒上构建了来源于Saccharomyes cerevisiae SCY4741的ARO10 D331V 、ADH6基因和来源于Klebsiellapneumoniae的hpaBC基因，借助强启动子T7来控制表达；T7启动子是受控于T7RNAP基因的启动子，高活性的T7RNAP合成mRNA的速度比大肠杆菌RNA聚合酶快5倍；当二者同时存在时，宿主本身基因的转录竞争不过T7表达系统，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；而T7RNAP需要xylF启动子来诱导表达，因此在发酵培养基中添加了5g/L木糖来诱导木糖启动子xylF发挥作用；木糖具有良好的水溶性和生物相容性，并且在体内能够被迅速代谢和排泄，具有廉价易得的优点，有利于羟基酪醇生产菌HT-8的工业化发酵生产。
（4）由于苯丙酮酸脱羧酶为硫胺素二磷酸依赖性脱羧酶，因此在发酵培养基中选择添加VB1作为辅酶因子，以用来提高苯丙酮酸脱羧酶的催化效率，在探究VB1浓度对菌体生物量和羟基酪醇产量的影响后发现，当培养基添加5mg/L的VB1时，能够最大发挥苯丙酮酸脱羧酶的催化效果，极大提高了生产效益。
附图说明
图1 羟基酪醇基因工程菌羟基酪醇从头合成途径改造过程图。
图2 质粒pET-HT-1结构示意图，特别指出，除专利中特别提及的质粒元件，图谱中所示其他元件均可由现已知任意同等效果元件替代。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明所述技术方案作进一步的详细说明。
实施例中涉及到的百分号“%”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
实施例中所用的出发菌株E.coli W3110为E.coli W3110 ATCC 27325（市售），相应启动子和基因等见序列表。涉及到的菌株构建过程中用到的引物见表1。
表1菌株构建过程中所涉及的引物
| 引物名称 | 序列号 | 引物序列（5’-3’） |
| tyrR-up-S | SEQ ID NO.17 | ATCTTTACGCCGAAGTGCC |
| tyrR-up-A | SEQ ID NO.18 | ACCGTCCAGTTGTGTCAGTCTCAACGCCAGATGCTCAC |
| tyrR-dw-S | SEQ ID NO.19 | GTGAGCATCTGGCGTTGAGACTGACACAACTGGACGGT |
| tyrR-dw-A | SEQ ID NO.20 | CCTCTCCACTTTCCGTAAC |
| pGRB-tyrR-S | SEQ ID NO.21 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTACACGTCCTGACCGGTGCGGGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-tyrR-A | SEQ ID NO.22 | TTCTAGCTCTAAAACCCGCACCGGTCAGGACGTGTACTAGTATTATACCTAGGACT |
| tyrB-up-S | SEQ ID NO.23 | GTCGCGATGAAATACGTGGATTAATCG |
| tyrB-up-A | SEQ ID NO.24 | GTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAATAGCAGTTAAGCCCTTCCATCG |
| tyrB-dw-S | SEQ ID NO.25 | GACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATAGCACAGAGATGCCAGAACG |
| tyrB-dw-A | SEQ ID NO.26 | ACAGGCAATAAGGCAAAGCATATTCT |
| pGRB-tyrB-S | SEQ ID NO.27 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTCCATGTTGCCACAACCCAACGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-tyrB-A | SEQ ID NO.28 | TTCTAGCTCTAAAACGTTGGGTTGTGGCAACATGGACTAGTATTATACCTAGGACT |
| feaB-up-S | SEQ ID NO.29 | ATGACAGAGCCGCATGTAGC |
| feaB-up-A | SEQ ID NO.30 | TTCACGCTCTGCGGGTAATCG |
| feaB-dw-S | SEQ ID NO.31 | CGCGTCGCTGGGCCGGGCGATTACCCGCAGAGCGTGAAAGAAGAGGCGTTACAACTGGCA |
| feaB-dw-A | SEQ ID NO.32 | TTAATACCGTACACACACCGACTTAGTTT |
| pGRB-feaB-S | SEQ ID NO.33 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGATCCGCAATGGGTTATTGAGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-feaB-A | SEQ ID NO.34 | TTCTAGCTCTAAAACTCAATAACCCATTGCGGATCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| ycdN-up-S | SEQ ID NO.35 | ATAGCGCAGGGTACATTCCACT |
| ycdN-up-A | SEQ ID NO.36 | GAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACCTTCTTCAATAGAGGCGGTACA |
| ycdN-dw-S | SEQ ID NO.37 | TGCCGCAGAGACCGACATCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAAT |
| ycdN-dw-A | SEQ ID NO.38 | ACAGCGGTTGTGGTGGCA |
| ycdN-T7RNAP-S | SEQ ID NO.39 | CCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAACACGATTAACATCGCTAAG |
| ycdN-T7RNAP-A | SEQ ID NO.40 | CAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACGCGAACGCGAAGTCCG |
| pGRB-ycdN-S | SEQ ID NO.41 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTGCGTGGAAATCATCATGGCTGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-ycdN-A | SEQ ID NO.42 | TTCTAGCTCTAAAACAGCCATGATGATTTCCACGCACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yeeL-up-S | SEQ ID NO.43 | TTCATCGGGACGAGTGGAGA |
| yeeL-up-A | SEQ ID NO.44 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACCATAGCATCGCCAATCTGA |
| yeeL-dw-S | SEQ ID NO.45 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATACCCAAAGGTGAAGATAAAGCC |
| yeeL-dw-A | SEQ ID NO.46 | CATTCCCTCTACAGAACTAGCCCTT |
| yeeL-aroGfbr-S | SEQ ID NO.47 | TCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAATTATCAGAACGACGATTTACG |
| yeeL-aroGfbr-A | SEQ ID NO.48 | CACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACCCGCGACGCGCTTT |
| pGRB-yeeL-S | SEQ ID NO.49 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTAACACAGCAATACGGTACGCGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-yeeL-A | SEQ ID NO.50 | TTCTAGCTCTAAAACGCGTACCGTATTGCTGTGTTACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yeeP-up-S | SEQ ID NO.51 | GGTCAGGAGGTAACTTATCAGCG |
| yeeP-up-A | SEQ ID NO.52 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAATGGCAGGGCTCCGTTTT |
| yeeP-dw-S | SEQ ID NO.53 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGAACTGGATTTTCTTCTGAACCTGT |
| yeeP-dw-A | SEQ ID NO.54 | ACGATGTCAGCAGCCAGCA |
| yeeP-tyrAfbr-S | SEQ ID NO.55 | AATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGTTGCTGAATTGACCGCAT |
| yeeP-tyrAfbr-A | SEQ ID NO.56 | CAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACTGGCGATTGTCATTCG |
| pGRB-yeeP-S | SEQ ID NO.57 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTAGGCGGTATTCCGTCTGTTCGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-yeeP-A | SEQ ID NO.58 | TTCTAGCTCTAAAACGAACAGACGGAATACCGCCTACTAGTATTATACCTAGGACT |
| yjiP-up-S | SEQ ID NO.59 | GCCATACCGCCAGCAAGAT |
| yjiP-up-A | SEQ ID NO.60 | AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAGCAGATATTCCCCTTTCCACC |
| yjiP-dw-S | SEQ ID NO.61 | AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGACGGATGACAAACGCAAAGC |
| yjiP-dw-A | SEQ ID NO.62 | AAAGGCGGATTTTTACTGTGGA |
| yjiP-talB-S | SEQ ID NO.63 | CTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGACGGACAAATTGACCTCCCT |
| yjiP-talB-A | SEQ ID NO.64 | GATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACAGCAGATCGCCGATCATTTTTTC |
| pGRB-yjiP-S | SEQ ID NO.65 | AGTCCTAGGTATAATACTAGTTGGTCGGTAAAGACCCGCGAGTTTTAGAGCTAGAA |
| pGRB-yjiP-A | SEQ ID NO.66 | TTCTAGCTCTAAAACTCGCGGGTCTTTACCGACCAACTAGTATTATACCTAGGACT |
| KpHpaBC-S | SEQ ID NO.67 | GGCAGCCATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCATGAAACCGGAAGATTTTCGCGC |
| KpHpaBC-A | SEQ ID NO.68 | GGTCACCGGCGCCATTTTCAATCTCCTATTATTTCCTTAGAAGCTTACACCGCCACTTCCATTTCCAT |
| ARO10*-S | SEQ ID NO.69 | GCTTCTAAGGAAATAATAGGAGATTGAAAATGGCGCCGGTGACC |
| ARO10*-A | SEQ ID NO.70 | TTATTTTTTGTTGCGTTTCAGCGCG |
| ADH6-S | SEQ ID NO.71 | CGCGCTGAAACGCAACAAAAAATAAAGGAAACAGTATTCATGATGTCTTATCCTGAGAAATTTGAAGGTATCGC |
| ADH6-A | SEQ ID NO.72 | CTAGTCTGAAAATTCTTTGTCGTAGCCG |
| xz-S | SEQ ID NO.73 | ACAAAGAATTTTCAGACTAGAAGCTTGCGGCCGCA |
| xz-A | SEQ ID NO.74 | GCGCGAAAATCTTCCGGTTTCATGAATTCGGATCCGCGACCC |
如图1所示，构建羟基酪醇生产菌株的步骤如下：
（1）底盘菌改造：
敲除反馈抑制蛋白基因：tyrR；
敲除羟基酪醇分解途径基因：tyrB、feaB；
引入了T7 RNAP基因，上调了aroG fbr 、tyrA fbr 、talB基因；
（2）pET-HT-1质粒系统：pET-HT-1质粒（如图2所示）携带复制起始位点、卡那霉素抗性、T7启动子、核糖体结合位点和终止子等质粒元件，敲除了阻遏蛋白基因lacI，该质粒高效表达了来源于Saccharomyes cerevisiaeSCY4741的ARO10 D331V 和ADH6基因，以及来源于Klebsiella pneumoniae的hpaBC基因。
上述基因操作采用的基因编辑方法参照文献（Li Y，Lin Z，Huang C，et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR-Cas9 meditated genomeediting. Metabolic Engineering，2015，31：13-21.）。该方法涉及的工程质粒pREDCas9、pGRB，其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除系统、λ噬菌体的Red重组系统、Cas9蛋白表达系统以及奇霉素抗性（工作浓度：100 mg/L）；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子J23100、gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列以及氨节青霉素抗性（工作浓度：100 mg/L）。下列实施例中涉及到的专业名词均可在该文章中解释。本发明涉及到的专业名词，若无特别备注，均可在该文章中得到解释。本发明所指的“敲除”是指将目的基因失活，“引入”是指将外源基因与启动子、终止子连接后插入到工程菌基因组中。
实施例1
本实施例旨在说明菌株HT-8的具体构建步骤。特别的，实施例中若有同类型基因操作方法，则仅提供1次，并做注释，不再多加赘述。
（1）敲除tyrR基因：
①以E.coli W3110基因组为模板，分别以tyrR-up-S、tyrR-up-A和tyrR-dw-S、tyrR-dw-A，通过PCR扩增得到上、下游同源臂。然后以上下游同源臂为模板，以tyrR-up-S、tyrR-dw-A为引物，通过重叠PCR扩增得到重叠片段；
②以pGRB-tyrR-S、pGRB-tyrR-A为引物，退火得到gRNA片段，并将其与pGRB载体连接，得到pGRB-tyrR；
③制备E.coli W3110电转化感受态细胞，将重叠片段与tyrR-pGRB一同电转化进入感受态细胞，并筛选得到阳性转化子，获得菌株HT-1。
（2）敲除tyrB基因：具有①中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为tyrB-up-S、tyrB-up-A、tyrB-dw-S、tyrB-dw-A、pGRB-tyrB-S、pGRB-tyrB-A。感受态细胞为HT-1，获得菌株HT-2。
（3）敲除feaB基因：具有（1）中相同操作方法，不同之处在于，所用引物为feaB-up-S、feaB-up-A、feaB-dw-S、feaB-dw-A、pGRB-feaB-S、pGRB-feaB-A。感受态细胞为HT-2，获得菌株HT-3。
（4）在ycdN基因位点使用xylF启动子控制T7 RNAP基因过表达：
①以E.coli W3110基因组为模板，分别以ycdN-up-S、ycdN-up-A、ycdN-dw-S、ycdN-dw-A与ycdN-T7RNAP-S、ycdN-T7RNAP-A为引物，通过PCR扩增获得到上游同源臂、下游同源臂和目的基因片段，然后以其为模板，通过重叠PCR获得ycdN-T7RNAP基因整合片段，所述基因整合片段由ycdN上游同源臂、ycdN-T7RNAP目的基因和ycdN下游同源臂组成。
②以pGRB-ycdN-S和pGRB-ycdN-A为一组引物，通过PCR退火程序构建pGRB-ycdN使用的含靶序列的DNA片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pGRB-ycdN。
③将步骤①、②中得到的ycdN-T7RNAP基因整合片段与pGRB-ycdN质粒电转进入HT-3菌株中，经过筛选获得阳性转化子，并命名为HT-4。
（5）在yeeL基因位点使用trc启动子控制aroG fbr 基因过表达：具有（4）中相同的操作方法，不同之处在于，所用引物为yeeL-up-S、yeeL-up-A、yeeL-dw-S、yeeL-dw-A、yeeL-aroGfbr-S、yeeL-aroGfbr-A、pGRB-yeeL-S、pGRB-yeeL-A。感受态细胞为HT-4，获得菌株HT-5。
（6）在yeeP基因位点使用trc启动子控制tyrA fbr 基因过表达：具有（4）中相同的操作方法，不同之处在于，所用引物为yeeP-up-S、yeeP-up-A、yeeP-dw-S、yeeP-dw-A、yeeP-tyrAfbr-S、yeeP-tyrAfbr-A、pGRB-yeeP-S、pGRB-yeeP-A。感受态细胞为HT-5，获得菌株HT-6。
（7）在yjiP基因位点使用trc启动子控制talB基因过表达：具有（4）中相同的操作方法，不同之处在于，所用引物为yjiP-up-S、yjiP-up-A、yjiP-dw-S、yjiP-dw-A、yjiP-talB-S、yjiP-talB-A、pGRB-yjiP-S、pGRB-yjiP-A。感受态细胞为HT-6，获得菌株HT-7。
④转化质粒pET-HT-1得到工程菌HT-8：将完整质粒pET-HT-1转化进入HT-7感受态细胞中，转化方法为电转化（也可以是化学转化等方法）得到工程菌HT-8。
实施例2
本实施例旨在说明实施例1中质粒pET-HT-1的构建方法，具体步骤如下：
①以粘红酵母（Klebsiella pneumoniae）基因组为模板，以KpHpaBC-S、KpHpaBC-A为引物，通过PCR扩增获得到DNA片段hpaBC。再以酿酒酵母（Saccharomyes cerevisiaeSCY4741）基因组为模版，分别以ARO10*-S和ARO10*-A、ADH6-S和ADH6-A为引物，通过PCR扩增获得到DNA片段ARO10*和ADH6。再以DNA片段hpaBC、ARO10*、ADH6为模版，以KpHpaBC-S、ADH6-A为引物，通过PCR扩增获得到目的基因片段。
②以PET28a(+)质粒基因组为模板，以xz-S和xz-A为引物，通过PCR扩增获得到线性化载体的DNA片段。
③利用重组酶连接线性化载体与目的基因片段，并将其化转至DH5α化转感受态细胞中，筛选获得阳性转化子，提取质粒pET-HT-1。
实施例3
本实施例旨在说明实施例1中获得的工程菌HT-8在5 L机械搅拌式发酵罐中发酵生产羟基酪醇的方法。具体步骤如下：
①斜面培养：取羟基酪醇生产菌株（工程菌HT-8）接种在斜面培养基上，32℃培养12h，斜面培养基选用通用LB固体培养基；
②种子培养：使用5 L机械搅拌式发酵罐，培养温度为32-34℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在6.4±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，当OD600nm为15时达到接种要求，其中，采用的种子培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，KH2PO42g/L，硫酸铵1g/L，FeSO4.7H2O 10mg/L，其余为水。
③发酵培养：使用5 L机械搅拌式发酵罐，发酵接种量为20%，培养温度为32-34℃，通过自动流加25%氨水溶液维持培养pH在6.4±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，通过流加80%葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5 g/L，当OD600为20-30时添加木糖，发酵周期为48 h，其中，采用的发酵培养基为：MgSO4.7H2O 1g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨2g/L，硫酸铵1g/L，KH2PO43g/L，谷氨酸2g/L，甲硫氨酸0.5g/L，FeSO4.7H2O 20mg/L，MnSO410mg/L，木糖5g/L，VB15mg/L，其余为水。
实施例4
以HT-8为生产菌株，本实施例旨在说明羟基酪醇发酵应用中VB1的最适用量。具体发酵培养方式如实施例3所示，唯一不同的是发酵培养基中VB1的初始浓度，共设置了5个浓度梯度，分别是1 mg/L、3 mg/L、5 mg/L、7 mg/L、9 mg/L。5组发酵罐发酵36 h的数据，分别为添加辅酶因子VB1浓度为1 mg/L、3 mg/L、5 mg/L、7 mg/L、9 mg/L时的OD600nm与羟基酪醇产量值，结果如表2所示。
表2 VB1浓度对菌体生物量和羟基酪醇产量的影响
| 第1组 | 第2组 | 第3组 | 第4组 | 第5组 | |
| VB1添加量mg/L | 1 | 3 | 5 | 7 | 9 |
| 菌体生物量OD600nm | 65 | 72 | 83 | 76 | 78 |
| 羟基酪醇产量g/L | 4.3 | 4.8 | 6.2 | 5.4 | 5.1 |
由结果可以看出，VB1辅酶因子添加量为5mg/L时菌体生物量与羟基酪醇产量达到最高，OD600为83。当VB1辅酶因子添加量较少的时候，适当增加VB1添加量可以有效提高羟基酪醇的产量。当添加量过多时，不仅没有进一步提高产量，反而会造成资源的浪费，因此结合OD600和产量可以看出VB1最适添加量为5 mg/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，本技术领域技术人员以本发明的方法或以本方法为基础进行的菌种改造等改进和润饰均视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种羟基酪醇生产菌株，其特征在于：以大肠杆菌作为底盘菌株，缺失了tyrR、tyrB、 feaB基因，引入了T7 RNAP基因，上调了aroG fbr 、tyrA fbr 、talB基因，携带有质粒pET-HT-1，所述质粒pET-HT-1的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.15所示，所述质粒pET-HT-1以PET28a(+)质粒基因组为模板，敲除了阻遏蛋白基因lacI，同时携带了来源于Saccharomyes cerevisiae SCY4741的ARO10 D331V 和ADH6基因，以及来源于Klebsiella pneumoniae的hpaBC基因，基因均选用T7启动子强化转录，所述ARO10 D331V 基因的核苷酸序列如序列表SEQ IDNO.8所示，ADH6基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.9所示，hpaBC基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.10所示，T7启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.13所示，PET28a(+)质粒的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.16所示。
2.根据权利要求1所述的羟基酪醇生产菌株，其特征在于：以E.coli W3110作为底盘菌株，敲除了菌株基因组上的转录调控因子基因tyrR、芳香族氨基酸转氨酶基因tyrB、苯乙醛脱氢酶基因feaB；利用xylF启动子强化T7 RNA聚合酶基因T7 RNAP转录，并整合到基因组ycdN基因位点；利用trc启动子强化DAHP合成酶基因aroG fbr 转录强度，并整合到基因组yeeL基因位点；利用trc启动子强化预苯酸脱氢酶基因tyrA fbr 转录强度，并整合到基因组yeeP基因位点；利用trc启动子强化转醛缩酶基因talB转录强度，并整合到基因组yjiP基因位点。
3.根据权利要求2所述的羟基酪醇生产菌株，其特征在于：所述E.coli W3110作为出发菌株为E.coli W3110 ATCC 27325。
4.根据权利要求2所述的羟基酪醇生产菌株，其特征在于：所述转录调控因子基因tyrR的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，芳香族氨基酸转氨酶基因tyrB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，苯乙醛脱氢酶基因feaB的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.3所示，T7 RNA聚合酶基因T7 RNAP基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.4所示，DAHP合成酶基因aroG fbr 基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.5所示，预苯酸脱氢酶基因tyrA fbr 基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.6所示，转醛缩酶基因talB的核苷酸序列如序列表SEQID NO.7所示，xylF启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.11所示，trc启动子的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.12所示。
5.权利要求1-4之一所述羟基酪醇生产菌株的构建方法，其特征在于：在出发菌株E.coli W3110基础上进行定向改造，具体步骤如下：
（1）底盘菌改造：
敲除反馈抑制蛋白基因：tyrR；
敲除羟基酪醇分解途径基因：tyrB、feaB；
引入了T7 RNAP基因，上调了aroG fbr 、tyrA fbr 、talB基因；
（2）pET-HT-1质粒系统：将质粒pET-HT-1转化进入步骤（1）得到的感受态细胞。
6.权利要求1-4之一所述羟基酪醇生产菌株在发酵生产羟基酪醇方面的应用。
7.根据权利要求6所述的羟基酪醇生产菌株的应用，其特征在于：使用机械搅拌式发酵罐进行培养，具体步骤如下：
①斜面培养：取羟基酪醇生产菌株接种在斜面培养基上，32℃培养12-16h；
②种子培养：培养温度为32-34℃，通过自动流加氨水溶液维持培养pH在6.4±0.2，通过调整搅拌转速或通风量维持培养溶氧值为30%，当OD600nm为15时达到接种要求；
③发酵培养：发酵接种量为20%，培养温度为32-34℃，通过自动流加氨水溶液维持培养pH在6.4±0.2，维持培养溶氧值为30%，通过流加葡萄糖溶液将罐内葡萄糖浓度控制在≤0.5 g/L，当OD600为20-30时添加木糖。
8.根据权利要求7所述的羟基酪醇生产菌株的应用，其特征在于：所述步骤②中采用的种子培养基为：葡萄糖20g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨1g/L，MgSO4.7H2O 1g/L，KH2PO42g/L，硫酸铵1g/L，FeSO4.7H2O10mg/L，其余为水；所述步骤③采用的发酵培养基为：MgSO4.7H2O 1g/L，酵母粉4g/L，蛋白胨2g/L，硫酸铵1g/L，KH2PO43g/L，谷氨酸2g/L，甲硫氨酸0.5g/L，FeSO4.7H2O 20-30mg/L，MnSO410-15mg/L，木糖5g/L，VB11-9mg/L，其余为水。
9.根据权利要求8所述的羟基酪醇生产菌株的应用，其特征在于：所述发酵培养基中VB1的添加量为5.0 mg/L。
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