CN115109738A - 一种生产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生产L‑高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用，通过代谢工程的方法，在基因组层面对大肠杆菌中L‑高丝氨酸合成相关基因进行改造，通过弱化降解途径L‑苏氨酸合成途径的通量、强化L‑高丝氨酸合成途径的代谢流、增强前体物草酰乙酸和L‑天冬氨酸的供应、促进L‑高丝氨酸的胞外转运，以及促进辅因子协同利用，得到一株遗传背景清晰、不携带质粒、无需诱导且能稳定高效生产L‑高丝氨酸的基因工程菌，具有大规模生产的应用潜力。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种生产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用。
背景技术
L-高丝氨酸是一种有价值的非蛋白质氨基酸，具有重要的生理学功能和应用价值。它是必需氨基酸L-苏氨酸和L-甲硫氨酸合成的前体物质，另外，它具有L-型-α-氨基酸的基本骨架，并且其γ-羟基具有多样的化学活性，可作为许多重要化学品合成的中间体。目前，L-高丝氨酸主要通过化学法合成，其过程需要使用碘化物和大量有机溶剂，反应过程复杂、成本高，且会对环境造成污染。而微生物发酵法具有成本低、工艺简单、条件温和、对环境影响相对较小等优势，更适合用于L-高丝氨酸的大规模工业生产。
目前，对于微生物发酵生产L-高丝氨酸的研究主要集中在谷氨酸棒状杆菌和大肠杆菌中。Li等(Li N,Xu S,Du G,et al.Efficient production of L-homoserine inCorynebacterium glutamicum ATCC 13032by redistribution of metabolicflux.Biochemical Engineering Journal,2020,161:107665.)以谷氨酸棒状杆菌为出发菌株构建L-高丝氨酸生产菌，最终产量为8.8g/L。Mu等(Mu Q,Zhang S,Mao X,etal.Highly efficient production of L-homoserine in Escherichia coli byengineering a redox balance route.Metab Eng.2021,67:321-329.)通过在大肠杆菌中设计一个氧化还原平衡路线来实现L-高丝氨酸的高效生产，最终产量达到84.1g/L。上述菌株均是利用质粒为载体来表达关键基因，发酵过程中质粒多拷贝对菌体生长会造成一定的负担，且在生产过程中质粒表达载体容易丢失，导致发酵不稳定，或者需要添加一定的选择压力来维持质粒，造成生产成本过高，最终导致这些L-高丝氨酸菌株难以投入到工业化生产中。Zhang等(Zhang Y,Wei M,Zhao G,et al.High-level production of L-homoserineusing a non-induced,non-auxotrophic Escherichia coli chassis throughmetabolic engineering.Bioresource Technology,2021,327(4):124814.)在大肠杆菌中构建了一株非诱导、非营养缺陷型、无质粒的L-高丝氨酸生产菌株，最终产量达到60.1g/L。虽然该菌株具有非诱导和非营养缺陷型的优点，但若要满足工业化生产的要求，其生产能力还有待进一步提高。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明通过代谢工程的方法，在基因组层面对大肠杆菌中L-高丝氨酸合成相关基因进行改造，通过弱化降解途径L-苏氨酸合成途径的通量、强化L-高丝氨酸合成途径的代谢流、增强前体物草酰乙酸和L-天冬氨酸的供应、促进L-高丝氨酸的胞外转运，以及协同利用辅因子，得到一株遗传背景清晰、不携带质粒、无需诱导且能稳定高效生产L-高丝氨酸的基因工程菌，具有大规模生产的应用潜力。
本发明的第一个目的是提供一种生产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因lacI，弱化高丝氨酸激酶编码基因thrB的表达，过表达天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I编码基因thrA、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc、天冬氨酸转氨酶编码基因aspC、天冬氨酸氨裂合酶编码基因aspA、苏氨酸和高丝氨酸外排系统编码基因rhtA和吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB，引入异源天冬氨酸激酶编码基因lysC、天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asd和天冬氨酸脱氢酶编码基因aspdh；
其中，
通过将thrB的原启动子替换为启动子PfliC弱化高丝氨酸激酶编码基因thrB的表达；
所述天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I编码基因thrA、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc、天冬氨酸转氨酶编码基因aspC、天冬氨酸氨裂合酶编码基因aspA、吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB、天冬氨酸激酶编码基因lysC、天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asd和天冬氨酸脱氢酶编码基因aspdh通过启动子Ptrc调控表达；
所述苏氨酸和高丝氨酸外排系统编码基因rhtA通过启动子Plpp调控表达。
进一步地，将启动子Ptrc控制的thrA分别整合至ycgH、ydeU、yjhE和tfaD基因位点。
进一步地，将启动子Ptrc控制的ppc整合至yeeL基因位点。
进一步地，将启动子Ptrc控制的aspC整合至ylbE基因位点。
进一步地，将启动子Ptrc控制的aspA整合至ycdN基因位点。
进一步地，将启动子Ptrc控制的lysC整合至ycjV基因位点。
进一步地，将启动子Ptrc控制的pntAB分别整合至ilvG和ygaY基因位点。
进一步地，将启动子Plpp控制的rhtA整合至yjiP基因位点。
进一步地，将启动子Ptrc控制的asd整合至yeeP基因位点。
进一步地，将启动子Ptrc控制的aspdh整合至yghX基因位点。进一步地，启动子PfliC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，启动子Ptrc的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，启动子Plpp的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
进一步地，高丝氨酸激酶编码基因thrB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I编码基因thrA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，天冬氨酸转氨酶编码基因aspC的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，天冬氨酸氨裂合酶编码基因aspA的核苷酸序列如SEQID NO.8所示，天冬氨酸激酶编码基因lysC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，苏氨酸和高丝氨酸外排系统编码基因rhtA的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示，吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asd的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，天冬氨酸脱氢酶编码基因aspdh的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
其中，所述lysC来源于Corynebacterium glutamicum；asd来源于Tistrellamobilis；aspdh来源于Pseudomonas aeruginosa。
进一步地，出发菌株为Escherichia coli W3110。
本发明的第二个目的是提供上述生产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌的构建方法，包括任意顺序的以下步骤：
(1)敲除大肠杆菌的lacI基因，并将thrB的原启动子替换为弱启动子PfliC；
(2)将Ptrc-thrA在基因组上进行四拷贝，分别整合至ycgH、ydeU、yjhE和tfaD基因位点；
(3)将ppc、aspC和aspA分别由启动子Ptrc控制，在基因组上进行过表达；
(4)将Ptrc-lysC和Plpp-rhtA分别整合到基因组上；
(5)将Ptrc-pntAB在基因组上进行双拷贝，分别整合至ilvG和ygaY基因位点；
(6)在基因组上整合Ptrc-asd和Ptrc-aspdh，构建得到上述重组大肠杆菌。
本发明以代谢途径清晰、遗传操作简单的大肠杆菌为出发菌株，从L-高丝氨酸生物合成途径以及相关代谢途径的基因工程改造出发，对整体代谢途径进行分析重构，得到一株遗传背景清晰、不携带质粒且能稳定高效生产L-高丝氨酸的基因工程菌株。
本发明获得的基因工程菌弱化了L-高丝氨酸的降解、提高了L-高丝氨酸的合成通量和前体物供应、促进了L-高丝氨酸的转运，并通过增强NADPH再生以及引入外源利用NADH的脱氢酶来调节胞内的辅因子水平，从而有效地提高了L-高丝氨酸的生产。
本发明的第三个目的是提供上述重组大肠杆菌在生产L-高丝氨酸中的应用。
进一步地，以葡萄糖为底物，通过上述重组大肠杆菌发酵生产L-高丝氨酸。
进一步地，摇瓶发酵时，将活化后的菌株在35-37℃、180-250r/min培养得到种子液，按10-20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，发酵温度为35-37℃，转速为180-250r/min，控制pH在7.0-7.2，当培养基中葡萄糖耗尽时，通过补加60％(m/v)的葡萄糖溶液维持发酵进行。
进一步地，发酵时间优选为24-48h，更优选为36h。
进一步地，种子培养基组成为：20-30g/L葡萄糖,5-10g/L酵母粉,1-5g/L(NH4)2SO4,1-5g/L KH2PO4,1-5g/L MgSO4·7H2O,1-5g/L柠檬酸钠,5-15mg/L FeSO4·7H2O,0.5-2mg/L VH和0.5-2mg/L VB1。
进一步地，发酵培养基组成为：10-20g/L葡萄糖,1-5g/L酵母粉,1-5g/L(NH4)2SO4,1-5g/L KH2PO4,1-5g/L MgSO4·7H2O,1-5g/L柠檬酸钠,20-30mg/L FeSO4·7H2O,0.5-2mg/LVH和0.5-2mg/L VB1。
进一步地，发酵罐发酵时，发酵培养之前，将重组大肠杆菌活化后在种子培养基中培养得到种子液，其中，培养温度为35-37℃，pH为7.0-7.2，通过调节搅拌转速和通风量控制溶氧为25-30％，再将种子液按10-20％的接种量接种至发酵培养基中，发酵培养过程中，发酵温度为35-37℃，pH为7.0-7.2，控制溶氧为25-30％，分批补料控制发酵液中葡萄糖残糖浓度为0.05-5g/L。
进一步地，发酵时间优选为36-60h，更优选为48h。
进一步地，种子培养基组成为：25-35g/L葡萄糖,5-10g/L酵母粉,1-5g/L蛋白胨,1-5g/L KH2PO4,0.5-2g/L MgSO4·7H2O,1-5g/L柠檬酸或柠檬酸钠,5-10mg/L FeSO4·7H2O,5-10mg/L MnSO4·H2O,0.2-2mg/L VH和0.5-2mg/L VB1。
进一步地，发酵培养基的组成为：10-20g/L葡萄糖，10-15g/L玉米浆,1-5g/L酵母粉，1-5g/L蛋白胨,1-5g/L KH2PO4，0.5-3g/L MgSO4·7H2O，,1-5g/L柠檬酸或柠檬酸盐，10-30mg/L FeSO4·7H2O，10-20mg/L MnSO4·H2O，0.2-2mg/L VH和0.3-1mg/L VB1，加或不加甜菜碱，优选地，加1-3g/L甜菜碱。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明提供了一种生产L-高丝氨酸的基因工程菌株，基因工程菌株以大肠杆菌为出发菌株，敲除了lacI基因，弱化了高丝氨酸激酶编码基因thrB，强化了天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I编码基因thrA、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc、天冬氨酸转氨酶编码基因aspC和天冬氨酸氨裂合酶编码基因aspA，引入了来源于C.glutamicum的天冬氨酸激酶编码基因lysCcgl，过表达苏氨酸和高丝氨酸外排系统编码基因rhtA和吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB，并引入来源于T.mobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asdtmo和来源于P.aeruginosa的天冬氨酸脱氢酶编码基因aspdhpae，在发酵生产L-高丝氨酸中表现良好，摇瓶发酵36h产物浓度高达42g/L，发酵罐发酵48h产物浓度高达96g/L，糖酸转化率达到45％，具有良好的工业应用前景。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明。
图1为L-高丝氨酸基因工程菌株摇瓶发酵结果；
图2为菌株E.coli HOM10在5L发酵罐中分批补料发酵过程曲线。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1基因工程菌E.coli W3110 HOM10的构建
1.敲除E.coli W3110的lacI基因：
以E.coli W3110基因组为模板，根据其lacI基因的上下游序列设计上游同源臂引物(lacI-1、lacI-2)和下游同源臂引物(lacI-3、lacI-4)，并通过PCR扩增其上下游同源臂片段。然后，通过重叠PCR的方法将上述片段融合，获得lacI基因的敲除片段。将引物gRNA-lacI-1和gRNA-lacI-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-lacI。将质粒pGRB-lacI和lacI基因的敲除片段同时电转化至含有pREDCas9的E.coli W3110的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得E.coli W3110ΔlacI菌株。
2.将thrB基因的原启动子替换为PfliC
以E.coli W3110基因组为模板，根据其thrB基因启动子区域的上下游序列设计上游同源臂引物(PthrB-1、PthrB-2)和下游同源臂引物(PthrB-3、PthrB-4)，将PfliC序列(SEQ IDNO.1)设计在引物PthrB-2和PthrB-3上，并通过PCR扩增其上下游同源臂片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得PthrB基因的替换片段。将引物gRNA-PthrB-1和gRNA-PthrB-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-PthrB。将质粒pGRB-PthrB和PthrB基因的替换片段同时电转化至含有pREDCas9的E.coli W3110ΔlacI的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM1。
3.将Ptrc-thrA基因分别整合至ycgH、ydeU、yjhE和tfaD位点
(1)将Ptrc-thrA基因整合至ycgH位点
以E.coli W3110基因组为模板，根据ycgH基因序列设计上游同源臂引物(ycgH-1、ycgH-2)和下游同源臂引物(ycgH-5、ycgH-6)，根据thrA基因序列设计引物ycgH-3和ycgH-4，其中，将Ptrc启动子序列(SEQ ID NO.2)设计在引物ycgH-2和ycgH-3上，通过PCR扩增获得各个片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Ptrc-thrA基因的整合片段。将引物gRNA-ycgH-1和gRNA-ycgH-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-ycgH。将质粒pGRB-ycgH和Ptrc-thrA基因的整合片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM1的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM2-1。
(2)将Ptrc-thrA基因整合至ydeU位点
以E.coli W3110基因组为模板，根据ydeU基因序列设计上游同源臂引物(ydeU-1、ydeU-2)和下游同源臂引物(ydeU-5、ydeU-6)，根据thrA基因序列设计引物ydeU-3和ydeU-4，其中，将Ptrc启动子序列设计在引物ydeU-2和ydeU-3(引物ydeU-3与上述ycgH-3序列一致)上，通过PCR扩增获得各个片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Ptrc-thrA基因的整合片段。将引物gRNA-ydeU-1和gRNA-ydeU-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-ydeU。将质粒pGRB-ydeU和Ptrc-thrA基因的整合片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM2-1的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM2-2。
(3)将Ptrc-thrA基因整合至yjhE位点
以E.coli W3110基因组为模板，根据yjhE基因序列设计上游同源臂引物(yjhE-1、yjhE-2)和下游同源臂引物(yjhE-5、yjhE-6)，根据thrA基因序列设计引物yjhE-3和yjhE-4，其中，将Ptrc启动子序列设计在引物yjhE-2和yjhE-3(引物yjhE-3与上述ycgH-3序列一致)上，通过PCR扩增获得各个片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Ptrc-thrA基因的整合片段。将引物gRNA-yjhE-1和gRNA-yjhE-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-yjhE。将质粒pGRB-yjhE和Ptrc-thrA基因的整合片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM2-2的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM2-3。
(4)将Ptrc-thrA基因整合至tfaD位点
以E.coli W3110基因组为模板，根据tfaD基因序列设计上游同源臂引物(tfaD-1、tfaD-2)和下游同源臂引物(tfaD-5、tfaD-6)，根据thrA基因序列设计引物tfaD-3和tfaD-4，其中，将Ptrc启动子序列设计在引物tfaD-2和tfaD-3(引物tfaD-3与上述ycgH-3序列一致)上，通过PCR扩增获得各个片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Ptrc-thrA基因的整合片段。将引物gRNA-tfaD-1和gRNA-tfaD-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-tfaD。将质粒pGRB-tfaD和Ptrc-thrA基因的整合片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM2-3的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM2-4。
4.将ppc基因的原启动子替换为Ptrc，并将Ptrc-ppc基因整合至yeeL位点
(1)将ppc基因的原启动子替换为Ptrc
以E.coli W3110基因组为模板，根据其ppc基因启动子区域的上下游序列设计上游同源臂引物(Pppc-1、Pppc-2)和下游同源臂引物(Pppc-3、Pppc-4)，将Ptrc序列设计在引物Pppc-2和Pppc-3上，并通过PCR扩增其上下游同源臂片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Pppc基因的替换片段。将引物gRNA-Pppc-1和gRNA-Pppc-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-Pppc。将质粒pGRB-Pppc和Pppc基因的替换片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM2-4的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM3-1。
(2)将Ptrc-ppc基因整合至yeeL位点
以E.coli W3110基因组为模板，根据yeeL基因序列设计上游同源臂引物(yeeL-1、yeeL-2)和下游同源臂引物(yeeL-5、yeeL-6)，根据ppc基因序列设计引物yeeL-3和yeeL-4，其中，将Ptrc启动子序列设计在引物yeeL-2和yeeL-3上，通过PCR扩增获得各个片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Ptrc-ppc基因的整合片段。将引物gRNA-yeeL-1和gRNA-yeeL-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-yeeL。将质粒pGRB-yeeL和Ptrc-ppc基因的整合片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM3-1的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM3-2。
5.将Ptrc-aspC基因整合至ylbE位点并将Ptrc-aspA基因整合至ycdN位点
(1)将Ptrc-aspC基因整合至ylbE位点
以E.coli W3110基因组为模板，根据ylbE基因序列设计上游同源臂引物(ylbE-1、ylbE-2)和下游同源臂引物(ylbE-5、ylbE-6)，根据aspC基因序列设计引物ylbE-3和ylbE-4，其中，将Ptrc启动子序列设计在引物ylbE-2和ylbE-3上，通过PCR扩增获得各个片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Ptrc-aspC基因的整合片段。将引物gRNA-ylbE-1和gRNA-ylbE-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-ylbE。将质粒pGRB-ylbE和Ptrc-aspC基因的整合片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM3-2的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM4。
(2)将Ptrc-aspA基因整合至ycdN位点
以E.coli W3110基因组为模板，根据ycdN基因序列设计上游同源臂引物(ycdN-1、ycdN-2)和下游同源臂引物(ycdN-5、ycdN-6)，根据aspA基因序列设计引物ycdN-3和ycdN-4，其中，将Ptrc启动子序列设计在引物ycdN-2和ycdN-3上，通过PCR扩增获得各个片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Ptrc-aspA基因的整合片段。将引物gRNA-ycdN-1和gRNA-ycdN-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-ycdN。将质粒pGRB-ycdN和Ptrc-aspA基因的整合片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM4的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM5。
6.将来源于C.glutamicum的lysCcgl基因整合至ycjV位点
以E.coli W3110基因组为模板，根据ycjV基因序列设计上游同源臂引物(ycjV-1、ycjV-2)和下游同源臂引物(ycjV-5、ycjV-6)，然后，以C.glutamicum13032基因组为模板，根据lysCcgl基因序列设计引物ycjV-3和ycjV-4，其中，将Ptrc启动子序列设计在引物ycjV-2和ycjV-3上，通过PCR扩增获得各个片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Ptrc-lysCcgl基因的整合片段。将引物gRNA-ycjV-1和gRNA-ycjV-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-ycjV。将质粒pGRB-ycjV和Ptrc-lysCcgl基因的整合片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM5的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM6。
7.将Plpp-rhtA基因整合至yjiP位点
以E.coli W3110基因组为模板，根据yjiP基因序列设计上游同源臂引物(yjiP-1、yjiP-2)和下游同源臂引物(yjiP-7、yjiP-8)，根据Plpp基因序列(SEQ ID NO.3)设计引物yjiP-3和yjiP-4，根据rhtA基因序列设计引物yjiP-5和yjiP-6，通过PCR扩增获得各个片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Plpp-rhtA基因的整合片段。将引物gRNA-yjiP-1和gRNA-yjiP-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-yjiP。将质粒pGRB-yjiP和Plpp-rhtA基因的整合片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM6的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM7。
8.将Ptrc-pntAB基因分别整合至ilvG和ygaY位点
(1)将Ptrc-pntAB基因整合至ilvG位点
以E.coli W3110基因组为模板，根据ilvG基因序列设计上游同源臂引物(ilvG-1、ilvG-2)和下游同源臂引物(ilvG-5、ilvG-6)，根据pntAB基因序列设计引物ilvG-3和ilvG-4，其中，将Ptrc启动子序列设计在引物ilvG-2和ilvG-3上，通过PCR扩增获得各个片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Ptrc-pntAB基因的整合片段。将引物gRNA-ilvG-1和gRNA-ilvG-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-ilvG。将质粒pGRB-ilvG和Ptrc-pntAB基因的整合片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM7的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM8-1。
(2)将Ptrc-pntAB基因整合至ygaY位点
以E.coli W3110基因组为模板，根据ygaY基因序列设计上游同源臂引物(ygaY-1、ygaY-2)和下游同源臂引物(ygaY-5、ygaY-6)，其中，将Ptrc启动子序列设计在引物ygaY-2和ilvG-3上，通过PCR扩增获得各个片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Ptrc-pntAB基因的整合片段。将引物gRNA-ygaY-1和gRNA-ygaY-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-ygaY。将质粒pGRB-ygaY和Ptrc-pntAB基因的整合片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM8-1的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM8-2。
9.将来源于T.mobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因整合至yeeP位点
以E.coli W3110基因组为模板，根据yeeP基因序列设计上游同源臂引物(yeeP-1、yeeP-2)和下游同源臂引物(yeeP-5、yeeP-6)，来源于T.mobilis的天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asdtmo经密码子优化后由公司合成，根据其序列设计引物yeeP-3和yeeP-4，其中，将Ptrc启动子序列设计在引物yeeP-2和yeeP-3上，通过PCR扩增获得各个片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Ptrc-asdtmo基因的整合片段。将引物gRNA-yeeP-1和gRNA-yeeP-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-yeeP。将质粒pGRB-yeeP和Ptrc-asdtmo基因的整合片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM8-2的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM9。
10.来源于P.aeruginos的aspdhpae基因整合至yghX位点
以E.coli W3110基因组为模板，根据yghX基因序列设计上游同源臂引物(yghX-1、yghX-2)和下游同源臂引物(yghX-5、yghX-6)，来源于P.aeruginos的天冬氨酸脱氢酶编码基因aspdhpae经密码子优化后由公司合成，根据其序列设计引物yghX-3和yghX-4，其中，将Ptrc启动子序列设计在引物yghX-2和yghX-3上，通过PCR扩增获得各个片段，再以其为模板，进行融合PCR，获得Ptrc-aspdhpae基因的整合片段。将引物gRNA-yghX-1和gRNA-yghX-2退火后得到的DNA片段与质粒pGRB连接，构建质粒pGRB-yghX。将质粒pGRB-yghX和Ptrc-aspdhpae基因的整合片段同时电转化至含有pREDCas9的HOM9的电转感受态细胞中，获得阳性转化子，消除质粒后获得菌株HOM10。
上述实验过程所用引物见下表：
实施例2利用基因工程菌HOM10摇瓶发酵生产L-高丝氨酸
(1)种子培养：取-80℃保藏菌种划线接种于斜面培养基中，37℃培养12h，并传代一次，然后，用接种环刮取一环斜面种子接种至装有30mL种子培养基的500mL圆底三角瓶中，九层纱布封口，37℃、220rmp培养8-10h。
种子培养基组成为：30g/L葡萄糖,10g/L酵母粉,4g/L(NH4)2SO4,3g/L KH2PO4,2g/LMgSO4·7H2O,2g/L柠檬酸钠,5mg/L FeSO4·7H2O,0.5mg/L VH和0.5mg/L VB1，其余为水，pH7.0-7.2。
(2)发酵培养：按15％的接种量将种子液接种至装有30mL发酵培养基的500mL挡板三角瓶中，九层纱布封口，37℃、240r/min培养，发酵过程中以苯酚红作指示剂，通过补加25％的氨水控制pH在7.0-7.2，当培养基中葡萄糖耗尽时，通过补加60％(m/v)的葡萄糖溶液维持发酵进行；发酵周期36h。
发酵培养基组成为：10g/L葡萄糖,5g/L酵母粉,5g/L(NH4)2SO4,3g/L KH2PO4,2g/LMgSO4·7H2O,2g/L柠檬酸钠,30mg/L FeSO4·7H2O,0.5mg/L VH,0.5mg/L VB1和8mg/L苯酚红，其余为水，pH 7.0-7.2。
经过36h的摇瓶发酵，各L-高丝氨酸基因工程菌株摇瓶发酵结果见图1。其中，HOM10菌株发酵液中L-高丝氨酸的产量为42g/L。未检测到其它氨基酸和有机酸副产物。
实施例3利用基因工程菌HOM10在5L发酵罐中发酵生产L-高丝氨酸
(1)种子培养：将适量无菌水倒入斜面中，用接种环将菌体悬浮，然后，将菌悬液接种于种子培养基中进行培养。培养温度为37℃，初始通气量为2L/min，初始搅拌转速为200r/min，通过自动流加25％的氨水控制培养基pH为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25-30％，当OD600达到15-20时，准备接入发酵培养基。
种子培养基组成为：30g/L葡萄糖,5g/L酵母粉,3g/L蛋白胨,1.5g/L KH2PO4,0.5g/L MgSO4·7H2O,1g/L柠檬酸钠,10mg/L FeSO4·7H2O,10mg/L MnSO4·H2O,1mg/L VH和0.5mg/L VB1，其余为水，pH 7.0-7.2。
(2)发酵培养：按15％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，培养温度为37℃，通过自动流加25％的氨水控制培养基pH为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25-30％，当培养基中葡萄糖耗尽时，自动流加80％的葡萄糖溶液，控制发酵液中葡萄糖残糖浓度为0.05-5g/L。
发酵培养基组成为：10g/L葡萄糖,10g/L玉米浆,4g/L酵母粉,3g/L蛋白胨,4g/LKH2PO4,1g/L MgSO4·7H2O,2g/L柠檬酸钠,10mg/L FeSO4·7H2O,10mg/L MnSO4·H2O,0.2mg/L VH和0.3mg/L VB1，其余为水，pH 7.0-7.2。
在5L发酵罐中发酵48h，L-高丝氨酸产量达到85g/L，糖酸转化率达到43％。未检测到其它氨基酸和有机酸副产物。
实施例4基因工程菌HOM10在5L发酵罐中发酵生产L-高丝氨酸的条件优化
(1)种子培养：将适量无菌水倒入斜面中，用接种环将菌体悬浮，然后，将菌悬液接种于种子培养基中进行培养。培养温度为37℃，初始通气量为2L/min，初始搅拌转速为200r/min，通过自动流加25％的氨水控制培养基pH为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25-30％，当OD600达到15-20时，准备接入发酵培养基。
种子培养基组成为：35g/L葡萄糖,5g/L酵母粉,3g/L蛋白胨,1.5g/L KH2PO4,0.5g/L MgSO4·7H2O,1g/L柠檬酸,10mg/L FeSO4·7H2O,10mg/L MnSO4·H2O,1mg/L VH和0.5mg/LVB1，其余为水，pH 7.0-7.2。
(2)发酵培养：按20％的接种量将种子液接种至发酵培养基中，培养温度为37℃，通过自动流加25％的氨水控制培养基pH为7.0-7.2，通过搅拌和通风控制溶氧在25-30％，当培养基中葡萄糖耗尽时，自动流加80％的葡萄糖溶液控制发酵液中葡萄糖残糖浓度为0.05-5g/L。
发酵培养基组成为：10g/L葡萄糖,12g/L玉米浆,4g/L酵母粉,3g/L蛋白胨,4g/LKH2PO4,1g/L MgSO4·7H2O,2g/L柠檬酸,10mg/L FeSO4·7H2O,10mg/L MnSO4·H2O,0.2mg/LVH和0.3mg/L VB1，其余为水，pH 7.0-7.2，并随糖流加1g/L甜菜碱。
在5L发酵罐中发酵48h，发酵过程曲线见图2，其中，L-高丝氨酸产量最高达到96g/L，糖酸转化率达到45％。未检测到其它氨基酸和有机酸副产物。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种生产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用
<160> 13
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 131
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
aaaaaatggc tgtttttgaa aaaaattcta aaggttgttt tacgacagac gataacaggg 60
ttgacggcga ttgagccgac gggtggaaac ccaatacgta atcaacgact tgcaatatag 120
gataacgaat c 131
<210> 2
<211> 74
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
ttgacaatta atcatccggc tcgtataatg tgtggaattg tgagcggata acaatttcac 60
acaggaaaca gacc 74
<210> 3
<211> 185
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
tgaatccgat ggaagcatcc tgttttctct caattttttt atctaaaacc cagcgttcga 60
tgcttctttg agcgaacgat caaaaataag tgccttccca tcaaaaaaat attctcaaca 120
taaaaaactt tgtgtaatac ttgtaacgct acatggagat taactcaatc tagagggtat 180
taata 185
<210> 4
<211> 933
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
atggttaaag tttatgcccc ggcttccagt gccaatatga gcgtcgggtt tgatgtgctc 60
ggggcggcgg tgacacctgt tgatggtgca ttgctcggag atgtagtcac ggttgaggcg 120
gcagagacat tcagtctcaa caacctcgga cgctttgccg ataagctgcc gtcagaacca 180
cgggaaaata tcgtttatca gtgctgggag cgtttttgcc aggaactggg taagcaaatt 240
ccagtggcga tgaccctgga aaagaatatg ccgatcggtt cgggcttagg ctccagtgcc 300
tgttcggtgg tcgcggcgct gatggcgatg aatgaacact gcggcaagcc gcttaatgac 360
actcgtttgc tggctttgat gggcgagctg gaaggccgta tctccggcag cattcattac 420
gacaacgtgg caccgtgttt tctcggtggt atgcagttga tgatcgaaga aaacgacatc 480
atcagccagc aagtgccagg gtttgatgag tggctgtggg tgctggcgta tccggggatt 540
aaagtctcga cggcagaagc cagggctatt ttaccggcgc agtatcgccg ccaggattgc 600
attgcgcacg ggcgacatct ggcaggcttc attcacgcct gctattcccg tcagcctgag 660
cttgccgcga agctgatgaa agatgttatc gctgaaccct accgtgaacg gttactgcca 720
ggcttccggc aggcgcggca ggcggtcgcg gaaatcggcg cggtagcgag cggtatctcc 780
ggctccggcc cgaccttgtt cgctctgtgt gacaagccgg aaaccgccca gcgcgttgcc 840
gactggttgg gtaagaacta cctgcaaaat caggaaggtt ttgttcatat ttgccggctg 900
gatacggcgg gcgcacgagt actggaaaac taa 933
<210> 5
<211> 2463
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
atgcgagtgt tgaagttcgg cggtacatca gtggcaaatg cagaacgttt tctgcgtgtt 60
gccgatattc tggaaagcaa tgccaggcag gggcaggtgg ccaccgtcct ctctgccccc 120
gccaaaatca ccaaccacct ggtggcgatg attgaaaaaa ccattagcgg ccaggatgct 180
ttacccaata tcagcgatgc cgaacgtatt tttgccgaac ttttgacggg actcgccgcc 240
gcccagccgg ggttcccgct ggcgcaattg aaaactttcg tcgatcagga atttgcccaa 300
ataaaacatg tcctgcatgg cattagtttg ttggggcagt gcccggatag catcaacgct 360
gcgctgattt gccgtggcga gaaaatgtcg atcgccatta tggccggcgt attagaagcg 420
cgcggtcaca acgttactgt tatcgatccg gtcgaaaaac tgctggcagt ggggcattac 480
ctcgaatcta ccgtcgatat tgctgagtcc acccgccgta ttgcggcaag ccgcattccg 540
gctgatcaca tggtgctgat ggcaggtttc accgccggta atgaaaaagg cgaactggtg 600
gtgcttggac gcaacggttc cgactactct gctgcggtgc tggctgcctg tttacgcgcc 660
gattgttgcg agatttggac ggacgttgac ggggtctata cctgcgaccc gcgtcaggtg 720
cccgatgcga ggttgttgaa gtcgatgtcc taccaggaag cgatggagct ttcctacttc 780
ggcgctaaag ttcttcaccc ccgcaccatt acccccatcg cccagttcca gatcccttgc 840
ctgattaaaa ataccggaaa tcctcaagca ccaggtacgc tcattggtgc cagccgtgat 900
gaagacgaat taccggtcaa gggcatttcc aatctgaata acatggcaat gttcagcgtt 960
tctggtccgg ggatgaaagg gatggtcggc atggcggcgc gcgtctttgc agcgatgtca 1020
cgcgcccgta ttttcgtggt gctgattacg caatcatctt ccgaatacag catcagtttc 1080
tgcgttccac aaagcgactg tgtgcgagct gaacgggcaa tgcaggaaga gttctacctg 1140
gaactgaaag aaggcttact ggagccgctg gcagtgacgg aacggctggc cattatctcg 1200
gtggtaggtg atggtatgcg caccttgcgt gggatctcgg cgaaattctt tgccgcactg 1260
gcccgcgcca atatcaacat tgtcgccatt gctcagggat cttctgaacg ctcaatctct 1320
gtcgtggtaa ataacgatga tgcgaccact ggcgtgcgcg ttactcatca gatgctgttc 1380
aataccgatc aggttatcga agtgtttgtg attggcgtcg gtggcgttgg cggtgcgctg 1440
ctggagcaac tgaagcgtca gcaaagctgg ctgaagaata aacatatcga cttacgtgtc 1500
tgcggtgttg ccaactcgaa ggctctgctc accaatgtac atggccttaa tctggaaaac 1560
tggcaggaag aactggcgca agccaaagag ccgtttaatc tcgggcgctt aattcgcctc 1620
gtgaaagaat atcatctgct gaacccggtc attgttgact gcacttccag ccaggcagtg 1680
gcggatcaat atgccgactt cctgcgcgaa ggtttccacg ttgtcacgcc gaacaaaaag 1740
gccaacacct cgtcgatgga ttactaccat cagttgcgtt atgcggcgga aaaatcgcgg 1800
cgtaaattcc tctatgacac caacgttggg gctggattac cggttattga gaacctgcaa 1860
aatctgctca atgcaggtga tgaattgatg aagttctccg gcattctttc tggttcgctt 1920
tcttatatct tcggcaagtt agacgaaggc atgagtttct ccgaggcgac cacgctggcg 1980
cgggaaatgg gttataccga accggacccg cgagatgatc tttctggtat ggatgtggcg 2040
cgtaaactat tgattctcgc tcgtgaaacg ggacgtgaac tggagctggc ggatattgaa 2100
attgaacctg tgctgcccgc agagtttaac gccgagggtg atgttgccgc ttttatggcg 2160
aatctgtcac aactcgacga tctctttgcc gcgcgcgtgg cgaaggcccg tgatgaagga 2220
aaagttttgc gctatgttgg caatattgat gaagatggcg tctgccgcgt gaagattgcc 2280
gaagtggatg gtaatgatcc gctgttcaaa gtgaaaaatg gcgaaaacgc cctggccttc 2340
tatagccact attatcagcc gctgccgttg gtactgcgcg gatatggtgc gggcaatgac 2400
gttacagctg ccggtgtctt tgctgatctg ctacgtaccc tctcatggaa gttaggagtc 2460
tga 2463
<210> 6
<211> 2652
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
atgaacgaac aatattccgc attgcgtagt aatgtcagta tgctcggcaa agtgctggga 60
gaaaccatca aggatgcgtt gggagaacac attcttgaac gcgtagaaac tatccgtaag 120
ttgtcgaaat cttcacgcgc tggcaatgat gctaaccgcc aggagttgct caccacctta 180
caaaatttgt cgaacgacga gctgctgccc gttgcgcgtg cgtttagtca gttcctgaac 240
ctggccaaca ccgccgagca ataccacagc atttcgccga aaggcgaagc tgccagcaac 300
ccggaagtga tcgcccgcac cctgcgtaaa ctgaaaaacc agccggaact gagcgaagac 360
accatcaaaa aagcagtgga atcgctgtcg ctggaactgg tcctcacggc tcacccaacc 420
gaaattaccc gtcgtacact gatccacaaa atggtggaag tgaacgcctg tttaaaacag 480
ctcgataaca aagatatcgc tgactacgaa cacaaccagc tgatgcgtcg cctgcgccag 540
ttgatcgccc agtcatggca taccgatgaa atccgtaagc tgcgtccaag cccggtagat 600
gaagccaaat ggggctttgc cgtagtggaa aacagcctgt ggcaaggcgt accaaattac 660
ctgcgcgaac tgaacgaaca actggaagag aacctcggct acaaactgcc cgtcgaattt 720
gttccggtcc gttttacttc gtggatgggc ggcgaccgcg acggcaaccc gaacgtcact 780
gccgatatca cccgccacgt cctgctactc agccgctgga aagccaccga tttgttcctg 840
aaagatattc aggtgctggt ttctgaactg tcgatggttg aagcgacccc tgaactgctg 900
gcgctggttg gcgaagaagg tgccgcagaa ccgtatcgct atctgatgaa aaacctgcgt 960
tctcgcctga tggcgacaca ggcatggctg gaagcgcgcc tgaaaggcga agaactgcca 1020
aaaccagaag gcctgctgac acaaaacgaa gaactgtggg aaccgctcta cgcttgctac 1080
cagtcacttc aggcgtgtgg catgggtatt atcgccaacg gcgatctgct cgacaccctg 1140
cgccgcgtga aatgtttcgg cgtaccgctg gtccgtattg atatccgtca ggagagcacg 1200
cgtcataccg aagcgctggg cgagctgacc cgctacctcg gtatcggcga ctacgaaagc 1260
tggtcagagg ccgacaaaca ggcgttcctg atccgcgaac tgaactccaa acgtccgctt 1320
ctgccgcgca actggcaacc aagcgccgaa acgcgcgaag tgctcgatac ctgccaggtg 1380
attgccgaag caccgcaagg ctccattgcc gcctacgtga tctcgatggc gaaaacgccg 1440
tccgacgtac tggctgtcca cctgctgctg aaagaagcgg gtatcgggtt tgcgatgccg 1500
gttgctccgc tgtttgaaac cctcgatgat ctgaacaacg ccaacgatgt catgacccag 1560
ctgctcaata ttgactggta tcgtggcctg attcagggca aacagatggt gatgattggc 1620
tattccgact cagcaaaaga tgcgggagtg atggcagctt cctgggcgca atatcaggca 1680
caggatgcat taatcaaaac ctgcgaaaaa gcgggtattg agctgacgtt gttccacggt 1740
cgcggcggtt ccattggtcg cggcggcgca cctgctcatg cggcgctgct gtcacaaccg 1800
ccaggaagcc tgaaaggcgg cctgcgcgta accgaacagg gcgagatgat ccgctttaaa 1860
tatggtctgc cagaaatcac cgtcagcagc ctgtcgcttt ataccggggc gattctggaa 1920
gccaacctgc tgccaccgcc ggagccgaaa gagagctggc gtcgcattat ggatgaactg 1980
tcagtcatct cctgcgatgt ctaccgcggc tacgtacgtg aaaacaaaga ttttgtgcct 2040
tacttccgct ccgctacgcc ggaacaagaa ctgggcaaac tgccgttggg ttcacgtccg 2100
gcgaaacgtc gcccaaccgg cggcgtcgag tcactacgcg ccattccgtg gatcttcgcc 2160
tggacgcaaa accgtctgat gctccccgcc tggctgggtg caggtacggc gctgcaaaaa 2220
gtggtcgaag acggcaaaca gagcgagctg gaggctatgt gccgcgattg gccattcttc 2280
tcgacgcgtc tcggcatgct ggagatggtc ttcgccaaag cagacctgtg gctggcggaa 2340
tactatgacc aacgcctggt agacaaagca ctgtggccgt taggtaaaga gttacgcaac 2400
ctgcaagaag aagacatcaa agtggtgctg gcgattgcca acgattccca tctgatggcc 2460
gatctgccgt ggattgcaga gtctattcag ctacggaata tttacaccga cccgctgaac 2520
gtattgcagg ccgagttgct gcaccgctcc cgccaggcag aaaaagaagg ccaggaaccg 2580
gatcctcgcg tcgaacaagc gttaatggtc actattgccg ggattgcggc aggtatgcgt 2640
aataccggct aa 2652
<210> 7
<211> 1191
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
atgtttgaga acattaccgc cgctcctgcc gacccgattc tgggcctggc cgatctgttt 60
cgtgccgatg aacgtcccgg caaaattaac ctcgggattg gtgtctataa agatgagacg 120
ggcaaaaccc cggtactgac cagcgtgaaa aaggctgaac agtatctgct cgaaaatgaa 180
accaccaaaa attacctcgg cattgacggc atccctgaat ttggtcgctg cactcaggaa 240
ctgctgtttg gtaaaggtag cgccctgatc aatgacaaac gtgctcgcac ggcacagact 300
ccggggggca ctggcgcact acgcgtggct gccgatttcc tggcaaaaaa taccagcgtt 360
aagcgtgtgt gggtgagcaa cccaagctgg ccgaaccata agagcgtctt taactctgca 420
ggtctggaag ttcgtgaata cgcttattat gatgcggaaa atcacactct tgacttcgat 480
gcactgatta acagcctgaa tgaagctcag gctggcgacg tagtgctgtt ccatggctgc 540
tgccataacc caaccggtat cgaccctacg ctggaacaat ggcaaacact ggcacaactc 600
tccgttgaga aaggctggtt accgctgttt gacttcgctt accagggttt tgcccgtggt 660
ctggaagaag atgctgaagg actgcgcgct ttcgcggcta tgcataaaga gctgattgtt 720
gccagttcct actctaaaaa ctttggcctg tacaacgagc gtgttggcgc ttgtactctg 780
gttgctgccg acagtgaaac cgttgatcgc gcattcagcc aaatgaaagc ggcgattcgc 840
gctaactact ctaacccacc agcacacggc gcttctgttg ttgccaccat cctgagcaac 900
gatgcgttac gtgcgatttg ggaacaagag ctgactgata tgcgccagcg tattcagcgt 960
atgcgtcagt tgttcgtcaa tacgctgcag gaaaaaggcg caaaccgcga cttcagcttt 1020
atcatcaaac agaacggcat gttctccttc agtggcctga caaaagaaca agtgctgcgt 1080
ctgcgcgaag agtttggcgt atatgcggtt gcttctggtc gcgtaaatgt ggccgggatg 1140
acaccagata acatggctcc gctgtgcgaa gcgattgtgg cagtgctgta a 1191
<210> 8
<211> 1437
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
atgtcaaaca acattcgtat cgaagaagat ctgttgggta ccagggaagt tccagctgat 60
gcctactatg gtgttcacac tctgagagcg attgaaaact tctatatcag caacaacaaa 120
atcagtgata ttcctgaatt tgttcgcggt atggtaatgg ttaaaaaagc cgcagctatg 180
gcaaacaaag agctgcaaac cattcctaaa agtgtagcga atgccatcat tgccgcatgt 240
gatgaagtcc tgaacaacgg aaaatgcatg gatcagttcc cggtagacgt ctaccagggc 300
ggcgcaggta cttccgtaaa catgaacacc aacgaagtgc tggccaatat cggtctggaa 360
ctgatgggtc accaaaaagg tgaatatcag tacctgaacc cgaacgacca tgttaacaaa 420
tgtcagtcca ctaacgacgc ctacccgacc ggtttccgta tcgcagttta ctcttccctg 480
attaagctgg tagatgcgat taaccaactg cgtgaaggct ttgaacgtaa agctgtcgaa 540
ttccaggaca tcctgaaaat gggtcgtacc cagctgcagg acgcagtacc gatgaccctc 600
ggtcaggaat tccgcgcttt cagcatcctg ctgaaagaag aagtgaaaaa catccaacgt 660
accgctgaac tgctgctgga agttaacctt ggtgcaacag caatcggtac tggtctgaac 720
acgccgaaag agtactctcc gctggcagtg aaaaaactgg ctgaagttac tggcttccca 780
tgcgtaccgg ctgaagacct gatcgaagcg acctctgact gcggcgctta tgttatggtt 840
cacggcgcgc tgaaacgcct ggctgtgaag atgtccaaaa tctgtaacga cctgcgcttg 900
ctctcttcag gcccacgtgc cggcctgaac gagatcaacc tgccggaact gcaggcgggc 960
tcttccatca tgccagctaa agtaaacccg gttgttccgg aagtggttaa ccaggtatgc 1020
ttcaaagtca tcggtaacga caccactgtt accatggcag cagaagcagg tcagctgcag 1080
ttgaacgtta tggagccggt cattggccag gccatgttcg aatccgttca cattctgacc 1140
aacgcttgct acaacctgct ggaaaaatgc attaacggca tcactgctaa caaagaagtg 1200
tgcgaaggtt acgtttacaa ctctatcggt atcgttactt acctgaaccc gttcatcggt 1260
caccacaacg gtgacatcgt gggtaaaatc tgtgccgaaa ccggtaagag tgtacgtgaa 1320
gtcgttctgg aacgcggtct gttgactgaa gcggaacttg acgatatttt ctccgtacag 1380
aatctgatgc acccggctta caaagcaaaa cgctatactg atgaaagcga acagtaa 1437
<210> 9
<211> 1266
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
gtggccctgg tcgtacagaa atatggcggt tcctcgcttg agagtgcgga acgcattaga 60
aacgtcgctg aacggatcgt tgccaccaag aaggctggaa atgatgtcgt ggttgtctgc 120
tccgcaatgg gagacaccac ggatgaactt ctagaacttg cagcggcagt gaatcccgtt 180
ccgccagctc gtgaaatgga tatgctcctg actgctggtg agcgtatttc taacgctctc 240
gtcgccatgg ctattgagtc ccttggcgca gaagcccaat ctttcacggg ctctcaggct 300
ggtgtgctca ccaccgagcg ccacggaaac gcacgcattg ttgatgtcac tccaggtcgt 360
gtgcgtgaag cactcgatga gggcaagatc tgcattgttg ctggtttcca gggtgttaat 420
aaagaaaccc gcgatgtcac cacgttgggt cgtggtggtt ctgacaccac tgcagttgcg 480
ttggcagctg ctttgaacgc tgatgtgtgt gagatttact cggacgttga cggtgtgtat 540
accgctgacc cgcgcatcgt tcctaatgca cagaagctgg aaaagctcag cttcgaagaa 600
atgctggaac ttgctgctgt tggctccaag attttggtgc tgcgcagtgt tgaatacgct 660
cgtgcattca atgtgccact tcgcgtacgc tcgtcttata gtaatgatcc cggcactttg 720
attgccggct ctatggagga tattcctgtg gaagaagcag tccttaccgg tgtcgcaacc 780
gacaagtccg aagccaaagt aaccgttctg ggtatttccg ataagccagg cgaggctgcg 840
aaggttttcc gtgcgttggc tgatgcagaa atcaacattg acatggttct gcagaacgtc 900
tcttctgtag aagacggcac caccgacatc atcttcacct gccctcgttc cgacggccgc 960
cgcgcgatgg agatcttgaa gaagcttcag gttcagggca actggaccaa tgtgctttac 1020
gacgaccagg tcggcaaagt ctccctcgtg ggtgctggca tgaagtctca cccaggtgtt 1080
accgcagagt tcatggaagc tctgcgcgat gtcaacgtga acatcgaatt gatttccacc 1140
tctgagattc gtatttccgt gctgatccgt gaagatgatc tggatgctgc tgcacgtgca 1200
ttgcatgagc agttccagct gggcggcgaa gacgaagccg tcgtttatgc aggcaccgga 1260
cgctaa 1266
<210> 10
<211> 888
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
atgcctggtt cattacgtaa aatgccggtc tggttaccaa tagtcatatt gctcgttgcc 60
atggcgtcta ttcagggtgg agcctcgtta gctaagtcac tttttcctct ggtgggcgca 120
ccgggtgtca ctgcgctgcg tctggcatta ggaacgctga tcctcatcgc gttctttaag 180
ccatggcgac tgcgctttgc caaagagcaa cggttaccgc tgttgtttta cggcgtttcg 240
ctgggtggga tgaattatct tttttatctt tctattcaga cagtaccgct gggtattgcg 300
gtggcgctgg agttcaccgg accactggcg gtggcgctgt tctcttctcg tcgcccggta 360
gatttcgtct gggttgtgct ggcggttctt ggtctgtggt tcctgctacc gctggggcaa 420
gacgtttccc atgtcgattt aaccggctgt gcgctggcac tgggggccgg ggcttgttgg 480
gctatttaca ttttaagtgg gcaacgcgca ggagcggaac atggccctgc gacggtggca 540
attggttcgt tgattgcagc gttaattttc gtgccaattg gagcgcttca ggctggtgaa 600
gcactctggc actggtcggt tattccattg ggtctggctg tcgctattct ctcgaccgct 660
ctgccttatt cgctggaaat gattgccctc acccgtttgc caacacggac atttggtacg 720
ctgatgagca tggaaccggc gctggctgcc gtttccggga tgattttcct cggagaaaca 780
ctgacaccca tacagctact ggcgctcggc gctatcatcg ccgcttcaat ggggtctacg 840
ctgacagtac gcaaagagag caaaataaaa gaattagaca ttaattaa 888
<210> 11
<211> 2932
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
atgcgaattg gcataccaag agaacggtta accaatgaaa cccgtgttgc agcaacgcca 60
aaaacagtgg aacagctgct gaaactgggt tttaccgtcg cggtagagag cggcgcgggt 120
caactggcaa gttttgacga taaagcgttt gtgcaagcgg gcgctgaaat tgtagaaggg 180
aatagcgtct ggcagtcaga gatcattctg aaggtcaatg cgccgttaga tgatgaaatt 240
gcgttactga atcctgggac aacgctggtg agttttatct ggcctgcgca gaatccggaa 300
ttaatgcaaa aacttgcgga acgtaacgtg accgtgatgg cgatggactc tgtgccgcgt 360
atctcacgcg cacaatcgct ggacgcacta agctcgatgg cgaacatcgc cggttatcgc 420
gccattgttg aagcggcaca tgaatttggg cgcttcttta ccgggcaaat tactgcggcc 480
gggaaagtgc caccggcaaa agtgatggtg attggtgcgg gtgttgcagg tctggccgcc 540
attggcgcag caaacagtct cggcgcgatt gtgcgtgcat tcgacacccg cccggaagtg 600
aaagaacaag ttcaaagtat gggcgcggaa ttcctcgagc tggattttaa agaggaagct 660
ggcagcggcg atggctatgc caaagtgatg tcggacgcgt tcatcaaagc ggaaatggaa 720
ctctttgccg cccaggcaaa agaggtcgat atcattgtca ccaccgcgct tattccaggc 780
aaaccagcgc cgaagctaat tacccgtgaa atggttgact ccatgaaggc gggcagtgtg 840
attgtcgacc tggcagccca aaacggcggc aactgtgaat acaccgtgcc gggtgaaatc 900
ttcactacgg aaaatggtgt caaagtgatt ggttataccg atcttccggg ccgtctgccg 960
acgcaatcct cacagcttta cggcacaaac ctcgttaatc tgctgaaact gttgtgcaaa 1020
gagaaagacg gcaatatcac tgttgatttt gatgatgtgg tgattcgcgg cgtgaccgtg 1080
atccgtgcgg gcgaaattac ctggccggca ccgccgattc aggtatcagc tcagccgcag 1140
gcggcacaaa aagcggcacc ggaagtgaaa actgaggaaa aatgtacctg ctcaccgtgg 1200
cgtaaatacg cgttgatggc gctggcaatc attctttttg gctggatggc aagcgttgcg 1260
ccgaaagaat tccttgggca cttcaccgtt ttcgcgctgg cctgcgttgt cggttattac 1320
gtggtgtgga atgtatcgca cgcgctgcat acaccgttga tgtcggtcac caacgcgatt 1380
tcagggatta ttgttgtcgg agcactgttg cagattggcc agggcggctg ggttagcttc 1440
cttagtttta tcgcggtgct tatagccagc attaatattt tcggtggctt caccgtgact 1500
cagcgcatgc tgaaaatgtt ccgcaaaaat taaggggtaa catatgtctg gaggattagt 1560
tacagctgca tacattgttg ccgcgatcct gtttatcttc agtctggccg gtctttcgaa 1620
acatgaaacg tctcgccagg gtaacaactt cggtatcgcc gggatggcga ttgcgttaat 1680
cgcaaccatt tttggaccgg atacgggtaa tgttggctgg atcttgctgg cgatggtcat 1740
tggtggggca attggtatcc gtctggcgaa gaaagttgaa atgaccgaaa tgccagaact 1800
ggtggcgatc ctgcatagct tcgtgggtct ggcggcagtg ctggttggct ttaacagcta 1860
tctgcatcat gacgcgggaa tggcaccgat tctggtcaat attcacctga cggaagtgtt 1920
cctcggtatc ttcatcgggg cggtaacgtt cacgggttcg gtggtggcgt tcggcaaact 1980
gtgtggcaag atttcgtcta aaccattgat gctgccaaac cgtcacaaaa tgaacctggc 2040
ggctctggtc gtttccttcc tgctgctgat tgtatttgtt cgcacggaca gcgtcggcct 2100
gcaagtgctg gcattgctga taatgaccgc aattgcgctg gtattcggct ggcatttagt 2160
cgcctccatc ggtggtgcag atatgccagt ggtggtgtcg atgctgaact cgtactccgg 2220
ctgggcggct gcggctgcgg gctttatgct cagcaacgac ctgctgattg tgaccggtgc 2280
gctggtcggt tcttcggggg ctatcctttc ttacattatg tgtaaggcga tgaaccgttc 2340
ctttatcagc gttattgcgg gtggtttcgg caccgacggc tcttctactg gcgatgatca 2400
ggaagtgggt gagcaccgcg aaatcaccgc agaagagaca gcggaactgc tgaaaaactc 2460
ccattcagtg atcattactc cggggtacgg catggcagtc gcgcaggcgc aatatcctgt 2520
cgctgaaatt actgagaaat tgcgcgctcg tggtattaat gtgcgtttcg gtatccaccc 2580
ggtcgcgggg cgtttgcctg gacatatgaa cgtattgctg gctgaagcaa aagtaccgta 2640
tgacatcgtg ctggaaatgg acgagatcaa tgatgacttt gctgataccg ataccgtact 2700
ggtgattggt gctaacgata cggttaaccc ggcggcgcag gatgatccga agagtccgat 2760
tgctggtatg cctgtgctgg aagtgtggaa agcgcagaac gtgattgtct ttaaacgttc 2820
gatgaacact ggctatgctg gtgtgcaaaa cccgctgttc ttcaaggaaa acacccacat 2880
gctgtttggt gacgccaaag ccagcgtgga tgcaatcctg aaagctctgt aa 2932
<210> 12
<211> 993
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
atgcgcattg gcattgtggg cgcgaccggc gcggtgggcc aagaaaccat tcaagtgctg 60
aaagatcgcg gctttccggt gaccgaactg catctgtttg cgagcgaacg cagcgcgggc 120
aaaaccaccg aaaccgcgtt tggcaccatt accattgaac cgtttagcgt ggatgcggcg 180
cgcggcatgg atattgtgtt tctggcggtg agcggcgatt ttgcgaaaga atatgcgccg 240
cagattgcgg cggaaggcgg cgcggtggtg attgataaca gcagcgcgtt tcgctatgat 300
gatgcggtgc cgctggtggt gccggaaatt aacggccgcc gcgcgctggg tcagaaactg 360
attgcgaacc cgaactgcac caccgcgatt ctgctgatgg cgctggcgcc gctgcatgaa 420
gcgtttggcg tgaaacgcgc gattgtgagc acgtatcaag cggcgagcgg cgccggcgcg 480
gagggcatga ccgaactgga acaaggcgcg cgtcagtatc tggcgggcga accggtgacc 540
gcgagcaaat ttgcgcatcc gctggcgttt aacctgattc cgcatattga tagctttcaa 600
gataacggct atacccgcga agaaatgaaa gtgctgtggg aaacccgcaa aattatggaa 660
gcgccggaag tgctgctgag ctgcaccgcg gtgcgcgtgc cgaccatgcg cgcgcatgcg 720
gaagccgtga cgatcgaaac ccgccacccg gtgaccccgg cggccgcgcg tgaggtgctg 780
gcgaaagcgc aaggcgtgac cctggcggat gatccggcga acaaactgta tccgatgccg 840
ttaaccgcga gcagcaaata tgatgtggaa gtgggccgca ttcgcgaaag cctggtgttt 900
ggcgaaaccg gcctggattt ttttgtgtgc ggcgatcagc tgctgaaagg cgcggcgctg 960
aacaccgtgc agattgcgga actgctggtg taa 993
<210> 13
<211> 804
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
atgctgaaca ttgtgatgat tggctgcggc gcgattggtg cgggcgttct ggaactgctg 60
gaaaacgatc cgcagctgcg cgtggatgcg gtgattgtgc cgcgcgatag cgagacccaa 120
gtgcgtcatc gcctggcgag cctgcgccgt ccaccgcgcg ttttaagcgc cctgccggcc 180
ggcgaacgcc cggatctgct ggtggaatgc gcgggccatc gcgcgattga acagcatgtg 240
ttaccggcgc tggcgcaagg cattccatgc ctggtggtga gcgtgggcgc cctgagcgag 300
ccgggtctgg tggagcgtct ggaagcggcc gcgcaagcgg gtggcagccg cattgaactg 360
ctgccgggcg cgattggcgc cattgatgcg ttaagcgcgg cgcgcgtggg cggcctggaa 420
agtgtgcgct ataccggccg caagccggcg agcgcgtggt taggcacccc gggcgaaacc 480
gtgtgcgatc tgcagcgcct ggaaaaagcg cgcgtgattt ttgatggcag cgcgcgcgaa 540
gcggcgcgcc tgtatccgaa aaacgcgaac gtggccgcga ccctgagcct ggcgggttta 600
ggcctggatc gcacccaagt gcgcctgatt gcggatccgg aaagctgcga aaacgtgcat 660
caagtggaag cgagcggcgc gtttggcggc tttgaactga ccctgcgcgg caaaccgctg 720
gcggcgaacc cgaaaacgag cgcgctgacc gtgtatagcg tggtgcgcgc gctgggcaac 780
catgcgcatg cgattagcat ttaa 804
Claims (10)
1.一种生产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌，其特征在于：所述生产L-高丝氨酸的重组大肠杆菌以大肠杆菌为出发菌株，敲除乳糖操纵子阻遏蛋白编码基因lacI，弱化高丝氨酸激酶编码基因thrB的表达，过表达天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I编码基因thrA、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc、天冬氨酸转氨酶编码基因aspC、天冬氨酸氨裂合酶编码基因aspA、苏氨酸和高丝氨酸外排系统编码基因rhtA和吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB，引入异源天冬氨酸激酶编码基因lysC、天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asd和天冬氨酸脱氢酶编码基因aspdh；
其中，
通过将thrB的原启动子替换为启动子PfliC弱化高丝氨酸激酶编码基因thrB的表达；
所述天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I编码基因thrA、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc、天冬氨酸转氨酶编码基因aspC、天冬氨酸氨裂合酶编码基因aspA、天冬氨酸激酶编码基因lysC、吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB、天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asd和天冬氨酸脱氢酶编码基因aspdh通过启动子Ptrc调控表达；
所述苏氨酸和高丝氨酸外排系统编码基因rhtA通过启动子Plpp调控表达。
2.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：将thrA分别整合至ycgH、ydeU、yjhE和tfaD基因位点；将ppc整合至yeeL基因位点；将aspC整合至ylbE基因位点；将aspA整合至ycdN基因位点；将lysC整合至ycjV基因位点；将pntAB分别整合至ilvG和ygaY基因位点；将rhtA整合至yjiP基因位点；将asd整合至yeeP基因位点；将aspdh整合至yghX基因位点。
3.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述启动子PfliC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，启动子Ptrc的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，启动子Plpp的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：高丝氨酸激酶编码基因thrB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，天冬氨酸激酶I/高丝氨酸脱氢酶I编码基因thrA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc的核苷酸序列如SEQ IDNO.6所示，天冬氨酸转氨酶编码基因aspC的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，天冬氨酸氨裂合酶编码基因aspA的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示，天冬氨酸激酶编码基因lysC的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，苏氨酸和高丝氨酸外排系统编码基因rhtA的核苷酸序列如SEQID NO.10所示，吡啶核苷酸转氢酶编码基因pntAB的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，天冬氨酸半醛脱氢酶编码基因asd的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，天冬氨酸脱氢酶编码基因aspdh的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示。
5.根据权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于：所述出发菌株为Escherichiacoli W3110。
6.权利要求1-5任一项所述的重组大肠杆菌在制备L-高丝氨酸中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：发酵培养过程中，发酵温度为35-37℃，初始转速为180-300r/min，pH为7.0-7.2，葡萄糖浓度控制在0.05-5g/L。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：发酵培养之前，将所述重组大肠杆菌活化后在种子培养基中培养得到种子液，再将种子液接种至发酵培养基中进行发酵培养。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：发酵罐发酵时，发酵培养之前，将所述重组大肠杆菌活化后在种子培养基中培养得到种子液，其中，培养温度为35-37℃，pH为7.0-7.2，控制溶氧为25-30％，再将种子液按10-20％的接种量接种至发酵培养基中。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，发酵培养基的组成为：10-20g/L葡萄糖，10-15g/L玉米浆,1-5g/L酵母粉，1-5g/L蛋白胨,1-5g/L KH2PO4，0.5-3g/L MgSO4·7H2O，,1-5g/L柠檬酸或柠檬酸盐，10-30mg/L FeSO4·7H2O，10-20mg/L MnSO4·H2O，0.2-2mg/L VH和0.3-1mg/L VB1，加或不加甜菜碱。
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|---|---|
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113151127A (zh) * | 2017-02-27 | 2021-07-23 | 四川利尔生物科技有限公司 | 一种l-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用 |
| CN116925992A (zh) * | 2023-08-01 | 2023-10-24 | 杭州精构生物科技有限责任公司 | 一种发酵生产l-高丝氨酸的工程菌及其构建方法和应用 |
| CN118086346A (zh) * | 2024-04-26 | 2024-05-28 | 天津科技大学 | 一种羟基酪醇生产菌株及其构建方法与应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112779204A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-05-11 | 天津科技大学 | 一种生产l-高丝氨酸的基因工程菌及其应用 |
| CN113956992A (zh) * | 2021-03-18 | 2022-01-21 | 中国科学院微生物研究所 | 一株耐受l-高丝氨酸的大肠杆菌及其应用 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113151127B (zh) * | 2017-02-27 | 2024-05-28 | 湖南利尔生物科技有限公司 | 一种l-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用 |
| CN109666617B (zh) * | 2017-10-13 | 2021-02-02 | 四川利尔生物科技有限公司 | 一种l-高丝氨酸的生产菌株及其构建方法和应用 |
| CN109055290B (zh) * | 2018-07-27 | 2021-04-06 | 浙江工业大学 | 一种高产l-高丝氨酸的重组大肠杆菌及其应用 |
| CN113122487B (zh) * | 2020-01-10 | 2022-05-24 | 中国科学院微生物研究所 | 一种高产l-高丝氨酸的重组菌及其制备方法与应用 |
| CN112592875B (zh) * | 2020-12-08 | 2022-06-10 | 鲁东大学 | 一株高丝氨酸生产菌及其构建方法和应用 |
-
2022
- 2022-06-15 CN CN202210675657.2A patent/CN115109738B/zh active Active
- 2022-08-24 WO PCT/CN2022/114482 patent/WO2023240794A1/zh unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112779204A (zh) * | 2021-01-26 | 2021-05-11 | 天津科技大学 | 一种生产l-高丝氨酸的基因工程菌及其应用 |
| CN113956992A (zh) * | 2021-03-18 | 2022-01-21 | 中国科学院微生物研究所 | 一株耐受l-高丝氨酸的大肠杆菌及其应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| SHUYAN ZHANG等: "Metabolic engineering of Escherichia coli for efcient ectoine production", SYSTEMS MICROBIOLOGY AND BIOMANUFACTURING, vol. 1, pages 1 * |
| YANAN HAO等: "High-yield production of L-valine in engineered Escherichia coli by a novel two-stage fermentation", METABOLIC ENGINEERING, vol. 62, pages 198 - 206, XP086318443, DOI: 10.1016/j.ymben.2020.09.007 * |
| YANJUN LI等: "Multiple-step chromosomal integration of divided segments from a large DNA fragment via CRISPR/Cas9 in Escherichia coli", JOURNAL OF INDUSTRIAL MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, vol. 46, no. 1, pages 85 * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113151127A (zh) * | 2017-02-27 | 2021-07-23 | 四川利尔生物科技有限公司 | 一种l-高丝氨酸生产菌株及其构建方法和应用 |
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