CN1834227A - 黄色短杆菌突变株及用于发酵法生产l－亮氨酸的生产工艺 - Google Patents

Abstract

黄色短杆菌突变株及用于发酵法生产L－亮氨酸的生产工艺。以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)HL41(CICC 10135)为出发菌种，选育具有遗传标记(Met^－+Ile^L+2－TA^r+α－AB^r+β－HL^r+Rif ^r+SG^r)的突变株TK0303，使其具有L－亮氨酸的生物合成能力。用黄色短杆菌突变株TK0303经扩培、发酵培养、及L－亮氨酸的提取步骤可得到L－亮氨酸粗品，进一步精制可得到L－亮氨酸纯品。本发明利用突变株发酵生产L－亮氨酸，可以大大提高L－亮氨酸的产率，最高产量可达30g/L，其产量完全满足实现大规模工业化生产的要求。本发明利用金属膜过滤法预处理发酵液，并以离子交换法提取L－亮氨酸，纯度可达98％以上，提取率55％。

Description

黄色短杆菌突变株及用于发酵法生产L-亮氨酸的生产工艺

【技术领域】：本发明属于生化工程领域，涉及一种棒杆菌属(Brevibacterium flavum)菌种以及应用该菌种发酵生产L-亮氨酸的方法。

【背景技术】：L-亮氨酸(L-leucine)的化学名为L-α-氨基异己酸，别名L-2-氨基-4-甲基戊酸，L-亮氨酸是人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的八大必需氨基酸之一，又是三种支链氨基酸之一，因其特殊的结构和功能，因此，在人类生命代谢中具有特别重要的地位。

L-亮氨酸生产方法有提取法、化学合成法和发酵法三类，但目前在工业生产上实施的只有发酵法。由于提取法和化学合成法生产的L-亮氨酸与其它异构体分离困难，因而均未能实现工业化生产。

发酵法就是利用微生物的代谢作用，生物合成并过量积累L-亮氨酸，包括添加前体物发酵法和直接发酵法两类。

添加前体物发酵法又称微生物转化法。这种方法使用葡萄糖作为发酵碳源、能源，再添加特异的前体物质即在氨基酸生物合成途径中的一些合适中间代谢产物，以避免氨基酸生物合成途径中的反馈调节作用，经微生物作用将其有效转化为目的氨基酸。由于其前体物质稀少或价格昂贵，目前已很少采用此法生产L-亮氨酸。

直接发酵法是借助于微生物具有合成自身所需氨基酸的能力，通过对特定微生物的诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制和反馈阻遏，从而达到过量积累某种氨基酸的目的。目前，亮氨酸产生菌大多由谷氨酸产生菌黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌诱变选育而来。

该法具有原料成本低，来源广泛，产品纯度高，反应条件温和等优点，具有工业化生产的潜力。

随着人口老龄化和人们保健意识的增强，对氨基酸的需求也在不断的增加。据报道，仅氨基酸输液一项，从1997年到2000年，每年以15％～20％的进度递增，年销售额达10亿元以上。而目前，L-亮氨酸的生产主要以日本为主。1996年世界氨基酸总产量为165万吨，其中L-亮氨酸为500吨，而日本就占了350吨。

近年来，随着亮氨酸在医药、食品等方面应用的开拓，市场需求量不断增加。提高亮氨酸发酵产率、降低生产成本，实现亮氨酸工业化生产已成为目前一个重要课题。目前亮氨酸工业化生产还存在着一些问题：(1)产酸率低：国内产酸率最高达30g/L，而L-亮氨酸在国外已经实现大规模工业化生产，产酸水平已达到35g/L。(2)转化率低：目前发酵生产L-亮氨酸的最高转化率仅为20％，提高转化率对工业化生产有极其重要的意义。(3)降低提取分离成本：寻找最佳的提取途径，包括所用试剂，提取工艺及效率等。(4)重组菌株的遗传改造：重组菌株在发酵培养基中的稳定性以及工程菌工业化生产的可行性研究。

目前国内虽然已有少数生产厂家，但菌株产酸水平不高，产量较小，远不能满足国内市场的需求。基于目前我国对发酵法生产L-亮氨酸的研究与生产水平与国际同行有较大差距，因此，开展L-亮氨酸高产菌的选育与发酵条件优化的研究，对于实现国内亮氨酸产业化，促进医药行业的发展有重要的意义。

【发明内容】：本发明目的之一是提供一种新的棒杆菌属的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)，该菌具有提高L-亮氨酸产率的能力。

本发明的目的之二是解决现有法和，无法实现产业化生产的问题，提供用上述菌种发酵法生产L-亮氨酸的生产工艺。

本发明提供的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TK0303，以棒杆菌属的黄色短杆菌HL41(保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 10135)为出发菌株，经硫酸二乙酯(DES)和紫外线诱变处理定向选育出一株L-亮氨酸生产菌株TK0303(Met^-+Ile^L+2-TA^r+α-AB^r+β-HL^r+Rif^r+SG^r)，其遗传标记为蛋氨酸缺陷(Met^-)、异亮氨酸缺陷(Ile^L)、α-氨基丁酸(α-AB^r)抗性、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TA^r)、β-羟基亮氨酸抗性(β-HL^r)、磺胺胍抗性(SG^r)、利福平抗性(Rif^r)，使其具有L-亮氨酸的生物合成能力。

(注：黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TK0303(Met^-+Ile^L+2-TA^r+α-AB^r+β-HL^r+Rif^r+SG^r)曾于2004年3月在《天津科技大学学报》第19卷第1期发表，现保藏于天津科技大学代谢控制发酵研究室，公众如有需要，可径直与该研究室联系。)

一种利用上述黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TK0303直接发酵法生产L-亮氨酸的生产工艺，包括：

A.将黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TK0303进行常规扩大培养；

B.将步骤A中获得的扩大培养的菌种接入发酵培养基进行发酵：发酵培养基中碳源含量应为1％～30％，氮碳比N∶C应介于5∶100～50∶100之间，无机盐含量应为0.0001～10％，发酵培养基的初始PH6.0～8.0，培养温度20℃～40℃，振荡培养或发酵罐培养2～5天，接种量为1％～15％(V/V)；发酵过程中，添加碳酸钙和流加尿素、氨水调节发酵培养基的PH6.0～8.0；

C.L-亮氨酸的提取步骤：采用金属膜过滤除菌体和蛋白，而后采用活性炭对滤液进行脱色处理，活性炭用量为0.1％～5％，pH范围0～14，操作温度为0～40℃，脱色时间为1～60min；脱色液通过阳离子交换法提取L-亮氨酸，离子交换过程中的上柱料液的pH范围0～14，操作温度为0～40℃，流速为1～6倍床体积/h。使用旋转蒸发仪将离子交换洗脱液在60℃～70℃减压蒸发至出结晶，加入一倍体积50％～95％乙醇，冷藏过夜，进行重结晶，烘干后得L-亮氨酸结晶。

上述B步发酵培养基中的碳源为：糖，即葡萄糖，蔗糖，果糖，麦芽糖，甘露糖，淀粉和糖浆；或糖醇，甘油；或有机酸，醋酸；或低分子醇，乙醇；碳源含量最佳为10％～20％。

上述B步中采用分阶段供氧控制模式，发酵前期溶氧控制在20～60％，后期控制在10～40％。

上述B步发酵培养基中的氮源为氨或铵盐：硫酸铵，醋酸铵，硝酸铵，磷酸铵，乙酸铵或氯化铵；或有机氮：蛋白胨，牛肉膏，玉米浆，或豆饼水解液。

上述B步发酵培养基中无机盐为：磷酸钾，硫酸镁，碳酸钙，硫酸亚铁，或硫酸锰。

发酵培养基中可加入营养物，氨基酸及维生素。

上述C步中的金属膜采用不锈钢管式膜分离系统，其孔径为50nm～100nm，截留分子量2000～50000MW，pH范围0～14，操作温度为0～40℃，操作压差为0.2～1.0MPa。

上述C步中，洗脱液为0.1～10mol/L氨水，氯化铵溶液，硫酸铵溶液，醋酸铵溶液，乙醇溶液。

上述C步中的离子交换树脂采用强酸型阳离子交换树脂，JK006，HD-8，732，D061，D001-CC和HZ014；离子交换柱采用串联方式。

上述C步中金属膜过滤除菌体和蛋白前，发酵液进行预处理，用碱将发酵液pH调至9～12，搅拌并加热到80℃，加入发酵液0.1％～0.5％硅藻土后注入不锈钢管式膜分离系统，操作温度控制在50～60℃，进膜压力与出膜压力差0.3～0.8kg/cm²，滤速控制在200～300ml/min。

本发明的优点和积极效果：本发明利用黄色短杆(Brevibacterium flavum)突变株TK0303，在10L全自动控制发酵罐采用该生产工艺发酵生产L-亮氨酸，可以大大提高L-亮氨酸的产率，最高产量可达30g/L。本发明利用金属膜过滤法预处理发酵液，并以离子交换法提取L-亮氨酸，纯度可达98％以上，提取率55％

选育磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活力减弱、天冬氨酸族氨基酸缺陷等突变株，可增大L-亮氨酸生物合成代谢流，节约碳源，从而有利于L-亮氨酸产量的提高。

2-噻唑丙氨酸(2-TA)是L-亮氨酸和L-缬氨酸的结构类似物，通过选育2-TA^r抗性标记，有利于解除乙酰羟基酸合成酶和α-异丙基苹果酸合成酶所受到的反馈抑制和阻遏。α-氨基丁酸(α-AB)是缬氨酸的结构类似物，选育α-AB^r有利于解除缬氨酸对乙酰羟基酸合成酶的反馈抑制。β-羟基亮氨酸(β-HL)是亮氨酸的结构类似物，选育β-HL^r等抗性标记，有利于解除终产物亮氨酸对L-亮氨酸生物合成酶系所受到的反馈抑制和阻遏，从而大幅度地提高L-亮氨酸的产量。2-TA^r和β-HL^r这两个标记，对L-亮氨酸高产菌的育种非常重要。

磺胺类药物是细菌生长所必需的代谢物对氨基苯甲酸(PABA)的竞争性抑制物。它们竞争性地与二氢叶酸合成酶结合，阻止或取代了对氨基苯甲酸掺入到叶酸分子中去，从而阻断了细菌细胞重要组分叶酸的合成。利用磺胺类药物如磺胺胍抗性(SG^r)突变株，从而解除磺胺胍的抑制作用，并造成四氢叶酸的大量合成。四氢叶酸是多种酶的辅酶，起一碳基转移作用，因而对维持菌体的正常代谢十分重要。

筛选利福平抗性(Rif^r)菌株有利于L-亮氨酸产量提高，其机制尚不清楚，可能是通过改变菌体的正常代谢，使像氨基酸这类的代谢产物大量的积累。利福平为半合成广谱抗菌素，对革兰氏阳性和阴性细菌以及结核分支杆菌均有明显抗菌效应。

利用金属膜过滤预处理可以有效除去发酵液中的菌体、杂蛋白质等悬浮物，有利于L-亮氨酸的吸附。使用001×7苯乙烯强酸型阳离子交换树脂，发酵液用草酸酸化至pH＝2，双柱串连吸附，用pH＝9的0.5mol/L NH₄Cl洗脱，经过活性炭吸附脱色后，用95％乙醇结晶纯化，纯度可达98％以上，提取率55％。

【具体实施方式】：

实施例1：突变株TK0303的获得

本发明提供的黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TK0303，以棒杆菌属的黄色短杆菌HL41为出发菌株，经硫酸二乙酯(DES)和紫外线诱变处理，定向选育出一株L-亮氨酸生产菌株TK0303，其遗传标记为蛋氨酸缺陷(Met^-)、异亮氨酸缺陷(Ile^L)、α-氨基丁酸(α-AB^r)抗性、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TA^r)、β-羟基亮氨酸抗性(β-HL^r)、磺胺胍抗性(SG^r)、利福平抗性(Rif^r)(Met^-+Ile^L+2-TA^r+α-AB^r+β-HL^r+Rif^r+SG^r)，使其具有L-亮氨酸的生物合成能力。

L-亮氨酸生产菌株的具体选育过程：

第一步、诱变初筛：

将经DES常规诱变后菌株，经离心洗涤制成菌悬液，稀释后涂布于基本培养基平板(葡萄糖20g/L，(NH₄)₂SO₄ 10g/L，KH₂PO₄·3H₂O 1g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，FeSO₄·7H₂O 0.01g/L，MnSO₄·H₂O 0.01g/L，生物素100μg/L，VB₁ 100μg/L，琼脂粉20g/L，PH 7.0～7.2)以及抗性药物梯度平板或添加了甲硫氨酸或异亮氨酸补充培养基平板，28℃恒温静置培养4～6天，挑选在抗性药物梯度平板上生长的单菌落或在甲硫氨酸补充培养基平板上生长而在基本培养基平板不生长的单菌落，并于斜面内保存待筛。

第二步、诱变复筛

摇瓶水平上对原菌株与各突变株产L-亮氨酸性能比较。

从上步新鲜斜面分别挑取一环原菌株与各突变株菌苔于种子培养基中(无水葡萄糖37g/L，豆饼水解液25mL/L，尿素2g/L(分消后补加)，KH₂PO₄·3H₂O 1.3g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，MnSO₄·H₂O 0.01g/L，L-Met 0.4g/L，V_B1 300μG/L，V_H200μg/L，pH7.0～7.2)，250mL三角瓶装液量25mL，9层纱布封口。置于旋转式摇床上(200r/min)，28℃振荡培养36小时。以接种量10％，初始pH7.0，接入发酵培养基中(葡萄糖150g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，NH₄Ac 15g/L，KH₂PO₄·3H₂O 1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4G/L，CaCO₃ 30g/L(分消)，MnSO₄·H₂O 10mg/l，生物素50μg/L，V_B1 300μg/L，L-Met 0.7g/L，L-Ile 63mg/L，L-Glu 0.42g/L，玉米浆37mL/L)。500mL三角瓶装液量50mL。28℃振荡培养72小时，转速为220r/min，间歇流加30％尿素控制pH在7.0左右。在所有的突变株中，L-亮氨酸产量最高的突变株为黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TK0303，其L-亮氨酸产量为19.4g/L。

实施例2：以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TK0303摇瓶发酵生产L-亮氨酸

从新鲜斜面挑取一环TK0303菌株的菌苔于种子培养基中，斜面种子培养及种子与发酵培养条件均同实施例1，种子培养基成分同实施例2。以接种量10％，初始pH7.0，接入发酵培养基中(葡萄糖70g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，NH₄Ac 15g/L，KH₂PO₄·3H₂O 1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，CaCO₃ 30g/L(分消)，MnSO₄·H₂O10mg/L，生物素50μg/L，V_B1 300μg/L，Met 0.7g/L，L-Ile 63mg/L，L-Glu 0.42g/L，玉米浆37mL/L)。500mL三角瓶装液量50mL。28℃振荡培养72小时，转速为220r/min，间歇流加30％尿素控制pH在7.0左右。当残糖量下降至15～20g/L时开始补料，分几次补完，每次补料后总糖不超过25～30g/L，发酵结束后，L-Leu产量可达21.8g/L。

实施例3：以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TK0303在10升发酵罐生产L-亮氨酸

从新鲜斜面挑取一环TK0303菌株的菌苔于种子培养基中，斜面种子培养及种子培养条件均同实施例1，种子培养基成分同实施例2。按10％接种量将种子液600mL接入10L发酵罐中，发酵培养基成分包括：葡萄糖150g/L，(NH₄)₂SO₄20g/L，NH₄Ac 15g/L，玉米浆37mL/L，KH₂PO₄·3H₂O 1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，MnSO₄·H₂O 10mg/L，生物素0.05mg/L，V_B1 300mμg/L，Met 0.7g/L，Glu0.42g/L，Ile 63mg/L。初始装液量6L，通风量500L/h，搅拌转速600r/min，培养温度28℃，通过自动流加氨水溶液控制pH7.0±0.05，发酵72h后，L-Leu产量可达24.52g/L。

实施例4：以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TK0303在10升发酵罐采用流加方式生产L-亮氨酸

从新鲜斜面挑取一环TK0303菌株的菌苔于种子培养基中，斜面种子培养及种子与同实施例1，种子培养基成分同实施例2。按10％接种量将种子液600mL接入10L发酵罐中，发酵培养基成分包括：葡萄糖70g/L，(NH₄)₂SO₄ 20g/L，NH₄Ac15g/L，玉米浆37mL/L，KH₂PO₄·3H₂O 1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，MnSO₄·H₂O10mg/L，生物素0.05mg/L，V_B1300mμg/L，Met 0.7g/L，Glu 0.42g/L，Ile 63mg/L。初始装液量6L，通风量500L/h，搅拌转速600r/min，培养温度28℃，通过自动流加氨水溶液控制pH7.0±0.05。发酵期间，每隔2h取样测残糖，当残糖降至2～3g/L即补入浓度80％葡萄糖。根据耗糖速率确定补料量，维持葡萄糖浓度2～3g/L。补料结束，残糖低于2g/L结束发酵。TK0303菌株在发酵15h后进入产酸期，在大约60h达到产酸高峰期，其最高产酸量达29.47g/L。

实施例5：L-亮氨酸的提取和精制

用NaOH将10L-亮氨酸发酵液pH调至11，搅拌并80℃水溶加热10min，加入0.1％硅藻土，将发酵液倒入金属膜过滤器，控制温度50℃～60℃，进膜压力与出膜压力差0.6kg/cm²，当进出膜压差明显降低时，补入适量去离子水，滤速控制在200～300ml/min，将滤液pH调至4.5，加入1％粉末状活性炭，60℃下脱色1h，过滤后用草酸或盐酸将过滤后的发酵液调至pH＝2备用。将处理成H⁺型的001×7树脂装入直径2.4cm的离子交换柱中，装柱高12cm，两柱串连，操作温度为室温，上柱速度为0.5BV/h，上柱后，用两倍发酵液体积pH＝2的酸性水洗涤树脂，流速为1BV/h，将洗涤液收集准备再次上柱。用氨水将0.5mol/LNH₄Cl调至pH＝9，0.6BV/h洗脱，收集pH＝2～9部分的洗脱液。

使用旋转蒸发仪将洗脱液在60℃～70℃减压蒸发至出结晶，加入一倍体积95％乙醇，冷藏过夜，过滤后得粗结晶。用一定量的蒸馏水溶解粗结晶，再加入等体积的95％乙醇，冷藏过夜，过滤晶体，烘干后得L-亮氨酸结晶，纯度可达98％以上，提取率55％。

Claims (10)

1、一种黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TK0303，以黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)HL41(保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CICC 10135)为出发菌种，选育具有蛋氨酸缺陷(Met^-)、异亮氨酸缺陷(Ile^L)、α-氨基丁酸抗性(α-AB^r)、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TA^r)、β-羟基亮氨酸抗性(β-HL^r)、磺胺胍抗性(SG^r)、利福平抗性(Rif^t)的突变株，使其具有L-亮氨酸的生物合成能力。

2、一种利用黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TK0303直接发酵法生产L-亮氨酸的生产工艺，包括：

A.将黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)突变株TK0303进行常规扩大培养；

B.将步骤A中获得的扩大培养的菌种接入发酵培养基进行发酵。发酵培养基中碳源含量应为1％～30％，氮碳比N∶C应介于5∶100～50∶100之间，无机盐含量应为0.0001～10％，发酵培养基的初始pH6.0～8.0，培养温度20℃～40℃，振荡培养或发酵罐培养2～5天，接种量为1％～15％(V/V)；发酵过程中，添加碳酸钙和流加尿素、氨水调节发酵培养基的PH6.0～8.0；

C.L-亮氨酸的提取步骤：采用金属膜过滤除菌体和蛋白，而后采用活性炭对滤液进行脱色处理，活性炭用量为0.1％～5％，pH范围0～14，操作温度为0～40℃，脱色时间为1～60min；脱色液通过阳离子交换法提取L-亮氨酸，离子交换过程中的上柱料液的pH范围0～14，操作温度为0～40℃，流速为1～6倍床体积/h。使用旋转蒸发仪将离子交换洗脱液在60℃～70℃减压蒸发至出结晶，加入一倍体积50％～95％乙醇，冷藏过夜，进行重结晶，烘干后得L-亮氨酸结晶。

3、根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于C步中的金属膜采用不锈钢管式膜分离系统，其孔径为50nm～100nm，截留分子量2000～50000MW，pH范围0～14，操作温度为0～40℃，操作压差为0.2～1.0MPa。

4、根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于C步中，洗脱液为0.1～10mol/L氨水，氯化铵溶液，硫酸铵溶液，醋酸铵溶液，乙醇溶液。

5、根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于C步中的离子交换树脂采用强酸型阳离子交换树脂，JK006，HD-8，732，D061，D001-CC和HZ014；离子交换柱采用串联方式。

6、根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于B步中采用分阶段供氧控制模式，发酵前期溶氧控制在20～60％，后期控制在10～40％。

7、根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于B步发酵培养基中的碳源为：糖，即葡萄糖，蔗糖，果糖，麦芽糖，甘露糖，淀粉和糖浆；或糖醇，甘油；或有机酸，醋酸；或低分子醇，乙醇；碳源含量最佳为10％～20％。

8、根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于B步发酵培养基中的氮源为氨或铵盐：硫酸铵，醋酸铵，硝酸铵，磷酸铵，乙酸铵或氯化铵；或有机氮：蛋白胨，牛肉膏，玉米浆，或豆饼水解液。

9、根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于B步发酵培养基中无机盐为：磷酸钾，硫酸镁，碳酸钙，硫酸亚铁，或硫酸锰。

10、根据权利要求2所述的生产工艺，其特征在于过滤前，发酵液进行预处理，用碱将发酵液pH调至9～12，搅拌并加热到80℃，加入发酵液0.1％～0.5％硅藻土后注入不锈钢管式膜分离系统，操作温度控制在50～60℃，进膜压力与出膜压力差0.3～0.8kg/cm²，滤速控制在200～300ml/min。