CN105441501A - 一种高产l-亮氨酸菌株及其在发酵法生产l-亮氨酸的应用 - Google Patents

一种高产l-亮氨酸菌株及其在发酵法生产l-亮氨酸的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高产L-亮氨酸菌株及其在发酵法生产L-亮氨酸的应用，属于生物工程领域。本发明提供了一株具有遗传标记的高产L-亮氨酸的黄色短杆菌FMME289，该菌株为蛋氨酸和异亮氨酸缺陷型，同时具有支链氨基酸和磺胺胍抗性。在7L发酵罐中培养60h，L-亮氨酸产量达到35.0～38.5g/L，糖酸转化率为26.0％～28.2％，该菌株能够高效积累L-亮氨酸，且遗传稳定、重复性良好。

Description

一种高产L-亮氨酸菌株及其在发酵法生产L-亮氨酸的应用
技术领域
本发明涉及一种高产L-亮氨酸菌株及其在发酵法生产L-亮氨酸的应用，属于生物工程领域。
背景技术
L-亮氨酸又称白氨酸，即α-氨基-γ-甲基戊酸、α-氨基异己酸，与缬氨酸、异亮氨酸同属于支链氨基酸，是人与动物自身不能合成而必须依赖外源供给的八大必需氨基酸之一。
L-亮氨酸具有多种生理功能，是临床选用的复合氨基酸静脉注射液不可缺少的原料，对维持危重病人的营养需要、抢救患者生命起着积极作用。另外，L-亮氨酸在食品、化妆品、农业上也具有广泛的应用。
L-亮氨酸的生产方法有提取法、化学合成法和发酵法。微生物发酵法条件温和、环境友好、产品质量稳定，是L-亮氨酸的主要生产方法。目前棒杆菌属、短杆菌属的L-亮氨酸生物合成途径及其调节机制已弄清，以鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum)、粘质赛氏杆菌(Serratiamarcescens)、乳糖发酵短杆菌(Brevibacteriumlactofermentum)、钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)、黄色短杆菌(Brevibacteriumflavum)为出发菌株，均有选育出L-亮氨酸高产菌的文献报道。通常用谷氨酸产生菌如黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌等，诱变处理，选育出营养缺陷型及氨基酸结构类似物抗性突变株，以解除代谢调节中的反馈抑制与阻遏，达到过量积累L-亮氨酸的目的。生产L-亮氨酸的日本企业占主导地位，尤以日本味之素公司，其在亮氨酸产量和品质均具有明显优势。
如何提高L-亮氨酸产量、生产强度等，是目前亟需解决的问题。
发明内容
为了克服上述问题，本发明得到了一株L-亮氨酸高产菌株并利用其发酵法生产L-亮氨酸。
本发明提供一种高效发酵法生产L-亮氨酸的方法，所述方法是将L-亮氨酸生产菌的种子液按8～12％的接种量接种于7L发酵罐中进行发酵，培养温度为30～35℃，控制pH为6.8～7.0，装液量为3L/7L，搅拌转速为600～700rpm，初始通气量为4.5L/min，培养56～60h。
所述发酵使用的发酵培养基，每L中含有：葡萄糖130～160g、玉米粉30g、(NH4)2SO46.5g、MgSO4·7H2O2g、DL-甲硫氨酸0.1g、L-异亮氨酸0.05g、生物素100μg、维生素B1300μg、FeSO40.02g、ZnSO40.01gMnSO40.01g，NaOH调节pH至7.2。
所述种子液使用的种子培养条件为：取一环保存于斜面培养基中的菌株，接种于种子培养基，培养温度为30～35℃，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养14～18h。
所述L-亮氨酸生产菌为黄色短杆菌。
所述L-亮氨酸生产菌为具有遗传标记的L-亮氨酸生产菌株FMME289，其遗传标记为蛋氨酸缺(Metr)、异亮氨酸缺陷(IleL)、磺胺胍(SGr)、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)、β-羟基亮氨酸抗性(β-HLr)。
本发明的有益效果：
本发明以生产谷氨酸的黄色短杆菌G14(CICC编号20160)为出发菌株，提供了一种通过多重诱变筛选得到具有遗传标记(Met-+IleL+SGr+2-TAr+β-HLr)的高产L-亮氨酸的黄色短杆菌FMME289，该菌株生产稳定，重复性良好。
附图说明
图1：黄色短杆菌G14诱变图谱；
图2：HPLC检测亮氨酸标准样品；
图3：HPLC检测发酵液中亮氨酸。
具体实施方式
诱变处理和筛选过程中所用的各种培养基的组成：斜面和种子培养基：葡萄糖2g、酵母粉5g、胰蛋白胨10g、CaCl25g、琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1L，自然pH。
完全培养基：葡萄糖10g、酵母粉5g、胰蛋白胨10g、CaCl25g、琼脂粉15g，用蒸馏水定容至1L，pH自然。
基本培养基(MM)：葡萄糖20g、(NH4)2SO42.0g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl2·2H2O0.01g、FeSO4·7H2O0.001g、Na2HPO4·12H2O1.5g，KH2PO41.5g，蒸馏水定容至1L。
筛选培养基(CM)：在MM培养基加支链氨基酸的结构类似物；在完全培养基的基础上添加抗性物质。
种子发酵条件：取一环保存于斜面培养基中的菌株，接种于种子培养基，培养温度为30～35℃，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养14～18h。
摇瓶发酵条件：将上述种子液按8～12％的接种量接种于装液量100mL/750mL摇瓶中，培养温度30～35℃，摇床转速200rpm，培养56～60h。
实施例1：蛋氨酸和异亮氨酸缺陷型菌株的筛选
将出发菌株黄色短杆菌G14用硫酸二乙酯进行诱变处理、中间培养、淘汰野生型、缺陷型筛选和鉴定等步骤，得到缺陷型菌株(Met-+IleL)共计28株，将28株菌株进行摇瓶发酵55～60h，使用高效液量色谱(HPLC)检测，检测标准样样品和发酵样品的结果如图1和图2，L-亮氨酸产量最高的为G14-1-179，产量仅为3.7g/L。
实施例2：具有磺胺胍抗性突变株的筛选
将得到的菌株G14-1-179摇瓶发酵，适当稀释OD600至0.8～1.0，进行ARTP诱变处理，功率为80W，气流量为8SLM，处理时间为60s。然后收集菌体涂布于含有磺胺胍的18～28g/L的完全培养基上，挑取在此培养基上生长的突变株，摇瓶发酵55～65h，检测发酵液中L-亮氨酸产量，产量最高的为菌株G14-2-092，产量为12.9g/L。
实施例3：具有2-噻唑丙氨酸抗性突变株的筛选
将G14-2-092菌株摇瓶发酵，适当稀释OD600至0.8～1.0，进行ARTP诱变处理，功率为80W，气流量为8SLM，处理时间为60s。然后收集菌体涂布于含有2-噻唑丙氨酸10～12g/L的完全培养基上，挑取在此培养基上生长的突变株，摇瓶发酵55～65h，检测发酵液中L-亮氨酸产量，产量最高的为菌株G14-3-232，产量为20.6g/L。
实施例4：具有β-羟基亮氨酸抗性突变株的筛选
将G14-3-232菌株摇瓶发酵，适当稀释OD600至0.8～1.0，进行ARTP诱变处理，功率为80W，气流量为8SLM，处理时间为60s。然后收集菌体涂布于含有β-羟基亮氨酸10～12g/L的完全培养基上，挑取在此培养基上生长的突变株，摇瓶发酵55～65h，检测发酵液中L-亮氨酸产量，产量最高的为菌株FMME289，产量为27.9g/L。
实施例5：FMME289菌株发酵生产L-亮氨酸
取一环保存于斜面培养基中的FMME289菌株，接种于种子培养基，培养温度为32℃，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养14～18h。
将种子液按12％的接种量接种于7L发酵罐中进行发酵，培养温度为30℃，控制pH为6.8～7.0，装液量为3L/7L，搅拌转速为700rpm，初始通气量为4.5L/min，培养60h，L-亮氨酸产量达到38.5g/L，生产强度达0.642g/(L·h)，糖酸转化率为28.2％，比发酵培养条件和发酵培养基优化前，产量提高了24.2％、转化率提高了27％。
发酵培养基(L)：葡萄糖130～160g、玉米粉30g、(NH4)2SO46.5g、MgSO4·7H2O2g、DL-甲硫氨酸0.1g、L-异亮氨酸0.05g、生物素100μg、维生素B1300μg、FeSO40.02g、ZnSO40.01gMnSO40.01g，NaOH调节pH至7.2。
实施例6：FMME289菌株发酵生产L-亮氨酸
取一环保存于斜面培养基中的FMME289菌株，活化后得到种子液。将种子液按8％的接种量接种于7L发酵罐中进行发酵，培养温度为35℃，控制pH为6.8～7.0，装液量为3L/7L，搅拌转速为600rpm，初始通气量为4.5L/min，培养60h，L-亮氨酸产量达到35.0g/L，糖酸转化率为26.0％。比发酵培养条件和发酵培养基优化前，产量提高了12.9％、转化率提高了22.9％。
发酵培养基(L)：葡萄糖130～160g、玉米粉30g、(NH4)2SO46.5g、MgSO4·7H2O2g、DL-甲硫氨酸0.1g、L-异亮氨酸0.05g、生物素100μg、维生素B1300μg、FeSO40.02g、ZnSO40.01gMnSO40.01g，NaOH调节pH至7.2。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (7)

1.一种高效发酵法生产L-亮氨酸的方法，其特征在于，所述方法是将L-亮氨酸生产菌的种子液按8～12％的接种量接种于7L发酵罐中进行发酵，培养温度为30～35℃，控制pH为6.8～7.0，装液量为3L/7L，搅拌转速为600～700rpm，初始通气量为4.5L/min，培养56～60h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L-亮氨酸生产菌为黄色短杆菌。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述L-亮氨酸生产菌为具有遗传标记的L-亮氨酸生产菌株FMME289，其遗传标记为蛋氨酸缺(Metr)、异亮氨酸缺陷(IleL)、磺胺胍(SGr)、2-噻唑丙氨酸抗性(2-TAr)、β-羟基亮氨酸抗性(β-HLr)。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵使用的发酵培养基，每L中含有：葡萄糖130～160g、玉米粉30g、(NH4)2SO46.5g、MgSO4·7H2O2g、DL-甲硫氨酸0.1g、L-异亮氨酸0.05g、生物素100μg、维生素B1300μg、FeSO40.02g、ZnSO40.01gMnSO40.01g，NaOH调节pH至7.2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述种子液使用的种子培养条件为：取一环保存于斜面培养基中的菌株，接种于种子培养基，培养温度为30～35℃，装液量50mL/500mL，摇床转速200rpm，培养14～18h。
6.根据权利要求1-5任一所述方法得到的亮氨酸。
7.权利要求6所述亮氨酸在食品、化妆品、农业、制备药物方面的应用。
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