TW201928062A - 生產丁酸及／或其鹽類之方法 - Google Patents
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Abstract
一種生產丁酸及／或其鹽類之方法，其係包含：對一含有醣類之基質進行發酵反應，其中該發酵反應係在一第一菌株與一第二菌株之存在下進行，該第一菌株係一丁酸菌，且該第二菌株係以下之至少一者：同型發酵型乳酸菌、以及兼型發酵型乳酸菌。
Description
本發明係關於一種生產丁酸及／或其鹽類的方法，其係包含：對一含有醣類之基質進行發酵反應，其中該發酵反應係在一第一菌株與一第二菌株之存在下進行，該第一菌株係一丁酸菌，且該第二菌株係以下之至少一者：同型發酵型乳酸菌（Homofermentative lactic acid bacterium）、以及兼型發酵型乳酸菌（Facultative heterofermentative lactic acid bacterium）。相較於傳統生產丁酸之方法，本發明方法可以提升丁酸產率並減少副產物的產生。
丁酸及其衍生物之已知用途非常廣泛，彼等既可做為化工原料，亦可作為食品添加劑。此外，研究顯示，丁酸具有維持和促進動物體腸道功能、誘導腫瘤細胞凋亡等的效果，在腸胃炎、癌症、及白血病等疾病治療的領域中有良好的應用潛力。已知之丁酸生產方法包括化學合成法及微生物催化法，其中，化學合成法主要有以石油為原料的正丁醛氧化法、丙烯羰基化法。在以往，化學合成法由於製造方式簡單且成本低廉，故為丁酸的主要生產方法；然而，受到能源危機的影響，此種以石油作為原料的化學合成法之製造成本亦日益提高。隨著丁酸及其衍生物在生物相關領域中的應用的發展，相較於化學合成，消費者日益青睞生物來源的丁酸產品，此使得丁酸的微生物催化法逐漸受到重視。
以微生物催化法生產丁酸係一厭氧發酵過程，其中，一般係採用單一菌株來進行，已知可使用於此一方法之微生物包括：梭菌屬菌株（Clostridium
sp.
）、丁酸弧菌屬菌株（Butyrivibrio
sp.
）、丁酸桿菌屬菌株（Butyribacterium
sp.
）、八疊球菌屬菌株（Sarcina
sp.
）、真桿菌屬菌株（Eubacterium
sp.
）、梭桿菌屬菌株（Fusobacterium
sp.
）、以及巨球形菌屬菌株（Megasphaera
sp.
）等。然而，目前所採用之單一菌株微生物催化法係存在原料成本高、單位體積產量低、副產物乙酸產量過高等缺點，故業界仍持續致力於開發可有效提升丁酸產率、且可同時減少副產物產生的微生物催化法。
本案發明人研究發現，相較於傳統之單一菌株微生物催化法，使一含有醣類之基質在一同時存在丁酸菌與以下至少一乳酸菌的環境下進行發酵，可以提供較佳之丁酸產率、且可減少副產物之產生：同型發酵型乳酸菌、以及兼型發酵型乳酸菌。
本發明之一目的，在於提供一種生產丁酸及／或其鹽類之方法，其係包含：對一含有醣類之基質進行發酵反應，其中該發酵反應係在一第一菌株與一第二菌株之存在下進行，該第一菌株係一丁酸菌，且該第二菌株係以下之至少一者：同型發酵型乳酸菌、以及兼型發酵型乳酸菌。
較佳地，該第一菌株係梭菌屬菌株（Clostridium
sp.
）。舉例言之，該第一菌株係酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum
），尤其係以下之至少一者：酪丁酸梭菌BCRC 910596、及酪丁酸梭菌ATCC 25755。
較佳地，該第二菌株係以下之至少一者：乳酸桿菌屬菌株（Lactobacillus
sp.）、乳酸球菌屬菌株（Lactococcus
sp.）、芽孢乳桿菌屬菌株（Sporolactobacillus
sp.）、及桿菌屬菌株（Bacillus
sp.）。舉例言之，該第二菌株係以下之至少一者：乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei
）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus
）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii
）、胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum
）、副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei
）、保加利亞乳酸桿菌（Lactobacillus bulgaricusi
）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis
）、及菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus
）。
於本發明部分具體實施態樣中，該第一菌株係酪丁酸梭菌BCRC 910596，且該第二菌株係以下之至少一者：乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei
）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus
）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii
）、胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum
）、副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei
）、保加利亞乳酸桿菌（Lactobacillus bulgaricusi
）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis
）、凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans
）、及菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus
）。
於上述根據本發明之方法中，所採用之基質所含之醣類可以是以下之至少一者：葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、糖蜜（molasses）、及纖維二糖（cellobiose）。較佳地，該基質可更含有碳源、氮源、及礦物質元素之至少一者。更佳地，該碳源係乙酸及乙酸鹽之至少一者，且該礦物質元素係以下之至少一者：磷、硫、鉀、鎂、鐵、及錳。
本發明之詳細技術內容及部分具體實施態樣，將描述於以下內容中，以供本發明所屬技術領域中具有通常知識者據以明瞭本發明之特徵。
以下將描述根據本發明之部分具體實施態樣；惟，在不背離本發明精神下，本發明尚可以多種不同形式之態樣來實踐，不應將本發明保護範圍解釋為限於說明書所具體陳述者。
除非文中有另外說明，於本說明書中（尤其是在後述專利申請範圍中）所使用之「一」、「該」及類似用語應理解為包含單數及複數形式；於本發明中，所謂的「微生物菌株」可包括於自然界中自然存在的野生型（wild type），以及因任何因素（天然或人為）所產生的突變型（mutant）。所謂「發酵反應」係指微生物菌株於厭氧氛圍下代謝一或多種物質以產生有機化合物的過程。所謂「培養基」係指可提供微生物菌株生長、繁殖所需的養分與條件（如酸鹼值、含水量等）之必要成分物質，通常係視所欲培養之微生物菌株而調整組成，例如可添加以下之一或多者以調整原料至一所欲的pH值：氯化氫、氫氧化鈣、氫氧化鈉、氫氧化銨（NH4
OH）、硫酸銨（(NH4
)2
SO4
）、氯化銨（NH4
Cl）、乙酸銨、磷酸氫二鉀（K2
HPO4
）、磷酸二氫鉀（KH2
PO4
）、磷酸二氫鈉（NaH2
PO3
）、磷酸氫二鈉（Na2
HPO3
）、檸檬酸（citric acid）、含水硫酸鎂（MgSO4
•7H2
O）、含水硫酸鐵（FeSO4
•7H2
O）、含水硫酸錳（MnSO4
•7H2
O），或調整其他物理、化學或生理性質。所謂「基質（substrate）」，係指能夠在微生物菌株之發酵反應中作為原料，進入發酵反應之代謝路徑而被轉化為其他物質者。
所謂「丁酸菌」，係指可於發酵反應中代謝醣類以生成丁酸之微生物菌株。所謂「乳酸菌」係指可於發酵反應中代謝醣類以生成乳酸之微生物菌株，其依代謝特性可大致分為三類：同型發酵型乳酸菌（Homofermentative lactic acid bacterium）、兼型發酵型乳酸菌（Facultative heterofermentative lactic acid bacterium）、及異型發酵型乳酸菌（Heterofermentative lactic acid bacterium）。其中，所謂「同型發酵型乳酸菌」係指會將大部分的醣類代謝為乳酸之乳酸菌；所謂「異型發酵型乳酸菌」則指會將部分醣類代謝為乳酸、並將部分醣類代謝為乙醇、乙酸與二氧化碳之乳酸菌；至於「兼型發酵型乳酸菌」則會視所處發酵反應條件（例如所選用之基質、pH值、溫度等）之不同而進行同型發酵或異型發酵者。
於本說明書中，所謂「丁酸產率」係指在發酵反應中，所生成之丁酸的克數與所消耗醣類及／或乳酸之總克數的比值，以如下式1進行計算。 式1：
於本說明書中，所謂「乳酸產率」係指在發酵反應中，所生成之乳酸的克數與所消耗醣類總克數的比值，以如下式2進行計算。 式2：乳
不同於先前技術多單獨使用丁酸菌以進行微生物催化法來生產丁酸，本發明提供一種生產丁酸及／或其鹽類之方法，其係包含：對一含有醣類之基質進行發酵反應，其中該發酵反應係在一第一菌株與一第二菌株之存在下進行，該第一菌株係一丁酸菌，且該第二菌株係以下之至少一者：同型發酵型乳酸菌、以及兼型發酵型乳酸菌。如後附實施例所示，相較於先前技術，本發明之方法可提供較佳之丁酸產率、且可同時降低副產物之產量。
於根據本發明之方法中，所使用之基質係含有一醣類。其中，可用之醣類（又稱「碳水化合物」）的例子包括，但不限於，單醣（例如：葡萄糖（glucose）、果糖（fructose）、半乳糖（galactose）、甘露糖（mannose）、阿拉伯糖（arabinose）、來蘇糖（lyxose）、核糖（ribose）、核酮糖（ribulose）、木酮糖（xylulose）、阿洛糖（allose）、阿卓糖（altrose）、古洛糖（gulose）、艾杜糖（idose）、塔羅糖（talose）、阿洛酮糖（psicose）、山梨糖（sorbose）、塔格糖（tagatose））；雙醣（例如：蔗糖（sucrose）、麥芽糖（maltose）、乳糖（lactose）、乳酮糖（lactulose）、海藻糖（trehalose）、纖維二糖（cellobiose））；寡糖（例如：水蘇糖（stachyose）、麥芽三糖（maltotriose）、麥芽四糖（maltotetrose）、麥芽五糖（maltopentaose））；多醣（例如：澱粉、纖維素、肝糖、環糊精（cyclodextrin）、阿拉伯聚糖（arabinoxylans）、關華豆膠（guar gum）、阿拉伯膠（gum arabic）、幾丁質（chitin）、樹膠（gum）、海藻酸鹽（alginate）、果膠（pectin）、結冷膠（gellan））；以及糖蜜（molasses）。於本發明部分具體實施態樣中，係使用含有葡萄糖、果糖、蔗糖、與糖蜜之至少一者的基質，以提供發酵反應所需之碳源。
視需要地，可於本發明方法所採用之基質中更包含一胺基酸來源，該胺基酸來源的例子包括酵母萃取物（yeast extract）、蛋白水解物、及蛋白腖（peptone）、玉米浸漬液（corn steep liquor，CSL）、乳清（whey）、豆粕、魚粉、肉骨粉、酵母粉、豆粉，但不以此為限。
適用於本發明方法以作為第一菌株之丁酸菌的例子包括，但不限於，梭菌屬菌株、丁酸弧菌屬菌株、丁酸桿菌屬菌株、八疊球菌屬菌株、真桿菌屬菌株、梭桿菌屬菌株、及巨球形菌屬菌株。較佳地，該第一菌株係梭菌屬菌株。更佳地，該第一菌株係酪丁酸梭菌，例如酪丁酸梭菌BCRC 910596及酪丁酸梭菌ATCC 25755。
適用於本發明方法以作為第二菌株之同型發酵型乳酸菌、及兼型發酵型乳酸菌的例子包括，但不限於，乳酸桿菌屬菌株、乳酸球菌屬菌株、芽孢乳桿菌屬菌株、及桿菌屬菌株。其中，該乳酸桿菌屬菌株的例子包括：乾酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、德氏乳桿菌、胚芽乳酸桿菌、副乾酪乳桿菌、保加利亞乳酸桿菌；該乳酸球菌屬菌株的例子包括：乳酸乳球菌；該芽孢乳桿菌屬菌株的例子包括：菊糖芽孢乳桿菌；且該桿菌屬菌株的例子包括：凝結芽孢桿菌。
於本發明部分具體實施態樣中，該第一菌株係酪丁酸梭菌BCRC 910596，且該第二菌株係以下之至少一者：乾酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、德氏乳桿菌、胚芽乳酸桿菌、副乾酪乳桿菌、保加利亞乳酸桿菌、乳酸乳球菌、凝結芽孢桿菌、及菊糖芽孢乳桿菌。
除了上述野生型菌種以外，亦可透過遺傳工程，以提供本發明方法所需之第一菌株，只要該菌株具有於發酵反應中代謝醣類以生成丁酸的能力即可。同樣地，本發明方法所需之第二菌株亦可透過遺傳工程提供，只要該菌株具有於發酵反應中代謝醣類以生成乳酸的能力即可。
於根據本發明之製備丁酸及／或其鹽類的方法中，所涉之厭氧氛圍係指氧氣含量低於5ppm，較佳低於0.5 ppm，更佳低於0.1 ppm之氛圍。可採用任何合宜之手段以提供所欲之厭氧氛圍。舉例言之，但不以此為限，可於發酵反應進行之前，先於發酵反應容器中通入惰性的氣體（例如：氮氣或二氧化碳）且進行曝氣，以排出存在於該反應容器中的空氣，提供所欲之厭氧氛圍；或者，於厭氧操作箱中進行發酵反應，厭氧操作箱是採用鈀催化劑將密閉箱體內的氧氣與厭氧混合氣體中的氫氣催化生成水，從而提供所欲之厭氧氛圍。
於根據本發明之製備丁酸及／或其鹽類的方法中，基質與菌株的混合順序並無特殊限制。可於發酵反應開始之前或發酵反應進行過程中，視需要一次性地或多次分批地添加基質，且可視需要補充菌株。例如，可於發酵反應進行前，即一次性地將基質與菌株混合；也可將基質分為等量或不等量的二或多批，於發酵反應開始之前或發酵反應進行過程中，分批加入發酵反應器中。
於根據本發明之製備丁酸及／或其鹽類的方法中，第一菌株及第二菌株的混合順序並無特殊限制。可於發酵反應開始之前或發酵反應進行過程中，視需要將基質與第一菌株及第二菌株一次性地或多次分批地混合。例如，可於發酵反應進行前，即一次性地將基質與第一菌株及第二菌株混合；也可於發酵反應開始時將基質與第一菌株及第二菌株的任一者混和，並於發酵反應進行過程中將另一菌株加入發酵反應器中。
於根據本發明之製備丁酸及／或其鹽類的方法中，視需要地，可於進行發酵反應之前，先對所採用之第一菌株及／或第二菌株進行前培養，以使菌株生長直到對數生長期（log phase），再使用該經前培養之菌株以進行本發明方法。
於根據本發明之製備丁酸及／或其鹽類的方法中，所採用之基質可視需要更含有碳源、氮源、及／或礦物質元素。其中，視所採用之第一菌株及第二菌株，該碳源可以是乙酸、乙酸鹽、及糖類（例如葡萄糖、蔗糖、糖蜜）之至少一者，該礦物質元素可以是磷、硫、鉀、鎂、鐵、及錳之至少一者，但不以此為限。舉例言之，可於該基質中含有磷酸二氫鉀（KH2
PO4
）以提供磷、鉀等元素，含有氯化鎂或含水硫酸鎂（MgSO4
．7H2
O）以提供鎂元素，及／或含有氯化鐵或含水硫酸鐵（FeSO4
．7H2
O）以提供鐵元素。
茲以下列實施例進一步例示說明本發明。其中該等實施例僅提供作為說明，而非用以限制本發明之保護範圍。本發明保護範圍係如後附申請專利範圍所示。
實施例
[ 物料來源或成分 ] ：
1. RCM（Reinforced Clostridial Medium）培養基：購自：Merck（含有肉類萃取物：10克／升；蛋白腖：10克／升；酵母萃取物：3克／升；D(+)葡萄糖：5克／升；澱粉：1克／升；氯化鈉：5克／升；乙酸鈉：3克／升；L-半胱胺酸鹽酸鹽（L-cysteine hydrochloride）：0.5克／升；以及瓊脂：0.5克／升；pH 6.8）。 2. CSL（Corn Steep Liquor）：購自豐年豐和公司。 3. MRS培養基：購自：Merck（含有蛋白腖：10克／升；肉類萃取物：8克／升；酵母萃取物：4克／升；D(+)葡萄糖：20克／升；磷酸氫二鉀：2克／升；聚山梨醇酯80：1克／升；檸檬酸氫二銨： 2克／升；乙酸鈉：5克／升；硫酸鎂：0.2克／升；硫酸錳：0.04克／升）。 4. 發酵培養液A~I，其組成分別如下：
[
厭氧氛圍與經除氧之培養基
]
：
於以下實施例中，係以如下操作於所使用之氣密容器（例如氣密血清瓶、離心管）中提供厭氧氛圍。將氣密容器與橡膠塞以鋁箔包覆，並以高溫高壓（121°Ｃ，1.2大氣壓）滅菌，確保不會受其他微生物的干擾。其後，以烘箱去除外部殘餘水氣，防止殘餘水氣於操作時造成微生物汙染。將烘乾之氣密容器送入厭氧操作箱內，稍微鬆開封口的鋁箔後，以鈀催化劑（購自Thermo scientific公司，產品編號：BR0042）催化氧氣與厭氧混合氣體中的氫氣生成水，從而將氣密容器中的氧氣去除，以提供厭氧氛圍。
於以下實施例中，係以如下操作提供經除氧的培養基。將配置好的培養基，以高溫高壓（121°Ｃ，1.2大氣壓）滅菌20分鐘，並於培養基冷卻至室溫之前，將其送入厭氧操作箱內，稍微鬆開盛裝培養基之容器的上蓋，讓水蒸氣釋出，並以鈀催化劑催化氧氣與厭氧混合氣體中的氫氣生成水，以進行培養基之除氧。於培養基冷卻至室溫之後，進一步於其中加入L-半胱胺酸鹽酸鹽（0.5克／升），以降低培養基之氧化還原電位（redox potential）至微生物所適之範圍，從而提供經除氧的培養基。
實施例
1
：以丁酸菌或乳酸菌單獨對含葡萄糖之基質進行發酵
1-1.
選取菌株
於本實施例中，係分別選取以下菌株以進行單一菌株之發酵實驗：酪丁酸梭菌BCRC 910596、乾酪乳桿菌BCRC 10697、短乳桿菌（Lactobacillus brevis
）BCRC 12187、乳酸乳球菌BCRC 12312、鼠李糖乳桿菌BCRC 11069、及德氏乳桿菌BCRC 12195。
1-2.
發酵試驗
自實施例1-1所提供之菌株中各挑選單一菌落，分別接種至4毫升之發酵培養液A中，其後再分別加入1毫升的滅菌水，並置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、31及95小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之葡萄糖、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、以及丁酸及／或乳酸產率，結果示於表1A及1B。
表1A
表1B
如表1A及1B所示，單獨以丁酸菌（例如：酪丁酸梭菌BCRC 910596）對含葡萄糖之基質進行發酵，僅能提供約0.41之丁酸產率。另一方面，單獨以乳酸菌（例如：乾酪乳桿菌BCRC 10697、短乳桿菌BCRC 12187、乳酸乳球菌BCRC 12312、鼠李糖乳桿菌BCRC 11069、及德氏乳桿菌BCRC 12195）對含葡萄糖之基質進行發酵，可得0.88-0.95之乳酸產率。
實施例
2
：以丁酸菌混合乳酸菌對含葡萄糖之基質進行發酵
2-1.
選取菌株
於本實施例中係選取酪丁酸梭菌BCRC 910596作為第一菌株，並以乾酪乳桿菌BCRC 10697、短乳桿菌BCRC 12187、乳酸乳球菌BCRC 12312、鼠李糖乳桿菌BCRC 11069、或德氏乳桿菌BCRC 12195作為第二菌株。
2-2. 前培養
(a) 酪丁酸梭菌BCRC 910596：取前述菌株之單一菌落，接種於5毫升RCM培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約17小時，接著取1毫升之菌液加入3毫升的RCM中，新鮮培養5小時。 (b) 乾酪乳桿菌BCRC 10697、短乳桿菌BCRC 12187、乳酸乳球菌BCRC 12312、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069：各取前述菌株之單一菌落，分別接種於5毫升MRS培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約28小時。 (c) 德氏乳桿菌BCRC 12195：取前述菌株之單一菌落，接種於5毫升MRS培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約3天。
2-3.
發酵試驗
將0.5毫升實施例2-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596菌液分別與0.5毫升實施例2-2所提供之各乳酸菌菌液混合，並將前述所獲得之五混合菌液分別接種至4毫升之發酵培養液A中，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、26、42及71小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之葡萄糖、乳酸、乙酸與丁酸的濃度、以及丁酸產率，結果示於表2A及2B。
表2A
表2B
如表2A及2B所示，相較於單獨以丁酸菌對含葡萄糖之基質進行發酵（丁酸產率為0.41，見表1A），當以丁酸菌混合異型發酵型乳酸菌（例如：短乳桿菌BCRC 12187）進行發酵時，並無法提升丁酸產率，甚至還會使得丁酸產率下降。另一方面，相較於單獨以丁酸菌對含葡萄糖之基質進行發酵，當以丁酸菌混合同型發酵型乳酸菌（例如：乳酸乳球菌BCRC 12312、及德氏乳桿菌BCRC 12195）或兼型發酵型乳酸菌（例如：乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069）進行發酵時，可有效提升丁酸產率。
實施例
3
：以酪丁酸梭菌
BCRC 910596
混合兼型發酵型乳酸菌對含葡萄糖之基質進行發酵
3-1.
選取菌株
於本實施例中係選取酪丁酸梭菌BCRC 910596作為第一菌株，並以乾酪乳桿菌BCRC 10697、或鼠李糖乳桿菌BCRC 11069作為第二菌株。
3-2. 前培養
(a) 酪丁酸梭菌BCRC 910596：取前述菌株之單一菌落，接種於20毫升RCM培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約18小時。 (b) 乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069：各取前述菌株之單一菌落，分別接種於20毫升MRS培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約18小時。
3-3.
發酵試驗
將10毫升實施例3-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596菌液分別與10毫升實施例3-2所提供之各乳酸菌菌液混合，並將該二混合菌液分別接種至含有80毫升之發酵培養液B的氣密瓶中。於前述氣密瓶中分別添加30克／升之碳酸鈣，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、23、及55小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之葡萄糖、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、以及丁酸產率，結果示於表3。
表3
如表3所示，相較於單獨以丁酸菌對含葡萄糖之基質進行發酵（丁酸產率為0.41，見表1A），當以丁酸菌混合兼型發酵型乳酸菌（例如：乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069）進行發酵時，可有效提升丁酸產率。
實施例
4
：以酪丁酸梭菌
BCRC 910596
混合異型發酵型或同型發酵型乳酸菌對含葡萄糖之基質進行發酵
4-1.
選取菌株
於本實施例中係選取酪丁酸梭菌BCRC 910596作為第一菌株，並以短乳桿菌BCRC 12187或凝結芽孢桿菌BCRC 10606作為第二菌株。
4-2. 前培養
(a) 酪丁酸梭菌BCRC 910596：取前述菌株之單一菌落，接種於20毫升RCM培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約18小時。 (b) 短乳桿菌BCRC 12187、及凝結芽孢桿菌BCRC 10606：各取前述菌株之單一菌落，分別接種於5毫升MRS培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約28小時。
4-3.
發酵試驗
將0.5毫升實施例4-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596菌液接種至4毫升之發酵培養液C中，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵作為對照組。接著，將0.5毫升實施例4-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596菌液分別與0.5毫升實施例4-2所提供之各乳酸菌菌液混合，並將該二混合菌液分別接種至4毫升之發酵培養液C中，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、25、及42小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之葡萄糖、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、以及丁酸產率，結果示於表4。
表4
如表4所示，相較於單獨以丁酸菌對含葡萄糖之基質進行發酵（丁酸產率為0.39，見對照組），當以丁酸菌混合異型發酵型乳酸菌（例如：短乳桿菌BCRC 12187）進行發酵時，並無法提升丁酸產率。而當以丁酸菌混合同型發酵型乳酸菌（例如：凝結芽孢桿菌BCRC 10606）進行發酵時，可有效提升丁酸產率。
實施例
5
：單獨以酪丁酸梭菌
BCRC 910596
或同型發酵型乳酸菌對含葡萄糖之基質進行發酵
5-1.
選取菌株
於本實施例中係選取酪丁酸梭菌BCRC 910596作為第一菌株，並以菊糖芽孢乳桿菌ATCC 15538作為第二菌株。
5-2. 前培養
(a) 酪丁酸梭菌BCRC 910596：取前述菌株之單一菌落，接種於10毫升RCM培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約18小時。 (b) 菊糖芽孢乳桿菌ATCC 15538：取前述菌株之單一菌落，接種於10毫升MRS培養基中，並置於37°C之震盪培養箱（厭氧）中以200 rpm之震盪轉速培養歷時約24小時。
5-3.
發酵試驗
將10毫升實施例5-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596菌液與10毫升實施例5-2所提供之菊糖芽孢乳桿菌ATCC 15538菌液分別接種至含有80毫升之發酵培養液B的氣密瓶中。於前述氣密瓶中分別添加10克／升之碳酸鈣，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、24、48、及82小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之葡萄糖、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、pH值、以及丁酸及／或乳酸產率，結果示於表5。
表5
如表5所示，單獨以丁酸菌（例如：酪丁酸梭菌BCRC 910596）對含葡萄糖之基質進行發酵，僅能提供約0.48之丁酸產率。另一方面，單獨以同型發酵型乳酸菌（例如：菊糖芽孢乳桿菌ATCC 15538）對含葡萄糖之基質進行發酵，則能提供約0.95之乳酸產率。
實施例
6
：以酪丁酸梭菌
BCRC 910596
混合同型發酵型乳酸菌對含葡萄糖之基質進行發酵
將10毫升實施例5-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596菌液與10毫升實施例5-2所提供之菊糖芽孢乳桿菌ATCC 15538菌液混合，並將該混合菌液接種至含有80毫升之發酵培養液B的氣密瓶中。於前述氣密瓶中添加10克／升之碳酸鈣，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、24、及82小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之葡萄糖、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、pH值、以及丁酸產率，結果示於表6。
表6
如表6所示，相較於單獨以丁酸菌對含葡萄糖之基質進行發酵（丁酸產率為0.48，見表5），當以丁酸菌混合同型發酵型乳酸菌（例如：菊糖芽孢乳桿菌ATCC 15538）進行發酵時，可有效提升丁酸產率。
實施例
7
：單獨以丁酸菌或乳酸菌對含果糖之基質進行發酵
7-1.
選取菌株
於本實施例中，係分別選取以下菌株以進行單一菌株之發酵實驗：酪丁酸梭菌BCRC 910596、乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069。
7 -2. 前培養
(a) 酪丁酸梭菌BCRC 910596：取前述菌株之單一菌落，接種於20毫升RCM培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約18小時。 (b) 乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069：各取前述菌株之單一菌落，分別接種於20毫升MRS培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約24小時。
7-3.
發酵試驗
以10%之接種率分別將實施例7-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596、乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069菌液接種至發酵培養液D中，使最後的發酵液體積為50毫升。將發酵液置於氣密瓶中，並於前述氣密瓶中分別添加30克／升之碳酸鈣，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、24、及48小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之果糖、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、pH值、以及丁酸及／或乳酸產率，結果示於表7。
表7
如表7所示，單獨以丁酸菌（例如：酪丁酸梭菌BCRC 910596）對含果糖之基質進行發酵，僅能提供約0.35之丁酸產率。另一方面，單獨以乳酸菌（例如：乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069）對含果糖之基質進行發酵，則能提供約0.9以上之乳酸產率。
實施例
8
：以酪丁酸梭菌
BCRC 910596
混合兼型發酵型乳酸菌對含果糖之基質進行發酵
以10%之接種率分別將實施例7-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596菌液接種至發酵培養液D中，並於該培養液中另以10%之接種率接種實施例7-2所提供之乾酪乳桿菌BCRC 10697、或鼠李糖乳桿菌BCRC 11069菌液，使最後的發酵液體積為50毫升。將發酵液置於氣密瓶中，並於前述氣密瓶中分別添加30克／升之碳酸鈣，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、48、及54小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之葡萄糖、果糖、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、pH值、以及丁酸產率，結果示於表8。
表8
如表8所示，相較於單獨以丁酸菌對含果糖之基質進行發酵（丁酸產率為0.35，見表7），當以丁酸菌混合兼型發酵型乳酸菌（例如：乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069）進行發酵時，可有效提升丁酸產率。
實施例
9
：單獨以丁酸菌或乳酸菌對含木糖之基質進行發酵
以10%之接種率分別將實施例7-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596、乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069菌液接種至5毫升之發酵培養液E中，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、23、及53小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之葡萄糖、木糖、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度，結果示於表9。
表9
如表9所示，酪丁酸梭菌BCRC 910596無法對木糖進行發酵以產生丁酸，且乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069無法對木糖進行發酵以產生乳酸。
實施例
10
：以酪丁酸梭菌
BCRC 910596
混合兼型發酵型乳酸菌對含木糖之基質進行發酵
10-1.
選取菌株
於本實施例中係選取酪丁酸梭菌BCRC 910596作為第一菌株，並以乾酪乳桿菌BCRC 10697、或鼠李糖乳桿菌BCRC 11069作為第二菌株。
10-2. 前培養
(a) 酪丁酸梭菌BCRC 910596：取前述菌株之單一菌落，接種於5毫升RCM培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約18小時。 (b) 乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069：各取前述菌株之單一菌落，分別接種於5毫升MRS培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約25小時。
10-3.
發酵試驗
將0.5毫升實施例10-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596菌液分別與0.5毫升實施例10-2所提供之各乳酸菌菌液混合，並將該二混合菌液分別接種至4毫升之發酵培養液E中，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、23、及53小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之木糖、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度，結果示於表10。
表10
如表10所示，將酪丁酸梭菌BCRC 910596與兼型發酵型乳酸菌混合，亦無法對木糖進行發酵以產生丁酸或乳酸。
實施例
11
：單獨以丁酸菌或乳酸菌對含蔗糖之基質進行發酵
以10%之接種率分別將實施例7-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596、乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069菌液接種至5毫升之發酵培養液F中，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、24、及48小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之蔗糖（以葡萄糖及果糖計）、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、以及丁酸及／或乳酸產率，結果示於表11。
表11
如表11所示，單獨以丁酸菌（例如：酪丁酸梭菌BCRC 910596）對含蔗糖之基質進行發酵，僅能提供約0.4之丁酸產率。另一方面，單獨以乳酸菌（例如：乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069）對含蔗糖之基質進行發酵，能提供約近1之乳酸產率。
實施例
12
：以酪丁酸梭菌
BCRC 910596
混合兼型發酵型乳酸菌對含蔗糖之基質進行發酵
12-1.
選取菌株
於本實施例中係選取酪丁酸梭菌BCRC 910596作為第一菌株，並以乾酪乳桿菌BCRC 10697、或鼠李糖乳桿菌BCRC 11069作為第二菌株。
12 -2. 前培養
(a) 酪丁酸梭菌BCRC 910596：取前述菌株之單一菌落，接種於5毫升RCM培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約18小時。 (b) 乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069：各取前述菌株之單一菌落，分別接種於5毫升MRS培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約24小時。
12-3.
發酵試驗
將0.5毫升實施例12-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596菌液分別與0.5毫升實施例12-2所提供之各乳酸菌菌液混合，並將該二混合菌液分別接種至4毫升之發酵培養液F中，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、48、及120小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之蔗糖（以葡萄糖及果糖計）、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、以及丁酸產率，結果示於表12。
表12
如表12所示，相較於單獨以丁酸菌對含蔗糖之基質進行發酵（丁酸產率為0.4，見表11），當以丁酸菌混合兼型發酵型乳酸菌（例如：乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069）進行發酵時，可有效提升丁酸產率。
實施例
13
：單獨以丁酸菌或乳酸菌對含糖蜜之基質進行發酵
以10%之接種率分別將實施例7-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596、乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069菌液接種至5毫升之發酵培養液G中，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、24、及72小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之糖蜜（以葡萄糖及果糖計）、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、以及丁酸及／或乳酸產率，結果示於表13。
表13
如表13所示，單獨以丁酸菌（例如：酪丁酸梭菌BCRC 910596）對含糖蜜之基質進行發酵，僅能提供約0.2之丁酸產率。另一方面，單獨以乳酸菌（例如：乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069）對含糖蜜之基質進行發酵，能得到約0.95之乳酸產率。
實施例
14
：以酪丁酸梭菌
BCRC 910596
混合兼型發酵型乳酸菌對含糖蜜之基質進行發酵
14-1.
選取菌株
於本實施例中係選取酪丁酸梭菌BCRC 910596作為第一菌株，並以乾酪乳桿菌BCRC 10697、或鼠李糖乳桿菌BCRC 11069作為第二菌株。
14 -2. 前培養
(a) 酪丁酸梭菌BCRC 910596：取前述菌株之單一菌落，接種於5毫升RCM培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約18小時。 (b) 乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069：各取前述菌株之單一菌落，分別接種於5毫升MRS培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約24小時。
14-3.
發酵試驗
將0.5毫升實施例14-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596菌液分別與0.5毫升實施例14-2所提供之各乳酸菌菌液混合，並將該二混合菌液分別接種至4毫升之發酵培養液H中，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、24、及72小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之糖蜜（以葡萄糖及果糖計）、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、以及丁酸產率，結果示於表14。
表14
如表14所示，相較於單獨以丁酸菌對含糖蜜之基質進行發酵（丁酸產率為0.2，見表13），當以丁酸菌混合兼型發酵型乳酸菌（例如：乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069）進行發酵時，可有效提升丁酸產率。
實施例
15
：單獨以酪丁酸梭菌
ATCC 25755
對含葡萄糖之基質進行發酵
15-1.
選取菌株
於本實施例中，係選取酪丁酸梭菌ATCC 25755進行單一菌株之發酵實驗。
15-2.
前培養
酪丁酸梭菌ATCC 25755：取前述菌株之單一菌落，接種於28毫升RCM培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約18小時。
15-3.
發酵試驗
以10%之接種率將實施例15-2所提供之酪丁酸梭菌ATCC 25755接種至發酵培養液B中，使最後的發酵液體積為50毫升。將發酵液置於氣密瓶中，並於前述氣密瓶中分別添加30克／升之碳酸鈣，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、24、及48小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之葡萄糖、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、pH值、以及丁酸產率，結果示於表15。
表15
如表15所示，以另一丁酸菌（例如：酪丁酸梭菌ATCC 25755）對含葡萄糖之基質進行發酵，所提供之丁酸產率約0.44。
實施例
16
：以酪丁酸梭菌
ATCC 25755
混合同型發酵型、兼型發酵型、或異型發酵型之乳酸菌對含葡萄糖之基質進行發酵
16-1.
選取菌株
於本實施例中係選取酪丁酸梭菌ATCC 25755作為第一菌株，並以短乳桿菌BCRC 12187、乾酪乳桿菌BCRC 10697、凝結芽孢桿菌BCRC 10606、或鼠李糖乳桿菌BCRC 11069作為第二菌株。
16-2. 前培養
(a) 酪丁酸梭菌ATCC 25755：取前述菌株之單一菌落，接種於28毫升RCM培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約18小時。 (b) 短乳桿菌BCRC 12187、乾酪乳桿菌BCRC 10697、凝結芽孢桿菌BCRC 10606、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069：各取前述菌株之單一菌落，分別接種於20毫升MRS培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約24小時。
16-3.
發酵試驗
以10%之接種率分別將實施例16-2所提供之酪丁酸梭菌ATCC 25755菌液接種至發酵培養液B中，並分別於該培養液中另以10%之接種率接種實施例16-2所提供之短乳桿菌BCRC 12187、乾酪乳桿菌BCRC 10697、凝結芽孢桿菌BCRC 10606、或鼠李糖乳桿菌BCRC 11069菌液，使最後的發酵液體積為50毫升。將發酵液置於氣密瓶中，並於前述氣密瓶中分別添加30克／升之碳酸鈣，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別於第0、24、48、及144小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之葡萄糖、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、pH值、以及丁酸產率，結果示於表16A及16B。
表16A
表16B
如表16A及16B所示，相較於單獨以丁酸菌對含葡萄糖之基質進行發酵（丁酸產率為0.44，見表15），當以丁酸菌混合異型發酵型乳酸菌（例如：短乳桿菌BCRC 12187）進行發酵時，並無法提升丁酸產率，甚至還會使得丁酸產率下降。而當以丁酸菌混合同型發酵型乳酸菌（例如：凝結芽孢桿菌BCRC 10606）或兼型發酵型乳酸菌（例如：乾酪乳桿菌BCRC 10697、及鼠李糖乳桿菌BCRC 11069）進行發酵時，可有效提升丁酸產率。
實施例
17
：在不同時間點混合酪丁酸梭菌
BCRC 910596
與
鼠李糖乳
桿菌
BCRC 11069
對含葡萄糖之基質進行發酵
17-1.
選取菌株
於本實施例中係選取酪丁酸梭菌BCRC 910596作為第一菌株，並以鼠李糖乳桿菌BCRC 11069作為第二菌株。
17-2. 前培養
(a) 酪丁酸梭菌BCRC 910596：取前述菌株之單一菌落，接種於10毫升RCM培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約8小時，接著將獲得之發酵液轉接至90毫升的RCM培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中震盪培養歷時約16小時。 (b) 鼠李糖乳桿菌BCRC 11069：取前述菌株之單一菌落，接種於10毫升MRS培養基中，並置於37°C之厭氧培養箱中靜置培養歷時約16小時，接著將獲得之發酵液轉接至90毫升的MRS培養基中，並置於37°C之震盪培養箱（厭氧）中震盪培養歷時約8小時。
17-3.
發酵試驗
取三個氣密瓶，於其中分別添加80毫升之發酵培養液I，並分別標示為A、B、C三組。於前述氣密瓶中分別加入10毫升實施例17-2所提供之鼠李糖乳桿菌BCRC 11069菌液，並分別添加30克／升之碳酸鈣，之後置於37°C之厭氧培養箱中培養發酵。分別取10毫升實施例17-2所提供之酪丁酸梭菌BCRC 910596於第16小時加入A氣密瓶、於第20小時加入B氣密瓶、及於第24小時加入C氣密瓶。分別於第0、16、20、24、48、及112小時取樣，並以Agilent 1260系列高效能液相層析儀搭配Aminex HPX- 87 H（300 mm x 7.8 mm）管柱分析，並分別計算所取樣之發酵液中之葡萄糖、乳酸、乙酸、丙酸與丁酸的濃度、pH值、以及丁酸產率，結果示於表17A至17C。
表17A
表17B
表17C
如表17A至C所示，當以丁酸菌混合同型發酵型或兼型發酵型之乳酸菌（例如：鼠李糖乳桿菌BCRC 11069）進行發酵時，不論在何種時間點將二菌株進行混和，皆可提供優良的丁酸產率。
於表1A至17C中，第0小時取樣之發酵液中所測得的乳酸是接種前培養之菌株時所帶入。
以上實施例結果清楚顯示，本發明之混合丁酸菌、以及同型發酵型或兼型發酵型之乳酸菌，對一含醣基質進行發酵之方法，確實可以提供較單獨使用丁酸菌之先前技術為佳的丁酸產率、且可同時降低副產物之產量。此外，丁酸菌與同型發酵型或兼型發酵型之乳酸菌的混合時間點並無特殊限制。
酪丁酸梭菌 ITRI04001（Clostridium tyrobutyricum
ITRI04001）：財團法人食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 910596；德國國家菌種保藏中心，寄存編號DSM 27751。
酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum
）：財團法人食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 14535；美國典型培養物保藏中心，寄存編號ATCC 25755。
乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei
）：財團法人食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 10697；美國典型培養物保藏中心，寄存編號ATCC 393。
鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus
）：財團法人食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 11069；美國農業研究菌種保藏中心，寄存編號NRRL B-445。
德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii
）：財團法人食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 12195；美國典型培養物保藏中心，寄存編號ATCC 9649。
乳酸乳球菌（Lactococcus lactis
）：財團法人食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 12312；美國典型培養物保藏中心，寄存編號ATCC 19435。
凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans
）：財團法人食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 10606；美國典型培養物保藏中心，寄存編號ATCC 7050。
短乳桿菌（Lactobacillus brevis
）：財團法人食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 12187；美國典型培養物保藏中心，寄存編號ATCC 14869。
菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus
）：財團法人食品工業發展研究所，寄存編號BCRC 14647；美國典型培養物保藏中心，寄存編號ATCC 15538。
Claims (10)
- 一種生產丁酸及／或其鹽類之方法，其係包含：對一含有醣類之基質進行發酵反應，其中該發酵反應係在一第一菌株與一第二菌株之存在下進行，該第一菌株係一丁酸菌，且該第二菌株係以下之至少一者：同型發酵型乳酸菌（homofermentative lactic acid bacterium）、以及兼型發酵型乳酸菌（facultative heterofermentative lactic acid bacterium）。
- 如請求項1之方法，其中該第一菌株係梭菌屬菌株（Clostridium sp.）。
- 如請求項1之方法，其中該第一菌株係酪丁酸梭菌（Clostridium tyrobutyricum ）。
- 如請求項1之方法，其中該第一菌株係以下之至少一者：酪丁酸梭菌BCRC 910596、及酪丁酸梭菌ATCC 25755。
- 如請求項1之方法，其中該第二菌株係以下之至少一者：乳酸桿菌屬菌株（Lactobacillus sp.）、乳酸球菌屬菌株（Lactococcus sp.）、芽孢乳桿菌屬菌株（Sporolactobacillus sp.）、及桿菌屬菌株（Bacillus sp.）。
- 如請求項1之方法，其中該第二菌株係以下之至少一者：乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei ）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus ）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii ）、胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum ）、副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）、保加利亞乳酸桿菌（Lactobacillus bulgaricusi ）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ）、及菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus ）。
- 如請求項1之方法，其中該第一菌株係酪丁酸梭菌BCRC 910596，且該第二菌株係以下之至少一者：乾酪乳桿菌（Lactobacillus casei ）、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus ）、德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii ）、胚芽乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum ）、副乾酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei ）、保加利亞乳酸桿菌（Lactobacillus bulgaricusi ）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis ）、凝結芽孢桿菌（Bacillus coagulans ）、及菊糖芽孢乳桿菌（Sporolactobacillus inulinus ）。
- 如請求項1至7中任一項之方法，其中該醣類係以下之至少一者：葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖、糖蜜（molasses）、及纖維二糖（cellobiose）。
- 如請求項1至7中任一項之方法，其中該基質更含有碳源、氮源、及礦物質元素之至少一者。
- 如請求項9之方法，其中該碳源係乙酸及乙酸鹽之至少一者，該礦物質元素係以下之至少一者：磷、硫、鉀、鎂、鐵、及錳。
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