BR102018076755A2 - Sistema de plataforma de fundição em nuvem aprimorado - Google Patents

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Chun-Han Chen
Wan-Shan CHIEN
Ruey-Fu Shih
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Abstract

sistema de plataforma de fundição em nuvem aprimorado.trata-se de um sistema de plataforma de fundição em nuvem que compreende pelo menos: um controlador em nuvem, uma corretora de serviço, um back-end de serviço constituído de várias instâncias de serviço, cada uma vinculada a pelo menos um aplicativo, em um grupo de agentes de execução de droplet (grupo de dea), uma interface gráfica de usuário (gui) e um diagnóstico de plataforma acoplado com sondas que fornecem informações quanto ao estado de recursos do sistema, em que a disposição de hardware e software que forma a interface gráfica de usuário compreende um conjunto de células de interface ativadas personalizadas que podem ser manipuladas pelo usuário, e cada uma pode gerar, após sua ativação, uma parte de uma instrução específica, sendo que cada uma das instruções específicas será combinada pela interface gráfica de usuário e transferida ao controlador em nuvem com o uso de uma rotina e de acordo com os recursos disponíveis determinados pelo diagnóstico de plataforma, em um comando, que substitui o comando regular inserido pelo usuário em uma interface de linha de comando.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODO PARA PRODUZIR ÁCIDO BUTÍRICO E/OU SAIS DO MESMO”
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido Provisório n° de Série US 62/609.170 depositado em 21 de dezembro de 2017, no Escritório de Marcas e Patentes dos Estados Unidos, e dos Pedidos de Patente n° TW 107120222 depositado em 12 de junho de 2018 e 107131552 depositado em 7 de setembro de 2018, no Escritório de Propriedade Intelectual de Taiwan, cujas descrições estão incorporadas em sua totalidade à presente invenção a título de referência.
CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção refere-se a um método para a produção de ácido butírico e/ou um butirato que compreende fermentar um substrato contendo sacarídeo na presença de uma primeira cepa e uma segunda cepa, em que a primeira cepa é uma bactéria de ácido butírico e a segunda cepa é pelo menos uma dentre uma bactéria de ácido láctico homofermentativa e uma bactéria do ácido lático heterofermentativa facultativa. Em comparação com o método convencional para produzir ácido butírico, o método da presente invenção pode aumentar o rendimento do ácido butírico e diminuir a produção de subproduto.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [003] O ácido butírico e seus derivados têm sido amplamente usados na indústria e podem ser usados como um material químico ou um aditivo alimentar. Foi revelado por pesquisas que o ácido butírico é eficaz em manter e promover a função do trato intestinal do animal, e induzir a apoptose de células tumorais. Portanto, o ácido butírico tem um bom potencial no tratamento de gastroenterite, câncer e leucemia. Os métodos para produzir ácido butírico incluindo quimiossíntese e catálise microbiana, em que a quimiossíntese é principalmente o processo à base de óleo fóssil como oxidação de butiraldeído e carbonilação de propileno. No passado, a quimiossíntese era o processo primário para produzir o ácido butírico, devido ao fato de que era simples e de baixo custo. No entanto, a crise energética colocou desafios, incluindo o
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2/44 aumento do custo, ao processo de quimiossíntese à base de óleo fóssil. Juntamente com o desenvolvimento da aplicação de ácido butírico e seus derivados no campo biológico relacionado, os produtos de ácido butírico biologicamente derivados são muito mais populares entre os consumidores do que aqueles produzidos pela quimiossíntese. Assim, as pessoas estão prestando mais atenção ao método de catálise microbiana para produzir ácido butírico.
[004] O método de catálise microbiana para a produção de ácido butírico é um processo de fermentação anaeróbico, que geralmente é realizado na presença de uma única cepa. Os micro-organismos adequados para esse método incluem Clostridium sp., Butyrivibrio sp., Butyribacterium sp., Sarcina sp., Eubacterium sp., Fusobacterium sp., Megasphaera sp., etc. No entanto, uma vez que o método de catálise microbiana de única cepa para produzir ácido butírico é deficiente em um alto custo de material, um baixo rendimento por unidade de volume e um alto rendimento de subproduto (isto é, ácido acético), os indivíduos nesse campo ainda se esforçam para desenvolver um método de catálise microbiana que é eficaz em aumentar o rendimento do ácido butírico e diminuir a produção de subproduto.
[005] Inventores da presente invenção constataram que, em comparação com o método convencional que usa catálise microbiana na presença de uma única cepa, o método que compreende fermentar um substrato contendo sacarídeo na presença de uma bactéria de ácido butírico e pelo menos uma das seguintes bactérias de ácido lático podem fornecer um melhor rendimento de ácido butírico e uma produção diminuída de subproduto: uma bactéria de ácido láctico homofermentativa e uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa facultativa.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [006] Um objetivo da presente invenção é fornecer um método para a produção de ácido butírico e/ou um butirato que compreende fermentar um substrato contendo sacarídeo na presença de uma primeira cepa e uma segunda cepa, em que a primeira cepa é uma bactéria de ácido butírico e a segunda cepa é pelo menos uma dentre uma bactéria de ácido láctico homofermentativa e uma bactéria do ácido lático
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3/44 heterofermentativa facultativa.
[007] De preferência, a primeira cepa é Clostridium sp. Por exemplo, a primeira cepa é Clostridium tyrobutyricum, especialmente pelo menos um de Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 e Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755.
[008] De preferência, a segunda cepa é pelo menos uma dentre Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Sporolactobacillus sp. E Bacillus sp. Por exemplo, a segunda cepa é pelo menos uma dentre Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus bulgaricusi, Lactococcus lactis e Sporolactobacillus inulinus.
[009] Em algumas modalidades da presente invenção, a primeira cepa é Clostridium tyrobutyricum DSM 27751, e a segunda cepa é pelo menos uma dentre Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus bulgaricusi, Lactococcus lactis, Bacillus coagulans e Sporolactobacillus inulinus.
[010] No método de acordo com a presente invenção descrito acima, o sacarídeo contido no substrato adotado é pelo menos um dentre glicose, frutose, lactose, sacarose, melaço e celobiose. De preferência, o substrato contém ainda uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e/ou um elemento mineral. Com mais preferência, a fonte de carbono é pelo menos um de ácido acético e acetato, e o elemento mineral é pelo menos um de fósforo, enxofre, potássio, magnésio, ferro e manganês.
[011] A tecnologia detalhada e modalidades preferenciais implantadas para a presente invenção são descritas nos parágrafos seguintes para indivíduos versados nesse campo apreciarem bem os recursos da invenção reivindicada.
DESCRIÇÃO DAS MODALIDADES PREFERENCIAIS [012] A seguir, serão descritas algumas das modalidades da presente invenção em detalhes. No entanto, sem se afastar do espírito da presente invenção, a presente invenção pode ser incorporada em várias modalidades e não deve ser limitada às modalidades descritas no relatório descritivo ou definidas nas reivindicações anexas. [013] Salvo indicação em contrário, as expressões “um”, “uma”, “o/a” ou
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4/44 similares, citadas no relatório descritivo da presente invenção (especialmente nas reivindicações), destinam-se a incluir as formas singular e plural. O termo microorganismo inclui o tipo selvagem presente na natureza e o tipo mutante induzido por quaisquer fatores (por exemplo, fator natural ou fator artificial). O termo “fermentação” se refere a um processo para metabolizar um ou mais substratos por um microorganismo em uma atmosfera aeróbica para produzir um composto orgânico. O termo meio se refere a uma composição que fornece nutrientes e condições (por exemplo, valor de pH, umidade, etc.) essenciais para o crescimento e replicação de um microorganismo. Em geral, a composição do meio seria ajustada de acordo com o tipo de cepa do micro-organismo a ser incubado. Por exemplo, o ajuste no meio pode ser feito adicionando-se um ou mais dentre HCl, Ca(OH)2, NaOH, NH4OH, (NH4)2SO4, NH4Cl, CH3COONH4, K2HPO4, KH2PO4, NaH2PO3, Na2HPO3, ácido cítrico, MgSO4«7H2O, FeSO4*7H2O ou MnSO4*7H2O de modo a proporcionar um meio com um valor de pH desejado e/ou propriedades físico-químicas ou fisiológicas desejadas. O termo “substrato” se refere a um material que pode ser utilizado durante a fermentação de um micro-organismo e, assim, entra na via metabólica da fermentação e, então, se converte em outra substância (ou substâncias).
[014] O termo bactéria de ácido butírico se refere a um micro-organismo que tem a capacidade de metabolizar o sacarídeo em ácido butírico durante a fermentação. O termo bactéria de ácido láctico se refere a um micro-organismo que tem a capacidade de metabolizar o sacarídeo em ácido láctico durante a fermentação. Dependendo dos caracteres de metabolização, as bactérias de ácido láctico podem ser classificadas em três classes: bactérias de ácido láctico homofermentativas, bactérias de ácido láctico heterofermentativas facultativas e bactérias de ácido láctico heterofermentativas. O termo bactéria de ácido láctico homofermentativa se refere a uma bactéria do ácido láctico que metaboliza a maior parte do sacarídeo em ácido láctico. O termo bactéria láctica heterofermentativa se refere a uma bactéria de ácido láctico que metaboliza parte do sacarídeo em ácido láctico e alguns em etanol, ácido acético e dióxido de carbono. Dependendo da condição de fermentação (por exemplo,
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5/44 o substrato adotado, valor de pH, temperatura, etc.), a bactéria de ácido láctico heterofermentativa facultativa pode conduzir a homofermentação ou heterofermentação.
[015] Neste relatório descritivo, o termo “rendimento de ácido butírico” se refere à razão entre a quantidade de ácido butírico produzido (grama) e a quantidade total de sacarídeo consumido (grama) e/ou ácido láctico (grama) durante a fermentação, e calculado pela Fórmula 1 como se segue:
Fórmula 1:
rendimento de ácido butírico ácido butírico produzido (gram) sacarídeo consumido (gram) + ácido láctico consumido (gram) [016] Neste relatório descritivo, o termo “rendimento de ácido láctico” se refere à razão entre a quantidade de ácido láctico produzido (grama) e a quantidade de sacarídeo consumido (grama) durante a fermentação, e calculado pela Fórmula 2 como se segue:
Fórmula 2:
ácido láctico produzido (gram) rendimento de ácido láctico =-----—-----------;—-----— sacarídeo consumido (gram) [017] Diferentemente do método da técnica anterior de produção de ácido butírico por meio do uso de uma única bactéria de ácido butírico, a presente invenção fornece um método para produzir ácido butírico e/ou um butirato, que compreende fermentar um substrato contendo sacarídeo na presença de uma primeira cepa e uma segunda cepa, em que a primeira cepa é uma bactéria de ácido butírico e a segunda cepa é pelo menos uma dentre uma bactéria de ácido láctico homofermentativa e uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa facultativa. Conforme mostrado nos Exemplos anexos, em comparação com a técnica anterior, o método da presente invenção pode fornecer um melhor rendimento de ácido butírico e uma produção reduzida de subproduto.
[018] No método de acordo com a presente invenção, o substrato compreende um sacarídeo. Exemplos de sacarídeo adequado (também chamado de carboidrato) incluem, sem limitação, monossacarídeos (por exemplo, glicose, frutose, galactose,
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6/44 manose, arabinose, lipose, ribose, ribulose, xilulose, alose, altrose, gulose, idose, talose psicose, sorbose, tagatose); dissacarídeos (por exemplo, sacarose, maltose, lactose, lactulose, trealose, celobiose); oligossacarídeos (por exemplo, estaquiose, maltotriose, maltotetrose, maltopentaose); polissacarídeos (por exemplo, amido, celulose, glicogênio, ciclodextrina, arabinoxilanos, goma de guar, goma arábica, quitina, goma, alginato, pectina, gelano); e melaço. Em algumas modalidades da presente invenção, utilizou-se um substrato contendo pelo menos um dentre glicose, frutose, sacarose e melaço para fornecer a fonte de carbono desejada para a fermentação.
[019] Opcionalmente, o substrato adotado no método da presente invenção pode ainda conter uma fonte de aminoácido. Exemplos de fontes de aminoácidos adequadas incluem, sem limitação, extrato de levedura, hidrolisado de proteína, peptona, licor de maceração de milho (CSL), soro de leite, farinha de soja, farinha de peixe, farinha de ossos de carne, pó de levedura e pó de soja.
[020] Exemplos de bactérias de ácido butírico adequadas para serem a primeira cepa do método da presente invenção incluem, sem limitação, Clostridium sp., Butyrivibrio sp., Butyribacterium sp., Sarcina sp., Eubacterium sp., Fusobacterium sp., e Megasphaera sp. De preferência, a primeira cepa é Clostridium sp. Com mais preferência, a primeira cepa é Clostridium tyrobutyricum, como Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 e Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755.
[021] Exemplos de bactérias de ácido láctico homofermentativas e bactérias de ácido láctico heterofermentativas facultativas adequadas para serem a segunda cepa do método da presente invenção incluem, sem limitação, Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Sporolactobacillus sp., e Bacillus sp. Exemplos de Lactobacillus sp. include Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei e Lactobacillus bulgaricusi. Exemplos de Lactococcus sp. incluem Lactococcus lactis. Exemplos de Sporolactobacillus sp. incluem Sporolactobacillus inulinus. Exemplos de Bacillus sp. incluem Bacillus coagulans.
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7/44 [022] Em algumas das modalidades da presente invenção, a primeira cepa é Clostridium tyrobutyricum, e a segunda cepa é pelo menos uma dentre Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus bulgaricusi, Lactococcus lactis, Bacillus coagulans e Sporolactobacillus inulinus.
[023] Além das cepas de tipo selvagem acima, a primeira cepa pode ser uma cepa modificada obtida por um procedimento de engenharia genética, contanto que a cepa modificada tenha a capacidade de metabolizar o sacarídeo em ácido butírico durante a fermentação. De modo similar, a segunda cepa necessária no método da presente invenção pode também ser uma cepa modificada obtida por um procedimento de engenharia genética, desde que a cepa modificada tenha a capacidade de metabolizar o sacarídeo em ácido láctico durante a fermentação.
[024] No método de produção de ácido butírico e/ou butirato de acordo com a presente invenção, o termo “atmosfera anaeróbica” se refere a uma atmosfera que contém menos de 5 ppm (parte por milhão) de oxigênio, de preferência menos que 0,5 ppm de oxigênio e, com mais preferência, menos de 0,1 ppm de oxigênio. Qualquer método adequado pode ser usado para fornecer a atmosfera anaeróbica desejada. Por exemplo, sem limitação, antes de a fermentação ser conduzida, um gás inerte (por exemplo, nitrogênio, dióxido de carbono) é introduzido no reator de fermentação para purgar o reator e, assim, fornecer a atmosfera anaeróbica desejada; alternativamente, a fermentação é conduzida em uma caixa de operação anaeróbica, em que um catalisador de paládio é usado para catalisar a reação do oxigênio na caixa e o hidrogênio na mistura gasosa anaeróbica para produzir água, e assim, fornecer a atmosfera anaeróbica desejada.
[025] No método de produção de ácido butírico e/ou butirato de acordo com a presente invenção, não há limitação particular à ordem de mistura do substrato e das cepas. O substrato pode ser adicionado de uma só vez ou em vários lotes antes ou durante a fermentação, e as cepas podem ser suplementadas opcionalmente. Por exemplo, o substrato pode ser misturado com as cepas de uma só vez antes de
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8/44 conduzir a fermentação; ou o substrato pode ser dividido em dois ou mais lotes de quantidades iguais ou diferentes e, então, os lotes são adicionados separadamente ao reator antes ou durante a fermentação.
[026] No método de produção de ácido butírico e/ou butirato de acordo com a presente invenção, não há limitação particular à ordem de mistura da primeira e da segunda cepas. Opcionalmente, antes ou durante a fermentação, o substrato pode ser misturado com a primeira e segunda cepas de uma só vez ou em vários lotes. Por exemplo, o substrato pode ser misturado com a primeira cepa e segunda cepa de uma só vez antes de conduzir a fermentação; ou o substrato pode ser misturado com qualquer uma dentre a primeira e cepas antes de conduzir a fermentação e, então, a outra cepa é adicionada ao reator de fermentação durante a fermentação.
[027] Opcionalmente, antes de conduzir a fermentação no método de produção de ácido butírico e/ou butirato de acordo com a presente invenção, a primeira cepa e/ou segunda cepa adoptada pode ser pré-cultivada até crescer na fase de log. Tais cepas pré-cultivadas são usadas para realizar o método da presente invenção.
[028] No método de produção de ácido butírico e/ou butirato de acordo com a presente invenção, o substrato adotado pode conter ainda uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e/ou um elemento mineral. Dependendo da primeira e segunda cepas adotadas, a fonte de carbono poderia ser pelo menos um dentre ácido acético, acetato e sacarídeos (por exemplo, glicose, sacarose e melaço), e o elemento mineral poderia ser pelo menos um dentre fósforo, enxofre, potássio, magnésio, ferro e manganês, mas não são limitados por isso. Por exemplo, o substrato pode conter dihidrogenofosfato de potássio (KH2PO4) para fornecer elementos como fósforo e potássio, e pode conter cloreto de magnésio ou hepta-hidrato de sulfato de magnésio (MgSO4-7H2O) fornecer elemento de magnésio e/ou pode conter cloreto férrico ou sulfato ferroso hepta-hidratado (FeSO4-7H2O) para fornecer um elemento de ferro.
[029] A presente invenção será adicionalmente ilustrada em detalhes com exemplos específicos da seguinte forma. No entanto, os exemplos seguintes são fornecidos apenas para ilustrar a presente invenção e o escopo da presente invenção
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9/44 não é limitado por isso. O escopo da presente invenção será indicado nas reivindicações anexas.
EXEMPLOS [FONTE OU INGREDIENTE DE MATERIAL]:
1. RCM (Meio Clostridial Reforçado): adquirido junto à Merck (contendo extrato de carne: 10 g/l; peptona: 10 g/l; extrato de levedura: 3 g/l; D (+) glicose: 5 g/l; amido: 1 g/l; NaCl: 5 g/l; acetato de sódio: 3 g/l; cloridrato de L-cisteína: 0,5 g/l; ágar: 0,5 g/l; pH 6,8).
2. CSL (Milhocina): adquirida junto à Fonenfonher company.
3. Meio MRS: adquirido junto à Merck (contendo peptona: 10 g/l; extrato de carne: 8 g/l; extrato de levedura: 4 g/l; D (+) glicose: 20 g/l; K2HPO4: 2 g/l; polissorbato
80: 1 g/l; citrato de diamônio: 2 g/l; acetato de sódio: 5 g/l; sulfato de magnésio: 0,2 g/l; sulfato de manganês: 0,04 g/l
4. Caldo de fermen tação A-I, cada um con tendo os seguintes ingredientes:
Caldo A B C D E F G H I
Sacarídeo, Glicos Glico Glico Fruto Xilos Saca Melaço Melaço Glico
g/l e se se se e rose s s se
25 50 20 50 20 20 11 11 50
Extrato de levedura, g/l 10 10 10 10 10 10 10 10 10
Peptona, g/l 10 10 10 10 10 10 10 10 10
(NH4)2SO4, g/l 3 3 3 3 3 3 3 3 3
K2HPO4, g/l 3,5 2 2 2 2 2 2 2 2
MgSO4«7H 2O, g/l 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8 0,8
FeSO4*7H2 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03
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10/44
O, g/l
MnSO4*H2 O, g/l 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04
Ácido acético, ml/l 18 13 6 13 6 6 13 6 11
PH 7 7 7 7 7 7 7 7 7
[ATMOSFERA ANAERÓBICA E MEIO DESOXIGENADO] [030] Nos exemplos seguintes, foi fornecida uma atmosfera anaeróbica em um recipiente hermético (por exemplo, garrafa de soro hermética, tubo de centrifugação) pelas seguintes operações. O recipiente hermético e o batoque de borracha foram cobertos com folha de alumínio e, então, esterilizados sob alta temperatura e alta pressão (121 °C, 0,12 MPa (1,2 atm)) para excluir a interferência de outros microorganismos. Depois que a esterilização foi concluída, o recipiente hermético foi colocado em um forno para remover a umidade residual para evitar qualquer contaminação por micro-organismos ocasionada pela umidade residual. Posteriormente, o recipiente hermético seco foi transferido para uma caixa de operação anaeróbica. Depois da folha de alumínio de vedação ter sido ligeiramente afrouxada, o catalisador de paládio (adquirido junto à Thermo Scientific, Inc., número do produto: BR0042) foi usado para catalisar a reação do oxigênio no recipiente hermético e o hidrogênio na mistura gasosa anaeróbica para produzir água e esgotar o oxigênio no recipiente hermético e, assim, fornecer uma atmosfera anaeróbica.
[031] Nos exemplos seguintes, todos os meios foram tratados da seguinte forma para serem desoxigenados. Primeiro de tudo, o meio foi preparado com a composição desejada. O meio preparado foi esterilizado sob alta temperatura e alta pressão (121 °C, 0,12 MPa (1,2 atm)) por 20 minutos e, então, transferido para uma caixa de operação anaeróbica antes que o meio esfriasse até a temperatura ambiente. Posteriormente, a tampa do recipiente hermético no qual o meio foi mantido foi
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11/44 ligeiramente afrouxada para liberar o vapor contido no mesmo. Então, com o uso do catalisador de paládio, a reação do oxigênio no recipiente hermético e o hidrogênio na mistura gasosa anaeróbica foi catalisada para produzir água de modo que a desoxigenação do meio tenha sido realizada. Depois de o meio ter arrefecido até à temperatura ambiente, adicionou-se cloridrato de L-cisteína (0,5 g/l) para reduzir o potencial redox do meio para uma faixa adequada para o micro-organismo de modo a fornecer um meio desoxigenado.
EXEMPLO 1: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO GLICOSE POR MEIO DO USO DE UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO BUTÍRICO ÚNICA OU UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO
1-1. SELEÇÃO DE CEPA [032] Para conduzir uma fermentação usando uma única cepa, usou-se uma dentre Clostridium tyrobutyricum DSM 27751, Lactobacillus casei ATCC 393, Lactobacillus brevis ATCC 14869, Lactococcus lactis ATCC 19435, Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 e Lactobacillus delbrueckii ATCC 9649.
1-2. EXPERIMENTOS DE FERMENTAÇÃO [033] Uma única colônia de cada cepa fornecida pelo Exemplo 1-1 foi selecionada individualmente. Prepararam-se seis caldos inoculados inoculando individualmente 4 ml de caldo de fermentação A com as seis colônias selecionadas e, então, adicionou-se respectivamente 1 ml de água esterilizada em cada um dos caldos. Posteriormente, os caldos inoculados foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas de cada um dos caldos às 0â, 31â e 95â hora, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de glicose, ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e os rendimentos de ácido butírico e/ou ácido láctico. Os resultados são mostrados nas Tabelas 1A e 1B.
TABELA 1A
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12/44
Cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 Lactobacillus brevis ATCC 14869 Lactobacillus casei ATCC 393
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 31 95 0 31 95 0 31 95
Glicose (g/l) 20,7 3,0 0 20,7 19,2 13,5 20,7 11,2 3,0
Ácido láctico (g/l) 1,2 0 0 1,2 1,6 3,9 1,2 9,6 17,1
Ácido acético (g/l) 14,1 12,7 12 14,1 14,0 13,8 14,1 13,7 13,6
Ácido propiônico (g/l) 0,4 0,4 0,4 0,4 0,5 0,5 0,4 0,5 0,4
Ácido butírico (g/l) 0,0 7,4 8,9 0,0 0 0 0,0 0 0
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,41 0
Rendimento de ácido láctico (g/g) 0,38 0,9
TABELA1B
Cepa Lactococcus lactis ATCC 19435 Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 Lactobacillus delbrueckii AT CC 9649
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 31 95 0 31 95 0 31 95
Glicose (g/l) 20,7 16,7 16,2 20,7 14,1 8,8 20,7 18,1 15,2
Ácido láctico (g/l) 1,2 4,7 5,4 1,2 7,2 12,0 1,2 3,4 6,0
Ácido acético (g/l) 14,1 13,9 13,9 14,1 14,0 13,6 14,1 14,0 13,9
Ácido propiônico (g/l) 0,4 0,5 0,6 0,4 0,5 0,4 0,4 0,5 0,6
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Ácido butírico (g/l) 0,0 0 0 0,0 0 0 0,0 0 0
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0 0 0
Rendimento de ácido láctico (g/g) 0,95 0,91 0,88
[034] Conforme mostrado nas Tabelas 1A e 1B, o uso de uma única bactéria de ácido butírico (por exemplo, Clostridium tyrobutyricum DSM 27751) na fermentação de um substrato contendo glicose forneceu apenas sobre 0,41 do rendimento de ácido butírico. Por outro lado, se a fermentação de um substrato contendo glucose foi conduzida por meio do uso de uma única bactéria do ácido láctico (por exemplo, Lactobacillus casei ATCC 393, Lactobacillus brevis ATCC 14869, Lactococcus lactis ATCC 19435, Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 e Lactobacillus delbrueckii ATCC 9649), o rendimento de ácido láctico foi entre 0,88 a 0,95.
EXEMPLO 2: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO GLICOSE POR MEIO DO USO DE UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO BUTÍRICO EM COMBINAÇÃO COM UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO
2-1. SELEÇÃO DE CEPA [035] Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 foi usada como a primeira cepa. Usou-se uma dentre Lactobacillus casei ATCC 393, Lactobacillus brevis ATCC 14869, Lactococcus lactis ATCC 19435, Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 e Lactobacillus delbrueckii ATCC 9649 como a segunda cepa.
2-2. PRÉ-CULTURA (a) Clostridium tyrobutyricum DSM 27751: uma única colônia dessa cepa foi selecionada e inoculada em 5 ml de meio RCM, e o meio inoculado foi incubado estaticamente em incubadora anaeróbica a 37 °C por 17 horas.. Em seguida, retirouse 1 ml de cepa líquida e adicionou-se a um meio RCM de 3 ml para realizar uma incubação recente durante 5 horas.
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14/44 (b) Lactobacillus casei ATCC 393, Lactobacillus brevis ATCC 14869, Lactococcus lactis ATCC 19435 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445: selecionouse uma única colônia de cada cepa e inoculou-se em 5 ml de meio MRS e o meio inoculado foi incubado estaticamente em uma incubadora anaeróbica a 37 °C durante cerca de 28 horas.
(c) Lactobacillus delbrueckii ATCC 9649: selecionou-se uma única colônia dessa cepa e inoculou-se em 5 ml de meio MRS e incubou-se estaticamente o meio inoculado em uma incubadora anaeróbica a 37 °C durante cerca de 3 dias.
2-3. EXPERIMENTOS DE FERMENTAÇÃO [036] Cinco misturas foram preparadas por meio da mistura de 0,5 ml de líquido de cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 fornecido pelo Exemplo 2-2 com 0,5 ml cada um dentre líquido de cepa Lactobacillus casei ATCC 393, líquido de cepa Lactobacillus brevis ATCC 14869, líquido de cepa Lactococcus lactis ATCC 19435, líquido de cepa Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 e líquido de cepa Lactobacillus delbrueckii ATCC 9649 fornecidos pelo Exemplo 2-2 respectivamente. Prepararam-se cinco caldos inoculados inoculando individualmente 4 ml de caldo de fermentação A com as cinco misturas e os caldos inoculados foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas de cada um dos caldos às 0, 26â, 42â e 71â horas, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de glicose, ácido lático, ácido acético e ácido butírico no caldo de fermentação, e o rendimento de ácido butírico. Os resultados são mostrados nas Tabelas 2A e 2B.
TABELA 2A
Cepa de bactéria de ácido láctico Lactobacillus brevis ATCC 14869 Lactobacillus casei BCRC10697 Lactococcus lactis ATCC 19435
Ponto no tempo de 0 26 42 0 26 42 0 26 42
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amostragem (horas)
Glicose (g/l) 22,2 0 0 21,9 0 0 21,5 2,5 0,1
Ácido láctico (g/l) 2,0 0 0 1,3 0,3 0 1,7 0 0
Ácido acético (g/l) 7,1 6,1 6,1 14,9 9,7 9,6 14,9 11,4 10,6
Ácido butírico (g/l) 0,2 9,7 9,7 0,0 13,0 13,3 0,0 10,3 11,7
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,39 0,57 0,5
TABELA 2B
Cepa de bactéria de ácido Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus delbrueckii
láctico NRRL B-445 ATCC 9649
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 26 42 0 71
Glicose (g/l) 21,7 0,0 0 21,2 0
Ácido láctico (g/l) 1,7 0,1 0 1,2 0
Ácido acético (g/l) 15,0 10,3 10,1 14,6 10,4
Ácido butírico (g/l) 0,0 13,0 13,1 0 13,0
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,56 0,58
[037] Conforme mostrado nas Tabelas 2A e 2B, em comparação com o uso de uma única bactéria de ácido butírico para conduzir a fermentação do substrato contendo glicose (conforme mostrado na Tabela 1A, fornecendo um rendimento de ácido butírico de 0,41), o uso de uma bactéria de ácido butírico em combinação com uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa (por exemplo, Lactobacillus brevis ATCC 14869) não poderia aumentar (ou ainda mesmo diminuir) o rendimento do ácido
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16/44 butírico, mas o uso de uma bactéria de ácido butírico em combinação com uma bactéria de ácido láctico homofermentativa (por exemplo, Lactococcus lactis ATCC 19435 e Lactobacillus delbrueckii ATCC 9649) ou uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa facultativa (por exemplo, Lactobacillus casei ATCC 393, e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445) poderia eficazmente aumentar o rendimento de ácido butírico.
EXEMPLO 3: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO GLICOSE POR MEIO DO USO DE CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM DSM 27751 EM COMBINAÇÃO COM UMA BACTÉRIA ÁCIDO LÁCTICO HETEROFERMENTATIVA FACULTATIVA
3-1. SELEÇÃO DE CEPA [038] Usou-se Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 como a primeira cepa. Usou-se uma entre Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 como a segunda cepa.
3-2. PRÉ-CULTURA [039] (a) Clostridium tyrobutyricum DSM 27751: uma única colônia dessa cepa foi selecionada e inoculada em 20 ml de meio RCM, e o meio inoculado foi incubado estaticamente em incubadora anaeróbica a 37 °C por cerca de 18 horas..
[040] (b) Lactobacillus caseiATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445:
selecionou-se uma única colônia de cada cepa e inoculou-se em 5 ml de meio MRS e o meio inoculado foi incubado estaticamente em uma incubadora anaeróbica a 37 °C durante cerca de 28 horas
3-3. EXPERIMENTOS DE FERMENTAÇÃO [041] Foram preparadas duas misturas misturando 10 ml de líquido de cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 fornecido pelo Exemplo 3-2 com 10 ml cada um dentre líquido de cepa Lactobacillus casei ATCC 393 e líquido de cepa Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 fornecidos pelo Exemplo 3-2, respectivamente. Prepararamse dois caldos inoculados em dois recipientes herméticos inoculando individualmente 80 ml de caldo de fermentação B com as duas misturas. Adicionou-se 30 g/l de
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17/44 carbonato de cálcio a cada um dos recipientes herméticos. Posteriormente, os recipientes herméticos foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas de cada um dos caldos às 0â, 23â e 55â hora, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de glicose, ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e o rendimento de ácido butírico. Os resultados são mostrados na Tabela 3.
TABELA 3
Cepa de bactéria de ácido láctico Lactobacillus casei BCRC10697 Lactobacillus rhamnosus NRRL B445
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 23 55 0 23 55
Glicose (g/l) 55,1 0 0 54,7 0,0 0,0
Ácido láctico (g/l) 2,7 19,9 0 2. 9 19,4 0,0
Ácido acético (g/l) 15,3 10,2 4,5 15,3 9,2 3,9
Ácido propiônico (g/l) 0,6 0,6 0,9 0,6 0,6 0. 7
Ácido butírico (g/l) 0,0 20,1 35,6 0,1 19,9 34,3
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,62 0,59
[042] Conforme mostrado na Tabela 3, em comparação com o uso de uma única bactéria de ácido butírico para conduzir a fermentação do substrato contendo glicose (conforme mostrado na Tabela 1A, fornecendo um rendimento de ácido butírico de 0,41), o uso de uma bactéria do ácido butírico em combinação com uma bactéria de
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18/44 ácido láctico heterofermentativa facultativa (por exemplo, Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445) poderia efetivamente aumentar o rendimento do ácido butírico.
EXEMPLO 4: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO GLICOSE POR MEIO DO USO DE CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM DSM 27751 EM COMBINAÇÃO COM UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO HETEROFERMENTATIVA OU UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO HOMOFERMENTATIVA
4-1. SELEÇÃO DE CEPA [043] Usou-se Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 como a primeira cepa. Usou-se uma dentre Lactobacillus brevis ATCC 14869 e Bacillus coagulans ATCC 7050 como a segunda cepa.
4-2. PRÉ-CULTURA [044] (a) Clostridium tyrobutyricum DSM 27751: uma única colônia dessa cepa foi selecionada e inoculada em 20 ml de meio RCM, e o meio inoculado foi incubado estaticamente em incubadora anaeróbica a 37 °C por cerca de 18 horas..
[045] (b) Lactobacillus brevis ATCC 14869 e Bacillus coagulans ATCC 7050:
selecionou-se uma única colônia de cada cepa e inoculou-se em 5 ml de meio MRS e o meio inoculado foi incubado estaticamente em uma incubadora anaeróbica a 37 °C durante cerca de 28 horas
4-3. EXPERIMENTOS DE FERMENTAÇÃO [046] Três líquidos de cepa, isto é, 0,5 do líquido de cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 fornecido pelo Exemplo 4-2 (doravante chamado de “grupo de controle”), uma mistura de 0,5 ml de líquido de cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 fornecido pelo Exemplo 4-2 e 0,5 ml de um dentre o líquido de cepa de bactéria de ácido láctico fornecido pelo Exemplo 4-2, e uma mistura de 0,5 ml de líquido de cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 fornecido pelo Exemplo 4-2 e 0,5 ml do outro líquido de cepa de bactéria de ácido láctico fornecido pelo Exemplo 4-2 foram preparadas. Prepararam-se três caldos inoculados inoculando individualmente 4 ml
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19/44 de caldo de fermentação C com os três líquidos de cepa e os caldos inoculados foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas de cada um dos caldos às 0â, 25â e 42â hora, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de glicose, ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e o rendimento de ácido butírico. Os resultados são mostrados na Tabela 4.
TABELA 4
Cepa de bactéria de ácido láctico Nenhuma (grupo de controle) Lactobacillus brevis ATCC 14869 Bacillus coagulans ATCC 7050
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 25 42 0 25 42 0 25 42
Glicose (g/l) 21,2 0 0 22,2 0,0 0,0 22,3 0 0
Ácido láctico (g/l) 1,6 0 0 2,0 0 0,0 1,6 0 0
Ácido acético (g/l) 6,6 6,0 6,1 7,1 6,2 6,1 6,8 3,7 3,7
Ácido propiônico (g/l) 0, 7 0,5 0,6 0,7 0,5 0,5 0,6 0,5 0,5
Ácido butírico (g/l) 0,2 9,0 8,9 0,2 9,7 9,7 0,2 11,7 11,7
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,39 0,39 0,48
[047] Conforme mostrado na Tabela 4, em comparação com o uso de uma única bactéria do ácido butírico para conduzir a fermentação do substrato contendo glicose (isto é, o grupo controle, fornecendo um rendimento de ácido butírico de 0,39), o uso de uma bactéria do ácido butírico em combinação com uma bactéria ácido láctico heterofermentativa (por exemplo, Lactobacillus brevis ATCC 14869) não poderia aumentar o rendimento do ácido butírico, mas o uso de uma bactéria do ácido butírico
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20/44 em combinação com uma bactéria de ácido láctico homofermentativa (por exemplo, Bacillus coagulans ATCC 7050) poderia efetivamente aumentar o rendimento do ácido butírico.
EXEMPLO 5: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO GLICOSE POR MEIO DO USO DE UMA ÚNICA CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM DSM 27751 OU UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO HOMOFERMENTATIVA
5-1. SELEÇÃO DE CEPA [048] Usou-se Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 como a primeira cepa Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538 foi usada como a segunda cepa.
5-2. PRÉ-CULTURA (a) Clostridium tyrobutyricum DSM 27751: uma única colônia dessa cepa foi selecionada e inoculada em 10 ml de meio RCM, e o meio inoculado foi incubado estaticamente em incubadora anaeróbica a 37 °C por cerca de 18 horas..
(b) Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538: selecionou-se uma única colônia dessa cepa e inoculou-se em 10 ml de meio MRS e incubou-se o meio inoculado em uma incubadora agitadora (anaeróbica) a 200 rpm e 37 °C durante cerca de 24 horas.
5-3. EXPERIMENTOS DE FERMENTAÇÃO [049] Foram preparados dois líquidos de cepa, isto é, 10 ml do líquido de cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 fornecido pelo Exemplo 5-2 e 10 ml do líquido de cepa Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538 fornecido pelo Exemplo 5-2. Prepararam-se dois caldos inoculados em dois recipientes herméticos inoculando individualmente 80 ml de caldo de fermentação B com os dois líquidos de cepa. Adicionou-se 10 g/l de carbonato de cálcio a cada um dos recipientes herméticos. Posteriormente, os recipientes herméticos foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas de cada um dos caldos às 0, 24â, 48â e 82â horas, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de
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21/44 modo a calcular as concentrações de glicose, ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e o valor de pH e os rendimentos de ácido butírico e/ou ácido láctico. Os resultados são mostrados na Tabela 5.
TABELA 5
Cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 24 48 0 24 82
Glicose (g/l) 50,64 9,43 0 52,4 33,24 12,61
Ácido láctico (g/l) 1,60 0 0 2,64 21,57 40,47
Ácido acético (g/l) 13,97 13,23 11,29 14,07 13,99 14,94
Ácido propiônico (g/l) 0,64 0,62 0,67 0,65 0,79 1,5
Ácido butírico (g/l) 0,44 19,55 25,75 0,00 0 0
valor de pH 7 5,12 4,13
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,48
Rendimento de ácido láctico (g/g) 0,95
[050] Conforme mostrado na Tabela 5, o uso de uma única bactéria de ácido butírico (por exemplo, Clostridium tyrobutyricum DSM 27751) na fermentação de um substrato contendo glicose forneceu apenas sobre 0,48 do rendimento de ácido butírico. Por outro lado, se a fermentação de um substrato contendo glucose foi conduzida por meio do uso de uma única bactéria de ácido láctico homofermentativa (por exemplo, Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538), o rendimento de ácido láctico foi cerca de 0,95.
EXEMPLO 6: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO
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GLICOSE POR MEIO DO USO DE CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM DSM 27751 EM COMBINAÇÃO COM UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO HOMOFERMENTATIVA [051] Uma mistura foi preparada por meio da mistura de 10 ml de líquido de cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 fornecido pelo Exemplo 5-2 com 10 ml de líquido de cepa Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538 fornecido pelo Exemplo 5-2. Preparou-se um caldo inoculado em um recipiente hermético inoculando 80 ml de caldo de fermentação B com a mistura. Adicionou-se 10 g/l de carbonato de cálcio ao recipiente hermético. Posteriormente, o recipiente hermético foi mantido em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas do caldo às 0, 24â, e 82â horas, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de glicose, ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e o valor de pH e o rendimento de ácido butírico. Os resultados são mostrados na Tabela 6.
TABELA 6
Cepa de bactéria de ácido láctico Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 24 82
Glicose (g/l) 52,81 15,16 0,45
Ácido láctico (g/l) 2,61 0 0
Ácido acético (g/l) 14,46 9,69 8,04
Ácido propiônico (g/l) 0,64 0,65 0,65
Ácido butírico (g/l) 0,42 23,86 32,29
valor de pH 7 5,04
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,58
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23/44 [052] Conforme mostrado na Tabela 6, em comparação com o uso de uma única bactéria de ácido butírico para conduzir a fermentação de substrato contendo glicose (conforme mostrado na Tabela 5, fornecendo um rendimento de ácido butírico de 0,48), o uso de uma bactéria de ácido butírico em combinação com uma bactéria de ácido láctico homofermentativa (por exemplo, Sporolactobacillus inulinus ATCC 15538) poderia eficazmente aumentar o rendimento de ácido butírico.
EXEMPLO 7: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO FRUTOSE POR MEIO DO USO DE UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO BUTÍRICO ÚNICA OU UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO
7-1. SELEÇÃO DE CEPA [053] Para conduzir uma fermentação por meio do uso de uma única cepa, foi usado uma dentre Clostridium tyrobutyricum DSM 27751, Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445.
7-2. PRÉ-CULTURA (a) Clostridium tyrobutyricum DSM 27751: uma única colônia dessa cepa foi selecionada e inoculada em 20 ml de meio RCM, e o meio inoculado foi incubado estaticamente em incubadora anaeróbica a 37 °C por cerca de 18 horas..
(b) Lactobacillus caseiATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445: selecionou-se uma única colônia de cada cepa e inoculou-se em 5 ml de meio MRS e o meio inoculado foi incubado estaticamente em uma incubadora anaeróbica a 37 °C durante cerca de 24 horas
7-3. EXPERIMENTOS DE FERMENTAÇÃO [054] O líquido de cepa de Clostridium tyrobutyricum DSM 27751, Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 fornecido pelo Exemplo 7-2 foi respectivamente inoculado em caldo de fermentação D a uma taxa de inoculação de 10% para fornecer três caldos de fermentação, cada um com um volume final de 50 ml. Cada um dos três caldos de fermentação inoculados foi colocado em um recipiente hermético, e 30 g/l de carbonato de cálcio foram, então, respectivamente adicionados a cada um dos recipientes herméticos. Posteriormente, os recipientes
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24/44 herméticos foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas de cada um dos caldos às 0â, 24â e 48â hora, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de frutose, ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e o valor de pH e os rendimentos de ácido butírico e/ou ácido láctico. Os resultados são mostrados na Tabela 7.
TABELA 7
Cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 Lactobacillus casei ATCC 393 Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 24 48 0 24 48 0 24 48
Frutose (g/l) 49,1 0,8 0,4 49,1 10,9 0,4 49,2 5,8 0,5
Ácido láctico (g/l) 1,6 0 0 2,9 38,3 48,4 3,2 43,3 48,9
Ácido acético (g/l) 13, 8 18,1 18,2 14,0 13,7 13,8 14,0 13,9 14,4
Ácido propiônico (g/l) 0,6 0,7 0,7 0,6 0,6 0,6 0,6 0,7 0,8
Ácido butírico (g/l) 0,2 17,7 17,9 0,00 0,2 0,1 0,0 0,2 0,1
valor de pH 6,2 5,2 5,9 5,1 5,9 5,2
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,35
Rendimento de ácido láctico (g/g) 0,93 0,94
[055] Conforme mostrado na Tabela 7, o uso de uma única bactéria de ácido butírico (por exemplo, Clostridium tyrobutyricum DSM 27751) na fermentação de um
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25/44 substrato contendo frutose forneceu apenas sobre 0,35 do rendimento de ácido butírico. Por outro lado, se a fermentação de um substrato contendo frutose foi realizada usando uma única bactéria de ácido láctico (por exemplo, Lactobacillus casei ATCC 393, e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445), o rendimento de ácido láctico foi pelo menos 0,9.
EXEMPLO 8: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO FRUTOSE POR MEIO DO USO DE CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM DSM 27751 EM COMBINAÇÃO COM UMA BACTÉRIA ÁCIDO LÁCTICO HETEROFERMENTATIVA [056] Líquido de cepa de Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 fornecido pelo Exemplo 7-2 foi inoculado em caldo de fermentação D a uma taxa de inoculação de 10% e, então, o líquido de cepa de Lactobacillus casei ATCC 393 ou Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 fornecido pelo Exemplo 7-2 foi inoculado nisso a uma taxa de inoculação de 10% para fornecer um caldo de fermentação que tem um volume final de 50 ml. O caldo de fermentação foi colocado num recipiente hermético e 30 g/l de carbonato de cálcio foram, então, adicionados aos recipientes herméticos. Posteriormente, os recipientes herméticos foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas do caldo às 0, 48â e 54â horas, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de glicose, frutose, ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e o valor de pH e o rendimento de ácido butírico. Os resultados são mostrados na Tabela 8.
TABELA 8
Cepa de bactéria de ácido Lactobacillus casei Lactobacillus rhamnosus
láctico ATCC 393 NRRL B-445
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 48 54 0 48 54
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Glicose (g/l) 0,1 0 0 0 0 0
Frutose (g/l) 49,7 0,4 0,4 49,6 0,8 0,6
Ácido láctico (g/l) 2,9 4,5 0 3,2 20,4 0
Ácido acético (g/l) 14,2 7,6 6,6 14,2 9,7 4,4
Ácido propiônico (g/l) 0,6 0,6 0,9 0,6 0,7 0,8
Ácido butírico (g/l) 0,2 27,3 30,6 0,2 18,0 32,3
valor de pH 5,8 6,5 5,8 6,3
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,66 0,62
[057] Conforme mostrado na Tabela 8, em comparação com o uso de uma única bactéria de ácido butírico para conduzir a fermentação do substrato contendo frutose (conforme mostrado na Tabela 7, fornecendo um rendimento de ácido butírico de 0,35), o uso de uma bactéria do ácido butírico em combinação com uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa facultativa (por exemplo, Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445) poderia efetivamente aumentar o rendimento do ácido butírico.
EXEMPLO 9: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO XILOSE POR MEIO DO USO DE UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO BUTÍRICO ÚNICA OU UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO [058] Líquidos de cepa de Clostridium tyrobutyricum DSM 27751, Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 fornecidos pelo Exemplo 72 foram individualmente inoculados em 5 ml de caldo de fermentação E a uma taxa de inoculação de 10% e, então, os três caldos de fermentação inoculados foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas de cada um dos caldos às 0â, 23â e 53â hora, respectivamente. As amostras foram analisadas
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27/44 por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de glicose, xilose, ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação. Os resultados são mostrados na Tabela 9.
TABELA 9
Cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 Lactobacillus casei ATCC 393 Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 23 53 0 23 53 0 23 53
Glicose (g/l) 0 0 0 0,5 0 0 0 0 0
Xilose (g/l) 19,8 19,4 19,5 19,9 19,5 19,5 19,8 19,4 19,5
Ácido láctico (g/l) 1,5 0 0 2,5 3,4 3,5 2,9 3,5 3,4
Ácido acético (g/l) 6,4 5,9 6,0 6,5 6,7 6,8 6,5 6,6 6,7
Ácido propiônico (g/l) 0,6 0,6 0,5 0,5 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
Ácido butírico (g/l) 0,2 1,5 1,5 0 0 0 0 0 0
[059] Conforme mostrado na Tabela 9, Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 não pode fermentar xilose em ácido butírico, e Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 não pode fermentar xilose em ácido láctico.
EXEMPLO 10: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO XILOSE POR MEIO DO USO DE CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM DSM 27751 EM COMBINAÇÃO COM UMA BACTÉRIA ÁCIDO LÁCTICO HETEROFERMENTATIVA FACULTATIVA
10-1. SELEÇÃO DE CEPA [060] Usou-se Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 como a primeira cepa. Usou-se uma entre Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL
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B-445 como a segunda cepa.
10-2. PRÉ-CULTURA (a) Clostridium tyrobutyricum DSM 27751: uma única colônia dessa cepa foi selecionada e inoculada em 5 ml de meio RCM, e o meio inoculado foi incubado estaticamente em incubadora anaeróbica a 37 °C por cerca de 18 horas..
(b) Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445: selecionou-se uma única colônia de cada cepa e inoculou-se em 5 ml de meio MRS e o meio inoculado foi incubado estaticamente em uma incubadora anaeróbica a 37 °C durante cerca de 25 horas
10-3. EXPERIMENTOS DE FERMENTAÇÃO [061] Foram preparadas duas misturas misturando 0,5 ml de líquido de cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 fornecido pelo Exemplo 10-2 com 0,5 ml cada um dentre líquido de cepa Lactobacillus casei ATCC 393 e líquido de cepa Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 fornecidos pelo Exemplo 10-2, respectivamente. Prepararam-se dois caldos inoculados inoculando individualmente em 4 ml de caldo de fermentação E com as duas misturas e os caldos inoculados foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas de cada um dos caldos às 0â, 23â e 53â hora, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de xilose, ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação. Os resultados são mostrados na Tabela 10.
TABELA 10
Cepa de bactéria de ácido Lactobacillus casei Lactobacillus rhamnosus
láctico ATCC 393 NRRL B-445
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 23 53 0 23 53
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Xilose (g/l) 19,7 19,4 19,4 19,7 19,4 19,4
Ácido láctico (g/l) 2,5 0 0 3,0 0 0
Ácido acético (g/l) 6,8 5,8 6,0 6,8 5,9 6,0
Ácido propiônico (g/l) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
Ácido butírico (g/l) 0,2 2,8 2,9 0,2 2,7 2,8
[062] Conforme mostrado na Tabela 10, o uso de uma bactéria de ácido butírico em combinação com uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa facultativa não pode fermentar xilose em ácido butírico ou ácido láctico.
EXEMPLO 11: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO SACAROSE POR MEIO DO USO DE UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO BUTÍRICO ÚNICA OU UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO [063] Foram preparados três caldos inoculados pela inoculação individual de 5 ml de caldo de fermentação F com líquidos de cepa de Clostridium tyrobutyricum DSM 27751, Lactobacillus casei ATCC 393, e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 fornecidos pelo Exemplo 7-2 a uma taxa de inoculação de 10%. Os três caldos de fermentação inoculados foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas de cada um dos caldos às 0â, 24â e 48â hora, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações da sacarose (com base nas concentrações de glicose e frutose), ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e os rendimentos de ácido butírico e/ou ácido láctico. Os resultados são mostrados na Tabela 11.
TABELA 11
Cepa Clostridium tyrobutyricum Lactobacillus casei ATCC 393 Lactobacillus rhamnosus NRRL
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DSM 27751 B-445
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 24 48 0 24 48 0 24 48
Glicose (g/l) 10,4 6,0 6,0 10,4 5,7 5,6 10,4 5,9 5,8
Frutose (g/l) 10,1 4,8 4,8 10,1 4,6 4,6 10,1 4,8 4,7
Ácido láctico (g/l) 1,5 0 0 2,8 12,7 13,3 3,0 12,5 12,6
Ácido acético (g/l) 6,4 6,8 6,8 6,5 6,5 6,5 6,5 6,6 6,5
Ácido propiônico (g/l) 0,5 0. 6 0,6 0,5 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
Ácido butírico (g/l) 0,2 4,8 4,7 0,0 0,0 0,0 0,0 0,1 0,1
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,40
Rendimento de ácido láctico (g/g) 1,01 0,96
[064] Conforme mostrado na Tabela 11, o uso de uma única bactéria de ácido butírico (por exemplo, Clostridium tyrobutyricum DSM 27751) na fermentação de um substrato contendo sacarose forneceu apenas sobre 0,4 do rendimento de ácido butírico. Por outro lado, se a fermentação de um substrato contendo sacarose foi realizada usando uma única bactéria de ácido láctico (por exemplo, Lactobacillus casei ATCC 393, e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445), o rendimento de ácido láctico foi quase 1.
EXEMPLO 12: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO SACAROSE POR MEIO DO USO DE CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM DSM 27751 EM COMBINAÇÃO COM UMA BACTÉRIA ÁCIDO LÁCTICO HETEROFERMENTATIVA FACULTATIVA
12-1. SELEÇÃO DE CEPA [065] Usou-se Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 como a primeira cepa.
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Usou-se uma entre Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 como a segunda cepa.
12-2. PRÉ-CULTURA (a) Clostridium tyrobutyricum DSM 27751: uma única colônia dessa cepa foi selecionada e inoculada em 5 ml de meio RCM, e o meio inoculado foi incubado estaticamente em incubadora anaeróbica a 37 °C por cerca de 18 horas..
(b) Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445: selecionou-se uma única colônia de cada cepa e inoculou-se em 5 ml de meio MRS e o meio inoculado foi incubado estaticamente em uma incubadora anaeróbica a 37 durante cerca de 24 horas
12-3. EXPERIMENTOS DE FERMENTAÇÃO [066] Foram preparadas duas misturas misturando 0,5 ml de líquido de cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 fornecido pelo Exemplo 12-2 com 0,5 ml cada um dentre líquido de cepa Lactobacillus casei ATCC 393 e líquido de cepa Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 fornecidos pelo Exemplo 12-2, respectivamente. Prepararam-se dois caldos inoculados inoculando individualmente em 4 ml de caldo de fermentação F com as duas misturas e os caldos foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas de cada um dos caldos às 0â, 48â e 120â hora, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações da sacarose (com base nas concentrações de glicose e frutose), ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e o rendimento de ácido butírico. Os resultados são mostrados na Tabela 12.
TABELA 12
Cepa de bactéria de ácido Lactobacillus casei Lactobacillus rhamnosus
láctico ATCC 393 NRRL B-445
Ponto no tempo de 0 48 120 0 48 120
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amostragem (horas)
Glicose (g/l) 10,4 5,6 5,0 10,4 5,8 2,9
Frutose (g/l) 10,1 4,6 4,8 10,1 4,7 2,7
Ácido láctico (g/l) 2,8 0 0,0 3,0 0 0,7
Ácido acético (g/l) 6,7 4,3 4,2 6,8 3,9 3,1
Ácido propiônico (g/l) 0,5 0,6 0. 6 0,5 0,6 0,6
Ácido butírico (g/l) 0,1 8,3 8,5 0,1 8,4 10,3
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,62 0,59
[067] Conforme mostrado na T abela 12, em comparação com o uso de uma única bactéria de ácido butírico para conduzir a fermentação do substrato contendo sacarose (conforme mostrado na Tabela 11, fornecendo um rendimento de ácido butírico de 0,4), o uso de uma bactéria do ácido butírico em combinação com uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa facultativa (por exemplo, Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445) poderia efetivamente aumentar o rendimento do ácido butírico.
EXEMPLO 13: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO MELAÇO POR MEIO DO USO DE UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO BUTÍRICO ÚNICA OU UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO [068] Foram preparados três caldos inoculados pela inoculação individual de 5 ml de caldo de fermentação G com líquidos de cepa de Clostridium tyrobutyricum DSM 27751, Lactobacillus casei ATCC 393, e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 fornecidos pelo Exemplo 7-2 a uma taxa de inoculação de 10%. Os três caldos de fermentação inoculados foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas de cada um dos caldos às 0â, 24â e 72â hora, respectivamente. As
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33/44 amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de melaço (com base nas concentrações de glicose e frutose), ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e os rendimentos de ácido butírico e/ou ácido láctico. Os resultados são mostrados na Tabela 13.
TABELA 13
Cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 Lactobacillus casei ATCC 393 Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 24 72 0 24 72 0 24 72
Glicose (g/l) 5,2 3,7 3,7 5,4 3,8 3,5 5,1 3,8 3,2
Frutose (g/l) 6,0 3,8 3,8 6,0 3,7 3,3 6,0 3,7 3,0
Ácido láctico (g/l) 1,7 0,0 0,0 3,2 7,5 7,5 3,5 7,2 8,0
Ácido acético (g/l) 12,7 12,5 12,5 12,9 13,1 13,1 12,8 13,0 13,1
Ácido propiônico (g/l) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6
Ácido butírico (g/l) 1,6 2,6 2,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,20
Rendimento de ácido láctico (g/g) 0,95 0,94
[069] Conforme mostrado na Tabela 13, o uso de uma única bactéria de ácido butírico (por exemplo, Clostridium tyrobutyricum DSM 27751) na fermentação de um substrato contendo melaço forneceu apenas sobre 0,2 do rendimento de ácido butírico. Por outro lado, se a fermentação de um substrato contendo melaço foi
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34/44 realizada usando uma única bactéria de ácido láctico (por exemplo, Lactobacillus casei ATCC 393, e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445), o rendimento de ácido láctico foi cerca de 0,95.
EXEMPLO 14: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO MELAÇO POR MEIO DO USO DE CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM DSM 27751 EM COMBINAÇÃO COM UMA BACTÉRIA ÁCIDO LÁCTICO HETEROFERMENTATIVA FACULTATIVA
14-1. SELEÇÃO DE CEPA [070] Usou-se Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 como a primeira cepa. Usou-se uma entre Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 como a segunda cepa.
14-2. PRÉ-CULTURA (a) Clostridium tyrobutyricum DSM 27751: uma única colônia dessa cepa foi selecionada e inoculada em 5 ml de meio RCM, e o meio inoculado foi incubado estaticamente em incubadora anaeróbica a 37 °C por cerca de 18 horas..
(b) Lactobacillus caseiATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445: selecionou-se uma única colônia de cada cepa e inoculou-se em 5 ml de meio MRS e o meio inoculado foi incubado estaticamente em uma incubadora anaeróbica a 37 °C durante cerca de 24 horas
14-3. EXPERIMENTOS DE FERMENTAÇÃO [071] Foram preparadas duas misturas misturando 0,5 ml de líquido de cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 fornecido pelo Exemplo 14-2 com 0,5 ml cada um dentre líquido de cepa Lactobacillus casei ATCC 393 e líquido de cepa Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 fornecidos pelo Exemplo 14-2. Prepararam-se dois caldos inoculados inoculando individualmente em 4 ml de caldo de fermentação H com as duas misturas e os caldos inoculados foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas de cada um dos caldos às 0â, 24â e 72â hora, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC
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Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de melaço (com base nas concentrações de glicose e frutose), ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e o rendimento de ácido butírico. Os resultados são mostrados na Tabela 14.
TABELA 14
Cepa de bactéria de ácido láctico Lactobacillus casei ATCC 393 Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 24 72 0 24 72
Glicose (g/l) 5,5 3,6 3,6 5,2 3,6 0,3
Frutose (g/l) 6,0 3,4 3,3 6,0 3,4 0,2
Ácido láctico (g/l) 3,2 0,0 0,0 3,4 0,0 0,0
Ácido acético (g/l) 13,1 11,5 11,4 13,1 11,4 10,3
Ácido propiônico (g/l) 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,7
Ácido butírico (g/l) 0,2 5,0 5,1 0,2 5,0 7,8
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,64 0,54
[072] Conforme mostrado na T abela 14, em comparação com o uso de uma única bactéria de ácido butírico para conduzir a fermentação do substrato contendo melaço (conforme mostrado na Tabela 13, fornecendo um rendimento de ácido butírico de 0,2), o uso de uma bactéria do ácido butírico em combinação com uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa facultativa (por exemplo, Lactobacillus casei ATCC 393 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445) poderia efetivamente aumentar o rendimento do ácido butírico.
EXEMPLO 15: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO
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GLICOSE POR MEIO DO USO DE UMA ÚNICA CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM ATCC 25755
15-1. SELEÇÃO DE CEPA [073] Para conduzir uma fermentação por meio do uso de uma cepa única, usouse Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755.
15-2. PRÉ-CULTURA [074] Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755: uma única colônia dessa cepa foi selecionada e inoculada em 28 ml de meio RCM, e o meio inoculado foi incubado estaticamente em incubadora anaeróbica a 37 °C por cerca de 18 horas..
15-3. EXPERIMENTOS DE FERMENTAÇÃO [075] Líquido de cepa de Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 fornecido pelo Exemplo 15-2 foi inoculado em caldo de fermentação B a uma taxa de inoculação de 10% para fornecer um caldo de fermentação que tem um volume final de 50 ml. O caldo de fermentação foi colocado num recipiente hermético e 30 g/l de carbonato de cálcio foram, então, adicionados ao recipiente hermético. Posteriormente, o recipiente hermético foi mantido em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas do caldo às 0, 24â, e 48â horas, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de glicose, ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e o valor de pH e o rendimento de ácido butírico. Os resultados são mostrados na Tabela 15.
TABELA 15
Cepa Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 24 48
Glicose (g/l) 51,6 48,7 47,3
Ácido láctico (g/l) 1,5 0,4 0
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37/44
Ácido acético (g/l) 13,5 13,6 13,5
Ácido propiônico (g/l) 0,6 0,6 0,6
Ácido butírico (g/l) 0,5 2,1 3,0
valor de pH 6,2
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,44
[076] Conforme mostrado na Tabela 15, o uso de uma outra bactéria de ácido butírico (por exemplo, Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755) na fermentação de um substrato contendo glicose forneceu cerca de 0,44 do rendimento de ácido butírico.
EXEMPLO 16: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO GLICOSE POR MEIO DO USO DE CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM ATCC 25755 EM COMBINAÇÃO COM UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO HOMOFERMENTATIVA, UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO HETEROFERMENTATIVA FACULTATIVA OU UMA BACTÉRIA DE ÁCIDO LÁCTICO HETEROFERMENTATIVA
16-1. SELEÇÃO DE CEPA [077] Usou-se Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 como uma primeira cepa. Usou-se uma dentre Lactobacillus brevis ATCC 14869, Lactobacillus casei ATCC 393, Bacillus coagulans ATCC 7050 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 como a segunda cepa.
16-2. PRÉ-CULTURA (a) Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755: uma única colônia dessa cepa foi selecionada e inoculada em 28 ml de meio RCM, e o meio inoculado foi incubado estaticamente em incubadora anaeróbica a 37 °C por cerca de 18 horas..
(b) Lactobacillus brevis ATCC 14869, Lactobacillus casei ATCC 393, Bacillus coagulans ATCC 7050 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445: selecionouse uma única colônia de cada cepa e inoculou-se em 20 ml de meio MRS e o meio inoculado foi incubado estaticamente em uma incubadora anaeróbica a 37 °C durante
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38/44 cerca de 24 horas.
16-3. EXPERIMENTOS DE FERMENTAÇÃO [078] Líquido de cepa de Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755 fornecido pelo Exemplo 16-2 foi inoculado em caldo de fermentação B a uma taxa de inoculação de 10% e, então, líquido de cepa de cada uma dentre Lactobacillus brevis ATCC 14869, Lactobacillus casei ATCC 393, Bacillus coagulans ATCC 7050 e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 fornecido pelo Exemplo 16-2 foi inoculado nisso a uma taxa de inoculação de 10% para fornecer um caldo de fermentação que tem um volume final de 50 ml. O caldo de fermentação foi colocado num recipiente hermético e 30 g/l de carbonato de cálcio foram, então, adicionados ao recipiente. Posteriormente, os recipientes herméticos foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C para conduzir a fermentação. Durante a fermentação, amostras de caldo de fermentação foram retiradas de cada caldo às 0, 24â, 48â e 82â horas, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de glicose, ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e o valor de pH e o rendimento de ácido butírico. Os resultados são mostrados nas Tabelas 16A e 16B.
TABELA 16A
Cepa de bactéria de ácido láctico Lactobacillus brevis ATCC 14869 Lactobacillus casei ATCC 393
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 24 48 144 0 24 48 144
Glicose (g/l) 53,1 45,9 40,8 31,1 51,8 0 0 0
Ácido láctico (g/l) 1,6 0,5 0,4 0 3,0 48,0 42,2 0
Ácido acético (g/l) 14,1 13,8 13,9 13,7 14,0 13,7 12,0 1,1
Ácido propiônico (g/l) 0,6 0,6 0 0,6 0,6 0,7 0,6 0,7
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39/44
Ácido butírico (g/l) 0,2 3,8 6 10,1 0,1 2,0 6,4 37,7
valor de pH 6,3 5,2 5,9
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,42 0,68
TABELA 16B
Cepa de bactéria de ácido láctico Bacillus coagulans ATCC 7050 Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 24 48 144 0 24 48 144
Glicose (g/l) 52,3 39,8 26,5 6,8 51,9 0 0 0
Ácido láctico (g/l) 2,4 6,4 10,7 13,2 3,1 42,7 7,0 0
Ácido acético (g/l) 14,0 13,0 11,6 8,8 14,0 12,9 3,4 1,4
Ácido propiônico (g/l) 0,6 0,6 0,6 0,4 0,6 0,6 0,6 0,7
Ácido butírico (g/l) 0,1 4,9 10,0 21,3 0,1 4,9 30,6 37,1
valor de pH 6,0 5,1 5,9
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,67
[079] Conforme mostrado nas Tabelas 16A e 16B, em comparação com o uso de uma única bactéria de ácido butírico para conduzir a fermentação do substrato contendo glicose (conforme mostrado na Tabela 15, fornecendo um rendimento de ácido butírico de 0,44), o uso de uma bactéria de ácido butírico em combinação com uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa (por exemplo, Lactobacillus brevis ATCC 14869) não poderia aumentar (ou ainda mesmo diminuir) o rendimento do ácido butírico, mas o uso de uma bactéria de ácido butírico em combinação com uma
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40/44 bactéria de ácido láctico homofermentativa (por exemplo, Bacillus coagulans ATCC 7050) ou uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa facultativa (por exemplo, Lactobacillus casei ATCC 393, e Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445) poderia eficazmente aumentar o rendimento de ácido butírico.
EXEMPLO 17: FERMENTAÇÃO DE UM SUBSTRATO CONTENDO GLICOSE POR MEIO DA ADIÇÃO DE CLOSTRIDIUM TYROBUTYRICUM DSM 27751 E LACTOBACILLUS RHAMNOSUS NRRL B-445 EM DIFERENTES PONTOS NO TEMPO
17-1. SELEÇÃO DE CEPA [080] Usou-se Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 como a primeira cepa. Usou-se Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 como a segunda cepa.
17-2. PRÉ-CULTURA (a) Clostridium tyrobutyricum DSM 27751: uma única colônia dessa cepa foi selecionada e inoculada em 10 ml de meio RCM, e o meio inoculado foi incubado estaticamente em incubadora anaeróbica a 37 °C por cerca de 8 horas.. Em seguida, o caldo de fermentação assim obtido foi inoculado em 90 ml de meio RCM e o meio inoculado foi incubado em uma incubadora agitadora (anaeróbica) a 37 °C durante cerca de 16 horas.
(b) Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445: uma única colônia dessa cepa foi selecionada e inoculada em 10 ml de meio MRS, e o meio inoculado foi incubado estaticamente em incubadora anaeróbica a 37 °C por cerca de 16 horas.. Em seguida, o caldo de fermentação assim obtido foi inoculado em 90 ml de meio MRS e o meio inoculado foi incubado em uma incubadora agitadora (anaeróbica) a 37 °C durante cerca de 8 horas.
17-3. EXPERIMENTOS DE FERMENTAÇÃO [081] Foram preparados três recipiente herméticos. Adicionou-se a cada um dos três recipientes 80 ml de caldo de fermentação I e, então, os recipientes foram marcados como “grupo A,” “grupo B” e “grupo C.” 10 ml de líquido de cepa de Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445 fornecido pelo Exemplo 17-2 e 30 g/l de
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41/44 carbonato de cálcio foram adicionados em cada um dos recipientes herméticos. Os três recipientes herméticos foram mantidos em uma incubadora anaeróbica a 37 °C, e 10 ml de líquido de cepa Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 fornecido pelo Exemplo 17-2 foi respectivamente adicionado ao recipiente hermético do “grupo A” na 16a hora, adicionado ao recipiente hermético do “grupo B” na 20a hora e adicionado ao recipiente hermético do “grupo C” na 24a hora. As amostras foram retiradas dos três recipientes herméticos na 0, 16a, 20a, 24a, 48a e 112^ hora, respectivamente. As amostras foram analisadas por meio do uso de análise de HPLC Agilent 1260 em combinação com coluna Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm) de modo a calcular as concentrações de glicose, ácido lático, ácido acético, ácido propiônico e ácido butírico no caldo de fermentação, e o valor de pH e o rendimento de ácido butírico. Os resultados são mostrados nas Tabelas 17A a 17C.
TABELA 17A
Recipiente hermético A (Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 foi adicionada nisso na 16a hora)
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 16 20 24 48 112
Glicose (g/l) 58,0 19,9 10,1 1,2 0 0
Ácido láctico (g/l) 2,0 30,2 39,4 47,6 48,0 1,9
Ácido acético (g/l) 13,9 12,8 12,8 12,8 12,5 0
Ácido propiônico (g/l) 0 0 0 0 0 0
Ácido butírico (g/l) 0 0,1 0,1 0,1 0,7 32,7
valor de pH 6,4
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,63
TABELA 17B
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Recipiente hermético B (Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 foi adicionada nisso na 20a hora)
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 16 20 24 48 112
Glicose (g/l) 57,7 28,8 18,5 9,4 0 0
Ácido láctico (g/l) 2,0 27,2 31,1 39,2 44,92 0,3
Ácido acético (g/l) 13,9 14,0 12,8 12,7 11,9 0,2
Ácido propiônico (g/l) 0 0 0 0 0 0
Ácido butírico (g/l) 0 0 0 0 2,3 34,8
valor de pH 6,4
Rendimento de ácido butírico (g/g) 0,65
TABELA 17C
Recipiente hermético C (Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 foi adicionada nisso na 24a hora)
Ponto no tempo de amostragem (horas) 0 16 20 24 48 112
Glicose (g/l) 57,8 29,8 21,8 13,1 0 0
Ácido láctico (g/l) 2,0 26,2 33,7 36,2 41,8 0
Ácido acético (g/l) 13,9 14,0 14,0 12,7 11,0 0,3
Ácido propiônico (g/l) 0 0 0 0 0 0
Ácido butírico (g/l) 0 0,0 0,0 0,0 4,7 34,6
valor de pH 6,4
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Recipiente hermético 0,64
[082] Conforme mostrado nas Tabelas 17A ao 17C, o uso de uma bactéria de ácido butírico em combinação com uma bactéria de ácido láctico homofermentativa ou uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa facultativa (por exemplo, Lactobacillus rhamnosus NRRL B-445), não importa as duas cepas que foram misturadas em qual ponto no tempo, o rendimento de ácido butírico foi alto.
[083] Nas Tabelas 1A a 17C, a quantidade de ácido láctico detectado nas amostras da 0 hora foi fornecida pelo líquido de cepa inoculado.
[084] Os resultados dos Exemplos acima evidentemente indicam que, em comparação com o método da técnica anterior que usa uma única bactéria de ácido butírico, o método da presente invenção que usa uma bactéria de ácido butírico em combinação com uma bactéria de ácido láctico homofermentativa ou com uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa facultativa na fermentação de um substrato contendo sacarídeo pode fornecer um melhor rendimento de ácido butírico e uma produção diminuída de subproduto. Ademais, não existe limitação particular em relação ao ponto no tempo para misturar a bactéria de ácido butírico com uma bactéria de ácido láctico homofermentativa ou com uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa facultativa.
DEPÓSITO DE MATERIAL BIOLÓGICO [085] Clostridium tyrobutyricum DSM 27751: DE Coleção Alemã de Microorganismos e Culturas Celulares (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ); Endereço: InhoffenstraBe 7 B, 38124 Braunschweig, Alemanha; Número de acesso: DSM 27751.
[086] Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755: Coleta de Cultura Tipo Americana (ATCC); Endereço: 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 EUA; Número de acesso: ATCC 25755.
[087] Lactobacillus casei: Coleta de Cultura Tipo Americana (ATCC); Endereço: 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 EUA; Número de acesso: ATCC
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393.
[088] Lactobacillus rhamnosus: Coleta de Cultura de Serviço de Pesquisa Agrícola (NRRL); Endereço: 1815 N. University Street Peoria, IL 61604 EUA; Número de acesso: NRRL B-445.
[089] Lactobacillus delbrueckii: Coleta de Cultura Tipo Americana (ATCC); Endereço: 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 EUA; Número de acesso: ATCC 9649.
[090] Lactococcus lactis: Coleta de Cultura Tipo Americana (ATCC); Endereço: 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 EUA; Número de acesso: ATCC 19435.
[091] Bacillus coagulans: Coleta de Cultura Tipo Americana (ATCC); Endereço:
10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 EUA; Número de acesso: ATCC 7050.
[092] Lactobacillus brevis: Coleta de Cultura Tipo Americana (ATCC); Endereço:
10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 EUA; Número de acesso: ATCC 14869.
[093] Sporolactobacillus inulinus: Coleta de Cultura Tipo Americana (ATCC); Endereço: 10801 University Boulevard Manassas, VA 20110 EUA; Número de acesso: ATCC 15538.

Claims (11)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Método para produzir ácido butírico e/ou um butirato caracterizado por compreender fermentar um substrato que contém sacarídeo na presença de uma primeira cepa e de uma segunda cepa, em que a primeira cepa é uma bactéria de ácido butírico, e a segunda cepa é pelo menos uma dentre uma bactéria de ácido láctico homofermentativa e uma bactéria de ácido láctico heterofermentativa facultativa.
  2. 2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a primeira cepa ser Clostridium sp.
  3. 3. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a primeira cepa ser Clostridium tyrobutyricum.
  4. 4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a primeira cepa ser pelo menos uma dentre Clostridium tyrobutyricum DSM 27751 e Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755.
  5. 5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a segunda cepa ser pelo menos uma dentre Lactobacillus sp., Lactococcus sp., Sporolactobacillus sp. e Bacillus sp.
  6. 6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a segunda cepa ser pelo menos uma dentre Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus bulgaricusi, Lactococcus lactis, Bacillus coagulans e Sporolactobacillus inulinus.
  7. 7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a segunda cepa ser pelo menos uma dentre Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus bulgaricusi, Lactococcus lactis e Sporolactobacillus inulinus.
  8. 8. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a primeira cepa ser Clostridium tyrobutyricum DSM 27751, e a segunda cepa ser pelo menos uma dentre Lactobacillus casei, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbrueckii,
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    Lactobacillus plantarum, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus bulgaricusi, Lactococcus lactis, Bacillus coagulans e Sporolactobacillus inulinus.
  9. 9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o sacarídeo ser pelo menos um dentre glicose, frutose, lactose, sacarose, melaço e celobiose.
  10. 10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o substrato conter adicionalmente uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio e/ou um elemento mineral.
  11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a fonte de carbono ser pelo menos um dentre acetato e ácido acético, e o elemento mineral ser pelo menos um dentre fósforo, enxofre, potássio, magnésio, ferro e manganês.
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B08K Patent lapsed as no evidence of payment of the annual fee has been furnished to inpi [chapter 8.11 patent gazette]

Free format text: EM VIRTUDE DO ARQUIVAMENTO PUBLICADO NA RPI 2703 DE 25-10-2022 E CONSIDERANDO AUSENCIA DE MANIFESTACAO DENTRO DOS PRAZOS LEGAIS, INFORMO QUE CABE SER MANTIDO O ARQUIVAMENTO DO PEDIDO DE PATENTE, CONFORME O DISPOSTO NO ARTIGO 12, DA RESOLUCAO 113/2013.