CN112626134B - 一种利用柠檬酸发酵尾气制备苹果酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用柠檬酸发酵尾气制备苹果酸的方法，所述方法包括：以柠檬酸发酵尾气代替无菌空气通入苹果酸发酵培养基中进行发酵，得到所述苹果酸。本发明提供的制备方法操作简单易行，在既不影响柠檬酸发酵的同时可以实现柠檬酸发酵尾气的利用，节约了资源，保护了环境；并且利用柠檬酸发酵尾气可以促进嗜热菌发酵制备苹果酸，提高了苹果酸的产量和总酸转化率，缩短了发酵周期。

Description

一种利用柠檬酸发酵尾气制备苹果酸的方法

技术领域

本发明属于发酵技术领域，涉及一种利用柠檬酸发酵尾气制备苹果酸的方法。

背景技术

苹果酸在菌体中的合成途径一般有三条：(1)丙酮酸羧化支路，过程不需要氧的参与，需要固定二氧化碳，苹果酸对葡萄糖的理论转化率148.8％；(2)TCA循环，过程需要氧的参与，苹果酸对葡萄糖的理论转化率74％；(3)TCA循环加乙醛酸支路，过程需要氧的参与。从三条途径来看，为了提高苹果酸的转化率，最好使菌体全部利用丙酮酸羧化支路(无氧代谢途径)，但该途径需要的ATP(三磷酸腺苷)、NADH(还原型辅酶I)等一般需要TCA循环(有氧代谢途径)提供，因此，一般将苹果酸发酵维持在微耗氧状态，但实际控制过程中找到微耗氧的状态较难，需要平衡有氧代谢途径与无氧代谢途径的比例，而这个比例很难把握。

因此，想要寻找一种苹果酸的新发酵方法。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种利用柠檬酸发酵尾气制备苹果酸的方法，本发明提供的方法操作简单易行，在既不影响柠檬酸发酵的同时可以实现柠檬酸发酵尾气的利用，节约了资源，保护了环境；并且利用柠檬酸发酵尾气可以促进嗜热菌发酵制备苹果酸，提高了苹果酸的产量和总酸转化率，缩短了发酵周期。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种利用柠檬酸发酵尾气制备苹果酸的方法，所述方法包括：以柠檬酸发酵尾气代替无菌空气通入苹果酸发酵培养基中进行发酵，得到所述苹果酸。

柠檬酸发酵尾气中的氧气和二氧化碳的比例可能比无菌空气更适合苹果酸的微耗氧发酵，本发明利用柠檬酸发酵尾气可以提高总酸转化率，同时柠檬酸发酵尾气中的水汽可以适当补充苹果酸发酵培养基在发酵过程中损失的水分，其中的柠檬酸可以进入TCA循环，进一步促进发酵，因此，本发明采用柠檬酸发酵尾气代替无菌空气通入苹果酸发酵培养基中，可以促进发酵，提高总酸转化率，提高苹果酸的产率；并且柠檬酸发酵尾气中的柠檬酸菌在苹果酸发酵的环境中难以存活，对苹果酸发酵没有丝毫影响。

本发明提供的利用柠檬酸发酵尾气制备苹果酸的方法既可以实现柠檬酸尾气的废物利用，又可以促进苹果酸发酵，节约资源，保护环境。

作为本发明的一种优选技术方案，所述制备方法包括：在开始发酵16-20h后，例如17h、18h、19h等，将无菌空气替换为柠檬酸发酵尾气通入苹果酸发酵培养基中。

将嗜热菌接种到发酵培养基中开始发酵时，嗜热菌需要在一定的时间内生长繁殖，此时所需的通气量大于产酸代谢阶段，因此，在开始发酵的一段时间内，苹果酸发酵培养基中的菌种以繁殖为主，本发明优选发酵16-20h通入柠檬酸发酵尾气，此时的嗜热菌开始进入产酸代谢阶段，所需通气量减少，此时柠檬酸发酵尾气可以满足苹果酸发酵溶氧需求，更能发挥柠檬酸发酵尾气促进苹果酸发酵的作用。

在本发明中，通入所述柠檬酸发酵尾气的流速实际上由苹果酸发酵罐的罐压来确定，有一定的压差即可。

本发明所述方法还包括：在开始发酵16-20h内，在发酵培养基中通入无菌空气。

作为本发明的一种优选技术方案，在开始发酵16-20h内，所述苹果酸发酵培养基中的溶氧量为20-30％，例如22％、25％、28％等。

在开始发酵16-20h内，需要控制苹果酸发酵培养液中的溶氧量为20-30％，控制方法可以为目前常规方法，例如在搅拌的状态下，通过控制搅拌速率来控制培养液中的溶氧量。

在开始发酵16-20h内，通风比为1:(0.2-0.3)V/V·m。

本发明所述发酵的温度为40-50℃，例如45℃。

本发明所述发酵的压力为0.02-0.05MPa。

在本发明中，所述制备方法采用嗜热菌作为发酵苹果酸的菌种。

本发明采用的发酵培养苹果酸的菌种为噬热毁丝霉，购自中科院天津工业微生物研究所。

本发明所述柠檬酸发酵尾气由柠檬酸发酵产生。

本发明所利用的柠檬酸发酵尾气是柠檬酸发酵过程中产生的，任何目前现有的柠檬酸发酵方法产生的柠檬酸发酵尾气均可以用于本发明，为了避免还需要将柠檬酸发酵尾气储存进行应用反而容易导致成本增加，在实际应用本发明的方法时，可以同时设置柠檬酸发酵装置进行柠檬酸的发酵，柠檬酸发酵的尾气管可以直接连接苹果酸发酵罐的进气管。

为了不受柠檬酸发酵周期的影响，保证苹果酸发酵过程中，柠檬酸发酵尾气的连续供应，一个苹果酸发酵罐的进气口可以同时连接两个以上的柠檬酸发酵罐尾气管。

进一步地，为了便于切换，每个尾气管均设置开关，每一路尾气均可以单独开启或关闭，这样当其中一罐柠檬酸发酵需要放罐时，则可切换到其他柠檬酸发酵尾气。

同时，为了保证尾气管处于无菌状态，每一路尾气管均可单独灭菌。

在实际应用过程中，发酵生产柠檬酸的罐压维持在0.08～0.15MPa，发酵生产柠檬酸的罐压可以通过调节发酵生产苹果酸的罐压来维持，相应的进气量可以满足苹果酸发酵。

本发明直接设置柠檬酸发酵装置进行柠檬酸发酵产生柠檬酸发酵尾气，所述柠檬酸发酵的通风比为1:(0.2-0.3)V/V·m，发酵温度为35-40℃，发酵罐压力为0.08-0.15MPa。

作为本发明的一种具体实施方式，所述制备方法包括：

(1)将嗜热菌的种子培养液接种到苹果酸发酵培养基中，40-50℃开始发酵，发酵16-20h内，苹果酸培养基中通入无菌空气，控制苹果酸培养液中的溶氧量为20-30％进行发酵；

(2)在发酵16-20h后，将柠檬酸发酵产生的柠檬酸发酵尾气代替无菌空气通入苹果酸培养基中继续发酵至发酵结束，得到含有苹果酸的发酵液。

与现有技术相比，本发明利用柠檬酸发酵尾气代替无菌空气具有以下优点：

(1)柠檬酸发酵尾气中含有的氧气和二氧化碳的比例比无菌空气更适合苹果酸的微耗氧发酵，因而可以提高总酸转化率，提高苹果酸产率；

(2)柠檬酸发酵尾气中还含有少量水汽可以补充因嗜热菌发酵的温度过高而损失的水分；

(3)柠檬酸发酵尾气中含有少量的柠檬酸可以直接进入TCA循环，进而促进嗜热菌发酵制备苹果酸，进一步的提高了苹果酸的产率，同时缩短了发酵周期；

(4)柠檬酸尾气中含有的少量柠檬酸菌在嗜热菌发酵温度和湿度下难以存活，不会影响嗜热菌发酵制备苹果酸；

(5)利用柠檬酸发酵尾气进行苹果酸发酵属于废气利用，节约资源，保护环境；

(6)采用本发明提供的制备方法制备苹果酸具有较高的产率，总酸转化率也较高，其中，苹果酸产率可达195g/L以上，总酸转化率在90％以上，发酵周期为120h以内。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

性能测试方法

利用下述测试方法对下述实施例提供的发酵液进行性能测试，方法如下：

(1)苹果酸和丁二酸的测定：1mL发酵液加入1mL 3M H₂SO₄进行充分水解后，离心，取上清，用安捷伦1200高效液相色谱仪分别测定苹果酸和丁二酸含量，5M H₂SO₄为流动相，流速为0.5mL/min，进样量20μL，苹果酸出峰时间为10.745min，丁二酸出峰时间为12.953min；

(2)总酸转化率：利用下述计算公式进行计算：

其中，M_A为苹果酸产量,kg；M_B为丁二酸产量,kg；M_C为投入糖量,kg。

实施例1

本实施例提供了一种由柠檬酸发酵产生柠檬酸发酵尾气的方法。

按照25％的粉浆比对玉米粉进行调浆，按照50U/g淀粉的量加入耐高温α-淀粉酶，90℃液化至碘试反应不变色，按照体积比取10％的液化液作为回料，剩下的液化液离心或板块压滤取清液得到玉米液化清液。将回料与玉米液化清液在发酵罐内混合后110℃灭菌10min，得到发酵培养基，种后总糖约17％，pH自然。

按照10％的接种量将黑曲霉种液接入发酵培养基中，发酵温度37℃，通风比1:0.25V/V·m，搅拌转速开度55％，发酵尾气通入相应培养时期的苹果酸发酵罐，通过控制苹果酸发酵罐压维持柠檬酸发酵罐压0.1MPa。柠檬酸发酵周期62h，产酸15.8％，转化率约92.9％。

实施例2

本实施例提供了一种利用柠檬酸发酵尾气制备苹果酸的方法。

在本实施例中，将实施例1中的柠檬酸发酵罐的尾气管与本实施例的苹果酸发酵罐的进气口连接，同时苹果酸发酵罐设置无菌空气的进气管；

方法如下：

(1)种子活化以及制备种子培养液：

噬热毁丝霉(购自中科院天津工业微生物研究所)在无菌的条件下接种于固体斜面培养基，45℃恒温培养7天，用0.8％NaCl和0.1％吐温-80洗孢子并计数，将2.5×10⁷个孢子转接到250mL三角瓶中(含100mL种子培养基)，45℃，150rpm培养24h，得到种子培养液；

(2)发酵培养：

发酵培养基(每升)由如下组分组成：葡萄糖230g、豆粕粉180g、K₂HPO₄ 0.15g、KH₂PO₄ 0.15g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、苹果酸0.05g、0.1g/L生物素2mL、NaCl 0.08g、ZnSO₄·7H₂O 0.1g、FeSO₄·7H₂O 0.15g，自来水作为溶剂配置发酵培养基；

将种子培养液按照接种量为6％接种至发酵培养基，在45℃，0.03MPa下进行发酵，从开始发酵至发酵18h以内，通入无菌空气，通风比为1:0.3V/V·m，通过控制搅拌转速控制苹果酸培养液中的溶氧量为25％进行发酵；

在发酵18h后，关闭无菌空气进气口，开启柠檬酸发酵尾气进气口，将柠檬酸发酵尾气通入苹果酸培养基中，通过控制实施例1中的柠檬酸发酵罐的罐压为0.1MPa来控制柠檬酸发酵尾气的进气速率，继续发酵至发酵结束，得到含有苹果酸的发酵液；

在本实施例中，发酵周期为120h，苹果酸含量195g/L，丁二酸含量25g/L，总酸转化率90.2％。

实施例3

本实施例提供了一种利用柠檬酸发酵尾气制备苹果酸的方法。

与实施例2的区别在于，在本实施例中，从开始发酵就通入柠檬酸发酵尾气。

在本实施例中，发酵周期为135h，苹果酸含量189g/L，丁二酸含量20g/L，总酸转化率85.9％。

实施例4

本实施例提供了一种利用柠檬酸发酵尾气制备苹果酸的方法。

与实施例2的区别在于，在本实施例中，在发酵25h后，将柠檬酸发酵尾气通入苹果酸培养基中。

在本实施例中，发酵周期为120h，苹果酸含量185g/L，丁二酸含量27g/L，总酸转化率86.9％。

对比例1

本对比例提供了一种常规的苹果酸的制备方法。

(1)种子活化以及制备种子培养液：

噬热毁丝霉(购自中科院天津工业微生物研究所)在无菌的条件下接种于固体斜面培养基，45℃恒温培养7天，用0.8％NaCl和0.1％吐温-80洗孢子并计数，将2.5×10⁷个孢子转接到250mL三角瓶中(含100mL种子培养基)，45℃，150rpm培养24h，得到种子培养液；

(2)发酵培养：

发酵培养基(每升)由如下组分组成：葡萄糖230g、豆粕粉180g、K₂HPO₄ 0.15g、KH₂PO₄ 0.15g、MgSO₄·7H₂O 0.1g、苹果酸0.05g、0.1g/L生物素2mL、NaCl 0.08g、ZnSO₄·7H₂O 0.1g、FeSO₄·7H₂O 0.15g，自来水作为溶剂配置发酵培养基；

将种子培养液按照接种量为6％接种至发酵培养基，在45℃，0.03MPa下进行发酵，从开始发酵至发酵18h以内，通入无菌空气，通风比为1:0.3VV/m，通过控制搅拌转速控制苹果酸培养液中的溶氧量为25％进行发酵；

在发酵18h后，控制通风比为1:0.15VV/m，改变搅拌转速控制溶氧量为10％继续发酵至发酵结束，得到含有苹果酸的发酵液。

在本对比例中，发酵周期为122h，苹果酸含量185g/L，丁二酸含量29g/L，总酸转化率85.06％。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种利用柠檬酸发酵尾气制备苹果酸的方法，其特征在于，所述方法包括：在发酵培养基中通入无菌空气发酵16-20 h后，以柠檬酸发酵尾气代替无菌空气通入苹果酸发酵培养基中进行发酵，得到所述苹果酸，

其中，所述方法采用嗜热毁丝霉菌作为发酵苹果酸的菌种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵16-20 h内，所述苹果酸发酵培养基中的溶氧量为20-30%。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在发酵16-20 h内，苹果酸发酵罐的通风比为1:(0.2-0.3) V/V·m。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为40-50℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵的压力为0.02-0.05 MPa。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述柠檬酸发酵的通风比为1:(0.2-0.3)V/V·m，发酵温度为35-40℃，发酵罐压力为0.08-0.15MPa。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）将嗜热毁丝霉菌的种子培养液接种到苹果酸发酵培养基中，40-50℃开始发酵，发酵16-20 h内，苹果酸培养基中通入无菌空气，控制苹果酸培养液中的溶氧量为20-30%进行发酵；

（2）在发酵16-20 h后，将柠檬酸发酵产生的柠檬酸发酵尾气代替无菌空气通入苹果酸培养基中继续发酵至发酵结束，得到含有苹果酸的发酵液。