CN111378698A - 发酵制备d-乳酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物发酵领域，具体公开了一种发酵制备D‑乳酸的方法，该方法包括：将保藏编号为CGMCC No.16835的植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）接种到至少部分碳源由糖化液提供的发酵培养基中；糖化液的制备方法包括：将含淀粉质原料的浆液与淀粉酶混合进行喷射液化，然后闪蒸、降温并保温，接着与糖化酶混合进行糖化；糖化液的用量使得发酵培养基中碳元素的含量为60‑80g/L；乳酸发酵的条件包括：温度37‑45℃，pH值5.3‑6.5，时间40‑60h，搅拌转速50‑150rpm，植物乳杆菌的接种量使得接种后乳酸发酵体系内植物乳杆菌OD600=0.3‑1。本发明采用的原料具有来源广、成本低的特点，使用本发明提供的方法，能够在较大pH及温度范围内进行生产，简化了原料预处理工作量，具有糖利用率和转化率高，生产周期短的特点。

Description

发酵制备D-乳酸的方法
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体公开了一种发酵制备D-乳酸的方法。
背景技术
D-乳酸是一种在食品行业、医药、农业、材料等领域有广泛的应用的重要有机酸。其作为一种绿色化学品，可以合成聚乳酸、乳酸乙酯等无毒可降解材料，可用来制造生物可降解塑料、绿色包装材料和药用修复材料等，以解决日益严重的“白色污染”问题，应用前景非常广阔，具有较好的社会效益和经济效益。
D-乳酸的工业化生产主要有化学合成法、酶法和微生物发酵法。我国多采用生物发酵法，以玉米、小麦等淀粉为原料，经过淀粉酶和糖化酶将淀粉糖化，再利用微生物发酵将糖转化为D-乳酸。
我国多以根霉属微生物来进行D-乳酸发酵，其中的代表菌种是米根霉，该菌种具有生长迅速、分泌有机酸及蛋白质能力强等优势，但是在发酵过程中，米根霉的生长形态难以控制。正常的米根霉生长形态包括丝状、絮状及球状。其中球状被认为是合成有机酸的首选形态，但在大规模液体深层发酵中，其形态受营养物质、pH、温度、搅拌等因素影响很大，使得发酵生产不稳定，产物纯度降低，粮耗增大。另外，米根霉发酵属于高耗氧型发酵，通气需求量大，设备及能耗成本较高。因此亟待寻求一种低成本、低能耗的乳酸发酵方法。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的D-乳酸发酵生产过程中设备、能耗以及粮耗高的问题，提供一种发酵制备D-乳酸的方法。该方法即能稳定的发酵生产高光学纯度的D-乳酸，又能降低粮耗，简化原料预处理工作量，节约成本，提高市场竞争力。
为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种发酵制备D-乳酸的方法，该方法包括：将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）接种到发酵培养基中进行乳酸发酵，其中，所述发酵培养基中至少部分碳源由糖化液提供；
其中，所述植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.16835；
所述方法还包括按照如下方法制备糖化液的步骤：
（1）将含淀粉质原料的浆液与淀粉酶混合进行喷射液化，然后闪蒸、降温并保温，得到液化液；
（2）将液化液与糖化酶混合进行糖化，得到糖化液；
所述糖化液的用量使得发酵培养基中碳元素的含量为60-80g/L；
所述乳酸发酵的条件包括：温度为37-45℃，pH值为5.3-6.5，时间为40-60h，搅拌转速为50-150rpm，相对于所述乳酸发酵体系，所述植物乳杆菌的接种量使得接种后乳酸发酵体系内所述植物乳杆菌的OD600=0.3-1。
本发明第二方面提供的了一种发酵制备D-乳酸的方法，该方法包括：将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）接种到发酵培养基中进行乳酸发酵，其中，所述发酵培养基中至少部分碳源由糖化液提供；
其中，所述植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.16835；
所述方法还包括按照如下方法制备糖化液的步骤：
（1）将含淀粉质原料的浆液与淀粉酶混合进行喷射液化，然后闪蒸、降温并保温，得到液化液；
（2）将液化液与糖化酶混合进行糖化，得到糖化液；
其中，含淀粉质原料的浆液中的干物含量为30-50重量%，pH值为5.5-6.5。
通过上述技术方案，利用淀粉糖化液作为碳源进行乳酸发酵生产，相比于采用葡萄糖进行乳酸发酵生产的方法，原料成本大幅降低，而采用高浓度的淀粉质原料的浆液进行糖化液制备，能够大幅简化原料预处理的工作量，一次液化可分多批次发酵，进一步降低了生产成本。采用本发明提供的方法进行乳酸发酵生产，可以实现淀粉糖化液利用率高、糖酸转化率高、生产周期短且原料和生产成本低廉的D-乳酸发酵生产，有利于工业化生产推广。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
淀粉糖：是指利用淀粉质原料（粮食、薯类），经过酸法、酸酶法或酶法制取的糖。包括麦芽糖、葡萄糖和果葡糖浆等，统称淀粉糖。
干物含量：将测试样品在规定的温度和时间内进行干燥，当干燥至恒重时，干燥后的物质质量占干燥前的样品质量的百分数。
本发明提供一种发酵制备D-乳酸的方法，其特征在于，该方法包括：将植物乳杆菌接种到发酵培养基中进行乳酸发酵，其中，所述发酵培养基中至少部分碳源由糖化液提供；
其中，所述植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.16835；
所述方法还包括按照如下方法制备糖化液的步骤：
（1）将含淀粉质原料的浆液与淀粉酶混合进行喷射液化，然后闪蒸、降温并保温，得到液化液；
（2）将液化液与糖化酶混合进行糖化，得到糖化液；
所述糖化液的用量使得发酵培养基中碳元素的含量为60-80g/L；
所述乳酸发酵的条件包括：温度为37-45℃，pH值为5.3-6.5，时间为40-60h，搅拌转速为50-150rpm，相对于所述乳酸发酵体系，所述植物乳杆菌的接种量使得接种后乳酸发酵体系内所述植物乳杆菌的OD600=0.3-1。
本发明的发明人在研究的过程中发现，保藏编号为CGMCC No.16835的植物乳杆菌在发酵的过程中具有耐抗逆性强，可以耐受较大范围pH和/或温度波动，发酵条件较为宽松。且其对于原料淀粉糖的利用和转化率高，生产周期短，利于工业化生产推广，特别适用于本发明提供的方法。
因此，根据本发明的优选实施方式，其中，所述植物乳杆菌为保藏编号为CGMCCNo.16835的植物乳杆菌菌株，该菌株已公开于CN109504630A。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述糖化液的DE值为95-99%。
根据本发明的优选实施方式，为了达到以最低廉的原料成本发酵生产D-乳酸的目的，其中，所述方法还包括按照如下方法制备糖化液的步骤：
（1）将含淀粉质原料的浆液与淀粉酶混合进行喷射液化，然后闪蒸、降温并保温，得到液化液；
（2）将液化液与糖化酶混合进行糖化。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述含淀粉质原料的浆液中的干物含量为30-50重量%，pH值为5.5-6.5。
优选地，所述淀粉质原料可以包括谷物原料和/或薯类原料。
更优选地，所述淀粉质原料选自稻谷、玉米、小麦、大麦和高粱中的至少一种。
根据本发明的优选实施方式，其中，相对于每千克以干物计的淀粉质原料，所述淀粉酶的用量可以为100-220U。
更优选地，所述淀粉酶的用量为140-180U。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述淀粉酶可以为本领域任意常用淀粉酶，只要能够达到将淀粉质原料中的淀粉水解的目的即可。
优选地，所述淀粉酶可以包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶中的至少一种。
更优选地，其中，为了达到更好的淀粉水解效果，所述淀粉酶可以是α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶的组合物。
进一步优选地，所述α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶的重量比可以为1：0.05-0.15:0.1-0.3。特别优选1：0.08-0.12：0.18-0.22。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述喷射液化的条件可以包括：温度为100-120℃，时间为1-4s。
根据本发明的优选实施方式，其中，闪蒸的条件可以包括：压力差为（-0.05）-（-0.1）MPa。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述降温为喷射所得产物在闪蒸后自然降温5-10℃的操作，以使物料达到保温温度。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述保温的方式可以为在80-100℃下保温30-90min。其目的在于使糖化酶在合适的温度下进行反应。
根据本发明的优选实施方式，其中，相对于每千克以干物计的淀粉质原料，所述糖化酶的用量为800-4000U。
更优选地，所述糖化酶的用量为1000-2000U。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述糖化的条件包括：温度为55-65℃，pH值为3-5，时间为20-26h。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述糖化液的用量使得发酵培养基中碳元素的含量为60-80g/L。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养基中的氮源为玉米浆。所述玉米浆的干物含量为5-45重量%。
根据本发明的优选实施方式，所述发酵培养基还可以含有无机盐。所述无机盐的用量可以为0.25-1g/L。
更优选地，所述无机盐可以包括：磷酸盐、可溶性镁盐和可溶性锰盐的复合物。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养基中氮源（特别是玉米浆）的用量使得发酵培养基中的氮元素含量为2-3.6g/L。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述乳酸发酵的条件可以包括：温度为37-45℃，pH值为5.3-6.5，时间为40-60h，搅拌转速为50-150rpm，相对于所述乳酸发酵体系，所述植物乳杆菌的接种量使得所述植物乳杆菌接种后的生物量OD600=0.3-1。
更优选地，所述乳酸发酵的条件包括：温度为37-43℃，pH值为5.5-6.3，时间为40-55h，搅拌转速为80-120rpm。相对于所述乳酸发酵体系，所述植物乳杆菌的接种量使得所述植物乳杆菌接种后的生物量OD600=0.3-1。
根据本发明的优选实施方式，其中，在发酵过程中，所述pH的调节方式包括：向发酵体系中加入适量中和剂。
本发明的发明人在研究的过程中发现，石灰乳具有缓释中和的特点，使其作为中和剂应用于乳酸发酵时，可以一次性添加，而不需要在发酵过程中多次添加或持续流加，即可维持合适的发酵液酸碱环境。因此，使用石灰乳作为中和剂可以使乳酸发酵工艺进一步简化。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述中和剂可以为石灰乳。相对于乳酸发酵液重量，石灰乳以Ca(OH)2计的添加量为8-15重量%（特别优选10.5重量%）。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述中和剂还可以包括：氢氧化钠、碳酸钙、氨水、柠檬酸钾和柠檬酸钠中的一种或几种。添加方式为：发酵过程中流加上述中和剂的4-14重量%浓度的溶液，以使得发酵体系保持pH在5.3-6.5范围内。
优选地，所述中和剂为柠檬酸钾和/或柠檬酸钠。
本发明的方法特别适合于在中试或大试水平的乳酸发酵生产。因此，所述方法优选在容积50L以上（特别是50-500L）的发酵罐中进行。
本发明第二方面提供了一种发酵制备D-乳酸的方法，该方法包括：将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）接种到发酵培养基中进行乳酸发酵，其中，所述发酵培养基中的碳源至少部分由糖化液提供；
其中，所述植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.16835；
所述方法还包括按照如下方法制备糖化液的步骤：
（1）将含淀粉质原料的浆液与淀粉酶混合进行喷射液化，然后闪蒸、降温并保温，得到液化液；
（2）将液化液与糖化酶混合进行糖化，得到糖化液；
其中，含淀粉质原料的浆液中的干物含量为30-50重量%，pH值为5.5-6.5。
目前，通常采用15-18重量%的淀粉质原料进行预处理获得淀粉糖用于乳酸发酵，但是该方法中淀粉质原料浓度低，获取淀粉糖化液的效率低下，应用于工业生产时，造成原料原处理操作成本较高，并且不利于整体的生产效率提升。而本发明的发明人在研究的过程中巧妙地发现，采用30重量%以上的高浓度淀粉质原料进行液化处理获取糖化液的方法，能够大幅缩短原料处理时间，从而提高了原料预处理效率。将其应用于乳酸发酵生产中时可以降低原料预处理操作成本，进而降低整体的生产成本，提高生产效率。
任意现有的淀粉质原料均能适用于本发明提供的方法。根据本发明的优选实施方式，其中，所述淀粉质原料可以包括谷物原料和/或薯类原料。
优选地，所述淀粉质原料选自稻谷、玉米、小麦、大麦和高粱中的至少一种。
根据本发明的优选实施方式，其中，相对于每千克以干物计的淀粉质原料，所述淀粉酶的用量可以为100-220U。
更优选地，所述淀粉酶的用量为140-180U。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述淀粉酶可以为本领域任意常用淀粉酶，只要能够达到将淀粉质原料中的淀粉水解的目的即可。
优选地，所述淀粉酶可以包括α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶中的至少一种。
更优选地，其中，为了达到更好的淀粉水解效果，所述淀粉酶可以是α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶的组合物。
进一步优选地，所述α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶的重量比可以为1：0.05-0.15:0.1-0.3。特别优选1：0.08-0.12：0.18-0.22。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述喷射液化的条件可以包括：温度为100-120℃，时间为1-4s。
根据本发明的优选实施方式，其中，闪蒸的条件可以包括：压力差为（-0.05）-（-0.1）MPa。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述降温为喷射所得产物在闪蒸后自然降温5-10℃的操作，以使物料达到保温温度。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述保温的方式可以为在80-100℃下保温30-90min。其目的在于使糖化酶在合适的温度下进行反应。
根据本发明的优选实施方式，其中，相对于每千克以干物计的淀粉质原料，所述糖化酶的用量为800-4000U。
更优选地，所述糖化酶的用量为1000-2000U。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述糖化的条件包括：温度为55-65℃，pH值为3-5，时间为20-26h。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述糖化液的用量使得发酵培养基中碳元素的含量为60-80g/L。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养基中的氮源为玉米浆。所述玉米浆的干物含量为5-45重量%。
根据本发明的优选实施方式，所述发酵培养基还可以含有无机盐。所述无机盐的用量可以为0.25-1g/L。
更优选地，所述无机盐可以包括：磷酸盐、可溶性镁盐和可溶性锰盐的复合物。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述发酵培养基中氮源（特别是玉米浆）的用量使得发酵培养基中的氮元素含量为2-3.6g/L。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述乳酸发酵的条件可以包括：温度为37-45℃，pH值为5.3-6.5，时间为40-60h，搅拌转速为50-150rpm，相对于所述乳酸发酵体系，所述植物乳杆菌的接种量使得所述植物乳杆菌接种后的生物量OD600=0.3-1。
更优选地，所述乳酸发酵的条件包括：温度为37-43℃，pH值为5.5-6.3，时间为40-55h，搅拌转速为80-120rpm。相对于所述乳酸发酵体系，所述植物乳杆菌的接种量使得所述植物乳杆菌接种后的生物量OD600=0.3-1。
根据本发明的优选实施方式，其中，在发酵过程中，所述pH的调节方式包括：向发酵体系中加入适量中和剂。
本发明的发明人在研究的过程中发现，石灰乳具有缓释中和的特点，使其作为中和剂应用于乳酸发酵时，可以一次性添加，而不需要在发酵过程中多次添加或持续流加，即可维持合适的发酵液酸碱环境。因此，使用石灰乳作为中和剂可以使乳酸发酵工艺进一步简化。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述中和剂可以为石灰乳。相对于乳酸发酵液重量，石灰乳以Ca(OH)2计的添加量为8-15重量%（特别优选10.5重量%）。
根据本发明的优选实施方式，其中，所述中和剂还可以包括：氢氧化钠、碳酸钙、氨水、柠檬酸钾和柠檬酸钠中的一种或几种。添加方式为：发酵过程中流加上述中和剂的4-14重量%浓度的溶液，以使得发酵体系保持pH在5.3-6.5范围内。
本领域技术人员可以根据实际情况对上述中和剂进行选择，在此不再赘述。
本发明的方法特别适合于在中试或大试水平的乳酸发酵生产。因此，所述方法优选在容积50L以上（特别是50-500L）的发酵罐中进行。
以下将结合具体实施例对本发明进行进一步地解释和说明。应当理解的时候，以下实施例仅用于说明本发明的内容，而不用于限制本发明。
在以下实施例中，干物含量是指将测试样品在130℃左右干燥40min后的质量占干燥前的样品质量的百分数。
在以下实施例中，所使用的淀粉乳为：中粮生化能源（榆树）有限公司的淀粉乳。石灰乳中Ca(OH)2的含量为20重量%。淀粉酶为：诺维信公司的耐高温α-淀粉酶、β-淀粉酶和异淀粉酶的复合酶体系，重量比为1:0.1:0.2。糖化酶为诺维信公司的AMG 300L。玉米浆为中粮生化能源（榆树）有限公司的浓玉米浆。纯葡萄糖为国药集团化学试剂有限公司的葡萄糖。
在以下实施例中，所使用的发酵罐为上海保兴生物工程设备有限公司的BIOTECH-100JS型号的100L发酵罐。
在以下实施例中，未作特殊说明的情况下，采用的发酵菌株为保藏编号为CGMCCNo.16835的植物乳杆菌（参见CN109504630A），-80℃超低温冰箱保存，甘油管每隔1-3个月活化复培一次。
在以下实施例中，D-乳酸的含量通过HPLC方法进行测定，条件包括：Aminex HPX-87H Column 300×7.8 mm色谱柱，柱温：55℃，流动相：0.005M硫酸，流量：0.5 mL/min，进样量：20μL，示差折光检测器。
实施例1
糖化液制备：pH为5.8的30kg淀粉乳（其中淀粉干物含量为40重量%）中加入6g淀粉酶（相当于200U/千克淀粉干基），用蒸汽在110℃下进行喷射液化（时间约为4s），然后闪蒸（压力差-0.08±0.02MPa），并于95℃中保温60min。经热交换降温至60℃，获得液化液。调节pH至5，加入糖化酶，重量为淀粉干基的0.5‰（相当于1000U/千克淀粉干基），搅拌均匀，60℃保温24h，获得DE值达到99%的糖化液。
配罐：将上述糖化液直接加入发酵罐，同时加入灭菌后的玉米浆，加入量使得发酵液中氮元素的含量为3g/L，控制发酵液中的葡萄糖含量为190g/L（使得发酵液中碳元素的含量为76g/L）。加入20%发酵液重量的石灰乳控制发酵体系pH约为6±0.2，无需监控pH，控制发酵温度为40±3℃，搅拌转速为100rpm。
发酵：将培养好的OD600=10的种子液以10%发酵液体积的接种量接入发酵罐，培养至葡萄糖耗尽。
结果：发酵周期50h，总糖酸转化率99%，D-乳酸产量达188g/L。
实施例2
糖化液制备：pH为5.8的30kg淀粉乳（其中淀粉干物含量为40重量%）中加入6g淀粉酶（相当于200U/千克淀粉干基），用蒸汽在110℃下进行喷射液化（时间约为2s），然后闪蒸（压力差-0.08±0.02MPa），并于95℃中保温90min，然后经热交换降温至60℃，获得液化液。调节pH至5，加入糖化酶，重量为淀粉干基的0.4‰（相当于800U/千克淀粉干基），搅拌均匀，60℃保温24h，获得DE值达到96%的糖化液。
配罐：将上述糖化液直接加入发酵罐，同时加入灭菌后的玉米浆，加入量使得发酵液中氮元素的含量为3g/L，控制发酵液中的葡萄糖含量为190g/L（使得发酵液中碳元素的含量为76g/L）。加入25%发酵液重量的石灰乳控制pH约为6.2±0.2，无需监控pH，控制发酵温度为40±3℃，搅拌转速为100rpm。
发酵：将培养好的OD600=10的种子液以10%发酵液体积的接种量接入发酵罐，培养至葡萄糖耗尽。
结果：发酵周期48h，糖酸转化率95%，D-乳酸产量达180g/L。
实施例3
糖化液制备：pH为5.8的30kg淀粉乳（其中淀粉干物含量为30重量%）中加入6g淀粉酶（相当于200U/千克淀粉干基），用蒸汽在110℃下进行喷射液化（时间约为3s），然后闪蒸（压力差-0.08±0.02MPa），并于95℃中保温60min。经热交换降温至60℃，获得液化液。调节pH至5，加入糖化酶，重量为淀粉干基的0.5‰（相当于1000U/千克淀粉干基），搅拌均匀，60℃保温24h，获得DE值达到99%的糖化液。
配罐：将上述糖化液直接加入发酵罐，同时加入灭菌后的玉米浆，加入量使得发酵液中氮元素的含量为3g/L，控制发酵液中的葡萄糖含量为160g/L（相当于使得发酵液中碳元素的含量为64g/L）。加入25%发酵液重量的石灰乳控制pH约为6.2±0.2，无需监控pH，控制发酵温度为40±3℃，搅拌转速为100rpm。
发酵：将培养好的OD600=10（相当于3.33g细胞干重/L）的种子液以10%发酵液体积的接种量接入发酵罐，培养至葡萄糖耗尽。
结果：发酵周期44h，糖酸转化率99%，D-乳酸产量达158g/L。
实施例4
糖化液制备：pH为5.8的30kg淀粉乳（其中淀粉干物含量为40重量%）中加入3g淀粉酶（相当于100U/千克淀粉干基），用蒸汽在100℃下进行喷射液化（时间约为1s），然后闪蒸（压力差-0.08±0.02MPa），并于80℃中保温90min，然后经热交换降温至60℃，获得液化液。调节pH至5，加入糖化酶，重量为淀粉干基的0.5‰（相当于1000U/千克淀粉干基），搅拌均匀，55℃保温20h，获得DE值达到95%的糖化液。
配罐：将上述糖化液直接加入发酵罐，同时加入灭菌后的玉米浆，加入量使得发酵液中氮元素的含量为3g/L，控制发酵液中的葡萄糖含量为190g/L（相当于使得发酵液中碳元素的含量为76g/L）。加入18%发酵液重量的石灰乳控制pH约为5.8±0.5，无需监控pH，控制发酵温度为38±1℃，搅拌转速为50rpm。
发酵：将培养好的OD600=10的种子液以10%发酵液体积的接种量接入发酵罐，培养至葡萄糖耗尽。
结果：发酵周期52h，糖酸转化率95%，D-乳酸产量达180g/L。
实施例5
糖化液制备：pH为5.8的30kg淀粉乳（其中淀粉干物含量为40重量%）中加入6g淀粉酶（相当于200U/千克淀粉干基），用蒸汽在120℃下进行喷射液化（时间约为4s），然后闪蒸（压力差-0.08±0.02MPa），并于100℃中保温90min，然后经热交换降温至65℃，获得液化液。调节pH至3，加入糖化酶，重量为淀粉干基的1‰（相当于2000U/千克淀粉干基），搅拌均匀，65℃保温20h，获得DE值达到98%的糖化液。
配罐：将上述糖化液直接加入发酵罐，同时加入灭菌后的玉米浆，加入量使得发酵液中氮元素的含量为3g/L，控制发酵液中的葡萄糖含量为160g/L（相当于使得发酵液中碳元素的含量为64g/L）。加入25%发酵液重量的石灰乳控制pH约为6.2±0.3，无需监控pH，控制发酵温度为44±1℃，搅拌转速为150rpm。
发酵：将培养好的OD600=10的种子液以10%发酵液体积的接种量接入发酵罐，培养至葡萄糖耗尽。
结果：发酵周期47h，糖酸转化率96%，D-乳酸产量达154g/L。
实施例6
采用实施例1的方法，不同的是，采用柠檬酸钠作为发酵过程中的中和剂，加入量和加入方式为：向发酵体系中持续流加10重量%的柠檬酸钠溶液，以使发酵体系pH控制在6。
结果：发酵周期48h，糖酸转化率90%，D-乳酸产量达171g/L。
实施例7
采用实施例1的方法，不同的是，采用氢氧化钠为发酵过程中的中和剂，加入量和加入方式为：向发酵体系中持续流加4重量%的氢氧化钠溶液，以使发酵体系pH控制在6±0.2。
结果：发酵周期38h，糖酸转化率100%，D-乳酸产量达160g/L。
实施例8
采用实施例1的方法，不同的是，采用下述方法进行糖化液制备：
pH为5.8的11.25kg淀粉乳（其中淀粉干物含量为15重量%）中加入2.25g淀粉酶（相当于200U/千克淀粉干基），用蒸汽在120℃下进行喷射液化（时间约为4s），然后闪蒸（压力差-0.08±0.02MPa），并于100℃中保温90min，然后经热交换降温至65℃，获得液化液。调节pH至3，加入糖化酶，重量为淀粉干基的1‰（相当于2000U/千克淀粉干基），搅拌均匀，65℃保温20h，获得DE值达到97%的糖化液。
结果：发酵周期45h，总糖酸转化率96%，D-乳酸产量达155g/L。
对比例1
采用实施例1的方法，不同的是，采用纯葡萄糖液替换糖化液作为碳源。
结果：发酵周期44h，糖酸转化率100%，D-乳酸产量达190g/L。
对比例2
采用实施例1的方法，不同的是，采用鼠李糖杆菌（CGMCC No. 16834，公开于CN109628339A）作为发酵菌种。
结果：发酵周期80h，糖酸转化率12%，D-乳酸产量达19g/L。
对比例3
采用实施例1的方法，不同的是，控制搅拌转速为180rpm，加向发酵体系中持续流加4重量%的氢氧化钠溶液，以使发酵体系pH控制在5.5±0.2。
结果：发酵周期63h，总糖酸转化率83%，D-乳酸产量达133g/L。
对比例4
采用实施例1的方法，不同的是，将培养好的OD600=10的种子液以20%发酵液体积的接种量接入发酵罐，控制搅拌转速为180rpm。
结果：发酵周期39h，总糖酸转化率88%，D-乳酸产量达141g/L。
对比例5
采用实施例1的方法，不同的是，所述糖化液的加入量使得发酵液中碳元素的含量为50g/L，并加向发酵体系中持续流加4重量%的氢氧化钠溶液，以使发酵体系pH控制在5±0.2。
结果：发酵周期38h，总糖酸转化率93%，D-乳酸产量达116g/L。
通过实施例1和对比例1的结果对比可看出，本发明提供的方法采用糖化液（淀粉糖）作为乳酸发酵的主要碳源，其发酵周期、糖酸转化率和D-乳酸产量和传统采用葡萄糖作为碳源的发酵工艺差别不大。但是本发明提供的方法在原料成本上较传统工艺更为低廉。以实施例1和对比例1中的糖化液和葡萄糖用量为例，实施例1中的淀粉原料成本约为60元，对比例1中的葡萄糖原料成本约为90元。以D-乳酸生产车间每年产1000吨D-乳酸计算，每年可节约生产成本100万元。
虽然实施例8中同样采用糖化液（淀粉糖）作为乳酸发酵的主要碳源，但是其淀粉糖制备过程中采用的是低浓度的淀粉乳作为原料。与实施例1相比，采用30重量%以上的高浓度淀粉质原料进行液化处理获取糖化液的方法，能够大幅缩短原料处理时间，从而提高了原料预处理效率。将其应用于乳酸发酵生产中时可以降低原料预处理操作成本，进而降低整体的生产成本，提高生产效率。
通过对比实施例1与对比例3-5的结果可以看出，只有在本发明提供的乳酸发酵条件下，配合本发明提供的方法，才能实现提高糖酸转化率和生产强度的同时，缩短发酵周期和降低生产成本的目的。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个具体技术特征以任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。但这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种发酵制备D-乳酸的方法，其特征在于，该方法包括：将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）接种到发酵培养基中进行乳酸发酵，其中，所述发酵培养基中至少部分碳源由糖化液提供；
其中，所述植物乳杆菌的保藏编号为CGMCC No.16835；
所述方法还包括按照如下方法制备糖化液的步骤：
（1）将含淀粉质原料的浆液与淀粉酶混合进行喷射液化，然后闪蒸、降温并保温，得到液化液；
（2）将液化液与糖化酶混合进行糖化，得到糖化液；
所述糖化液的用量使得发酵培养基中碳元素的含量为60-80g/L；
所述乳酸发酵的条件包括：温度为37-45℃，pH值为5.3-6.5，时间为40-60h，搅拌转速为50-150rpm，相对于所述乳酸发酵体系，所述植物乳杆菌的接种量使得接种后乳酸发酵体系内所述植物乳杆菌的OD600=0.3-1。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述糖化液的DE值为95-99%。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，含淀粉质原料的浆液中的干物含量为30-50重量%，pH值为5.5-6.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于每千克以干物计的淀粉质原料，所述淀粉酶的用量为100-220U。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述喷射液化的条件包括：温度为100-120℃，时间为1-4s；
和/或，闪蒸的条件包括：压力差为（-0.05）-（-0.1）MPa；
和/或，所述降温的方式为在闪蒸后使喷射所得产物自然降温5-10℃；
和/或，保温的方式为将降温后的物料在80-100℃下保温30-90min。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，相对于每千克以干物计的淀粉质原料，所述糖化酶的用量为800-4000U。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，所述糖化的条件包括：温度为55-65℃，pH值为3-5，时间为20-26h。
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