CN112980911A

CN112980911A - 一种低残油发酵生产鼠李糖脂的方法

Info

Publication number: CN112980911A
Application number: CN201911311255.9A
Authority: CN
Inventors: 杨付伟; 陈长生; 王竞辉; 石森; 姜西娟; 张雅萍
Original assignee: Wanhua Chemical Group Co Ltd
Current assignee: Wanhua Chemical Group Co Ltd
Priority date: 2019-12-18
Filing date: 2019-12-18
Publication date: 2021-06-18
Anticipated expiration: 2039-12-18
Also published as: CN112980911B

Abstract

本发明公开了一种低残油发酵生产鼠李糖脂的方法。本发明公开的一种低残油发酵生产鼠李糖脂的方法包括将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)进行发酵培养，发酵培养期间在稳定期分别补料补料I和补料II，然后在衰亡期加入嗜油菌共发酵以降低残油的步骤。本发明解决了现有的发酵生产鼠李糖脂的工艺中发酵液乳化问题，消除了高残油对后提取工艺的不利影响，可显著提高碳源转化率和生产效率，降低鼠李糖脂的生产成本，本发明提供的方法具备工业化应用价值。

Description

一种低残油发酵生产鼠李糖脂的方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种低残油发酵生产鼠李糖脂的方法。

背景技术

表面活性剂是具有固定的亲水亲油基团，能在溶液的表面定向排列，降低溶液表面张力的物质，广泛用于石油、环境、农业、日化、食品和医药等多个领域。

目前市面上的表面活性剂多是以石油基化学品为原料合成，受限于石油类资源的不可再生性和环境不相容性，近年来生物表面活性剂的开发广受关注。

鼠李糖脂是某些微生物在特定条件下分泌产生的一种代谢产物，属于阴离子型生物表面活性剂，它不仅溶于甲醇、氯仿和乙醚，而且在碱性溶液中也表现出良好的溶解性，具有油、水两亲性，可以显著降低溶液的表面张力，并且能够在温度、pH值及盐度处于极端状况下发挥作用。鼠李糖脂广泛应用于石油工业、绿色农业和生态环境方面，在食品行业、化妆品、医疗方面也有较大的应用潜力。

在石油领域，常规的一次、二次采油一般仅能采收地下原油的30-40％左右。鼠李糖脂可运用于三采技术，与地层中的残油混合后产生增溶、乳化及互溶效果，进而把残油驱替出来。如果配合其它驱油剂使用，具有驱油效果好、见效时间长的优点。已有研究表明，使用鼠李糖脂复配其它驱油剂，采收率可提高20％以上。此外，鼠李糖脂还可以降低石油黏度，用于清洗储油罐、油轮贮仓、输油管道以及运油车等。

在环境领域，鼠李糖脂可用于修复人类所造成的环境污染，包括土壤、水、海岸线及海底中的油、金属或其他污染物。鼠李糖脂具有一定的金属螯合能力，因此可用来清除土壤、污水及其他液体中的重金属污染物。鼠李糖脂和其产生菌可降解硫丹，从而修复被剧毒农药污染的土壤或水体。鼠李糖脂能够减小油膜与水之间的界面张力，使油污分散在水中形成乳液。同时，多数鼠李糖脂产生菌具有烃类代谢能力，可进一步分解分散在水中的油膜，因而可以解决原油泄漏带来的环境问题。鼠李糖脂可100％生物降解，不会给环境带来二次污染。

在农业领域，鼠李糖脂能够刺激作物生长、辅助吸收营养、增加农药及肥料作用效果，并且对人和动物无毒副作用。在碱性条件下，鼠李糖脂可电离出H+，中和碱性土壤中的OH-，从而改变土壤板结环境，改良碱性土壤。鼠李糖脂可抑制真菌生长，用于农作物拌种，能够提高出芽率，减少病虫害。

在日化领域，几乎每种产品中都存在表面活性剂，鼠李糖脂除具备良好的表面活性外，还具有良好的细胞通透性，以及无毒、可降解特性。这些特点使其可广泛应用于各种日化产品中，例如抗头皮屑产品、护肤霜、染发剂、香波和护发素、牙膏、睫毛膏、指甲油、唇膏、止汗剂、婴儿用品、剃须膏、保湿剂、肥皂、眼影、湿巾及香水等。

此外，鼠李糖脂还被发现具有抗菌、抗肿瘤、抗病毒等作用，可被开发成新型生物医药或生物农药，为鼠李糖脂的应用提供了新的市场和动力。

目前，鼠李糖脂的生产在国内已实现工业化，但是纯度更高的高端精制品还处于实验室研究阶段。主要原因在于鼠李糖脂生产过程中多是以植物油为碳源，因为油性碳源更有利于诱导表面活性剂的合成，虽然文献中也有以葡萄糖、甘油、乙醇等为碳源，但往往产率较低，生产成本较高，难以实现工业化。而利用植物油来生长的菌株，往往发酵液中残油含量高，黏度较大，乳化严重，不仅影响传质和氧传递，降低了碳源转化率，而且给后处理工艺带来极大不便。具体表现在：菌体难以从发酵液中分离，需要加入化学破乳剂；不仅增加成本，而且新加入成分又会给后续提纯工艺增加难度；残油不易从上清液中分离，影响后续酸沉淀工艺以及产品品质。

发明内容

本发明旨在解决现有的发酵生产鼠李糖脂的工艺中发酵液残油含量高、黏度大、乳化严重的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供一种低残油发酵生产鼠李糖脂的方法，采用两相隔离补料控制工艺，包括将铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)进行发酵培养，发酵培养期间在稳定期分别补料补料I和补料II，然后在衰亡期加入嗜油菌共发酵以降低发酵液中的残油的步骤；

其中，所述补料I包含碳源或由碳源组成，其为一相；

所述补料II包含氮源和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)生长所需的营养盐，其为另一相；

所述营养盐可以包含钾盐、钠盐、铁盐、镁盐和钙盐，例如包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、硫酸亚铁、硫酸镁和氯化钙。

在一些实施方案中，上述方法中，所述碳源选自菜籽油、棕榈油、棉籽油、玉米油、大豆油、椰子油、橄榄油和花生油中的一种或多种。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述氮源为有机氮源和/或无机氮源，选自蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母浸粉、玉米粉、硫酸铵、尿素、硝酸钠和硝酸铵中的一种或多种。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)进行发酵培养所用的发酵培养基为任何适合的发酵培养基，可以为具有如下组成的培养基：棕榈油60g/L、玉米浆8g/L、硫酸铵8g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钠1g/L、硫酸亚铁0.2g/L、硫酸镁0.1g/L、氯化钙0.1g/L，余量为水；

发酵培养条件设定为温度28-40℃、溶氧30％-50％。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述补料I可以为棕榈油，所述补料II的组成可以为：玉米浆16g/L、硫酸铵16g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠2g/L、硫酸亚铁0.4g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钙0.2g/L，余量为水。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，发酵培养期间在稳定期分别补料补料I和补料II的方法如下：在铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌发酵培养的OD600达到20-25时(发酵培养18-36小时时)，连续进行以下三个阶段的补料：

第一阶段补料持续24-30小时，所述补料I的初始速率设定为每小时补加发酵液总体积的1‰，初始呼吸商设定为0.5，在该阶段控制呼吸商为0.4-0.6、碳氮比10:1以及补料I的速率范围为每小时补加发酵液总体积的0.5‰-2.0‰；

第二阶段补料持续36-48小时，控制呼吸商为0.6-0.8、碳氮比8:1以及补料I的速率范围为每小时补加发酵液总体积的1.0‰-3.0‰；

第三阶段补料持续24-48小时，控制呼吸商为0.5-0.6、碳氮比6:1以及补料I的速率范围为每小时补加发酵液总体积的1.0‰-2.0‰；

在所述第一阶段、第二阶段和第三阶段，补料I的速率根据呼吸商调整，补料II的速率根据所述碳氮比随着补料I的速率同步调整。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，在所述第一阶段、第二阶段和第三阶段，当呼吸商高于该阶段的上限时，补料I的速率在原有基础上降低10％；当呼吸商低于该阶段的下限时，补料I的速率在原有基础上增加10％；如果调整后的补料I的速率大于该阶段的补料I的速率的上限，则将补料I的速率调整为上限所示的补料速率，如果调整后的补料I的速率小于该阶段的补料I的速率的下限，则将补料I的速率调整为下限所示的补料速率；

通过以上三个阶段实现了分阶段调控呼吸商，避免因碳源过剩造成发酵液中残油累积；补料II的速率按照预先设定的碳氮比，根据补料I的速率动态调整，与单一补料培养基的固定碳氮比模式不同，本发明的两相补料速率可以动态变化，从而实现在不同生长阶段控制不同的碳氮比，以适应菌体生长代谢，从而快速消耗碳源，降低发酵液中残油含量，此时发酵液中残油不超过15g/L，菌体快速合成鼠李糖脂。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述嗜油菌选自假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、头孢霉属(Cephalosporium)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicilium)、曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)和红酵母属(Rhodotorula)中的一种或多种。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述嗜油菌为顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)和/或热带假丝酵母(Candida tropicalis)；

共发酵的温度可以为28℃、溶氧10％-20％，嗜油菌快速生长并消耗残油。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述嗜油菌的接种量为发酵液体积的1％-3％，具体通过嗜油菌的对数生长期(尤其是对数生长期末期)菌液接入铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌的发酵液。

在一些实施方案中，上述任一所述的方法中，所述共发酵的时间为24小时，接入嗜油菌的时机为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)到达衰亡期时，即发酵培养120-144小时时，共发酵24小时后，残油在3g/L以下，产物鼠李糖脂的浓度达到60g/L以上，碳源转化率高达75％，发酵液黏度远小于5cP；

在衰亡期菌体的碳源代谢能力下降，鼠李糖脂产率下降，引入嗜油微生物共发酵，调整发酵控制参数，促进嗜油菌生长，利用优势嗜油菌消耗残留碳源，可以进一步降低发酵液中残油含量。

为解决上述技术问题，本发明还提供上述任一所述的方法在制备鼠李糖脂中的应用。

为解决上述技术问题，本发明还提供上述任一所述的方法在降低发酵生产鼠李糖脂过程中的残油、降低发酵生产鼠李糖脂过程中的发酵液黏度和/或提高发酵生产鼠李糖脂过程中的碳源转化率中的应用。

本发明提供一种两相隔离补料工艺，可使整个发酵过程中残油含量控制在15g/L以下，发酵液黏度控制在5.0cP以下，菌体生长进入衰亡期后引入嗜油菌共发酵，利用不同菌株生长条件和代谢强度的差异，进一步将残油降低到3g/L以下，成熟发酵液可以进入后提取工序。本发明的工艺解决了发酵生产鼠李糖脂的过程中发酵液乳化问题，消除了高残油对后提取工艺的不利影响，可显著提高碳源转化率和生产效率，降低鼠李糖脂的生产成本，具备工业化应用价值。

本发明的有益效果在于：

1、本发明通过调控补料速率、补料碳氮比、呼吸商等过程参数，使得整个发酵过程中残油控制在15g/L以下，发酵液黏度在5cP以下，解决了鼠李糖脂生产过程中残油高、发酵液乳化、菌体难以分离的问题。

2、本发明将补料培养基中碳源和其它组分分开补料，碳源补料速率关联呼吸商，可以根据菌体生长状况实时调整补料碳氮比，促进菌体生长，进而加速碳源转化，使碳源得到充分利用，最终碳源转化率达到75％，原料成本大幅度降低。

3、本发明通过引入嗜油菌共发酵来控制发酵后期残油含量，将残油进一步降低到3g/L以下，为开发后提取工艺扫清障碍。

附图说明

图1为鼠李糖脂标准品的电喷雾质谱图。

图2为实施例1第144小时的发酵液的电喷雾质谱图。

图3为实施例3和对比例的发酵液中鼠李糖脂浓度的比较。

图4为实施例3和对比例的碳源转化率的比较。

图5为实施例3和对比例的发酵液中残油浓度的比较。

图6为实施例3和对比例的发酵液黏度的比较。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)KT1115在申请号为201710367255.5的中国专利申请中公开过，其是一株已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC的菌株，保藏号为CCTCC M2016686。

恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC，保藏号为CICC 23651。

顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心CICC，保藏号为CICC40514。

热带假丝酵母(Candida tropicalis)在申请号为201511013981.4的中国专利申请中公开过，其是一株已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC的菌株，保藏号为CCTCCNO.M2014349。

鼠李糖脂标准品为Sigma产品，产品目录号为R90。

呼吸商使用山东省科学院生物研究所的FGA-2B发酵尾气分析仪测定。

下述实施例中的鼠李糖脂的鉴定采用1100型高效液相色谱/G1969A型电喷雾质谱联用仪(HPLC/ESI-TOF/MS)(美国Agilent公司)，并配有二极管阵列(DAD)检测器：

高效液相色谱：色谱柱：Diamonsil C18柱，规格为150mm×4.6mm×5μm；柱温为30℃；进样量为1μL；检测波长为UV 207nm；流动相A：0.5％甲酸水溶液，流动相B：乙腈；梯度洗脱条件:0min，50％B；5min，50％B；30min，60％B；50min，100％B；60min，100％B。流速为0.4mL/min。

质谱采用电喷雾正离子模式；扫描范围：m/z 200～900；毛细管电压：3.5kV；喷雾气压：344.5kPa；干燥气体：高纯N₂，气体流速：11.0L/min；气体温度：350℃；裂解电压：100V；锥孔电压：65V；参比溶液：m/z 121.05，922.01；分辨率：9500±500(922.01)。

鼠李糖脂的浓度检测：

1)配制2g/L蒽酮试剂：准确称取0.2000g蒽酮溶解于100ml 80％浓硫酸中，现配现用。

2)绘制标准曲线：分别配制0.02g/L、0.05g/L、0.08g/L、0.10g/L、0.15g/L、0.20g/L鼠李糖标准溶液，各取0.5mL，加入2mL蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，各管加完后一起浸于沸水浴中，准确计时10分钟，迅速取出用冰水冷却，于620nm处比色。以光密度为横坐标，鼠李糖含量为纵坐标，绘制鼠李糖标准曲线(R²＞0.995)。

3)发酵液12000rpm离心10min，上清稀释一定的浓度后，取0.5mL加入2mL蒽酮试剂，迅速浸入冰水中冷却，每个样品做3个平行，各管加完后一起浸于沸水浴中，准确计时10分钟，迅速取出用冰水冷却，于620nm处比色。根据标准曲线和稀释倍数计算样品中鼠李糖含量，乘以2.5系数，即得到样品中鼠李糖脂浓度。

残油测定：

1)取一只洁净铝盒，称量其空重m₀，单位g；

取1mL发酵液，加入1mL乙腈和3mL正庚烷，震荡混匀，6000rpm常温离心5min，取其上清，转移至上述铝盒中；

2)向下层溶液中继续加入3mL正庚烷，震荡混匀，6000rpm常温离心5min，取其上清，转移至上述铝盒中；

3)重复步骤2)；

4)待铝盒内液体全部挥发完毕后，称量铝盒总重m₁，单位g，残油含量＝(m₁-m₀)*1000，单位g/L。

碳源转化率计算方法：

发酵液中鼠李糖脂浓度(g/L)乘以发酵液总体积(L)，得到发酵液中鼠李糖脂总量(g)，除以基础培养基和当前时间补进的补料培养基中所有碳源的质量(g)，即得到碳源转化率(％)。

发酵液黏度检测方法：

参照国标GB/T 15357-2014表面活性剂和洗涤剂旋转黏度计测定液体产品的黏度和流动性质。

实施例1

1、以超低温冻存的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)KT1115为发酵菌株，经两级平板活化，挑取单菌落接种于摇瓶种子培养基，35℃、200rpm条件下培养16h。

种子培养基组成如下：

胰蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、NaCl 10g/L，余量为水。

2、将步骤1的培养物按照6％的接种量接种到装液量2L的装有步骤1的种子培养基的3L种子罐。在35℃、溶氧10％-50％的条件下培养8h，种子液的OD600达到6.0以上，得到成熟种子液。

3、将步骤2得到的种子液按照6％的接种量接种到装液量25L的装有发酵培养基的50L发酵罐，进行发酵。

发酵培养基组成如下：

棕榈油60g/L、玉米浆8g/L、硫酸铵8g/L、磷酸二氢钾1g/L、磷酸氢二钠1g/L、硫酸亚铁0.2g/L、硫酸镁0.1g/L、氯化钙0.1g/L，余量为水。

在发酵的第0-18小时期间，培养条件设定为温度35℃、溶氧40％-50％，在此期间菌体快速增殖；

在第18-120小时期间(处于稳定期)，培养条件设定为温度35℃、溶氧30％-40％，18h(OD600达到20)开始补料，其中，补料I为棕榈油，补料II的组成为：玉米浆16g/L、硫酸铵16g/L、磷酸二氢钾2g/L、磷酸氢二钠2g/L、硫酸亚铁0.4g/L、硫酸镁0.2g/L、氯化钙0.2g/L，余量为水。补料I速率与呼吸商(RQ)关联，根据设定的RQ，在设定的速率范围内自动调整；补料II速率根据设定的碳氮比，随着补料I速率同步调整。具体地，补料阶段RQ和碳氮比分阶段调控如下：18-48h，RQ 0.4-0.6，碳氮比10:1，补料I的速率范围为每小时补加发酵液总体积的0.5‰-2.0‰；48-96h，RQ 0.6-0.8，碳氮比8:1，补料I的速率范围为每小时补加发酵液总体积的1.0‰-3.0‰；96-120h，RQ0.5-0.6，碳氮比6:1，补料I的速率范围为每小时补加发酵液总体积的1.0‰-2.0‰。补料I的初始速率为每小时补加发酵液总体积的1‰，初始RQ为0.5。同时，按照如下方法调整补料速率以保证RQ：在不同的阶段，当呼吸商高于设定上限时，补料I的速率在原有基础上降低10％；当呼吸商低于设定下限时，补料I的速率在原有基础上增加10％；调整后的补料I的速率以各阶段预先设定的速率范围为界限，超出部分不再执行，即如果调整后的补料I的速率大于该阶段的补料I的速率的上限，则将补料I的速率调整为上限所示的补料速率，如果调整后的补料I的速率小于该阶段的补料I的速率的下限，则将补料I的速率调整为下限所示的补料速率。

经检测，18-120小时期间发酵液中残油为10-15g/L，菌体快速合成鼠李糖脂。

4、摇瓶培养顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)，27℃、200rpm培养20h(处于对数生长期)，得到培养成熟的顶头孢霉菌种子液。

顶头孢霉菌的培养基为：葡萄糖25g/L、蔗糖10g/L、玉米浆20g/L、碳酸钙1g/L，余量为水。

5、在第120小时(处于衰亡期)停止补料，接入步骤4培养成熟的顶头孢霉菌种子液，接种量为发酵液体积的1％。在第120-144小时期间，在温度28℃、溶氧10％-20％的条件下进行培养，顶头孢霉菌快速生长并消耗残油。

6、取第144小时的发酵液，测得其中鼠李糖脂的浓度为63.2g/L，碳源转化率为74.3％，发酵液黏度为2.27cP，残油为2.9g/L，结束发酵。

将第144小时的发酵液和鼠李糖脂标准品进行HPLC/ESI-TOF/MS分析，鼠李糖脂标准品的电喷雾质谱图如图1所示，第144小时的发酵液的电喷雾质谱图如图2所示，图1和图2表明发酵液中的目的产物为鼠李糖脂。下述实施例的最终发酵液也进行了HPLC/ESI-TOF/MS分析，同样证实了发酵液中的目的产物为鼠李糖脂。

实施例2

种子培养基与实施例1步骤1中的种子培养基相同。

发酵培养基与实施例1步骤3的发酵培养基相同。

在发酵的第0-36小时期间，培养条件设定为温度35℃、溶氧40％-50％，在此期间菌体快速增殖；

在第36-144小时期间(处于稳定期)，培养条件设定为温度35℃、溶氧30％-40％，36h(OD600达到25)开始补料，其中，补料I和补料II的组成与实施例1相同。补料I速率与呼吸商(RQ)关联，根据设定的RQ，在设定的速率范围内自动调整；补料II速率根据设定的碳氮比，随着补料I速率同步调整。具体地，补料阶段RQ和碳氮比分阶段调控如下：36-60h，RQ0.4-0.6，碳氮比10:1，补料I的速率范围为每小时补加发酵液总体积的0.5‰-2.0‰；60-96h，RQ 0.6-0.8，碳氮比8:1，补料I的速率范围为每小时补加发酵液总体积的1.0‰-3.0‰；96-144h，RQ 0.5-0.6，碳氮比6:1，补料I的速率范围为每小时补加发酵液总体积的1.0‰-2.0‰。补料I的初始速率为每小时补加发酵液总体积的1‰，初始RQ为0.5。同时，按照如下方法调整补料速率以保证RQ：在不同的阶段，当呼吸商高于设定上限时，补料I的速率在原有基础上降低10％；当呼吸商低于设定下限时，补料I的速率在原有基础上增加10％；调整后的补料速率以各阶段预先设定的速率范围为界限，超出部分不再执行。

经检测，36-144h小时期间发酵液中残油为10-15g/L，菌体快速合成鼠李糖脂。

4、摇瓶培养热带假丝酵母(Candida tropicalis)，28℃、200rpm培养24h(处于对数生长期)，得到培养成熟的热带假丝酵母种子液。

热带假丝酵母的培养基为：葡萄糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母膏10g/L，余量为水。

5、在第144小时(处于衰亡期)停止补料，接入步骤4培养成熟的热带假丝酵母种子液，接种量为发酵液体积的3％。在第144-168小时期间，在温度28℃、溶氧10％-20％的条件下进行培养，热带假丝酵母快速生长并消耗残油。

6、取第168小时的发酵液，测得其中鼠李糖脂的浓度为68.5g/L，碳源转化率为71.4％，发酵液黏度为2.82cP，残油为2.4g/L，结束发酵。

实施例3

1、以超低温冻存的恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)为发酵菌株，经两级平板活化，挑取单菌落接种于摇瓶种子培养基，35℃、200rpm条件下培养16h。

种子培养基与实施例1步骤1中的种子培养基相同。

发酵培养基与实施例1步骤3的发酵培养基相同。

在发酵的第0-24小时期间，培养条件设定为温度35℃、溶氧40％-50％，在此期间菌体快速增殖；

在第24-144小时期间(处于稳定期)，培养条件设定为温度35℃、溶氧30％-40％，24h(OD600达到22)开始补料，其中，补料I和补料II的组成与实施例1相同。补料I速率与呼吸商(RQ)关联，根据设定的RQ，在设定的速率范围内自动调整；补料II速率根据设定的碳氮比，随着补料I速率同步调整。具体地，补料阶段RQ和碳氮比分阶段调控如下：24-48h，RQ0.4-0.6，碳氮比10:1，补料I的速率范围为每小时补加发酵液总体积的0.5‰-2.0‰；48-96h，RQ 0.6-0.8，碳氮比8:1，补料I的速率范围为每小时补加发酵液总体积的1.0‰-3.0‰；96-144h，RQ 0.5-0.6，碳氮比6:1，补料I的速率范围为每小时补加发酵液总体积的1.0‰-2.0‰。补料I的初始速率为每小时补加发酵液总体积的1‰，初始RQ为0.5。同时，按照如下方法调整补料速率以保证RQ：在不同的阶段，当呼吸商高于设定上限时，补料I的速率在原有基础上降低10％；当呼吸商低于设定下限时，补料I的速率在原有基础上增加10％；调整后的补料速率以各阶段预先设定的速率范围为界限，超出部分不再执行。

经检测，24-144小时期间发酵液中残油为10-15g/L，菌体快速合成鼠李糖脂。

热带假丝酵母的培养基与实施例2步骤4的培养基相同。

5、在第144小时(处于衰亡期)停止补料，接入步骤4培养成熟的热带假丝酵母种子液，接种量为发酵液体积的2％。在第144-168小时期间，在温度28℃、溶氧10％-20％的条件下进行培养，热带假丝酵母快速生长并消耗残油。

6、取第168小时的发酵液，测得其中鼠李糖脂的浓度为70.2g/L，碳源转化率为70.5％，发酵液黏度为2.90cP，残油为2.6g/L，结束发酵。

对比例

除了将补料I速率固定为每小时补加发酵液总体积的1‰，补料碳氮比固定为10:1，补料II速率根据碳氮比调整之外，重复实施例3的步骤1-步骤3，24-144小时期间菌体合成鼠李糖脂，残油逐渐累积。

在第144小时(处于衰亡期)停止补料，温度35℃、溶氧30％-40％，继续培养并消耗残油。

取第168小时的发酵液，测得其中鼠李糖脂的浓度为45.6g/L，碳源转化率为55.2％，发酵液黏度为45.26cP，残油为18.2g/L，结束发酵。

实施例3和对比例的发酵液中鼠李糖脂浓度的比较如图3所示，碳源转化率比较如图4所示，发酵液中残油浓度的比较如图5所示，发酵液黏度的比较如图6所示。

图3-6表明，实施例3最终发酵液中鼠李糖脂浓度和碳源转化率均显著高于对比例，而最终发酵液中残油浓度和黏度均显著低于对比例，并且在整个发酵过程中，残油在15g/L以下，发酵液黏度在5cP以下。

Claims

1.一种低残油发酵生产鼠李糖脂的方法，包括将铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)进行发酵培养，发酵培养期间在稳定期分别补料补料I和补料II，然后在衰亡期接入嗜油菌共发酵以降低残油的步骤；

其中，所述补料I包含碳源；

所述补料II包含氮源和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)或恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)生长所需的营养盐。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述碳源选自菜籽油、棕榈油、棉籽油、玉米油、大豆油、椰子油、橄榄油和花生油中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氮源为有机氮源和/或无机氮源，选自蛋白胨、玉米浆、酵母粉、酵母浸粉、玉米粉、硫酸铵、尿素、硝酸钠和硝酸铵中的一种或多种。

4.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于：发酵培养期间在稳定期分别补料补料I和补料II的方法如下：在铜绿假单胞菌或恶臭假单胞菌发酵培养的OD600达到20-25时，连续进行以下三个阶段的补料：

第一阶段补料持续24-30小时，在该阶段控制呼吸商为0.4-0.6、碳氮比10:1以及补料I的速率范围为每小时补加发酵液总体积的0.5‰-2.0‰；

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：所述嗜油菌选自假单胞菌属(Pseudomonas)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、头孢霉属(Cephalosporium)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicilium)、曲霉属(Aspergillus)、假丝酵母属(Candida)和红酵母属(Rhodotorula)中的一种或多种。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于：所述嗜油菌为顶头孢霉菌(Cephalosporium acremonium)和/或热带假丝酵母(Candida tropicalis)。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述嗜油菌的接种量为发酵液体积的1％-3％。

8.根据权利要求1-7任一项所述的方法，其特征在于：所述共发酵的时间为24小时。

9.权利要求1-8任一项所述的方法在制备鼠李糖脂中的应用。

10.权利要求1-8任一项所述的方法在降低发酵生产鼠李糖脂过程中的残油、降低发酵生产鼠李糖脂过程中的发酵液黏度和/或提高发酵生产鼠李糖脂过程中的碳源转化率中的应用。