CN103695512B - 一种发酵生产多粘菌素e的方法 - Google Patents

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尚海涛
杨为华
邓远德
徐斌
张雪锋
张家泉
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SHANDONG GALAXY BIO-TECH CO., LTD.
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Abstract

本发明涉及一种发酵生产多粘菌素E的方法，包括以下步骤：1）种子培养：将冷冻多粘芽胞杆菌孢子液接种到种子培养基中，培养30-40h,得到种子液；2）发酵培养：将步骤1）培养好的种子液接种到发酵培养基中，全程氨水自控pH5.5-6.0，培养75-85h，得到多粘菌素E。本发明通过对发酵培养基中碳源和氮源的配方进行优化，合理碳氮比搭配，利用非粮作物木薯淀粉代替部分粮食作物葡萄糖、玉米淀粉等，并且在现有发酵培养基配方基础上增加碳酸钙和微量元素，使多粘菌素E的产量显著提高，多粘菌素E的最大产量可达到710000u/ml。

Description

一种发酵生产多粘菌素E的方法
技术领域
本发明涉及一种发酵生产多粘菌素E的方法，属于微生物制剂领域。
背景技术
多粘菌素E是由多粘类芽胞杆菌(Bacillus polymgxa)产生的，由多种氨基酸和脂肪酸组成的一种碱性多肤类抗生素的总称。在已知的抗生素中，多粘菌素E对革兰氏阴性杆菌的杀菌作用最强。临床上常用其硫酸盐和钾硫酸盐用于治疗革兰阴性菌感染，也可用做饲料添加剂促进禽畜生长和提高饲料利用率。
目前，多粘菌素E的生产研究主要在诱变育种、种子培养等方面，CN101235406A公开了一种发酵法合成多粘菌素E的方法，其中所述发酵培养基使用的有机氮源的浓度为4-10%，最大发酵单位22143U/ml。《多粘菌素E发酵工艺研究》（赖滨霞，化学工程与装备，2010年11期，P20-21）研究了温度、溶氧、生物素、磷酸盐及PH对多粘菌素E发酵的影响，结果表明在控制培养温度34℃,溶氧40%以上的条件下,采用补料和自动控制PH工艺,可明显提高发酵效价,从480000u/ml提高到650000u/ml。
虽然，近年来对多粘菌素E的研究已经取得一定进展，但总体来说，多粘菌素E的发酵产量依然偏低。
发明内容
针对上述不足，本发明提供一种发酵生产多粘菌素E的方法。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种发酵生产多粘菌素E的方法，包括以下步骤：
1）种子培养：将冷冻多粘芽胞杆菌孢子液接种到种子培养基中，每30L种子培养基接种3ml冻存孢子液，接种量万分之一，控制温度33±0.5℃，通风量0.6-0.9vvm，转速350-450rpm，罐压0.04-0.06MPa，控制溶氧40-60%，培养30-40h,得到种子液；
2）发酵培养：将步骤1）培养好的种子液按5-8%（v/v）接种到50L发酵罐的发酵培养基中，控制温度33±0.5℃，通风量0.5-0.8vvm，转速250-350rpm，全程氨水自控pH5.5-6.0，罐压0.04-0.06MPa，控制溶氧20-40%，培养培养75-85h，得到多粘菌素E。
在步骤1）中，所述种子培养基组分(m/v)：葡萄糖1.5%,酵母浸粉0.7%蛋白胨0.3%,NaCl 0.03%,碳酸钙0.02%。
在步骤2）中，所述发酵培养基的碳源浓度为5%-10%，氮源浓度为3%-8%，优选碳源浓度为6-7%，氮源浓度为3.5-4%。
所述碳源为葡萄糖、木薯淀粉、糖蜜、玉米淀粉中的一种或两种以上；所述氮源为大豆水解液、豆粕粉、玉米浆、毛发水解液、硫酸铵中的一种或两种以上。
在本发明技术方案中，所述发酵培养基还包括CaCO3及微量元素。
其中，所述CaCO3在发酵培养基中的浓度为0.1%-0.3%，优选0.2%。
所述微量元素为Mg2﹢、K+和Na+，其中，Mg2﹢、K+与Na+的质量比为4:3:5；微量元素总质量占发酵培养基体积的0.03%-0.08%（m/v），优选0.06%（m/v）。
本发明中所述多粘芽孢杆菌孢子液均为市售产品。
本发明通过对发酵培养基中碳源和氮源的配方进行优化，合理碳氮比搭配，利用非粮作物木薯淀粉代替部分粮食作物葡萄糖、玉米淀粉等，并且在现有发酵培养基配方基础上增加碳酸钙和微量元素，使多粘菌素E的产量显著提高，多粘菌素E的最大产量可达到710000u/ml。本发明生产多粘菌素E的方法，成本低，产率高，适合大规模企业推广。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1）种子培养：将制备好的冷冻孢子液接种到种子培养基中，每30L种子培养基中接种3ml冻存孢子液，在33℃，通风量0.8vvm，转速400rpm，罐压0.06MPa，全程控制溶氧45%，培养35h，得到种子液;
2）发酵培养：将步骤1）培养好的种子液按5%（v/v）接种到50L发酵罐的发酵培养基中，在33℃，通风量0.6vvm，转速300rpm，全程氨水自控pH5.8，控制溶氧30%，培养80h，结果得到650000u/ml的多粘菌素E。
其中在步骤1）中，所述种子培养基组分(m/v)：葡萄糖1.5%,酵母浸粉0.7%蛋白胨0.3%,NaCl 0.03%,碳酸钙0.02%。
在步骤2）中，所述发酵培养基组成（m/v）：木薯淀粉10%、大豆水解液3%、(NH4)2SO4 1%、CaCO3 0.2%、MgSO4　 7H2O 0.02%、KH2PO4 0.015%、NaCl 0.025%、泡敌1.5ml。
实施例2
1）种子培养：将制备好的冷冻孢子液接种到种子培养基中，每30L种子培养基中接种3ml冻存孢子液，在33℃，通风量0.8vvm，转速400rpm，罐压0.05MPa，控制溶氧42%，培养35h，得到种子液;
2）发酵培养：将步骤1）培养好的种子液按6%（v/v）接种到50L发酵罐的发酵培养基中，在33℃，通风量0.6vvm，转速300rpm，全程氨水自控pH5.8，控制溶氧20%，培养80h，结果得到660000u/ml的多粘菌素E。
其中，在步骤1）中，所述种子培养基组分(m/v)：葡萄糖1.5%,酵母浸粉0.7%蛋白胨0.3%,NaCl 0.03%,碳酸钙0.02%。
在步骤2）中，所述发酵培养基组成（m/v）：木薯淀粉3%，糖蜜4%、大豆水解液2%、毛发水解液1%、(NH4)2SO4 1%、CaCO3 0.2%、MgSO47H2O0.02%、KH2PO4 0.015%、NaCl 0.025%、泡敌1.5ml。
实施例3
1）种子培养：将制备好的冷冻孢子液接种到种子培养基中，每30L种子培养基中接种3ml冻存孢子液，在33℃，通风量0.8vvm，转速400rpm，罐压0.05MPa，全程控制溶氧50%，培养35h，得到种子液;
2）发酵培养：将步骤1）培养好的种子液按6%（v/v）接种到50L发酵罐的发酵培养基中，在33℃，通风量0.6vvm，转速300rpm，全程氨水自控pH5.8，通过提高转速、风量、罐压控制溶氧40%，培养80h，结果得到650000u/ml的多粘菌素E。
其中，在步骤1）中，所述种子培养基组分(m/v)：葡萄糖1.5%,酵母浸粉0.7%蛋白胨0.3%,NaCl 0.03%,碳酸钙0.02%。
在步骤2）中，所述发酵培养基组成（m/v）：木薯淀粉4%，糖蜜1%、葡萄糖2%、大豆粉1.5%、玉米浆1%、(NH4)2SO4 1%、CaCO3 0.2%、MgSO47H2O 0.02%、KH2PO4 0.015%、NaCl 0.025%、泡敌1.5ml。
实施例4
1）种子培养：将制备好的冷冻孢子液接种到种子培养基中，每30L种子培养基中接种5ml冻存孢子液，在33℃，通风量0.8vvm，转速400rpm，罐压0.05MPa，全程控制溶氧50%，培养35h，得到种子液;
2）发酵培养：将培养好的种子液按照7%（v/v）接种到50L发酵罐中，在33℃，通风量0.6vvm，转速300rpm，全程氨水自控pH5.8，控制溶氧30%，培养80h，结果得到710000u/ml的多粘菌素E。
其中，在步骤1）中，所述种子培养基组分(m/v)：葡萄糖1.5%,酵母浸粉0.7%蛋白胨0.3%,NaCl 0.03%,碳酸钙0.02%。
在步骤2）中，所述发酵培养基组成（m/v）：木薯淀粉3%，玉米淀粉1%、葡萄糖2%、豆粕粉2%、玉米浆1%、(NH4)2SO4 1%、CaCO3 0.2%、MgSO4　7H2O 0.02%、KH2PO4 0.015%、NaCl 0.025%、泡敌1.5ml。
实施例5
1）种子培养：将制备好的冷冻孢子液接种到种子培养基中，每30L种子培养基中接种5ml冻存孢子液，在33℃，通风量0.8vvm，转速400rpm，罐压0.05MPa，全程控制溶氧50%，培养35h，得到种子液;
2）发酵培养：将培养好的种子培养液按照7%（v/v）接种到50L发酵罐的发酵培养基中，在33℃，通风量0.6vvm，转速300rpm，全程氨水自控pH5.8，控制溶氧20-40%，培养80h，结果得到710000u/ml的多粘菌素E。
其中，在步骤1）中，所述种子培养基组分(m/v)：葡萄糖1.5%,酵母浸粉0.7%蛋白胨0.3%,NaCl 0.03%,碳酸钙0.02%。
在步骤2）中，所述发酵培养基组成（m/v）：木薯淀粉2%、玉米淀粉5%、毛发水解液2%、玉米浆1%、(NH4)2SO4 1%、CaCO3 0.2%、MgSO47H2O 0.02%、KH2PO4 0.015%、NaCl 0.025%、泡、敌1.5ml。
为了进一步验证本发明多粘菌素E的生产方法所取得的优越性，发明人以《多粘菌素E发酵工艺研究》中多粘菌素E发酵方法为对比例进行比较。
上述实施例1-5生产多粘菌素E的产量在650000-710000U/ml，相比对比例，其产率大大提升，并且发酵培养基中碳源为非粮作物木薯淀粉代替部分粮食作物葡萄糖、玉米淀粉，有效降低生产成本。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种发酵生产多粘菌素E的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)种子培养：将冷冻多粘芽胞杆菌孢子液接种到种子培养基中，培养30-40h,得到种子液；
2)发酵培养：将步骤1)培养好的种子液接种到发酵培养基中，全程氨水自控pH5.5-6.0，培养75-85h，得到多粘菌素E；
所述发酵培养基中碳源浓度为6％-7％，氮源浓度为3.5％-4％；
所述碳源为木薯淀粉，或所述碳源进一步含有葡萄糖、糖蜜、玉米淀粉中的一种或两种以上组合；
在步骤2)中，所述发酵培养条件：接种量为5-8％(v/v)，控制温度33±0.5℃，通风量0.5-0.8vvm，转速250-350rpm，罐压0.04-0.06MPa，控制溶氧20-40％；
所述发酵培养基还包括CaCO3及微量元素；
所述CaCO3在发酵培养基中的浓度为0.1％-0.3％；
所述微量元素为Mg2﹢、K+和Na+，其中，Mg2﹢、K+与Na+的质量比为4:3:5；
所述微量元素与发酵培养基质量体积比为0.03％-0.08％m/v。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述种子培养条件：控制温度33±0.5℃，通风量0.6-0.9vvm，转速350-450rpm，罐压0.04-0.06MPa，控制溶氧40-60％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤1)中，所述种子培养基组分(m/v)：葡萄糖1.5％,酵母浸粉0.7％，蛋白胨0.3％,NaCl0.03％,碳酸钙0.02％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氮源为大豆水解液、豆粕粉、玉米浆、毛发水解液、硫酸铵中的一种或两种以上。
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