CN103993059B - 优化多粘芽孢杆菌发酵液中e1和e2组分比例的方法 - Google Patents

优化多粘芽孢杆菌发酵液中e1和e2组分比例的方法 Download PDF

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优化多粘芽孢杆菌发酵液中E1和E2组分比例的方法，步骤如下：a、斜面培养；b、种子液培养；c、发酵培养；d、发酵液中E1和E2组分检测。本发明解决了多粘菌素E发酵液中E1和E2组分比例不稳定性和不可控性的问题。

Description

优化多粘芽孢杆菌发酵液中E1和E2组分比例的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及优化多粘芽孢杆菌发酵液中E1和E2组分比例的方法。
背景技术
多粘菌素E是由多粘类芽胞杆菌产生的，由多种氨基酸和脂肪酸组成的一种碱性多肽类抗生素，多粘菌素E对革兰氏阴性菌的作用最强，无论生长期还是静止期的细胞均能很快被杀死，它可以治疗由志贺氏痢疾菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、沙门氏菌属和普通变形杆菌引起的感染，并对霍乱弧菌、鼠疫杆菌等也有很好的作用。由于多粘菌素E具有良好的抗菌活力和高效，低毒，残留少的特性，可用于饲料添加剂，促进禽畜生长和提高饲料利用率，并且可以防止饲料大规模生产中常出现的由大肠埃希氏菌和沙门氏菌污染引起的疾病。
多粘菌素E主要成分为多粘菌素E1和E2，多粘菌素E主要的获得方法就是发酵法，而多粘菌素E发酵液中E1和E2组分比例的不稳定性和不可控性一直是困扰多粘菌素E发酵行业的一个问题，因此有必要发明一种实施简单，工艺可行的方法来解决这一问题。
发明内容
本发明的目的是解决多粘菌素E发酵液中E1和E2组分比例的不稳定性和不可控性的问题。
本发明为实现其目的采用的技术方案是：
优化多粘芽孢杆菌发酵液中E1和E2组分比例的方法，包括以下操作步骤：
a、斜面培养：将多粘菌素生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，于温度28-30℃、湿度30％-60％的条件下培养48-72h；
b、种子液培养：挖取2-5cm2步骤a制备的斜面孢子接种于种瓶培养基中，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养24-26h；
c、发酵培养：将步骤b培养成熟的种子液按2％的接种量接入发酵培养基中，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养48-72h；在发酵培养24h-32h按不同配比加入缬氨酸和异亮氨酸继续培养；
d、发酵液中E1和E2组分检测：将步骤c培养48-72h后得到的多粘菌素E发酵液中E1和E2组分的含量进行检测。
步骤a中所用的斜面培养基成分及其含量为：以质量百分比计，葡萄糖1％-1.5％、硫酸铵1％-1.5％、柠檬酸钠1％-1.5％、磷酸二氢钾1％-1.5％、硫酸镁0.12％-1.13％、琼脂2％-2.5％。
步骤b中所用的种子液培养基成分及其含量为：以质量百分比计，葡萄糖2.0％-2.5％、蛋白胨1.5％-2.0％、氯化钠0.2％-0.3％、碳酸钙0.4％-0.5％、泡敌0.04％-0.05％。
步骤c中所用的发酵培养基的成分及其含量为：以质量百分比计，玉米淀粉6.0-8.0％、葡萄糖1.0％-1.5％、蛋白胨1.5％-2.0％、碳酸钙0.4％-0.5％、氯化钠0.1％-0.2％、硫酸铵0.1％-0.2％、磷酸二氢钾1％-1.5％、泡敌0.04％-0.05％。
步骤c中不同缬氨酸和异亮氨酸的配比包括以下三种情况：
Ⅰ、E2组分：E1组分≥2:1，添加缬氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0.8mg/mL-1.6mg/mL，同时添加异亮氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0mg/mL-0.1mg/mL。
Ⅱ、2:1>E2组分：E1组分>1:1，添加缬氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0.3mg/mL-0.8mg/mL，同时添加异亮氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0.1mg/mL-0.3mg/mL。
Ⅲ、E2组分：E1组分≤1:1，添加缬氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0mg/mL-1.2mg/mL，同时添加异亮氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0.3mg/mL-1.5mg/mL。
本发明的有益效果是：本发明研究的这种优化多粘菌素E发酵液中E1和E2组分的方法解决了多粘菌素E发酵液中E1和E2组分比例不稳定性和不可控性的问题，而且本发明具有方法简单、实用性强、重现性好的优点。具体实施方式
本发明的目的是解决多粘菌素E发酵液中E1和E2组分的不稳定性和比例的不可控性的问题，下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
具体实施例1，E2组分：E1组分≥2:1的情况
a、斜面培养：将多粘菌素生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，于温度28-30℃、湿度30％-60％的条件下培养60h；
b、种子液培养：挖取2-5cm2步骤a制备的斜面孢子接种于种瓶培养基中，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养25h；
c、发酵培养：将步骤b培养成熟的种子液按2％的接种量接入发酵培养基中，每个种子做4个平行样，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养60h；发酵25h后加入缬氨酸使其在发酵培养基中的终浓度为0.954mg/mL，同时加入异亮氨酸使其在发酵培养基中的终浓度为0.015mg/mL继续震荡培养；
d、发酵液中E1和E2组分检测：将步骤c培养60h后得到的多粘菌素E发酵液中E1和E2组分的含量进行检测。
检测结果见表1
表1 60h发酵样品检测结果
发酵平行样品 E1(峰面积) E2(峰面积) E2/E1
发酵平行样品1 1021097 2225768 2.18
发酵平行样品2 1075070 2163723 2.01
发酵平行样品3 1060537 2240680 2.11
发酵样品均值 1052235 2210057 2.10
具体实施例2，2:1>E2组分：E1组分>1:1的情况
a、斜面培养：将多粘菌素生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，于温度28-30℃、湿度30％-60％的条件下培养60h；
b、种子液培养：挖取2-5cm2步骤a制备的斜面孢子接种于种瓶培养基中，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养25h；
c、发酵培养：将步骤b培养成熟的种子液按2％的接种量接入发酵培养基中，每个种子做4个平行样，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养60h；发酵25h后加入缬氨酸使其在发酵培养基中的终浓度为0.460mg/mL，同时加入异亮氨酸使其在发酵培养基中的终浓度为0.148mg/mL继续震荡培养；
d、发酵液中E1和E2组分检测：将步骤c培养60h后得到的多粘菌素E发酵液中E1和E2组分的含量进行检测。
检测结果见表2
表2 60h发酵样品检测结果
发酵平行样品 E1(峰面积) E2(峰面积) E2/E1
发酵平行样品1 1149420 1698556 1.47
发酵平行样品2 1232251 1665791 1.35
发酵平行样品3 1203322 1687841 1.40
发酵样品均值 1194998 1684063 1.41
具体实施例3，E2组分：E1组分≤1:1的情况
a、斜面培养：将多粘菌素生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，于温度28-30℃、湿度30％-60％的条件下培养60h；
b、种子液培养：挖取2-5cm2步骤a制备的斜面孢子接种于种瓶培养基中，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养25h；
c、发酵培养：将步骤b培养成熟的种子液按2％的接种量接入发酵培养基中，每个种子做4个平行样，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养60h；发酵25h后加入缬氨酸使其在发酵培养基中的终浓度为1.060mg/mL，同时加入异亮氨酸使其在发酵培养基中的终浓度为0.366mg/mL继续震荡培养；
d、发酵液中E1和E2组分检测：将步骤c培养60h后得到的多粘菌素E发酵液中E1和E2组分的含量进行检测。
检测结果见表3
表3 60h发酵样品检测结果
本发明研究的这种优化多粘菌素E发酵液中E1和E2组分的方法解决了多粘菌素E发酵液中E1和E2组分比例不稳定性和不可控性的问题，而且本发明具有方法简单、实用性强、重现性好的优点。

Claims (1)

1.优化多粘芽孢杆菌发酵液中E1和E2组分比例的方法，其特征在于，包括以下操作步骤：
a、斜面培养：将多粘菌素生产菌株砂土孢子接种于斜面培养基中，于温度28-30℃、湿度30％-60％的条件下培养48-72h；
b、种子液培养：挖取2-5cm2步骤a制备的斜面孢子接种于种瓶培养基中，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养24-26h；
c、发酵培养：将步骤b培养成熟的种子液按2％的接种量接入发酵培养基中，于温度28-30℃、湿度30％-60％、转速180-220rpm的条件下震荡培养48-72h；在发酵培养24h-32h按不同配比加入缬氨酸和异亮氨酸继续培养；
d、发酵液中E1和E2组分检测：将步骤c培养48-72h后得到的多粘菌素
E发酵液中E1和E2组分的含量进行检测；
其中，步骤a中所用的斜面培养基成分及其含量为：以质量百分比计，葡萄糖1％-1.5％、硫酸铵1％-1.5％、柠檬酸钠1％-1.5％、磷酸二氢钾1％-1.5％、硫酸镁0.12％-1.13％、琼脂2％-2.5％；步骤b中所用的种子液培养基成分及其含量为：以质量百分比计，葡萄糖2.0％-2.5％、蛋白胨1.5％-2.0％、氯化钠0.2％-0.3％、碳酸钙0.4％-0.5％、泡敌0.04％-0.05％；步骤c中所用的发酵培养基的成分及其含量为：以质量百分比计，玉米淀粉6.0-8.0％、葡萄糖1.0％-1.5％、蛋白胨1.5％-2.0％、碳酸钙0.4％-0.5％、氯化钠0.1％-0.2％、硫酸铵0.1％-0.2％、磷酸二氢钾1％-1.5％、泡敌0.04％-0.05％；步骤c中缬氨酸和异亮氨酸的配比包括以下三种情况：
Ⅰ、E2组分：E1组分≥2:1，添加缬氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0.8mg/mL-1.6mg/mL，同时添加异亮氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0mg/mL-0.1mg/mL；
Ⅱ、2:1>E2组分：E1组分>1:1，添加缬氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0.3mg/mL-0.8mg/mL，同时添加异亮氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0.1mg/mL-0.3mg/mL；
Ⅲ、E2组分：E1组分≤1:1，添加缬氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0mg/mL-1.2mg/mL，同时添加异亮氨酸使其在发酵液中的终浓度为：0.3mg/mL-1.5mg/mL。
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