CN105543314A - 一种应用发酵与泡沫分离耦合生产多粘菌素e的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种应用发酵与泡沫分离耦合生产多粘菌素E的方法。该方法提出将发酵、膜分离与泡沫分离耦合通过蠕动泵构成循环回流装置制备多粘菌素E。在耦合操作时，利用蠕动泵将发酵液通过膜过滤器进入泡沫分离塔，产物和液体通过膜而细胞被截留在发酵罐中继续发酵，保证了菌体的恒定；在泡沫分离塔底部装有气泡分布器，通过鼓气产生气泡进行泡沫分离，由于通过膜过滤器部分营养物质进入泡沫分离塔，所以本发明采用的是循环回流的方式将泡沫分离后的余液回流回发酵罐中，保证了营养物质的充分利用；同时本发明采用罐体外耦合，发酵的操作条件和泡沫分离的操作条件分别控制，都可以满足最佳的操作条件。

Description

一种应用发酵与泡沫分离耦合生产多粘菌素E的方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种应用发酵与泡沫分离耦合生产多粘菌素E的系统及方法。
背景技术
多粘菌素E具有较好抗菌谱、高效、低毒、残留少的特性，可用于饲料添加剂，促进禽兽生长，提高饲料利用率，并且可以防止饲料在大规模生产中常出现的由大肠埃希氏菌和沙门氏菌污染引起的疾病，我国已将多粘菌素E列为国家法定品种，但产品效价较低，主要依靠进口。本产品主要由发酵法制得，传统的分离方法主要用离子交换色谱，这一过程的能耗很大。本课题组采用泡沫分离的方法分离发酵液中的多粘菌素E已发表专利，首先发酵液预处理，真空干燥，喷雾干燥继而得到多粘菌素E的浓缩液，浓缩倍数达到15，收率为95％，具有广阔以及实用的经济效果。
但这种方法在发酵过程中随着产物的增加会造成严重的抑制作用，使得发酵液中多粘菌素E的总效价较低。对于这一现象目前已有文献采用泡沫分离的方法，在发酵罐底部装有气泡分布器，通过鼓泡分离目的产物，这种方法可以有效的消除产物抑制作用，提高产率，比传统方法有很大的进步，但是在泡沫分离过程中，随着泡沫相的上升会带走部分营养物质和细胞，降低原料利用率，降低富集比，同时由于在充当反应器的发酵罐中进行分离产生大量气泡会影响传质。
发明内容
当前技术中存在的多粘菌素E主要由发酵法制得，但是在发酵过程中随着产物多粘菌素E的增加会造成严重的产物抑制作用的不足；而目前已经有应用泡沫分离的方法在线分离产物，并在发酵与泡沫分离耦合制备乳链菌肽取得成功。但由于是罐内耦合有很多的局限性，一方面对于操作条件既要满足发酵的最佳条件又要符合分离的要求；另一方面随着气泡的产生不止带走了产物而且会将营养物质带出。基于以上局限，本发明提供一种应用发酵与泡沫分离耦合生产多粘菌素E的工艺方法和装置。该方法提出将发酵、膜分离与泡沫分离耦合通过蠕动泵构成循环回流装置制备多粘菌素E。在耦合操作时，利用蠕动泵将发酵液通过膜过滤器进入泡沫分离塔，产物和液体通过膜而细胞被截留在发酵罐中继续发酵，保证了菌体的恒定；在泡沫分离塔底部装有气泡分布器，通过鼓气产生气泡进行泡沫分离，由于通过膜过滤器部分营养物质进入泡沫分离塔，所以本发明采用的是循环回流的方式将泡沫分离后的余液回流回发酵罐中，保证了营养物质的充分利用；同时本发明采用罐体外耦合，发酵的操作条件和泡沫分离的操作条件分别控制，都可以满足最佳的操作条件。
本发明采用的技术方案是：
一种微生物发酵与泡沫分离技术耦合生产多粘菌素E的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)菌种活化：将从冷冻甘油管中得到的多粘芽孢杆菌菌液，接种于斜面培养基中进行活化，30℃，培养65～75h；
b)种子培养：将活化后的菌种接种到含种子培养基的种子瓶中，在32℃培养24h，得到种子液，准备进入微生物发酵与泡沫分离技术耦合生产多粘菌素E的联合装置进行下一步骤；
c)发酵培养：将上步得到的种子液以10％的接种量首先接种到装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度30-35℃、搅拌转速100-400r/min、通气量100-300mL/min，多粘芽孢杆菌在发酵培养基中发酵培养得到富含多粘菌素E的发酵液；培养基装液量为发酵罐容积的60～85％；
d)微孔滤膜过滤：多粘芽孢杆菌在发酵罐中发酵培养，发酵30-40h后，启动发酵罐内部的膜过滤器，发酵液中的产物分子和部分培养基通过膜过滤器，通过蠕动泵以100-300mL/h的速度进入发酵罐外部的泡沫分离塔中，生物细胞被截留在发酵罐内继续发酵；
e)泡沫分离：分离塔内的液体体积累积到塔体积的25～40％后，开启分离系统进行泡沫分离，其中，通气量为50-150mL/min，温度为30-35℃，顶部接收液体形成多粘菌素E的浓缩液，而后为保持分离塔的装液量不变，开启回流阀将富有营养物质的泡沫分离余液回流进入发酵罐中，循环进行，直至发酵结束。
所述的发酵罐和分离塔均通入无菌空气。
所述的膜过滤器中使用的微孔滤膜材料为0.45μm的纤维素无机膜。
所述的步骤(a)中多粘芽孢杆菌的斜面培养基的组成及制备方法包括：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨1g/L，氯化钠1g/L，琼脂15g/L，氨水调节pH到7，115-121℃高压蒸汽灭菌15-30min；
所述的步骤(b)中多粘芽孢杆菌的种子培养基的组成及制备方法包括：葡萄糖20g/L，酵母粉40g/L，氯化钠1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氨水调节pH到6.8，115-121℃高压蒸汽灭菌15-30min；
所述的步骤(c)中多粘芽孢杆菌的发酵培养基的组成及制备方法包括：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸铵10g/L，硫酸亚铁0.1g/L，氨水调节初始pH为7，115-121℃高压蒸汽灭菌15-30min；
所述的微生物发酵与泡沫分离技术耦合生产多粘菌素E的联合装置，包括生物反应器、膜过滤器、泡沫分离塔、出料阀、回流阀、蠕动泵；
所述的生物反应器包括：发酵罐、恒温测速磁力搅拌器、原料罐、pH计、鼓气泵、进料阀、真空泵；
所述的膜过滤器安装在发酵罐内的出料口处，具体为一张无机纤维素膜，0.45μm，天津市东科仪器设备有限公司购得；
其中，膜过滤器设置在发酵罐的右侧下方罐壁出料口处，发酵罐中物料经过膜过滤器的过滤后，通过出料口经出料阀通过蠕动泵与泡沫分离塔右侧进料口相连；泡沫分离塔的底部从回流口经回流阀与发酵罐的进料口相连；
其中原料罐通过进料阀与发酵罐左侧下方相连；所述的发酵罐出料口与泡沫分离塔进料口相连接；发酵罐进料口与泡沫分离塔回流口相连接；
所述的泡沫分离塔包括：泡沫分离塔柱、气泡分布器、消泡液、恒温水浴进水口、恒温水浴出水口；
泡沫分离塔柱底部连接有气泡分布器和回流口；所述的回流口经回流阀与发酵罐进料口相连接；所述的进料口经蠕动泵与发酵罐出料口相连接；所述的泡沫分离塔顶部设置有产物接收装置消泡液；所述的恒温水浴进水口(设置在泡沫分离塔柱外侧套管左侧下方，恒温水浴出水口设置在泡沫分离塔柱外侧套管右侧上方，恒温水浴进水口和恒温水浴出水口与数显恒温水浴相连接。
现有的发酵耦合分离技术，离子交换树脂提取需要定期换树脂，成本较高；而在泡沫分离时会带出大量的营养物质，导致原材料利用率和富集比较低。
相对于现有发酵与分离耦合技术，本发明的有益效果是：该工艺方法的特征是将发酵、膜分离和泡沫分离相耦合，通过发酵过程与泡沫分离过程的循环回流来降低营养物质的流失，减少产物抑制，提高原材料的转化率，发酵与分离可构成连续也可间歇操作，并且泡沫分离条件温和，与发酵温度接近，不会影响发酵的顺利进行。
1.降低成本，环保。采用本发明中的发酵与泡沫分离耦合装置来进行多粘菌素E的发酵、产物分离过程，装置简单，泡沫分离操作条件温和，所需成本降低，发酵结束的废液无毒害、无污染、绿色环保。
2.降低产物抑制，提高原材料利用率。本发明采用泡沫分离的方法在线移除产物多粘菌素E，降低或解除了在发酵过程中随着产物增加造成的严重产物抑制作用，提高了多粘菌素E的总效价，比传统发酵相比效价提高了22％左右；应用循环回流的方式将通过膜过滤器进入泡沫分离塔的营养物质回流入发酵罐，降低原材料的流失，提高原材料利用率。
附图说明
图1是多粘芽孢杆菌发酵与泡沫分离耦合生产多粘菌素E的工艺流程示意图。
其中，1－生物反应器；2－膜过滤器；3－泡沫分离塔；4－出料阀；5－回流阀；6－蠕动泵。
图2是生物反应器的结构示意图
其中，100—发酵罐；101—恒温测速磁力搅拌器；102—原料罐；103—出料口；104—进料口；105—pH计；106—鼓气泵；107—进料阀；108—真空泵。
图3是泡沫分离塔的结构示意图
其中，301—泡沫分离塔柱；302—进料口；303—回流口；304—气泡分布器；305—消泡液；306—恒温水浴进水口；307—恒温水浴出水口。
具体实施方式
本发明的具体实施方式参照附图1—3详细说明如下，但仅作为说明，并不是限制本发明。
一种微生物发酵与泡沫分离技术耦合生产多粘菌素E的联合装置，由生物反应器和泡沫分离装置通过蠕动泵连接构成的循环回流装置；
该装置的组成如图1，包括生物反应器(1)、膜过滤器(2)、泡沫分离塔(3)、出料阀(4)、回流阀(5)、蠕动泵(6)；
所述的生物反应器(1)的组成如图2，包括：发酵罐(100)、恒温测速磁力搅拌器(101)、原料罐(102)、出料口(103)、进料口(104)、pH计(105)、鼓气泵(106)、进料阀(107)、真空泵(108)；
所述的膜过滤器(2)安装在发酵罐(100)内的出料口(103)处，具体为一张无机纤维素膜，0.45μm，天津市东科仪器设备有限公司购得；
其中，膜过滤器(2)设置在发酵罐(100)的右侧下方罐壁出料口(103)处，发酵罐(100)中物料经过膜过滤器(2)的过滤后，通过此出口经出料阀(4)通过蠕动泵(6)与泡沫分离塔(3)右侧进料口相连；泡沫分离塔(3)的底部从回流口经回流阀(5)与发酵罐(100)的右侧上方的进料口(104)相连；
其中原料罐(102)通过进料阀(107)与发酵罐(100)左侧下方相连；所述的发酵罐(100)出料口(103)与泡沫分离塔进料口(302)相连接；发酵罐(100)进料口(104)与泡沫分离塔回流口(303)相连接；
所述的泡沫分离塔(3)又包括：泡沫分离塔柱(301)、进料口(302)、回流口(303)、气泡分布器(304)、消泡液(305)、恒温水浴进水口(306)、恒温水浴出水口(307)；
其中所述的泡沫分离塔(301)的内径为5cm，高度为75cm的为圆柱体；泡沫分离塔柱(301)底部连接有气泡分布器(304)和回流口(303)；所述的气泡分布器(304)与鼓气泵相连接；所述的回流口(303)经回流阀(5)与发酵罐(100)进料口(104)相连接；所述的进料口(302)经蠕动泵(6)与发酵罐(100)出料口(103)相连接；所述的泡沫分离塔顶部设置有产物接收装置消泡液(305)；所述的恒温水浴进水口(306)设置在泡沫分离塔柱外侧套管左侧下方，恒温水浴出水口(307)设置在泡沫分离塔柱外侧套管右侧上方，恒温水浴进水口(306)和恒温水浴出水口(307)与数显恒温水浴相连接。
所述的出料阀(4)左侧与发酵罐(100)内的膜过滤器出料口(103)相连接，右侧通过蠕动泵与泡沫分离塔进料阀(302)连接；
所述的回流阀(5)左侧连接发酵罐100进料口(104)，右侧与泡沫分离塔底回流口(303)连接。
发酵与泡沫分离耦合操作时，首先开启真空泵(108)，使整个系统处于高真空状态。然后关闭真空泵(108)，打开进料阀(107)使料液在外界大气压下自动由原料罐(102)进入经过高温灭菌处理的发酵罐(100)中，将种子液以10％的接种量接种到发酵罐(100)内。调节以致发酵罐(100)装液量为60％-85％，培养温度30-35℃、搅拌转速100-400r/min、通气量100-300mL/min。在此条件下发酵30-40h后，打开出料阀(4)、蠕动泵(6)和分离塔外侧的数显恒温水浴装置及恒温水浴进水口(306)和恒温水浴出水口(307)，将发酵液通过膜过滤器以100-300mL/h的进料速度进入泡沫分离塔中，生物细胞被截留在发酵罐中继续发酵。当一定时间后，分离塔内液体达到塔体积的25％-40％左右，开启泡沫分离系统，在通气量为50-150mL/min，温度为30-35℃进行泡沫分离，分离塔上部接收液为多粘菌素E的浓缩液。而后为保持分离塔的装液量不变，开启回流阀(5)将含有营养物质的泡沫分离余液回流进入发酵罐(100)中，循环进行，直至发酵结束。
实施例1
将从冷冻甘油管中得到的多粘芽孢杆菌菌液接种于斜面培养基中进行活化，30℃，培养72h。将活化后的菌液接种到种子培养基中，在32℃培养24h，得到种子液(以下实施例同)。将种子液以10％的接种量接种到经过高温灭菌处理的1.8L的发酵罐(100)内，发酵罐(100)装液量为1.2L，培养温度30℃、搅拌转速200r/min、通气量150mL/min。发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸铵10g/L，硫酸亚铁0.1g/L，氨水调节初始pH为7，115-121℃高压蒸汽灭菌15-30min。在此条件下发酵33h后，检测菌体含量达到4.19g/L，多粘菌素E含量达到4680U/mL。此时打开出料阀(4)、进料蠕动泵(6)和分离塔外侧的数显恒温水浴装置及恒温水浴进水口(306)和恒温水浴出水口(307)，将发酵液通过膜过滤器以200mL/h的进料速度进入泡沫分离塔中，生物细胞被截留在发酵罐(100)中继续发酵。当1.5h后，分离塔内液体达到300mL，开启泡沫分离系统，在32℃，通气量50mL/min进行泡沫分离，分离塔上部接收液为多粘菌素E的浓缩液。而后为保持分离塔的装液量不变，开启回流阀(5)将含有营养物质的泡沫分离余液回流进入发酵罐(100)中，循环进行14h，直至发酵结束。发酵结束测得总效价比耦合前提高21％，浓缩液富集比为3.5，用DNS法检测消泡液中葡萄糖含量为1.322g/L，表明原材料利用率高；在发酵和分离过程中未添加有毒害的物质，且本身不产生新的污染源；应用此装置设备简单，投资少，能耗低可以降低分离成本。
实施例2
将种子液以10％的接种量接种到经过高温灭菌处理的1.8L的发酵罐(100)内，发酵罐(100)装液量为1.4L，培养温度34℃、搅拌转速300r/min、通气量200mL/min。发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸铵10g/L，硫酸亚铁0.1g/L，氨水调节初始pH为7，115-121℃高压蒸汽灭菌15-30min。在此条件下发酵36h后，检测菌体含量达到4.01g/L，多粘菌素E含量达到4712U/mL。此时打开出料阀(4)、进料蠕动泵(6)和分离塔外侧的的数显恒温水浴装置及恒温水浴进水口(306)和恒温水浴出水口(307)，将发酵液通过膜过滤器以200mL/h的进料速度进入泡沫分离塔中，生物细胞被截留在发酵罐(100)中继续发酵。当1.5h后，分离塔内液体达到300mL，开启泡沫分离系统，在32℃，通气量100mL/min进行泡沫分离，分离塔上部接收液为多粘菌素E的浓缩液。而后为保持分离塔的装液量不变，开启回流阀(5)将含有营养物质的泡沫分离余液回流进入发酵罐(100)中，循环进行12h，直至发酵结束。发酵结束测得总效价比耦合前提高23％，浓缩液富集比为3.2。
实施例3
将种子液以10％的接种量接种到经过高温灭菌处理的1.8L的发酵罐(100)内，发酵罐(100)装液量为1.3L，培养温度32℃、搅拌转速250r/min、通气量200mL/min。发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸铵10g/L，硫酸亚铁0.1g/L，氨水调节初始pH为7，115-121℃高压蒸汽灭菌15-30min。在此条件下发酵33h后，检测菌体含量达到4.24g/L，多粘菌素E含量达到4901U/mL。此时打开出料阀(4)、进料蠕动泵(6)和分离塔外侧的的数显恒温水浴装置及恒温水浴进水口(306)和恒温水浴出水口(307)，将发酵液通过膜过滤器以200mL/h的进料速度进入泡沫分离塔中，生物细胞被截留在发酵罐(100)中继续发酵。当1.5h后，分离塔内液体达到300mL，开启泡沫分离系统，在32℃，通气量100mL/min进行泡沫分离，分离塔上部接收液为多粘菌素E的浓缩液。而后为保持分离塔的装液量不变，开启回流阀(5)将含有营养物质的泡沫分离余液回流进入发酵罐(100)中，循环进行14h，直至发酵结束。发酵结束测得总效价比耦合前提高22％，浓缩液富集比为3.3。
本发明未尽事宜为公知技术。

Claims (6)

1.一种微生物发酵与泡沫分离技术耦合生产多粘菌素E的方法，其特征在于包括如下步骤：
a)菌种活化：将从冷冻甘油管中得到的多粘芽孢杆菌菌液，接种于斜面培养基中进行活化，30℃，培养65～75h；
b)种子培养：将活化后的菌种接种到含种子培养基的种子瓶中，在32℃培养24h，得到种子液，准备进入微生物发酵与泡沫分离技术耦合生产多粘菌素E的联合装置进行下一步骤；
c)发酵培养：将上步得到的种子液以10％的接种量首先接种到装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度30-35℃、搅拌转速100-400r/min、通气量100-300mL/min，多粘芽孢杆菌在发酵培养基中发酵培养得到富含多粘菌素E的发酵液；培养基装液量为发酵罐容积的60～85％；
d)微孔滤膜过滤：多粘芽孢杆菌在发酵罐中发酵培养，发酵30-40h后，启动发酵罐内部的膜过滤器，发酵液中的产物分子和部分培养基通过膜过滤器，通过蠕动泵以100-300mL/h的速度进入发酵罐外部的泡沫分离塔中，生物细胞被截留在发酵罐内继续发酵；
e)泡沫分离：分离塔内的液体体积累积到塔体积的25～40％后，开启分离系统进行泡沫分离，其中，通气量为50-150mL/min，温度为30-35℃，顶部接收液体形成多粘菌素E的浓缩液，而后为保持分离塔的装液量不变，开启回流阀将富有营养物质的泡沫分离余液回流进入发酵罐中，循环进行，直至发酵结束。
2.如权利要求1所述的微生物发酵与泡沫分离技术耦合生产多粘菌素E的方法，其特征在于所述的步骤(a)中多粘芽孢杆菌的斜面培养基的组成及制备方法包括：葡萄糖10g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨1g/L，氯化钠1g/L，琼脂15g/L，氨水调节pH到7，115-121℃高压蒸汽灭菌15-30min。
3.如权利要求1所述的微生物发酵与泡沫分离技术耦合生产多粘菌素E的方法，其特征在于所述的步骤(b)中多粘芽孢杆菌的种子培养基的组成及制备方法包括：葡萄糖20g/L，酵母粉40g/L，氯化钠1g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，氨水调节pH到6.8，115-121℃高压蒸汽灭菌15-30min。
4.如权利要求1所述的微生物发酵与泡沫分离技术耦合生产多粘菌素E的方法，其特征在于所述的步骤(c)中多粘芽孢杆菌的发酵培养基的组成及制备方法包括：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠1g/L，磷酸二氢钾0.1g/L，硫酸铵10g/L，硫酸亚铁0.1g/L，氨水调节初始pH为7，115-121℃高压蒸汽灭菌15-30min。
5.如权利要求1所述的微生物发酵与泡沫分离技术耦合生产多粘菌素E的方法，其特征为所述的联合装置，包括生物反应器、膜过滤器、泡沫分离塔、出料阀、回流阀、蠕动泵；
所述的生物反应器包括：发酵罐、恒温测速磁力搅拌器、原料罐、pH计、鼓气泵、进料阀、真空泵；
其中，膜过滤器设置在发酵罐的右侧下方罐壁出料口处，发酵罐中物料经过膜过滤器的过滤后，通过出料口经出料阀通过蠕动泵与泡沫分离塔右侧进料口相连；泡沫分离塔的底部从回流口经回流阀与发酵罐的进料口相连；所述的膜过滤器内设置有微孔滤膜材料。
其中原料罐通过进料阀与发酵罐左侧下方相连；所述的发酵罐出料口与泡沫分离塔进料口相连接；发酵罐进料口与泡沫分离塔回流口相连接；
所述的泡沫分离塔包括：泡沫分离塔柱、气泡分布器、消泡液、恒温水浴进水口、恒温水浴出水口；
泡沫分离塔柱底部连接有气泡分布器和回流口；所述的回流口经回流阀与发酵罐进料口相连接；所述的进料口经蠕动泵与发酵罐出料口相连接；所述的泡沫分离塔顶部设置有产物接收装置消泡液；所述的恒温水浴进水口设置在泡沫分离塔柱外侧套管左侧下方，恒温水浴出水口设置在泡沫分离塔柱外侧套管右侧上方，恒温水浴进水口和恒温水浴出水口与数显恒温水浴相连接。
6.如权利要求5所述的微生物发酵与泡沫分离技术耦合生产多粘菌素E的方法，其特征为为所述的联合装置中，膜过滤器中使用的微孔滤膜材料为0.45μm的纤维素无机膜。
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