CN102796675A

CN102796675A - 一种粘红酵母油脂基因工程菌及其构建方法和应用

Info

Publication number: CN102796675A
Application number: CN2012102220187A
Authority: CN
Inventors: 孙晗笑; 王一杨; 李智; 孙晗蓄; 冯丽霞; 孙长伟; 匡超; 周瑞秒
Original assignee: NANYANG QIWEI MICROECOLOGY GENE SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd
Current assignee: Guangzhou abduction Biotechnology Co., Ltd.
Priority date: 2012-06-29
Filing date: 2012-06-29
Publication date: 2012-11-28
Anticipated expiration: 2032-06-29
Also published as: CN102796675B

Abstract

本发明涉及一种粘红酵母油脂基因工程菌及其构建方法和应用，其基因工程菌的构建方法主要利用粘红酵母rDNA为同源整合的靶序列，将酿酒酵母的强启动子基因PGK1和卷毛枝霉的苹果酸酶基因ME构建成表达载体引入粘红酵母，使ME基因在粘红酵母体内获得高效表达，转化株脂质含量较野生菌株提高2.5倍。本发明在了解微生物油脂合成代谢的基础上，通过导入脂质合成代谢的关键酶基因和强启动子，将为调控脂质代谢，提高油脂产量。该基因工程菌株可应用于微生物油脂的生产和功能性油脂相关产品的开发，如药品，保健品等。

Description

一种粘红酵母油脂基因工程菌及其构建方法和应用

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种粘红酵母高产油脂基因工程菌的构建方法。

背景技术

粘红酵母（Rhodotorula glutinis(Fres.)Harrison）是一种重要的产油微生物，可以产生微生物油脂和其他活性物质，类胡萝卜素，L-苯丙氨酸，SOD等，并在一定条件下，产生α-丙氨酸和谷氨酸。由于其营养要求简单、粗放，可用蔗渣、废糖蜜等作为培养基质，成本较低。尤其是其脂质含量明显高于其他产油微生物，近年来人们越来越专注于其产油功能的开发研究，并对其发酵工艺进行了研究，使粘红酵母产油量获得了一定的提高。但是靠外在的生长环境的改变使其产油量获得更高的提升显然不现实。

目前对于产油粘红酵母基因工程改造方面的研究较为匮乏，还未见有文献报道将产油相关基因导入粘红酵母内表达，对于粘红酵母基因工程改造的资料也几乎处于空白。产油微生物油脂合成代谢调控过程有两个关键酶，柠檬酸裂解酶（ACL）和苹果酸酶(ME）（Adams IP,et al.The distinctiveness of ATP:citratelyase from Aspergillus nidulans.Biochem Biophys Acta，2002），大量研究表明，产油微生物油脂积累的多少与ME的代谢调控有关，如果ME受到抑制，则油脂积累下降。这是因为虽然微生物代谢途径中有许多生成NADPH的过程，但FAS几乎只能利用由ME产生的NADPH（Wynn JP,etal.The role ofmalic enzymein the regulation of lipid accumulation in filamentous fungi.Microbiology,1999）。研究表明，以卷枝毛霉为模式有机体，在苹果酸酶活性的特异性抑制剂芝麻酚的作用下，其脂肪积累量从25%下降到2%，而其菌体生长没有任何负面的影响(Song Y,et al.A pregenetic study of the isoforms of malic enzyme associated with lipid accumulation in Mucor circinelloides.Microbiology,2001.)。进一步证实了ME的活性与脂肪积累量之间存在直接的相关性。因此，如果能鉴定和分离产油微生物的ME基因，就可以利用基因工程手段甚至化学生物学手段选择性调控苹果酸酶的活性，提高微生物产油能力。rDNA在酵母基因组中有100-200个重复单元(Scopione RC,et al.A new promoter probe vector for Saccharomtee scerevisiae using fungal glucoamylase cDNA as the reporter gene.Yeast,1993.)，以rDNA为同源整合的靶顺序构建的载体，既克服了通常整合载体只有单拷贝或几个拷贝的局限，同时又保留整合载体稳定性好的特点，所以是一类用于表达外源基因理想的载体系统。目前这种策略已成功在多种微生物中构建并实现表达应用，如Bacillus subtilis、Saccharomy cerevisiae、Pichia pastoris、Candida albicans、Kluyveromyces lactis、Phaffa rhodozyma、Hansenula Polymorpha、Arxula adeninivorans等(Jens K,Cornelis PH,etal.Integration of heterologous genes in several yeast species using vectors containing a Hansenula polymorpha-derived rDNA-targeting element.FEMS Yeast Research,2003；Mahadtanapuk S,etal.Cloning of antifungal gene from Bacillus licheniformis by application of low energy ion beam bombardment.Surface&Coatings Technology,2009.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种粘红酵母野生菌株（Rhodotorulaglutinis）。

本发明的目的还在于提供一种粘红酵母野生菌株的构建方法，以提高粘红酵母的产油量。

本发明的目的还在于提供了一种粘红酵母野生菌株的应用。

为了实现上述目的，本发明的技术方案采用了粘红酵母GM4（Rhodotorula glutinis GM4），于2012年6月5日保藏在位于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为:CCTCC NO:M 2012203。

本发明的技术方案还在于采用了一种粘红酵母高产油脂基因工程菌的构建方法，利用粘红酵母rDNA为同源整合的靶序列，将酿酒酵母的强启动子基因PGKl和卷枝毛霉的苹果酸酶基因ME构建成表达载体引入粘红酵母，使ME基因在粘红酵母体内获得高效表达，其基因工程菌的构建的具体步骤如下：

A、目的基因的获取：

（1）采用珠磨与酚氯仿结合法提取粘红酵母的总基因组DNA；将提取的总DNA纯化后点样于1%琼脂糖凝胶电泳验证，此基因组模板分装后于-20℃保存，并用于后序的PCR反应；根据粘红酵母基因组中rDNA的保守序列设计了两对引物扩增26SrDNA D1/D2片段和5.8SrDNA-ITS片段；

（2）以卷枝毛霉基因组为模板，根据Genbank数据库中苹果酸酶同源保守的氨基酸序列设计简并引物，引物设计如下:

Fr5'-AATCATTCCTCTCTCGAGCTCTCAACAGAAATGTCG-3' 如SEQ IDNO.2所示

Rr5'-CTATATTGCGGCCGCTACTACAACTACAATTTACCAGC-3' 如SEQ IDNO.3所示

PCR扩增得到大小为2.1kb的ME基因片段，通过A-T克隆插入pMD-T质粒载体，获得pMD-ME，转入E.coli DH5α，筛选阳性转化子，经XhoI和NotI消化转入pPICZ-E，构建pPICZ-ME载体；

（3）强启动子PGK1的获取及载体的构建

提取酿酒酵母YS58基因组DNA，根据PGK1基因保守序列设计引物扩增启动子PGK1基因，引物设计如下:

Fr：5'-ACTGAATTCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC-3' 如SEQ IDNO.4所示

EcoRI

Rr：5'-TATGGATCCTGTTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAG-3' 如SEQ IDNO.5所示

BamHI

将PCR扩增的PGKI基因纯化后直接与pMD18-T载体连接，连接产物经乙醇沉淀纯化后电转化感受态细胞DH5a，经验证结果为阳性的克隆再抽提质粒进行酶切验证；

B、同源重组表达载体pPICZ-rD-ME的构建

将ME基因酶切连接到质粒pPICZ-rD上，构建多顺反子并与抗性基因Zeocin共用一个PGK1启动子和CYC1终止子；构建的同源重组载体pPICZ-rD-ME转化粘红酵母菌，能整合到染色体上，便可同时表达ME基因和抗性基因。

步骤（1）扩增26SrDNA D1/D2片段的一对引物为：

26SrDNA D1/D2 NL-1：5'-CGCGGATCCGTAGGTCGAAACAGAACA-3' 如SEQ IDNO.6所示

26SrDNA D1/D2 NL-4：5'-TGCTCTAGAGAAAGTAACATCCCAATG-3'。如SEQ IDNO.7所示

步骤（1）扩增5.8SrDNA-ITS片段的一对引物为：

5.8SrDNA-ITS(1):

5'-CTGCAGAACCAATGCATTGGTCCGTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3' 如SEQ IDNO.8所示

5.8SrDNA-ITS(2):

5'-GAAGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。如SEQ IDNO.9所示

所述的A中步骤3）中在含有氨节青霉素、x-Gal、IPTG的LB平板上筛选白色菌落进行菌落PCR验证，验证结果为阳性的克隆。

rDNA的PCR扩增条件：

94℃预变性5min，94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸1min，此过程共计35个循环，最后72℃延伸10min。

rDNA的PCR扩增反应体系：

B.PGK1的PCR扩增条件为：

94℃预变性4min，94℃变性1min，54℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。

PGK1的PCR扩增反应体系为：

C.ME基因的PCR扩增条件为：

94℃预变性5min，94℃变性lmin，544℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。

ME基因的PCR扩增反应体系为：

同源重组载体pPICZ-rD-ME的基因序列表如SEQ IDNO.1所示。

首先通过利用XhoI和NotI双酶切同源重组载体pPICZ-rD-ME。

表1 重组载体pPICZ-rD-ME的双酶切体系

酶切反应在37℃水浴反应3h。

载体pPICZ-rD-ME双酶切体系的回收纯化采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和PCR产物直接纯化试剂盒纯化回收。

本发明的技术方案还采用了一种粘红酵母的筛选和培养方法,其方法的具体步骤如下：

1）粘红酵母筛选：菌株初筛采用孟加拉红培养基，发酵培养采用YPD培养基，并通过苏丹黑染色法进行产油量的初筛；通过热酸-有机溶剂法进一步定量确定候选菌株的产油量高低；两轮筛选之后，获得一株高产油脂菌株，通过形态学生理生化鉴定，初步判断这是一株酵母菌；通过测定其26SrDNAD1/D2区域序列，进一步确定该微生物为粘红酵母；

2）粘红酵母培养条件：将粘红酵母保藏斜面移接到活化培养基上，28℃培养48h之后，挑2环接入装有50mL液体种子培养基的250mL三角瓶中，28℃振荡培养24h，然后按10%的接种量接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于28℃振荡发酵96h，发酵结束经离心收集菌体。

所述粘红酵母筛选过程中26SrDNAD1/D2区域序列为序列表中的SEQ IDNO.1。

所述粘红酵母培养中活化培养基为：酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH值为6.8~7.2。

所述粘红酵母培养中液体种子培养基为：酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖4%，KH₂PO₄0.7%，Na₂HPO₄0.25%，MgSO₄.7H₂O0.15%，pH值为6.8~7.2。

所述粘红酵母培养中发酵培养基为：酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖4%，KH₂PO₄0.7%，Na₂HPO₄0.25%，MgSO₄.7H₂O0.15%，CaCl₂0.015%，FeCl₃.6H₂O0.015%，ZnSO₄.7H₂O0.002%，MnSO₄.H₂O0.006%，(NH4)₂SO₄0.05%，pH6.0。

本发明的技术方案还采用了一种粘红酵母高产油脂基因工程菌（Rhodotorula glutinis）在生产微生物油脂方面的应用。

另外，本发明的技术方案还采用了一种粘红酵母高产油脂基因工程菌（Rhodotorula glutinis）在生产功能性油脂方面的应用。

通过5L发酵罐小试培养，表明导入ME和PGK1后的粘红酵母菌，相对于野生菌株，其苹果酸酶活性提高了3.6倍，脂质含量从27%提高到68%，生物量从15%提高到33%。同时，脂质积累的稳定期，转化菌株较野生菌株提前5.5小时，而脂质积累的稳定期也相对野生菌株延长了2小时。转化菌株的脂肪酸代谢中不饱和脂肪酸含量尤其是Y-亚麻酸的含量增加显著，提高了13%。转化菌株在非选择培养条件下，连续生长50世代质粒稳定性为99.86%。由此可见，该基因工程菌株能够在强启动子PGK1带动下稳定地表达外源基因ME，从而实现脂质在粘红酵母内的快速积累。

发酵罐小试培养的具体的实验操作过程：

①首先发酵培养基的配制：酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖4%，pH6.0，装样量为4L。

②对发酵培养基进行灭菌处理，121℃灭菌30min。

③灭菌结束，设定培养条件：30℃，180rpm，空气流量为每分钟0.5个罐体体积。并通过2mol.L-1的KOH或2mol.L-1的HCl自动添加使pH维持在5.5~6.5。

④按10%接种量的接种量接入粘红酵母种子培养液。培养96h。

⑤发酵结束，管式离心机18000rpm离心收集菌体。测定生物量和脂质含量。

本发明主要根据酵母较易发生同源重组的特点，利用染色体DNA中多拷贝串联的两段rDNA单位序列作为整合载体同源重组靶位点，以提高外源基因在酵母基因组中的拷贝数，构建出兼具多拷贝数和高稳定性双重优点的新型整合型载体。通过本发明的提供了一种构建rDNA介导的多拷贝整合表达载体，以适用对粘红酵母野生株的分子生物学操作，提高外源基因的稳定性和表达水平。在了解微生物油脂合成代谢的基础上，通过导入脂质合成代谢的关键酶基因和强启动子，能够调控脂质代谢，提高油脂产量。

本发明的粘红酵母高产油脂基因工程菌是应用粘红酵母工程菌株生产微生物油脂：微生物油脂可以广泛应用于生物柴油的生产。生物柴油是以动植物油脂为原料生产的柴油替代品，基本成分是脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。来源麦麸、秸秆、玉米等有机农作物。生物柴油燃料是一种高脂酸甲烷，它是通过以不饱和油酸C18为主要成分的甘油脂分解而获得的。与常规柴油相比，生物柴油具有下述无法比拟的性能：

（1）具有优良的环保特性

（2）具有较好的低温发动机启动性能

（3）具有较好的润滑性能

（4）具有较好的安全性能

（5）具有良好的燃料性能

（6）具有可再生性能

（7）无须改动柴油机，可直接添加使用，同时无需另添设加油设备、储存设备及人员的特殊技术训练

（8）生物柴油以一定比例与石化柴油调和使用，可以降低油耗、提高动力性，并降低尾气污染

另外，本发明的粘红酵母高产油脂基因工程菌应用粘红酵母工程菌株生产功能性油脂，可制成相关保健品和药品：功能性油脂是一类对人体健康具有重要作用的脂质，主要是一些多不饱和脂肪酸，目前多不饱和脂肪酸主要来源于动植物油脂，因而产量不高，受到季节，原料和生长周期等的影响较大。而微生物油脂因其生产和提取较为便捷，生产方便，成本低廉，克服了动植物油脂来源单一和高昂的缺点。

说明书附图

图1为粘红酵母菌落图（孟加拉红平板）;

图2为粘红酵母菌落图（LB平板）;

图3为胶回收载体pPICZ-rD-ME双酶切目的片段；图中1、2、3为目的片段，经测定，其大小为2.1kb左右，与ME基因大小相吻合。可以确定该目的基因ME也成功插入载体；

图4为载体构建流程图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明作具体的说明。

实施例1

本发明所用的微生物为粘红酵母野生菌株，为本发明人从自然界筛选获得，其具体的筛选方法为：菌株初筛采用孟加拉红培养基（蛋白胨5g,葡萄糖10g,磷酸二氢钾1g,硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g,琼脂20g,1/3000孟加拉红溶液100mL,蒸馏水1000mL,氯霉素0.1g。），发酵培养采用YPD培养基（1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖），并通过苏丹黑染色法进行产油量的初筛；通过热酸-有机溶剂法进一步定量确定候选菌株的产油量高低；两轮筛选之后，获得一株高产油脂菌株，通过形态学生理生化鉴定，初步判断这是一株酵母菌；通过测定其26SrDNA D1/D2区域序列，进一步确定该微生物为粘红酵母。

1）粘红酵母生理生化特性:在孟加拉红培养基（图1）上生长，菌体形态为卵圆形，菌落凸起，边缘整齐，菌落橙红或微带橘红色，表面可由光滑到褶皱，有光泽，菌落正背面颜色一致。多边芽殖，有明显的红色或黄色色素，因生荚膜而形成粘质状菌落，无酒精发酵能力，可产生脂肪。

2）粘红酵母培养条件：将粘红酵母保藏斜面移接到活化培养基（酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖2%，琼脂2%，自然pH）上，28℃培养48h之后，挑2环接入装有50mL液体种子培养基（酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖2%，自然pH）的250mL三角瓶中，28℃振荡（150rpm）培养24h，然后按10%的接种量接入装有50mL发酵培养基（酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖4%，pH6.0）的250mL三角瓶中，于28℃振荡（150rpm）发酵96h。发酵结束经离心收集菌体并测定生物量和脂质含量。

粘红酵母生理生化特性:在LB培养基（图2）上生长，菌体形态为卵圆形，直径3~5mm，菌落凸起，边缘整齐，菌落橘红色或黄色，表面可由光滑带有光泽，菌落正背面颜色一致。在LB平板上生长的菌落相对于孟加拉红平板上生长的菌落要小。多边芽殖，有明显的红色或黄色色素，因生荚膜而形成粘质状菌落，无酒精发酵能力，可产生脂肪。

发酵结束经离心收集菌体并测定生物量和脂质含量测定生物量和脂质含量:

实施例2

粘红酵母基因工程菌构建过程的具体步骤如下：

A、目的基因的获取：

（1）粘红酵母基因组DNA提取方法参见Omega公司E.Z.N.A.TM Yeast DNA Kit说明书。采用改良的珠磨与酚氯仿结合法提取粘红酵母的总基因组DNA。将提取的总DNA纯化后点样于1%琼脂糖凝胶电泳验证，此基因组模板分装后-20℃保存，并用于后序的PCR反应。根据粘红酵母基因组中rDNA的保守序列设计了两对引物扩增26SrDNA D1/D2片段和5.8SrDNA-ITS片段。

（2）以卷枝毛霉（Mucor circinelloides）基因组为模板，根据Genbank数据库中苹果酸酶同源保守的氨基酸序列设计简并引物，

Fr5'-A ATCATTCCTCTCTCGAGCTCTCAACAGAAATGTCG-3'

Rr5'-CTATATTGCGGCCGCTACTACAACTACAATTTACCAGC-3'

PCR扩增得到大小为2.1kb的ME基因片段，通过A-T克隆插入pMD-T质粒载体，获得pMD-ME，转入E.coli DH5α，筛选阳性转化子。经XhoI和NotI消化转入pPICZ-E，构建pPICZ-ME载体。

（3）强启动子PGK1的获取及载体的构建

提取酿酒酵母YS58基因组DNA，根据PGK1基因保守序列设计引物扩增启动子PGK1基因，引物设计如下：

Fr：5'-ACTGAATTCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC-3'

EcoRI

Rr：5'-TATGGATCCTGTTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAG-3'

BamHI

将PCR扩增的PGKI基因纯化后直接与pMD18-T载体连接，连接产物经乙醇沉淀纯化后电转化感受态细胞DH5a。在含有氨节青霉素+x-Gal+IPTG的LB平板上筛选白色菌落进行菌落PCR验证，验证结果为阳性的克隆再抽提质粒进行酶切验证。

B、同源重组表达载体pPICZ-rD-ME的构建

将ME基因酶切连接到质粒pPICZ-rD上，构建多顺反子并与抗性基因Zeocin共用一个PGK1启动子和CYC1终止子。构建的同源重组载体pPICZ-rD-ME转化粘红酵母菌，能整合到染色体上，便可同时表达ME基因和抗性基因。

实施例3

本实施例为粘红酵母高产油脂基因工程菌（Rhodotorula glutinis）在生产微生物油脂方面的应用,包括两部分：微生物菌种发酵和油脂提取两个阶段，其中，第一阶段，微生物菌种发酵是采用大规模高密度纳米材料浓缩液半连续发酵技术，将纳米材料浓缩发酵液高密度半连续发酵技术大规模发酵菌株，菌株的生物量及产油量较普通发酵方法高30倍左右，纳米材料的浓缩液应用保证了原料的充分利用和有效供氧问题，同时发酵液的浓缩降低了后续处理的难度，半连续发酵方式延长了菌株的生命力。这一高效新型发酵法在并不增加原材料成本的前提下，明显提高了得率。具体发酵方法采用专利名称：微纳米泡发生装置及用该发生装置的发酵装置和发酵方法，申请号：201110183816.9所公开的方法，通过采样测定OD值，确定其菌体生长状况，以及时补料，提高油脂产率；第二阶段：油脂提取，发酵后油脂提取采用酯交换法，将常用甲醇等低碳醇作为酯交换剂，NaOH和KOH等碱性物质，或H2SO4和H3PO4等酸性物质作为酯交换法催化剂，反应生成脂肪酸甲酯，其主要成分为脂肪酸三甘油酯的微生物油脂，在催化作用下与甲醇等低碳醇同时进行酯化与转酯化作用，生成脂肪酸甲酯（即生物柴油），同时副产出价值较高的甘油。

实施例4

本实施例为粘红酵母高产油脂基因工程菌（Rhodotorula glutinis）在生产功能性油脂方面的应用，具体为：将实施例3制备得到的微生物油脂在50℃的温度下预热后20分钟，预热后的微生物油脂置于反应罐中，每克油脂中甲醇加入量为5.7~7.4mL；打开搅拌器并每毫升油脂中加入10~15mg的氢氧化钠（在反应中作为催化剂）使之混合反应；控制反应温度为55℃，离心机分离；上层为脂肪酸甲酯（微生物柴油），下层为反应副产物甘油，过滤掉甘油，分离出微生物柴油，将所分离的产品用70℃左右的热水清洗3-5次，然后水浴蒸出多余的甲醇，最后在真空干燥去除微生物柴油中的水分，即得到浅黄色的微生物柴油。

功能性油脂主要是不饱和脂肪酸。功能性油脂提取采用尿素包合法进行提取。在装有搅拌器和回流冷凝管的四口烧瓶中，加入预定量的尿素和预定体积的溶剂。开启电源加热回流，待尿素完全溶解后再加入预热到50℃作用的生物柴油，然后在65~70℃回流50min。倒入烧杯，用塑料薄膜封口后，于包合温度下放置一定时间进行包合。将尿素包合物及其溶液用真空抽滤泵，分为滤液和滤饼。滤液在35℃减压蒸馏回收溶剂，用温水洗涤2~3次，直至油相呈清澈透明状，用无水硫酸钠干燥，即得不饱和脂肪酸甲酯透明液体。

利用气相色谱对提取的脂肪酸进行成分提纯鉴定，色谱条件如下：FID检测器，色谱柱PEG50m（0.32×50m），柱温280℃，进样温度300℃，气化温度300℃，检测温度280℃，进样量0.6μL，计算方法为面积归一法。结果见表一

表1 粘红酵母工程菌油脂脂肪酸组成及相对含量分析

本发明的菌株获得的微生物油脂具有许多生理功能，被广泛应用于食品、医药、化工等领域。可以直接添加使用，或作为药品原料使用。

(1)在食品领域的应用

食品营养强化剂PUFAS是人体必需的营养物质，可作为营养强化剂应用于各种食品(如婴幼儿奶粉、鲜奶、饮料、饼干等)的营养强化，在婴幼儿和青少年的身体发育特别是智力发育提供必需脂肪酸。在婴幼儿食品配方中添加不饱和脂肪酸是婴幼儿配方食品的发展趋势。本方法提取的ARA及DHA可以直接添加到婴儿和孕妇食品中。

(2)在医药领域的应用

多不饱和脂肪酸（PUFAS）中ARA是前列腺素的直接前体，通过本方法提取的ARA可以作为合成前列腺素的原料。

(3)在生物柴油生产领域的应用

本发明的菌株获得的微生物油脂可以直接代替植物油及动物脂肪，通过前面提到的酯交换法转化生产生物柴油。可以直接应用于燃料柴油使用。

SEQ IDNO.1

〈110〉南阳奇伟微生态基因科技开发有限公司

〈120〉一种粘红酵母油脂基因工程菌及其构建方法和应用

〈160〉

〈210〉

〈211>535bp

〈212>DNA

〈213〉

〈400〉1

GGAAGAGCTC AAATTTATAA TCTGGCACCT TCGGTGTCCG AGTTGTAATC 50

TCTAGAAGTG TTTTCCGCGT TGGACCGCAC ACAAGTCTGT TGGAATACAG 100

CGGCATAGTG GTGAAACCCC CGTATATGGT GCGGACGCCC AGCGCTTTGT 150

GATACACTTT CAATGAGTCG AGTTGTTTGG GAATGCAGCT CAAATTGGGT 200

GGTAAATTCC ATCTAAAGCT AAATATTGGC GAGAGACCGA TAGCGAACAA 250

GTACCGTGAG GGAAAGATGA AAAGCACTTT GGAAAGAGAG TTAACAGTAC 300

GTGAAATTGT TGGAAGGGAA ACGCTTGAAG TCAGACTTGC TTGCCGGAGC 350

TTGCTTCGGT TTGCAGGCCA GCATCAGTTT TCCGGGGTGG ATAATGACGG 400

TTTGAAGGTA GCAGTCTCGG CTGTGTTATA GCTTTCCGTT GGATACGCCC 450

TGGGGGACTG AGGAACGCAG CGTGCTTTTT GCGAAAGACT CGTCTTTTTC 500

ACGCTTAGGA TGCTGGTGGA ATGGCTTTAA ACGAC 535

<210>2

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物 Fr1

AATCATTCCTCTCTCGAGCTCTCAACAGAAATGTCG 36

<210>3

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物Rr1

CTATATTGCGGCCGCTACTACAACTACAATTTACCAGC 38

<210>4

<211>33

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物Fr2

ACTGAATTCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC 33

<210>5

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物Rr2

TATGGATCCTGTTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAG 35

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物26SrDNA D1/D2 NL-1

CGCGGATCCGTAGGTCGAAACAGAACA 27

<210>7

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物26SrDNA D1/D2 NL-4

TGCTCTAGAGAAAGTAACATCCCAATG 27

<210>8

<211>43

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物25.8SrDNA-ITS(1)

CTGCAGAACCAATGCATTGGTCCGTCCGTAGGTGAACCTGCGG 43

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<221>引物5.8SrDNA-ITS(2)

GAAGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC 28

Claims

1.一种粘红酵母高产油脂基因工程菌GM4（Rhodotorula glutinis），其特征在于：保藏编号为:CCTCC NO:M2012203。

2.一种如权利要求1所述的粘红酵母高产油脂基因工程菌的构建方法，其特征在于：利用粘红酵母rDNA为同源整合的靶序列，将酿酒酵母的强启动子基因PGK1和卷枝毛霉的苹果酸酶基因ME构建成表达载体引入粘红酵母，使ME基因在粘红酵母体内获得高效表达，其基因工程菌构建的具体步骤如下：

A、目的基因的获取：

Fr1 5'-AATCATTCCTCTCTCGAGCTCTCAACAGAAATGTCG-3'

Rr1 5'-CTATATTGCGGCCGCTACTACAACTACAATTTACCAGC-3'

PCR扩增得到大小为2.1kb的ME基因片段，通过A-T克隆插入pMD-T质粒

载体，获得pMD-ME，转入E.coli DH5α，筛选阳性转化子，经XhoI和NotI消化转入pPICZ-E，构建pPICZ-ME载体；

（3）强启动子PGK1的获取及载体的构建

Fr2：5'-ACTGAATTCTATTTAGATTCCTGACTTCAACTC-3'

EcoRI

Rr2：5'-TATGGATCCTGTTTTTATATTTGTTGAAAAAGTAG-3'

BamHI

B、同源重组表达载体pPICZ-rD-ME的构建

3.根据权利要求2所述的粘红酵母高产油脂基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤（1）扩增26SrDNA D1/D2片段的一对引物为：

26SrDNA D1/D2 NL-1：5'-CGCGGATCCGTAGGTCGAAACAGAACA-3'

26SrDNA D1/D2 NL-4：5'-TGCTCTAGAGAAAGTAACATCCCAATG-3'。

4.根据权利要求2所述的粘红酵母高产油脂基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤（1）扩增5.8SrDNA-ITS片段的一对引物为：

5.8SrDNA-ITS(1):

5'-CTGCAGAACCAATGCATTGGTCCGTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'

5.8SrDNA-ITS(2):

5'-GAAGATCTTCCTCCGCTTATTGATATGC-3'。

5.根据权利要求2所述的构建方法,其特征在于：所述的A中步骤(3）中在含有氨苄青霉素、x-Gal、IPTG的LB平板上筛选白色菌落进行菌落PCR验证，验证结果为阳性的克隆。

6.一种粘红酵母的培养方法,其特征在于：其方法的具体步骤如下：

7.根据权利要求6所述的培养方法，其特征在于：所述粘红酵母培养中发酵培养基为：酵母粉1%，蛋白胨1%，葡萄糖4%，KH₂PO₄0.7%，Na₂HPO₄0.25%，MgSO₄.7H₂O0.15%，CaCl₂0.015%，FeCl₃.6H₂O0.015%，ZnSO₄.7H₂O0.002%，MnSO₄.H₂O0.006%，(NH₄)₂SO₄0.05%，pH6.0。

8.一种如权利要求1所述的粘红酵母高产油脂基因工程菌（Rhodotorula glutinis）在生产微生物油脂方面的应用。

9.一种如权利要求1所述的粘红酵母高产油脂基因工程菌（Rhodotorula glutinis）在生产功能性油脂方面的应用。

10.一种如权利要求1所述的粘红酵母高产油脂基因工程菌（Rhodotorula glutinis）在食品方面的应用。