CN101638676B - 一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是有关于一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，包括以下步骤：酶的制备，即对酵母菌培养、发酵获得发酵液；发酵液的分离纯化，获得酶浓缩液；酶的固定化，即先将载体加入酶浓缩液中并进行孵育，再经清洗获得固化酶；酯交换反应，即丙三醇与多不饱和脂肪酸乙酯在固化酶作用下反应，制得甘油三酯；甘油三酯的提纯。本发明一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，工艺比较简单，成本较低且反应转化率较高。
Description
技术领域
本发明涉及利用微生物和化学原料制备深海鱼油营养物质替代物的方法，特别是涉及一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法。
背景技术
经研究发现，二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等多不饱和脂肪酸(PUFA)在神经系统发育、预防心脑血管疾病、抗炎免疫、抗癌、维护视网膜健康等方面可以发挥重要作用。而PUFA不能由人体合成，因此，现有技术多是将深海鱼油中的多不饱和脂肪酸甘油三酯提取并制成保健品、药品等再补充到人体。随着我国心脑血管疾病发病率的逐年升高，多不饱和脂肪酸甘油三酯的开发和推广应用，对于改善我国人民健康，延长寿命具有重要作用和深刻的社会效益。目前，我国市场上EPA和DHA产品主要以其乙酯形式应用，其特点是制备工艺成熟，但该形式产品存在着功能上的缺陷：
1、乙酯型鱼油脂肪酸被小肠吸收进入人体后易作为供能的物质基础而被氧化，影响了鱼油的保健功效。
2、乙酯型产品在胃肠道分解成形成乙醇，对乙醇耐受性差的人易引起一些不良反应，如过敏症，尤其是不适宜儿童。
3、长期以脂肪酸、乙醇为膳食来源，易引起人体内甘油的缺失或不足，从而拉动人体糖代谢，这样易造成人体内糖代谢的不平衡而产生一定的副作用。
天然甘油三酯型鱼油吻合了人们的吸收机能，是人体吸收鱼油的最佳形式。国际市场对EPA和DHA的需求主要是多不饱和脂肪酸乙酯混合物及甘油酯形式，其制备工艺复杂，但是技术含量大大增加，产品价值很高。
石红旗、刘澄凡等研究了脂肪酶催化水解法制备多不饱和脂肪酸甘油酯产品的工艺方法，以国产解脂假丝酵母(Candida lipalytica Lipase)脂肪酶为菌种，在选定脂肪酶的情况下，试验了反应温度、反应时间、酶用量、油水比、乳化剂种类等影响水解反应的主要因素，提出了鱼油水解的适宜条件为：脂肪酶用量300u/g油，乳化剂为Ca(OH)2，油水比为0.4mL/g油，45℃下搅拌12h。用本工艺制得的富含DHA的甘油酯产品中，DHA和EPA含量分别为34.0％和13.9％，总含量为47.9％。
吴可克研究了假丝酶母脂肪酶催化鱼选择性水解反应，确定了油水比、脂肪酶浓度、反应温度、pH、激活剂、溶剂、反应时间、水解率等因素对反应的影响，同时对鱼油水解产物进行了分离和检测，使EPA、DHA在甘油脂型产品中含量达到50％以上。
上述的多不饱和脂肪酸甘油三酯的制造方法，虽可制备出具有较好功效的多不饱和脂肪酸甘油三酯产品，确实具有进步性，但是在实际使用时却发现其工艺过于复杂，甘油三酯酶催化生产过程中酶试剂的成本较高高、反应转化率较低且分离纯化比较困难，因而未能达到最佳的使用效果。
由此可见，上述现有的多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法显然仍存在有不便与缺陷，而亟待加以进一步改进。如何能创设一种工艺比较简单，成本较低且反应转化率较高的新的多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，实属当前的重要研究课题之一，也是当前业界极需改进的目标。
发明内容
本发明的目的在于，克服现有的多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法存在的缺陷，而提供一种新型结构的多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，所要解决的技术问题是使其工艺比较简单，成本较低且反应转化率较高，从而更加适于实用。
本发明的目的及解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。依据本发明提出的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，包括以下步骤：酶的制备，即对酵母菌培养、发酵获得发酵液；发酵液的分离纯化，获得酶浓缩液；酶的固定化，即先将载体加入酶浓缩液中并进行孵育，再经清洗获得固化酶；酯交换反应，即丙三醇与多不饱和脂肪酸乙酯在固化酶作用下反应，制得甘油三酯；甘油三酯的提纯。
本发明的目的及解决其技术问题还可采用以下技术措施进一步实现。
前述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，所述的酯交换反应是指：在间歇式酶反应器中加入质量比1∶6-8∶0.6-0.7的丙三醇、多烯酸乙酯与固化酶，并加入占丙三醇、多烯酸乙酯与固化酶总质量8％的油酸钾作为均相化试剂，温度为25-30℃，初始水活度为0.40-0.50，反应6-8h制得甘油三酯。
前述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，所述的酶的固定化包括：按照酶液活力与载体质量比为8000∶1U/g，把载体加入酶浓缩液中；在20-30℃、摇床反应器80r/min转速下、孵育8-10h固定化；吸去酶液，用pH8.0 0.1mol/L的磷酸缓冲液清洗，所得固化酶于4℃保存。
前述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，所述的载体经以下方法制得：混合体积比为1∶0.4-0.5∶0.7-0.8∶0.7-0.8的甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙烯基苯、甲苯和正庚烷，以10g/L的比例将粒径小于80nm的纳米碳酸钙加入上述混合液中，并置于搅拌器中反复搅拌混合，再置于65℃恒温反应器中反应12h；所得固体经粉碎后，筛分收集0.3-0.45mm粒径的颗粒，用乙醇抽提20-24h，然后用0.1mol/L的HCl于常温、搅拌状态下浸泡70-72h，并且每隔24h换1次HCl；最后用去离子水冲洗至中性，制得的载体密封湿态保存。
前述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，所述的酶的固定化之前，还包括载体的活化步骤，即将载体于65℃下用0.1mol/L HCl水解12h；用去离子水冲洗至中性，以每2.0kg载体加入100L 10％的戊二醛酸性溶液的比例，在室温下于反应器中搅拌反应12h；用去离子水洗去戊二醛，所得载体置于4℃保存。
前述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，所述的酶的制备包括以下步骤：将酵母菌在斜面培养基上活化4小时；以体积百分比10％的接种量接种至装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，种子培养基初始pH为5.0，培养温度25-30℃，再置于HYG-II型回转式恒温调速摇瓶柜中，转速220r/min，培养时间为20h；把种子培养液按体积分数10％的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度28-30℃，搅拌转速300r/min，通气量4.0L/min，pH为6.0，发酵时间28h。
前述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，所述的斜面培养基为YPD培养基；种子培养基的成分为2g/L的酵母膏、5g/L的豆油、1g/L的K2HPO4、0.1g/L的MgSO4·7H2O、以及0.5g/L的NaCl；发酵培养基的成分为3g/L的酵母膏、20g/L的豆油、1g/L的K2HPO4、0.1g/L的MgSO4·7H2O、以及0.5g/L的NaCl。
前述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，所述的发酵液的分离纯化是指：将发酵液经5000rpm离心30min，室温下，用截留分子量为20000的PU-20K-PS管式超滤膜系统处理，膜面积为0.186m2，膜前压力为1.2MPa，膜后压力为0.15MPa，pH为6.0～7.0，分离获得酶浓缩液。
前述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，所述的甘油三酯的提纯是指：酯交换反应结束后，在搅拌状态下滴入占物料质量0.96％的浓度为85％的浓H3PO4，维持搅拌35min；所得的混合物在釜温160℃、真空度0.5-0.7Pa下分子蒸馏5-7h；残留物加入2％的活性炭脱色，在氮气保护下加热至110-120℃，搅拌30-40min后，冷却至室温；板框抽滤除去活性炭、磷酸盐后得到多不饱和脂肪酸甘油三酯。
前述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，所述的酵母菌为假丝酵母菌种。
本发明与现有技术相比至少具有以下明显的优点和有益效果：本发明一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，工艺比较简单，成本较低且反应转化率较高，对我国鱼类资源的充分利用和推动海洋药物产业的发展都有重要的意义，并具有可观的经济效益，在实用性及成本效益上，完全符合产业发展所需，相当具有产业利用价值。
综上所述，本发明一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，工艺比较简单，成本较低且反应转化率较高。本发明具有上述诸多优点及实用价值，较现有技术有较大的改进和显著的进步，从而更加适于实用，并具有广泛的产业利用价值。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，特举较佳实施例详细说明如下。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合较佳实施例，详细说明本发明一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法的具体实施方式、生产方法、步骤、特征及其功效。
本发明一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法包括以下步骤：
步骤一，酶的制备，即对酵母菌培养、发酵获得发酵液。
具体来说，酶的制备包括以下步骤：
将酵母菌再斜面培养基上活化4小时；
以体积百分比10％的接种量接种至装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，种子培养基初始pH为5.0，培养温度25-30℃，再置于HYG-II型回转式恒温调速摇瓶柜，转速220r/min，培养时间为20h；
把种子培养液按体积分数10％的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度28-30℃，搅拌转速300r/min，通气量4.0L/min，pH为6.0，发酵时间28h。
较佳的，酵母菌选用假丝酵母菌种(Candida sp.，YGB03-02，北京禹光生物科学研究中心保藏和提供)；斜面培养基为YPD培养基(YeastExtract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)；种子培养基的成分为2g/L的酵母膏、5g/L的豆油、1g/L的K2HPO4、0.1g/L的MgSO4·7H2O、以及0.5g/L的NaCl；发酵培养基的成分为3g/L的酵母膏、20g/L的豆油、1g/L的K2HPO4、0.1g/L的MgSO4·7H2O、以及0.5g/L的NaCl。
步骤二，发酵液的分离纯化，获得酶浓缩液。
具体来说，是将发酵液经5000rpm离心30min，室温下，用截留分子量为20000的PU-20K-PS管式超滤膜系统处理，膜面积为0.186m2，调节膜前压力为1.2MPa，膜后压力为0.15MPa，pH为6.0～7.0，分离获得酶浓缩液。
步骤三，酶的固定化，即先将载体加入酶浓缩液中并进行孵育，再经清洗获得固化酶。
其中，载体是通过以下方法制得：混合体积比为1∶0.4-0.5∶0.7-0.8∶0.7-0.8的甲基丙烯酸缩水甘油酯，二乙烯基苯，甲苯和正庚烷，以10g/L的比例将粒径小于80nm的纳米碳酸钙加入上述混合液中，并置于搅拌器中反复搅拌混合，再置于65℃恒温反应器中反应12h。所得固体经粉碎后，筛分收集0.3-0.45mm粒径的颗粒，用乙醇抽提20-24h，然后用适量的0.1mol/L HCl于常温、搅拌状态下浸泡70-72h，并且每隔24h换1次HCl，以除去碳酸钙。最后用去离子水冲洗至中性。制得的载体密封湿态保存。
酶的固定化之前，先将载体活化，具体操作方法为：将载体于65℃下用0.1mol/L HCl水解12h。用去离子水冲洗至中性，以每2.0kg载体加入100L 10％的戊二醛酸性溶液的比例，在室温下于反应器中搅拌反应12h。用去离子水洗去戊二醛，所得载体置于4℃保存待用。
酶的固定化的具体反应条件为：按照酶液活力与载体质量比为8000∶1(U/g)，把载体加入酶浓缩液中。在20-30℃、摇床反应器80r/min转速下、孵育8-10h。吸去酶液，用pH8.0 0.1mol/L的磷酸缓冲液清洗，直到洗液以考马斯亮蓝法判断不含蛋白、即不含脂肪酶为止。所得固化酶于4℃保存。
步骤四，酯交换反应，即丙三醇与多不饱和脂肪酸乙酯在固化酶作用下反应，制得甘油三酯。
具体是指，在间歇式酶反应器中加入质量比1∶6-8∶0.6-0.7的丙三醇、多烯酸乙酯与固化酶，并加入占丙三醇、多烯酸乙酯与固化酶总质量8％的油酸钾作为均相化试剂，温度为25-30℃，初始水活度为0.40-0.50，反应时间为6-8h，根据以下反应式制得甘油三酯
步骤五，甘油三酯的提纯。
具体是指，在酯交换反应结束后，在搅拌状态下滴加入占物料质量0.96％的浓度为85％的浓H3PO4，维持搅拌35min。此时，加入的磷酸与油酸钾形成磷酸盐析出，将上述反应所得的混合物进行分子蒸馏，蒸馏条件为釜温160℃，真空度0.5-0.7Pa，蒸馏5-7h。残留物加入2％的活性炭脱色，在氮气保护下加热至110-120℃，搅拌维持30-40min后，冷却至室温。板框抽滤除去活性炭、磷酸盐后得到黄色澄清的多不饱和脂肪酸甘油三酯。
以下，例举部分具体实施例，以对本发明生产方法的具体步骤做进一步说明。
实施例1
步骤一，酶的制备
菌种：假丝酵母菌种(Candida sp.)YGB03-02，北京禹光生物科学研究中心保藏和提供；
斜面培养基：YPD培养基
种子培养基(g·L-1)：酵母膏2，豆油5，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O 0.1，NaCl 0.5。
发酵培养基(g·L-1)：酵母膏3，豆油20，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O 0.1，NaCl 0.5。
斜面种子活化4小时后，以体积分数10％的接种量接种至装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，培养基初始pH为5.0，培养温度25℃，HYG-II型回转式恒温调速摇瓶柜，转速220r/min，培养时间为20h。把种子培养液按体积分数10％的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度28℃，搅拌转速300r/min，通气量4.0L/min，pH为6.0，发酵时间28h。
步骤二，发酵液的分离纯化
发酵液经5000rpm离心30min，室温下，用截留分子量为20000的PU-20K-PS管式超滤膜系统处理，膜面积为0.186m2。调节膜前压力为1.2MPa，膜后压力为0.15MPa，pH为6.0。
步骤三，酶的固定化
3.1载体的制备
称取甲基丙烯酸缩水甘油酯，二乙烯基苯，甲苯和正庚烷，使它们的体积比为1∶0.4∶0.7∶0.7，称取纳米碳酸钙(粒径小于80nm)，以10g/L的比例与上述液体一起放于搅拌器中，反复搅拌混合后，置于65℃恒温反应器中反应12h。所得固体经粉碎后，筛分收集0.3mm粒径的颗粒，用乙醇抽提20h，然后用适量的0.1mol/L HCl于常温、搅拌状态下浸泡70h，并且每隔24h换1次HCl，以除去碳酸钙，最后用去离子水冲洗至中性，密封湿态保存。
3.2载体的活化
载体于65℃下用0.1mol/L HCl水解12h，用去离子水冲洗至中性，以每2.0kg载体加入100L 10％的戊二醛酸性溶液，室温下于反应器中搅拌反应12h，用去离子水洗去戊二醛，所得载体置于4℃保存。
3.3酶的固定化
把载体加入酶浓缩液，室温下，在摇床反应器中80r/min转速下，孵育8h，吸去酶液，用pH8.0磷酸缓冲液(0.1mol/L)清洗固定化酶载体，直到洗液中不含脂肪酶为止，所得固化酶于4℃保存。
其中，固定化条件为温度20℃、固定化时间8h、酶液活力与载体质量比为8000∶1(U/g)。
步骤四，酯交换反应
在间歇式酶反应器中加入丙三醇、多烯酸乙酯与固化酶，质量比为1∶6∶0.6，再加入占物料质量8％的油酸钾作为均相化试剂，反应时间为6h，温度为25℃，初始水活度为0.40。
步骤五，甘油三酯的提纯
酯交换反应结束后，在搅拌状态下滴加入85％的浓H3PO4，维持搅拌35min，此时，加入的磷酸与油酸钾形成磷酸盐析出，将上述反应所得的混合物进行分子蒸馏，蒸馏条件：釜温160℃，真空度0.5Pa，蒸馏5h，残留物加入2％的活性炭脱色，在氮气保护下加热至110℃，搅拌，维持30min，冷却至室温。板框抽滤除去活性炭、磷酸盐后得到黄色澄清的多不饱和脂肪酸甘油三酯。
以下通过试验测定本实施例制得产品的性能：
(1)以甘油测定试剂盒测定丙三醇的含量，将本实施例制得的产品中丙三醇的含量记为b，反应前丙三醇的量记为a，根据公式v＝(a-b)/a算得甘油酯的转化率为67.6％，且产品多不饱和脂肪酸甘油三酯连续生产性能稳定。
(2)以分子排阻色谱法测定多不饱和脂肪酸甘油三酯产品中单酸和二酸甘油酯含量为43％。
(3)以多不饱和脂肪酸甘油三酯中EPA和DHA的气相色谱测定方法，测定二者总含量为52％。
实施例2
步骤一，酶的制备
菌种：假丝酵母菌种(Candida sp.)YGB03-02，北京禹光生物科学研究中心保藏和提供；
斜面培养基：YPD培养基
种子培养基(g·L-1)：酵母膏2，豆油5，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O 0.1，NaCl 0.5。
发酵培养基(g·L-1)：酵母膏3，豆油20，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O 0.1，NaCl 0.5。
斜面种子活化4小时后，以体积分数10％的接种量接种至装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，培养基初始pH为5.0，培养温度28℃，HYG-II型回转式恒温调速摇瓶柜，转速220r/min，培养时间为20h。把种子培养液按体积分数10％的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度29℃，搅拌转速300r/min，通气量4.0L/min，pH为6.0，发酵时间28h。
步骤二，酶的分离纯化
发酵液经5000rpm离心30min，室温下，用截留分子量为20000的PU-20K-PS管式超滤膜系统处理，膜面积为0.186m2。调节膜前压力为1.2MPa，膜后压力为0.15MPa，pH为6.5。
步骤三，酶的固定化
3.1载体的制备
称取甲基丙烯酸缩水甘油酯，二乙烯基苯，甲苯和正庚烷，使它们的体积比为1∶0.45∶0.75∶0.75，称取纳米碳酸钙(粒径小于80nm)，以1％的比例与上述液体一起放于搅拌器中，反复搅拌混合后，置于65℃恒温反应器中反应12h。所得固体经粉碎后，筛分收集0.3-0.45mm粒径的颗粒，用乙醇抽提22h，然后用适量的0.1mol/L HCl于常温、搅拌状态下浸泡71h，并且每隔24h换1次HCl，以除去碳酸钙，最后用去离子水冲洗至中性，密封湿态保存。
3.2载体的活化
载体于65℃下用0.1mol/L HCl水解12h，用去离子水冲洗至中性，以每2.0kg载体加入100L 10％的戊二醛酸性溶液，室温下于反应器中搅拌反应12h，用去离子水洗去戊二醛，所得载体置于4℃保存。
3.3酶的固定化
把载体加入酶浓缩液，室温下，在摇床反应器中80r/min转速下，孵育9h，吸去酶液，用pH8.0磷酸缓冲液(0.1mol/L)清洗固定化酶载体，直到洗液中不含脂肪酶为止，所得固化酶于4℃保存。
固定化条件为温度25℃、固定化时间9h、酶液活力与载体质量比为8000∶1(U/g)。
步骤四，酯交换反应
在间歇式酶反应器中加入重量比1∶7∶0.65的丙三醇、多烯酸乙酯与固化酶，再加入占物料质量8％的油酸钾作为均相化试剂，反应时间为7h，温度为28℃，初始水活度为0.45。
步骤五，甘油三酯的提纯
酯交换反应结束后，在搅拌状态下滴加入85％的浓H3PO4，维持搅拌35min，此时，加入的磷酸与油酸钾形成磷酸盐析出，将上述反应所得的混合物进行分子蒸馏，蒸馏条件：釜温160℃，真空度0.6Pa，蒸馏6h，残留物加入2％的活性炭脱色，在氮气保护下加热至115℃，搅拌，维持35min，冷却至室温。板框抽滤除去活性炭、磷酸盐后得到黄色澄清的多不饱和脂肪酸甘油三酯。
本次结果：
(1)多不饱和脂肪酸甘油三酯连续生产性能稳定，甘油酯转化率达69.0％。
(2)分子排阻色谱法测定多不饱和脂肪酸甘油三酯产品中单酸和二酸甘油酯含量为48.3％；
(3)多不饱和脂肪酸甘油三酯中EPA和DHA的气相色谱测定方法，二者总含量为45.6％。
实施例3
步骤一，酶的制备
菌种：假丝酵母菌种(Candida sp.)YGB03-02，北京禹光生物科学研究中心保藏和提供；
斜面培养基：YPD培养基
种子培养基(g·L-1)：酵母膏2，豆油5，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O 0.1，NaCl 0.5。
发酵培养基(g·L-1)：酵母膏3，豆油20，K2HPO4 1，MgSO4·7H2O 0.1，NaCl 0.5。
斜面种子活化4小时后，以体积分数10％的接种量接种至装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，培养基初始pH为5.0，培养温度30℃，HYG-II型回转式恒温调速摇瓶柜，转速220r/min，培养时间为20h。把种子培养液按体积分数10％的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度30℃，搅拌转速300r/min，通气量4.0L/min，pH为6.0，发酵时间28h。
步骤二，酶的分离纯化
发酵液经5000rpm离心30min，室温下，用截留分子量为20000的PU-20K-PS管式超滤膜系统处理，膜面积为0.186m2。调节膜前压力为1.2MPa，膜后压力为0.15MPa，pH为7.0。
步骤三，酶的固定化
3.1载体的制备
称取甲基丙烯酸缩水甘油酯，二乙烯基苯，甲苯和正庚烷，使它们的体积比为1∶0.5∶0.8∶0.8，称取纳米碳酸钙(粒径小于80nm)，以1％的比例与上述液体一起放于搅拌器中，反复搅拌混合后，置于65℃恒温反应器中反应12h。所得固体经粉碎后，筛分收集0.3-0.45mm粒径的颗粒，用乙醇抽提24h，然后用适量的0.1mol/L HCl于常温、搅拌状态下浸泡72h，并且每隔24h换1次HCl，以除去碳酸钙，最后用去离子水冲洗至中性，密封湿态保存。
3.2载体的活化
载体于65℃下用0.1mol/L HCl水解12h，用去离子水冲洗至中性，以每2.0kg载体加入100L 10％的戊二醛酸性溶液，室温下于反应器中搅拌反应12h，用去离子水洗去戊二醛，所得载体置于4℃保存。
3.3酶的固定化
把载体加入酶浓缩液，室温下，在摇床反应器中80r/min转速下，孵育10h，吸去酶液，用pH8.0磷酸缓冲液(0.1mol/L)清洗固定化酶载体，直到洗液中不含脂肪酶为止，所得固化酶于4℃保存。
固定化条件为温度30℃、固定化时间10h、酶液活力与载体质量比为8000∶1(U/g)。
步骤四，酯交换反应
在间歇式酶反应器中加入重量比1∶8∶0.7的丙三醇、多烯酸乙酯与固化酶，再加入占物料质量8％的油酸钾作为均相化试剂，反应时间为8h，温度为30℃，初始水活度为0.50。
步骤五，甘油三酯的提纯
酯交换反应结束后，在搅拌状态下滴加入85％的浓H3PO4，维持搅拌35min，此时，加入的磷酸与油酸钾形成磷酸盐析出，将上述反应所得的混合物进行分子蒸馏，蒸馏条件：釜温160℃，真空度0.7Pa，蒸馏7h，残留物加入2％的活性炭脱色，在氮气保护下加热至120℃，搅拌，维持40min，冷却至室温。板框抽滤除去活性炭、磷酸盐后得到黄色澄清的多不饱和脂肪酸甘油三酯。
本次结果：
(1)多不饱和脂肪酸甘油三酯连续生产性能稳定，甘油酯转化率达64.9％。
(2)分子排阻色谱法测定多不饱和脂肪酸甘油三酯产品中单酸和二酸甘油酯含量为45.6％；
(3)多不饱和脂肪酸甘油三酯中EPA和DHA的气相色谱测定方法，二者总含量为53.3％。
由上述具体实施例可知，本发明一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，工艺比较简单，成本较低，并具有反应转化率高、多不饱和脂肪酸甘油三酯连续生产性能稳定、产品有效含量高等优点，适于业界广泛推广使用。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，任何熟悉本专业的技术人员，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (6)
1.一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，其特征在于包括以下步骤：
酶的制备，具体包括
将假丝酵母菌在YPD培养基上活化4小时，
以体积百分比10％的接种量接种至装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，种子培养基的成分为2g/L的酵母膏、5g/L的豆油、1g/L的K2HPO4、0.1g/L的MgSO4·7H2O、以及0.5g/L的NaCl，初始pH为5.0，培养温度25-30℃，再置于HYG-II型回转式恒温调速摇瓶柜中，转速220r/min，培养时间为20h，
把种子培养液按体积分数10％的接种量接种至装有发酵培养基的发酵罐中，发酵培养基的成分为3g/L的酵母膏、20g/L的豆油、1g/L的K2HPO4、0.1g/L的MgSO4·7H2O、以及0.5g/L的NaCl，培养温度28-30℃，搅拌转速300r/min，通气量4.0L/min，pH为6.0，发酵时间28h，获得发酵液；
发酵液的分离纯化，即将发酵液经5000rpm离心30min，室温下，用截留分子量为20000的PU-20K-PS管式超滤膜系统处理，膜面积为0.186m2，膜前压力为1.2MPa，膜后压力为0.15MPa，pH为6.0～7.0，分离获得酶浓缩液；
酶的固定化，即先将载体加入酶浓缩液中并进行孵育，再经清洗获得固化酶；
酯交换反应，即丙三醇与多不饱和脂肪酸乙酯在固化酶作用下反应，制得多不饱和脂肪酸甘油三酯；
多不饱和脂肪酸甘油三酯的提纯。
2.根据权利要求1所述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，其特征在于所述的酯交换反应是指：
在间歇式酶反应器中加入质量比1∶6-8∶0.6-0.7的丙三醇、多不饱和脂肪酸乙酯与固化酶，并加入占丙三醇、多不饱和脂肪酸乙酯与固化酶总 质量8％的油酸钾作为均相化试剂，温度为25-30℃，初始水活度为0.40-0.50，反应6-8h制得多不饱和脂肪酸甘油三酯。
3.根据权利要求1所述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，其特征在于所述的酶的固定化包括：
按照酶液活力与载体质量比为8000∶1U/g，把载体加入酶浓缩液中；
在20-30℃、摇床反应器80r/min转速下、孵育8-10h固定化；
吸去酶液，用pH8.0 0.1mol/L的磷酸缓冲液清洗，所得固化酶于4℃保存。
4.根据权利要求1所述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，其特征在于所述的载体经以下方法制得：
混合体积比为1∶0.4-0.5∶0.7-0.8∶0.7-0.8的甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙烯基苯、甲苯和正庚烷，以10g/L的比例将粒径小于80nm的纳米碳酸钙加入上述混合液中，并置于搅拌器中反复搅拌混合，再置于65℃恒温反应器中反应12h；
所得固体经粉碎后，筛分收集0.3-0.45mm粒径的颗粒，用乙醇抽提20-24h，然后用0.1mol/L的HCl于常温、搅拌状态下浸泡70-72h，并且每隔24h换1次HCl；
最后用去离子水冲洗至中性，制得的载体密封湿态保存。
5.根据权利要求4所述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，其特征在于所述的酶的固定化之前，还包括载体的活化步骤，即
将载体于65℃下用0.1mol/L HCl水解12h；
用去离子水冲洗至中性，以每2.0kg载体加入100L 10％的戊二醛酸性溶液的比例，在室温下于反应器中搅拌反应12h；
用去离子水洗去戊二醛，所得载体置于4℃保存。
6.根据权利要求1所述的一种多不饱和脂肪酸甘油三酯的生产方法，其特征在于所述的甘油三酯的提纯包括：
酯交换反应结束后，在搅拌状态下滴入占物料质量0.96％的浓度为85％的浓H3PO4，维持搅拌35min；
所得的混合物在釜温160℃、真空度0.5-0.7Pa下分子蒸馏5-7h；
残留物加入2％的活性炭脱色，在氮气保护下加热至110-120℃，搅拌30-40min后，冷却至室温；
板框抽滤除去活性炭、磷酸盐后得到多不饱和脂肪酸甘油三酯。
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| 全文琴.ω-3多不饱和脂肪酸甘油酯富集的研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》.2009,(第3期),摘要,正文5-9页. * |
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