CN105039282B - 一种脂肪酶及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是提供一种脂肪酶及其应用，即从寡养单胞菌发酵粗酶液中分离纯化的脂肪酶，其氨基酸序列为SEQ？ID？NO:1。本发明的脂肪酶合成的DHA甘油酯不含饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸等低效成分，合成产物中甘油酯含量高，且催化合成过程时间短，在产品品质和合成效率方面具有较明显的优势。

Description

一种脂肪酶及其应用
技术领域
本发明属于功能酶技术领域，具体涉及一种脂肪酶及其应用。
背景技术
脂肪酶(LipaseE.C.3.1.1.3)是一类特殊的界面酯酶，能够水解甘油三酯的酯键产生脂肪酸、二酸甘油酯、单酸甘油酯及甘油，其天然底物一般是不溶于水的长链脂肪酸酰基酯。在非水反应体系中脂肪酶还能够催化其逆反应，发生酯化反应、酯交换反应、醇解反应、酸解反应以及氨解反应等。微生物脂肪酶由于其种类多、生产周期短、便于结构修饰，且相比动植物脂肪酶具有更加广泛的温度、pH适应性，广泛的底物特异性，高度的位置选择性和异构体选择性，催化活性高，副反应少等特点使其广泛应用于食品加工、新型生物材料、生物传感器、生物医学、手性药物拆分等领域。同时微生物脂肪酶催化的条件温和性和环境友好性，已经改变了传统的酯化或转酯化反应所需要的高温、强酸、强碱等相对苛刻的条件，在提高生产效率的同时减少了对环境的污染，所以从自然界中筛选具有特异性活力的脂肪酶是非常有必要的。
发明内容
本发明的目的是提供一种脂肪酶及其应用，即从寡养单胞菌发酵粗酶液中分离纯化的脂肪酶，从而弥补现有技术的不足。
本发明的脂肪酶，包含有：
1)氨基酸序列为SEQIDNO:1的多肽，
2)与1)中的多肽具有85％以上序列同一性，且具有1)中酶学功能的，由1)所衍生的多肽。
作为优选，所述的2)中的多肽与1)中的多肽具有90％以上序列同一性；更进一步的，具有95％以上序列同一性。
本发明还提供编码上述脂肪酶的核酸，其一种具体的序列为SEQIDNO:2；
上述的脂肪酶是从寡养单胞菌中分离纯化得到，其SDS-PAGE电泳分子量大小为22kDa。
上述的脂肪酶，Fe3+和SDS能够完全抑制酶活，Cu2+，Zn2+，Al3+，Mn2+以及H2O2(1％，v/v)，Phenol(5％，w/v)能够部分抑制酶活。
上述的脂肪酶，其最适的pH为7-8；在pH5-12的范围内4℃放置过夜能够保持80％以上的活力。
上述的脂肪酶，其最适的反应温度为40℃；在10-40℃范围内放置1h能够维持80％以上的活力。
本发明还提供一种重组微生物，用于重组表达上述的脂肪酶。
本发明脂肪酶用于以甘油和DHA乙酯为底物转酯合成DHA甘油酯。
相比较于现有的利用脂肪酶催化法制备DHA产品的工艺：EPA浓缩油和DHA浓缩油的制造方法(CN101765662A)、一种脂肪酶催化合成鱼油乙酯的方法(CN101979622A)、高纯度DHA藻油乙酯及其转化为甘油酯的制备方法(CN103880672A)，利用本发明的脂肪酶合成的DHA甘油酯不含饱和脂肪酸及单不饱和脂肪酸等低效成分，合成产物中甘油酯含量高，且催化合成过程时间短，在产品品质和合成效率方面具有较明显的优势。
附图说明
图1：本发明的脂肪酶纯化过程电泳图；其中泳道1为蛋白Marker，泳道2为SephadexG-75分离样品，泳道3为DEAESepharoseFastFlow分离样品，泳道4为80％硫酸铵沉淀透析液，泳道5为发酵粗酶液。
图2：本发明的脂肪酶最适pH及pH稳定性示意图；1为最适pH示意图，2为pH稳定性示意图。
图3：本发明的脂肪酶最适温度及温度稳定性示意；1为最适温度示意图，2为温度稳定性示意图。
图4：本发明克隆脂肪酶基因PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；泳道1为PCR扩增产物，泳道2为DNAMarker。
图5：本发明脂肪酶的重组表达电泳示意图；泳道1为蛋白Marker，泳道2为镍柱纯化蛋白，泳道3为重组表达粗酶液。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的酶的分离纯化、酶学性质、克隆表达及应用进行详细的描述。
实施例1：LH15脂肪酶的分离纯化
本发明的酶是从寡养单胞菌(Stenotrophomonassp.)发酵粗酶液中分离纯化，该菌株是本实验从富油土壤中筛选得到的，于2015年03月30日保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(ChinaGeneralMicrobiologicalCultureCollectionCenter,CGMCC)，保藏编号为CGMCCNO.10672。
将寡养单胞菌种子培养液按照2％(v/v)的接种量接种于发酵培养基中，28℃180rpm震荡培养72h，4℃8000rpm离心10min得到发酵粗酶液。
种子培养基：10g/L葡萄糖，7.5g/L牛肉膏，7.5g/L蛋白胨，3g/LNaCl，1g/LMgSO4·7H2O，pH7.0，115℃蒸气灭菌20min。
发酵培养基：10g/L葡萄糖，20g/L酵母粉，5g/L蛋白胨，2g/LK2HPO4，0.5g/LMgSO4·7H2O，pH7.0，115℃蒸气灭菌20min。
离心得到的发酵粗酶液进行80％硫酸铵沉淀。冰水浴保温，磁力搅拌的条件下均匀缓慢地向发酵粗酶液加入粉碎并干燥的硫酸铵。4℃静置过夜后离心收集沉淀，用10mMpH7.5Tris-Hclbuffer复溶沉淀，并在此缓冲液中透析。
用pH8.5的10mMTris-HCl缓冲液充分平衡DEAESepharoseFF离子交换柱(10cm*1.2cm)，上样吸附。然后用pH8.5的10mMTris-HCl含有NaCl(0.1-0.6MNaCl)进行梯度洗脱，3min/管分管收集。对收集管中的溶液测酶活和蛋白质分析。
将上步0.2MNaCl洗脱峰用超滤管超滤浓缩，上样1mL于以平衡好的SephadexG-75FF柱(80cm*1cm),用超纯水洗脱2.5mL/3min分管收集。对收集管中的溶液测酶活和蛋白质分析。
分别测定以上几个步骤样品的酶活力和蛋白质含量并进行SDS-PAGE电泳检测。纯化结果见表1，粗酶液经过几步纯化后，比活从0.57U/mg提高到154.29U/mg，纯化倍数为270.67倍。蛋白电泳结果(图1)表明，纯化后的脂肪酶在电泳上为一条带，分子量约为22kDa。
表1:脂肪酶的纯化步骤及结果
实施例2：LH15脂肪酶的酶学性质
(1)LH15脂肪酶分子量的测定
在SDS-PAGE电泳中蛋白质的迁移率与其相对分子质量的对数成正比。因此可以通过SDS-PAGE测定目标蛋白的相对分子质量。根据SDS-PAGE中标准分子量蛋白和目标蛋白的相对迁移率计算出目的蛋白的相对分子量为22kDa。
(2)LH15脂肪酶的最适pH及pH稳定性
纯化后的脂肪酶在不同的pH下进行酶活测定，结果如图2所示。LH15脂肪酶pH适用范围比较窄，pH7-8为其最适反应pH，低于或者高于这个范围时，酶活减低的比较明显。pH稳定性是将酶液在不同的pH缓冲液中进行10倍稀释，4℃放置过夜，然后在标准条件下测定残余酶活。结果显示在pH5-12的范围内其能够保持80％以上的活力，具有较好的pH稳定性。
(3)LH15脂肪酶最适温度及温度稳定性
纯化后的脂肪酶在不同的温度(10、20、30、40、50℃)下测定酶活，结果如图3所示。LH15脂肪酶最适的反应温度为40℃，当温度低于或高于这个温度点时酶活降低的非常明显。
酶的温度稳定性是将酶在不同的温度(10、20、30、40、50、60℃)中保温，间断时间取样在标准条件下测定酶活，结果见图3。LH15脂肪酶在10-40℃时稳定性较好，保温1h能够维持90％以上的活力。在50℃时酶活力只有对照的50％左右，并且随着保温时间的延长活力逐渐降低。在60℃时纯酶保温15min，残余酶活只有20％左右；随着保温时间的延长，酶活逐渐丧失，60min时已经完全丧失活力。
(4)金属离子及有机试剂对LH15脂肪酶的影响
将纯酶与pH7.4Tris-HCl(0.05mM)缓冲液配置的金属离子溶液和超纯水配置的有机试剂溶液等体积混合，30℃温浴30min后在标准条件下测定残余酶活，结果详见表2。Fe3+和SDS能够完全抑制酶活，Cu2+和Zn2+能够抑制50％左右的酶活，Al3+、Mn2+、H2O2能够抑制40％左右的酶活。10％的Tris能够提高一倍的酶活，同时发现该脂肪酶能够耐受10％的乙醇。
表2：金属离子及有机时间对脂肪酶的影响
实施例3：LH15脂肪酶的克隆
目的基因PCR及酶切回收
引物：5'-CGGGATCCATGCGCAAGACCTCC-3'(BamHI)
5'-CCCAAGCTTTTAGAACTTGAAGACGTACGA-3'(HindIII)
PCR反应体系如表3所示。
表3：PCR反应体系
在冰盒上将各成分添加到200μLEP管中，分装结束后用小型离心机稍微离心，然后进行PCR。PCR扩增程序见表4。
表4：PCR扩增程序
PCR克隆后电泳检测，结果见图4，在琼脂糖凝胶中能够发现很明显的700bp大小左右的条带。将带有酶切位点的目的基因和pET28a质粒进行双酶切。酶切体系20μL，BamHI和HindIII各1μLbufferK2μL，克隆基因及pET28a质粒各16μL，30℃水浴3h后琼脂糖电泳检测、分离并回收，电泳检测结果如图4所示。
扩增基因经核酸测序和序列分析，实验所克隆脂肪酶基因的长度为630bp(SEQIDNO:2，编码的氨基酸序列为SEQIDNO:1)，明显小于大部分已报道脂肪酶的基因长度，申请人通过性质研究后将该基因编码的蛋白定义为脂肪酶。
实施例4：LH15脂肪酶的表达
利用T4DNA连接酶16℃水浴过夜连接，重做质粒的构建及表达参考《分子克隆》。双酶切检测重组子构建是否成功，在琼脂糖凝胶电泳汇总可以明显的发现5400bp和700bp的两个条带，说明重组子构建成功。将构建好的重组质粒转入道BL21表达菌株中表达，ZYP-5052培养基在20℃220rpm震荡培养48h。9000g离心收集菌体，10mLpH7.4PBSbuffer复溶冰浴超声破碎30min(50％功率)。9000g4℃离心30min除去沉淀。测定上清液酶活，并用镍柱对重组表达脂肪酶进行纯化，纯化电泳图见图5。
酶活测定结果如表5所示，LH15脂肪酶在大肠杆菌中能够很好的表达，镍柱纯化结果显示重组后的脂肪酶相对分子质量为26kDa，略大于原始菌株中的酶蛋白。
表5：LH15脂肪酶酶活测定
实施例5：LH15脂肪酶用于DHA甘油酯的合成
DHA乙酯和甘油等质量混合，称取5g混合物于25mL的具塞三角瓶中，加入6％脂肪酶冷冻干粉，50℃水浴震荡反应5h。反应结束后用薄层层析进行分离碘蒸气染色，刮下硅胶板上的DHA甘油酯，用10％浓硫酸-甲醇60℃甲酯化20min，正己烷萃取无水硫酸钠除水，氮气浓缩，气相检测。在INNOWAX石英毛细管柱(Agilent，0.32mm*30m*0.25μm)DHA甲酯的保留时间为21min，根据样品吸收峰面积可以测得DHA甘油酯的含量。经测定在实验条件下，所得产品中DHA乙酯和各DHA甘油酯含量(质量百分比)分别为11.5％(DHA乙酯)、6.7％(DHA单甘脂)、23.2％(DHA二甘酯)和58.6％(DHA三甘酯)。

Claims (2)

1.一种脂肪酶的应用，其特征在于，所述的应用是脂肪酶以甘油和DHA乙酯为底物合成DHA甘油酯的应用；其中脂肪酶的氨基酸序列为SEQIDNO:1。
2.重组微生物用于以甘油和DHA乙酯为底物代谢发酵合成DHA甘油酯的应用，所述的重组微生物用于重组表达氨基酸序列为SEQIDNO:1的脂肪酶。
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