CN103820405A

CN103820405A - 一种通过无细胞蛋白质合成系统表达脂肪酸脱饱和酶的方法

Info

Publication number: CN103820405A
Application number: CN201410056249.4A
Authority: CN
Inventors: 陈海琴; 陈永泉; 陈卫; 陈思; 顾震南; 赵建新; 张灏; 杨芹; 王鸿超
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2014-02-19
Filing date: 2014-02-19
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2034-02-19
Also published as: CN103820405B

Abstract

本发明公开了一种通过无细胞蛋白质合成系统表达脂肪酸脱饱和酶的方法，属于酶工程领域。本发明使用麦胚无细胞蛋白合成系统将来自高山被孢霉（Mortierella alpine）ATCC32222中的ω3脱饱和酶基因（FADS15）进行克隆表达，无需制备mRNA且表达量高，后续纯化步骤简单，为下一步进行该膜蛋白晶体结构和功能研究奠定了基础。

Description

一种通过无细胞蛋白质合成系统表达脂肪酸脱饱和酶的方法

技术领域

本发明涉及一种通过无细胞蛋白质合成系统表达脂肪酸脱饱和酶的方法，属于酶工程技术领域。

背景技术

脂肪酸脱饱和酶是在脂酰碳链上将相邻原子之间单键转化为双键的酶类。它们存在于大多数生物中，如细菌、真菌、植物和动物等，且对于维持这些生物的生物膜的正确结构和功能发挥着重要作用。根据蛋白在细胞内定位的不同，脂肪酸脱饱和酶可以分为两类，可溶或膜结合存在，它们是独立进化的。其中脂酰ACP（Acyl-ACP）是一种可溶性脱饱和酶，主要存在于高等植物质体中，催化与酰基载体蛋白结合的脂肪酸脱饱和；而脂酰CoA（Acyl-CoA）属于膜结合蛋白，目前发现主要存在于真核和原核生物的内膜系统中，主要催化与CoA结合的脂肪酸脱饱和，几乎所有的生物中都存在脱饱和酶，它们最基本的作用是通过改变细胞膜的脂肪酸组成和不饱和度使生物适应外界变化。

多不饱和脂肪酸（PUFAs）是指含有两个或两个以上双键且碳链长度为16～26个碳原子的直链脂肪酸。其中，ω-3系列PUFAs和ω-6系列PUFAs是人体所必需的脂肪酸，其不能在体内源头合成，因此都是通过食物摄取。ω-6系列PUFAs主要在机体免疫方面发挥重要作用，而ω-3系列PUFAs在预防心血管疾病、炎症等方面至关重要。在当前人们的膳食油脂结构中，ω-6/ω-3的比例超过10:1，大大高于人体所需最佳比例，主要是因为在传统的食用植物油如豆油、葵花籽油、花生油中含有较多的ω-6PUFAs，而ω-3PUFAs的含量很低。ω-3PUFAs的传统来源仅限于深海鱼油，随着世界人口的扩张和海洋环境的污染，海洋渔业所提供的ω-3PUFAs正在经受着巨大的压力和潜在的风险。产脂微生物作为一种经济安全的ω-3PUFAs替代资源，正在逐渐成为当前PUFAs领域的研究热点。因此，寻找能将ω-6系列PUFAs转化为ω-3系列PUFAs的方法具有重大意义，在某些微生物中存在的ω3脱饱和酶就是一种将ω-6系类PUFAs转化为ω-3系列PUFAs的关键酶。高山被孢霉是一类油脂量高达细胞干重50%以上的产油真菌，是一株已知的花生四烯酸（AA）的高产菌株。研究发现，该菌株中的ω3脂肪酸脱饱和酶充当着将ω-6系列的PUFAs转化为ω-3系列PUFAs的重要角色，因此对其进行结构和功能的研究具有重要的作用。膜结合脱饱和酶已经被尝试在不同的宿主中表达，如大肠杆菌、酿酒酵母、米曲霉、高山被孢霉以及无细胞蛋白质合成系统，但目前还没有一个膜结合脂肪酸脱饱和酶的晶体结构被解析。其原因主要如下：一、上述方法表达出来的膜蛋白的表达量不能达到进行晶体结构分析的要求；二、膜蛋白难以纯化，纯度不能达到进行晶体结构分析的要求。因此，亟需寻找一种大量合成高纯度膜蛋白的方法。

无细胞蛋白质合成系统是一种新兴的体外蛋白质表达方式，该系统以外源mRNA或DNA为模板，利用细胞抽提物的酶系，通过外源添加氨基酸、RNA聚合酶和能量物质等来表达蛋白质。相比于传统的蛋白质表达系统，无细胞蛋白质合成系统由于不存在细胞膜，为蛋白质合成过程提供了一个开放、通用的环境，有助于灵活控制，快速取样和直接进行操作。其次，无细胞蛋白质合成系统对细胞活性和细胞生长没有要求，可以将能量和底物直接用于生产单一目标蛋白，因此，无细胞蛋白质合成系统作为一种蛋白质高产手段是很理想的为膜蛋白的晶体结构和功能分析提供足量蛋白材料的分析方法。目前对于无细胞蛋白质合成系统在膜蛋白表达方面的研究报导不多，主要是由于膜蛋白的合成需要类似于细胞膜的脂质体参与才能让其进行正确的折叠，因此合适体积和质量的脂质体的加入对于膜蛋白的表达至关重要。Michael A et.al（2008）使用麦胚抽提物无细胞蛋白质翻译合成系统成功翻译、纯化、以及重构得到具有催化活性的人类硬脂酰CoA脱饱和酶复合物，但此方法为采用人工制备的麦胚抽提物，并且仅在翻译系统中使用，需要提取mRNA，实验手段繁杂且难度高，因此，很难进行推广。

本发明旨在为膜结合脂肪酸脱饱和酶的表达提供一种新型高效通用的方法。

发明内容

本发明的目的是针对目前膜结合脂肪酸脱饱和酶表达量低、难以纯化、表达步骤繁杂等问题，将ω3脂肪酸脱饱和酶通过麦胚无细胞蛋白质合成系统进行高效表达，包括构建含编码ω3脂肪酸脱饱和酶的基因的重组质粒、制备脂质体，将重组质粒和脂质体先后加入到麦胚无细胞蛋白质表达系统进行表达。

所述ω3脂肪酸脱饱和酶是来自高山被孢霉（Mortierella alpine）ATCC32222的ω3脂肪酸脱饱和酶（FADS15）。编码所述酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明技术方案主要包括以下步骤：

从高山被孢霉ATCC32222中克隆获得ω3脱饱和酶基因（FADS15），以具有亲和标签的载体pIVEX WG1.4在麦胚无细胞蛋白质合成系统中表达，得到大小正确、高产量的重组蛋白。

上述制备方法的具体步骤如下：

（1）重组质粒的构建：以高山被孢霉ATCC32222基因组为模板，PCR获得编码ω3脂肪酸脱饱和酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；扩增得到的PCR产物、pIVEXWG1.4（购自Roche）经NotI和XhoI酶切连接，转化至大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆子验证后，提取重组质粒，获得的质粒用酚氯仿（苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1，v/v/v）进一步除去残留的RNase；

（2）脂质体的制备：称取0.03g大豆脂质提取物粉末，溶解于适量三氯甲烷中，彻底溶解后用真空蒸发除去三氯甲烷，加入1ml水合缓冲液在55℃搅拌孵育1h，之后超声5-10min至溶液变澄清，即得到浓度30mg/ml的脂质体；所述水合缓冲液含有0.9%NaCl、5%葡萄糖和10%蔗糖；

（3）ω3脂肪酸脱饱和酶的表达：以麦胚抽提物无细胞蛋白质合成试剂盒（RTS100WheatGerm CECF kit）为表达系统，向50μl反应体系中加入步骤（1）纯化得到的1-2μg质粒（纯化后OD_260/280=1.7-1.8），混匀后加入反应槽，于900rpm、24℃反应，反应10.5h后加入1.7-2.5μl步骤（2）制备的脂质体，继续反应5.5h后停止。

（4）ω3脂肪酸脱饱和酶的纯化：取45μl上述反应混合液，加入含25mM Hepes、pH7.4、100mM NaCl和30%甘油的缓冲液至体积为75μl，之后与等体积的80%Accudenz（购自AvantiPolar Lipids，Accudenz溶解于含有25mM Hepes，pH7.4,100mM NaCl和10%甘油的缓冲液中）混合，随后加入350μl30%Accudenz（同上），最后用100μl含25mM Hepes、pH7.4、100mM NaCl的缓冲液覆盖，17000g、4℃超速离心2h，取60μl上清即为纯化蛋白。

本发明中高山被孢霉ATCC32222的ω3脂肪酸脱饱和酶（FADS15）蛋白表达量达1.8mg/mL，仅需加入重组质粒作为模板，无需中间的提取mRNA过程，并且表达的蛋白能利用外源添加的脂质体正确折叠成活性状态，最后表达出来的蛋白只需通过超速离心纯化，克服了膜蛋白表达量低、难以纯化和表达步骤繁杂的难题，为膜蛋白的快速、简便表达提供了一种新方法，且可为下一步对蛋白的晶体结构和功能进行研究奠定基础。

附图说明

图1 携带编码ω3脂肪酸脱饱和酶基因的重组质粒pIVEX WG1.4-FADS15的示意图。

图2 pIVEX WG1.4-FADS15重组质粒验证的琼脂糖凝胶电泳图；M为marker；泳道1为以重组质粒为模板的PCR扩增；泳道2为经NotI和XhoI双酶切的质粒；泳道3是以pIVEXWG1.4为空质粒的阴性对照。

图3 麦胚无细胞蛋白质合成系统表达的ω3脂肪酸脱饱和酶聚丙烯酰胺凝胶电泳图；15P为pIVEX WG1.4-FADS15经麦胚无细胞反应混合物离心后的沉淀；15S为pIVEXWG1.4-FADS15经麦胚无细胞反应后混合物离心后的上清；NP为阴性对照pIVEX WG1.4经麦胚无细胞反应后混合物离心后的沉淀；NS为阴性对照pIVEX WG1.4经麦胚无细胞反应后混合物离心后的沉淀；15M为pIVEX WG1.4-FADS15经麦胚无细胞反应后的混合蛋白；NM为阴性对照pIVEX WG1.4经麦胚无细胞反应后的混合蛋白。

图4 麦胚无细胞蛋白质合成系统表达的ω3脂肪酸脱饱和酶的Western Blot结果；15P为pIVEX WG1.4-FADS15经麦胚无细胞反应后混合物离心后的沉淀；15S为pIVEXWG1.4-FADS15经麦胚无细胞反应后混合物离心后的上清；NP为阴性对照pIVEX WG1.4经麦胚无细胞反应后混合物离心后的沉淀；NS为阴性对照pIVEX WG1.4经麦胚无细胞反应后混合物离心后的沉淀；15M为pIVEX WG1.4-FADS15经麦胚无细胞反应后的混合蛋白；NM为阴性对照pIVEX WG1.4经麦胚无细胞反应后的混合蛋白。

具体实施方式

实施例1 转入高山被孢霉ATCC#32222中ω3脂肪酸脱饱和酶基因FADS15的重组质粒构建

根据高山被孢霉ATCC#32222的ω3脂肪酸脱饱和酶基因（FADS15）序列信息，设计引物P1、P2，下划线部分分别为酶切位点Not I和Xho I，以含有ω3脱饱和酶基因（FADS15）的质粒pET19b-FADS15为模板（本实验室已发表文章Haiqin Chen,Zhennan Gu,Hao Zhang,Mingxuan Wang,Wei Chen,W.Todd Lowther,Yong Q.Chen*.Expression and Purification ofIntegral Membrane Fatty Acid Desaturases.PLoS ONE.2013,8(3):e58139），以引物P₁/P₂，KOD高保真聚合酶，通过PCR对ω3脱饱和酶基因（FADS15）进行扩增。所得ω3脂肪酸脱饱和酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。PCR程序为：95℃30s，60℃30s，68℃90s，30个循环，并对PCR产物进行纯化，纯化产物以及表达载体pIVEX WG1.4经限制性内切酶Not I和Xho I消化，回收后两者以合适的比例进行连接反应。连接产物转化至大肠杆菌DH5α，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB平板进行筛选。挑选阳性转化子，提取质粒，以该重组质粒为模板，进行PCR验证及限制性内切酶Not I和Xho I双酶切验证，验证正确（见图2）后送测序，获得的重组质粒pIVEX WG1.4-FADS15见图1。

P₁（sense）：ATAAGAATGCGGCCGCATGGCACCCCCTCACGTTGTC

P₂（antisense）：GGCGAGCTCCTAATGCTTGTAGAACACTACGTCTCCC

实施例2 添加进无细胞蛋白质合成系统中脂质体的制备

采用购自Avanti Polar Lipids公司的大豆脂质提取物（Soybean Lipid Extract）制备得到有别于药物包埋、可供膜蛋白结合的脂质体。具体制备方法如下：

（1）称取0.03g大豆脂质提取物（Soybean Lipid Extract）粉末，溶解于适量三氯甲烷中，待其充分溶解后，真空旋转蒸发除去三氯甲烷；

（2）向上述蒸发去除了三氯甲烷的混合物中添加1ml水合缓冲液（含有0.9%NaCl，5%葡萄糖，10%蔗糖），55℃搅拌孵育1h，直至溶液变浑浊；

（3）将上述浑浊溶液置于55℃超声5-10min，待溶液由浑浊变澄清即得到浓度30mg/ml脂质体，用于后续实验或者置于-80℃保存。

实施例3 麦胚无细胞蛋白质合成系统表达ω3脂肪酸脱饱和酶

（1）表达载体的制备：将转化有pIVEX WG1.4-FADS15重组质粒的大肠杆菌DH5α进行活化，37℃培养过夜，取20ml菌液提取质粒，使用购自Qiagen公司的质粒中量抽提试剂盒（PlasmidMidiKit）提取质粒，获得的质粒使用酚氯仿（苯酚：氯仿：异戊醇=25:24:1）进一步抽提，以除去其中残留的RNase，最后测定质粒浓度及OD_260/280比值。

（2）蛋白表达：采用Roche公司的麦胚抽提物无细胞蛋白质合成试剂盒（RTS100WheatGerm CECF kit），在50μl反应体系中加入上述纯化质粒量1-2μg左右，将麦胚抽提物、RNA聚合酶、氨基酸等反应混合液混匀后加入反应槽，能量再生混合物、氨基酸等混合物混匀后加入补给槽，覆盖薄膜，注意操作过程中远离RNase污染。将上述反应板置于恒温混匀仪（Eppendorf Thermomixer comfort）上，在900rpm、24℃条件下反应。

（3）脂质体添加：在反应后期，即在反应10.5h时取下反应板，在超净台中用无酶枪头补加1.7-2.5ul实施例2中制备的脂质体，继续在900rpm、24℃条件下反应5.5h结束，将反应液存于-80℃冰箱。

实施例4麦胚抽提物无细胞蛋白质合成系统合成蛋白质的检测

（1）重组蛋白样品制备：在50μl反应完成的麦胚无细胞反应混合物中取样5μl，4℃、13000g离心30min，得到重组蛋白样品的沉淀和上清，分别用50μl-20℃预冷的丙酮在4℃沉淀10min之后，继续在4℃、13000g离心30min，除去上清丙酮，将沉淀置于通风橱至丙酮完全挥发，即沉淀由白色变为无色，此时加入20μl1×蛋白上样缓冲液，100℃煮沸10min，直接上样进行SDS-PAGE分析或置于4℃保存。

（2）SDS-PAGE及Western Blot

将10μl样品在两片12%的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳，80V浓缩25min，再120V分离60～80min。其中一片胶用考马斯亮蓝染色和醋酸-乙醇溶液脱色，在凝胶呈像系统上分析蛋白分布与浓度，另一片胶转移至预先用80%甲醇激活30s的PVDF膜上，采用含有10%甲醇的转膜缓冲液，在4℃、恒压50V转膜6h后，依次结合一抗（抗His抗体）和二抗（Horseradishperoxidase(HRP)-conjugated anti-mouse IgG），最后用增强型荧光试剂盒进行处理及显影。

SDS-PAGE及Western Blot分析结果显示重组蛋白得到顺利表达，分子量为59KDa，表达量经灰度扫描分析达1.8mg/ml（见图3），由于不存在细胞膜的抑制作用，无细胞表达系统相比于细胞表达系统表达膜蛋白时的一般产量提高了近十倍，且Western Blot结果显示总产量中大约有30%的蛋白质是以可溶形式，即有活性状态（见图4）状态存在。此发明的麦胚无细胞蛋白质合成系统为膜蛋白的高效表达提供了选择，也为进一步对膜蛋白进行晶体结构和功能研究提供了奠定了基础。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种表达ω3脂肪酸脱饱和酶的方法，其特征在于，包括构建含编码ω3脂肪酸脱饱和酶的基因的重组质粒、制备脂质体，将重组质粒和脂质体脂质体先后加入到麦胚无细胞蛋白质表达系统表达ω3脂肪酸脱饱和酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，编码所述ω3脂肪酸脱饱和酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重组质粒的构建是以高山被孢霉ATCC32222基因组为模板，PCR获得编码ω3脂肪酸脱饱和酶的基因，将扩增得到的PCR产物、载体pIVEX WG1.4经Not I和Xho I酶切连接，转化至大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆子验证后，提取重组质粒，获得的质粒用酚氯仿进一步除去残留的RNase。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂质体用于帮助蛋白正确折叠。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脂质体的制备是称取0.03g大豆脂质提取物粉末，溶解于适量三氯甲烷中，彻底溶解后用真空蒸发除去三氯甲烷，加入1ml水合缓冲液在55℃搅拌孵育1h，之后超声5-10min至溶液变澄清，即得到30mg/ml的脂质体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述水合缓冲液含有0.9%NaCl、5%葡萄糖和10%蔗糖。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ω3脂肪酸脱饱和酶的表达是以麦胚抽提物无细胞蛋白质合成试剂盒为表达系统，向50μl反应体系中加入纯化得到的1-2μg质粒，混匀后加入反应槽，于900rpm、24℃反应，反应10.5h后加入1.7-2.5μl浓度30mg/ml的脂质体，继续反应5.5h后停止。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所使用的质粒原液的OD_260/280=1.7-1.8。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述脂质体的添加量是2μl。