CN105198983A - 一种利于七次跨膜蛋白ccr5功能性表达的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种利于七次跨膜蛋白CCR5功能性表达的方法，其步骤如下：（1）将CCR5外源DNA模版经编码修饰后，插入到载体上，直接添加到无细胞表达体系中，通过添加DNA转录翻译以及蛋白质表达所必需的氨基酸、能量物质、T7聚合酶和表面活性剂，优化实验条件，来实现蛋白质的体外表达。（2）由于在步骤（1）表达CCR5时，膜蛋白易产生聚集形成包涵体或者产生错误折叠的现象，所以在步骤（1）的同时，加入相对应的分子伴侣，为目标蛋白质的正确折叠提供封闭的疏水环境，使所表达的CCR5能够充分的正确折叠，并且提高膜蛋白的可溶性表达量。本发明中CCR5制备设备工艺简单，适合跨膜蛋白质的快速和高通量表达，活性也得到很好得改善。

Description

一种利于七次跨膜蛋白CCR5功能性表达的方法
技术领域
本发明涉及一种利于七次跨膜蛋白CCR5功能性表达的方法发明，属于分子伴侣辅助的无细胞表达方式高效重组表达膜蛋白的方法。
背景技术
绝大多数膜蛋白在自然组织中的表达量很低，尤其是含有七个疏水跨膜螺旋的膜蛋白，其稳定性和功能受两亲性环境的影响很大，蛋白容易聚集和发生错误折叠，从而导致蛋白样品的有效制备比水溶性蛋白要困难得多。所以，通过大量体外蛋白质再折叠研究来进一步完善包括分子伴侣作用机制在内的膜蛋白折叠理论面临着非常实际的困难。另一方面，由于细胞内环境和生物膜组成相当复杂，通过体内研究探讨膜蛋白折叠过程，确定分子伴侣作用的决定因素也存在相当难度。
无细胞表达体系是高效的体外蛋白表达技术，该体系中含有蛋白质合成所必需的各种主要组分（如核糖体、酶、氨基酸、各种因子等）。进行无细胞表达时，将构建好的表达质粒加入到该体系中，在适宜温度下（一般在30-37℃之间）经几个小时即可实现目标蛋白的高量表达。与传统的细胞表达体系相比，无细胞表达具有操作简便、耗时少、体积小、不产生细胞毒性及体系开放等显著特点。
但由于无细胞表达体系中缺乏生物膜环境，进行包括七次跨膜在内的膜蛋白表达时，需要通过向反应体系中加入表面活性剂来弥补。这样，在膜蛋白无细胞表达过程中，随着新生肽链由核糖体中不断地往外延长，表面活性剂形成的胶束会即时包围新生肽链的跨膜疏水部分，同时也为膜蛋白功能性折叠提供必要的疏水环境；否则，膜蛋白新生肽链会很快聚集变性并发生沉降。大量研究表明，在适宜表面活性剂或类脂双层结构存在下，无细胞体系表达的膜蛋白是溶解的且具有生物活性，从而适合结构和功能研究膜蛋白正确折叠是其发挥生物功能的先决条件，对于膜蛋白折叠机制及关键因素的研究，能够极大地加深对其结构与功能的认识，既是揭示生命基本过程的必要手段，也势必对相关疾病的治疗产生深远影响，因此具有极其重要的理论和现实意义。
基于无细胞表达体系开放性的特点，除了表面活性剂，还可以添加配基、分子伴侣等各种物质进行相关研究。这样，由无细胞表达体系提供溶液环境，通过直接添加分子伴侣，可以系统研究它们在目标膜蛋白新生肽链折叠过程中的作用及其机制，从而有效克服上述膜蛋白样品制备困难以及体内研究所面临的细胞内环境和磷脂双分子层复杂等瓶颈因素。
CCR5是HIV-1侵入宿主细胞的主要辅助受体之一，并且参与介导免疫细胞的趋化作用，在肿瘤的发生和发展过程中也起着重要作用，是极其重要的药物靶标分子。最近，CCR5三维结构的成功解析将极大地推动相关药物的开发，同时该突破也更利于针对CCR5开展系列生物物理化学研究。
文献检索结果表明，利用无细胞表达体系，用修饰和标记好的带6XHis-tag的蛋白基因，添加HSP60和HSP10、Brij35以及大肠杆菌提取物和氨基酸、甲硫氨酸以及反应缓冲液表达七次跨膜蛋白CCR5的方法鲜有报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足，提供了一种新的用无细胞表达体系制备七次跨膜蛋白的方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下。
一种利于七次跨膜蛋白功能性表达的方法，其特征在于：其步骤如下：
（1）表达基因的制备：将CCR5的编码DNA在C端接入6×His-tagged，并且插入到pIVEX2.3d载体序列中。
（2）七次跨膜蛋白的表达：将步骤（1）得到的载体基因，连同蛋白表达必需的无细胞表达体系：大肠杆菌提取物、反应缓冲液、去甲硫氨酸氨基酸以及甲硫氨酸、T7聚合酶、表面活性剂和分子伴侣混合，按一定体积，置于反应容器中，并在33℃条件下，于恒温摇床培养3.5h，摇床转速165rpm。
（3）在步骤（2）反应开始30min后，再加入与步骤（2）等体积的补给缓冲液、氨基酸和甲硫氨酸的混合液，作为养料补充，使其能够充分表达折叠。
进一步地，所述步骤（2）中氨基酸∶甲硫氨酸=5∶4。
进一步地，所述步骤（2）中所用反应缓冲液为2.5X，补给缓冲液2X。
进一步地，所述步骤（2）中的反应恒温摇床，振荡转速为165rpm，反应温度为33℃。
进一步地，所述步骤（2）中蛋白反应体系中同时加入分子伴侣浓度是100mg/100ml的HSP60和浓度为50mg/50ml的HSP10，所加入的体积比例为HSP60∶HSP10=6∶1。
进一步地，所述步骤（3）中，在蛋白反应30min后，再加入与步骤（2）中等体积的补给溶液和氨基酸和甲硫氨酸。
进一步地，所述步骤（2）中所使用的表面活性剂为Brij35。
该发明的有益效果在于：本发明七次跨膜蛋白CCR5表达制备设备和工艺简单，以无细胞表达体系为载体进行研究，不受细胞生理限制可进行较大量的毒性蛋白表达；产物的活性和溶解性增加；产物不受胞内蛋白酶的降解；反应可以在短时间内进行；无需繁杂的下游处理；适合于高通量表达。通过直接添加不同的分子伴侣及其组合来研究它们在目标七次跨膜蛋白折叠中的作用机制，有效克服了膜蛋白样品制备困难以及体内研究所面临的细胞内环境和磷脂双分子层复杂等瓶颈因素，同时还保持了CCR5本身的生物活性。附图说明
图1、本发明所使用的分子伴侣的结构图以及所表达的实例七次跨膜蛋白CCR5的结构图。
图2、本发明所表达的实例七次跨膜蛋白CCR5的可溶性表达量和表达分子量条带表征。
图3、本发明所表达的实例七次跨膜蛋白CCR5的生物活性表征。
具体实施方式
下面结合实例对本发明的具体实施方式进行描述，以便更好的理解本发明。
实例：
以100ul反应体系表达七次跨膜蛋白CCR5为例。
步骤（1）首先是CCR5基因的设计与合成和载体的构建，在CCR5基因的C端插入6XHis-tag序列，使所表达的CCR5新生肽链能够通过免疫沉淀印迹法进行表达量的检测。
步骤（2）然后在离心管中，依次加入20ul大肠杆菌提取液，20ul的2.5X反应缓冲液，1.25ul50mM的去甲硫氨酸氨基酸，1ul甲硫氨酸，1ulT7聚合酶，10ulBrij35，3ulHSP60，0.5ulHSP10，最后加入4ul修饰的CCR5表达基因。溶液组分配置好后，将离心管置于恒温摇床中进行蛋白培养表达，培养温度33℃，摇床转速165rpm，培养3.5h。
步骤（3）另取一只离心管，加入25ul的2X补给缓冲液、1.25ul50nM的去甲硫氨酸氨基酸、1ul甲硫氨酸和22.75ul的超纯水。
步骤（4）是在步骤（2）的离心管培养表达30min后，将步骤（3）中所配置的溶液加入到步骤（2）的反应溶液中，继续在恒温摇床中培养表达3h，以确保所表达的CCR5有足够的营养成分以进行表达折叠。
步骤（5）在步骤（4）表达3h后，将离心管从恒温摇床中取出，进行蛋白含量的表征，经表征，本方法100ul表达体系所制备的CCR5可溶性含量高达0.9mg。
以上所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种利于七次跨膜蛋白CCR5功能性表达的方法，其特征在于：其步骤如下：
(1)表达基因的制备：将CCR5的编码DNA在C端接入6×His-tagged，并且插入到pIVEX2.3d载体序列中。
(2)七次跨膜蛋白的表达：将步骤(1)得到的载体基因，连同蛋白表达必需的无细胞表达体系：大肠杆菌提取物、反应缓冲液、去甲硫氨酸氨基酸以及甲硫氨酸、T7聚合酶、表面活性剂和分子伴侣混合，按一定体积，置于反应容器中，并在33℃条件下，于恒温摇床培养3.5h。
(3)在步骤(2)反应开始30min后，再加入与步骤(2)等体积的补给缓冲液、氨基酸和甲硫氨酸的混合液，作为养料补充，使其能够充分表达折叠。
2.按照权利要求1所述，其特征在于：所述步骤(1)中所使用的蛋白表达DNA为在C端修饰过的，便于后续蛋白产量表征的基因。
3.按照权利要求1所述，其特征在于：所述步骤(2)中的氨基酸是去甲硫氨酸的，而甲硫氨酸是按照氨基酸∶甲硫氨酸＝5∶4的比例添加的。
4.按照权利要求1所述，其特征在于：所述步骤(2)中的无细胞表达体系，是由各种蛋白表达所必需的成分按照一定比例构成，而且所用反应缓冲液为2.5X，补给缓冲液2X。
5.按照权利要求1所述，其特征在于：所述步骤(2)中的反应恒温摇床，振荡转速为165rpm，反应温度为33℃。
6.按照权利要求1所述，其特征在于：所述步骤(2)中蛋白反应体系中同时加入了分子伴侣浓度是100mg/100ml的HSP60和浓度为50mg/50ml的HSP10，所加入的体积比例为HSP60∶HSP10＝6∶1。
7.按照权利要求1所述，其特征在于：所述步骤(3)中，在蛋白反应30min后，再加入与步骤(2)中等体积的补给溶液和氨基酸和甲硫氨酸。
8.按照权利要求1所述，其特征在于蛋白表达折叠的时间为3.5h。
9.按照权利要求1所述，其特征在于所表达的蛋白为七次跨膜蛋白质。
10.按照权利要求1所述，其特征在于所使用的表面活性剂为Brij35。
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