ES2336548T3 - Metodos y composiciones para extraer proteinas de celulas. - Google Patents
Metodos y composiciones para extraer proteinas de celulas. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2336548T3 ES2336548T3 ES02707529T ES02707529T ES2336548T3 ES 2336548 T3 ES2336548 T3 ES 2336548T3 ES 02707529 T ES02707529 T ES 02707529T ES 02707529 T ES02707529 T ES 02707529T ES 2336548 T3 ES2336548 T3 ES 2336548T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- cells
- detergent
- host cells
- reducing agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 66
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 51
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 12
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 55
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 claims abstract description 42
- SFBHPFQSSDCYSL-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethyltetradecan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCN(C)C SFBHPFQSSDCYSL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 15
- MWGFSMCDBAKEST-UHFFFAOYSA-N CC(CCCCCCCCC)(NCCCCCCCCCC)C Chemical compound CC(CCCCCCCCC)(NCCCCCCCCCC)C MWGFSMCDBAKEST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- YWWNNLPSZSEZNZ-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethyldecan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCCCN(C)C YWWNNLPSZSEZNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- ONHFWHCMZAJCFB-UHFFFAOYSA-N myristamine oxide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] ONHFWHCMZAJCFB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- NHLUVTZJQOJKCC-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylhexadecan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCN(C)C NHLUVTZJQOJKCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- MMWFTWUMBYZIRZ-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethylundecan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCCCCN(C)C MMWFTWUMBYZIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- OZHBUVQCJMARBN-UHFFFAOYSA-N undecylamine-n,n-dimethyl-n-oxide Chemical compound CCCCCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] OZHBUVQCJMARBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 66
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 64
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims description 11
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 7
- PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N TCEP Chemical compound OC(=O)CCP(CCC(O)=O)CCC(O)=O PZBFGYYEXUXCOF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 claims description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 6
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 3
- ADXNPXDFKKWVGE-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethyltridecan-1-amine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCN(C)C ADXNPXDFKKWVGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ZRKZFNZPJKEWPC-UHFFFAOYSA-N decylamine-N,N-dimethyl-N-oxide Chemical compound CCCCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] ZRKZFNZPJKEWPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 2
- SEAMOONDNLUSBG-UHFFFAOYSA-N CCCCCCCCCCN(C(C)(C)CCCCCCCCC)O Chemical compound CCCCCCCCCCN(C(C)(C)CCCCCCCCC)O SEAMOONDNLUSBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- VHXSGTCOHZCUKB-UHFFFAOYSA-N n,n-dimethyltridecan-1-amine oxide Chemical compound CCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)[O-] VHXSGTCOHZCUKB-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 94
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 16
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 13
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 9
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 8
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 8
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 239000000047 product Substances 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 5
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 5
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 3
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000270322 Lepidosauria Species 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000011536 extraction buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- -1 glycerol Chemical class 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 2
- KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 3,3'-Dithiobis(6-nitrobenzoic acid) Chemical compound C1=C([N+]([O-])=O)C(C(=O)O)=CC(SSC=2C=C(C(=CC=2)[N+]([O-])=O)C(O)=O)=C1 KIUMMUBSPKGMOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108010058643 Fungal Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 230000007253 cellular alteration Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 1
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/145—Extraction; Separation; Purification by extraction or solubilisation
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/804—Single cell protein
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Un método para liberar una proteína de interés de células hospedadoras que comprende poner en contacto las células hospedadoras con un agente reductor y un detergente, en el que el detergente se selecciona entre el grupo que consiste en: dimetildecilamina, dimetilundecilamina, dimetildidecilamina, dimetiltetradecilamina, dimetilhexadecilamina, óxido de dimetildecilamina, óxido de dimetilundecilamina, óxido de dimetildidecilamina, óxido de dimetiltetradecilamina y óxido de dimetiltridecilamina.
Description
Métodos y composiciones para extraer proteínas
de células.
La presente invención se refiere a un proceso
para recuperar proteínas intracelulares y otras moléculas de una
célula.
Es deseable lisar células cultivadas como
hospedadores de producción que contienen una proteína u otra
molécula de interés para recuperar cualquier producto deseado
producido intracelularmente. Los modos convencionales de destruir y
lisar tales células incluyen el uso de calor (Patente de Estados
Unidos Nº 4.601.986 de Wegner, et al.), presión osmótica
(Patente de Estados Unidos Nº 4.299.858 de Aubert, et al),
enzimas que descomponen las paredes o las membranas celulares
(Patente de Estados Unidos Nº 3.816.260 de Sugiyama, Patente de
Estados Unidos Nº 3.890.198 de Kobayashi, et al. y la
Patente de Estados Unidos Nº 3.917.510 de Kitamura, et al.)
y alteración mecánica de la pared celular, por ejemplo, por
homogeneización a alta presión.
También se han utilizado detergentes para lisar
la pared celular. Por ejemplo, el reactivo de extracción de
proteína de levadura (Y-PER®), comercializado por
Pierce Chemical Company, contiene un detergente para proporcionar
un medio suave de lisis celular que no es perjudicial para la
proteína de interés. Sin embargo, Y-PER® tiene por
objeto el uso como un reactivo experimental de laboratorio, no como
un reactivo útil para la producción a gran escala de proteínas, y
es costoso. Por estos motivos, Y-PER® no ha obtenido
aceptación como un reactivo útil para la producción a gran escala
de proteína recombinante de células hospedadoras.
Existe una necesidad en la técnica de un proceso
que se pueda usar para provocar de forma sencilla la liberación de
proteínas de células hospedadoras sin dañar la proteína deseada y
con un mínimo de etapas de proceso. El método de lisis celular no
debe conducir directa o indirectamente a la desnaturalización del
producto deseado y el método debe ser coherente con los requisitos
de procesamiento posteriores y con la producción a gran escala.
La presente invención se refiere a un proceso
para liberar una proteína, recombinante u otra, de una célula. El
proceso de la presente invención implica poner las células
hospedadoras en contacto con un agente reductor y un detergente,
donde el detergente se selecciona entre el grupo que consiste en:
dimetildecilamina, dimetilundecilamina, dimetildidecilamina,
dimetiltetradecilamina, dimetilhexadecilamina, óxido de
dimetildecilamina, óxido de dimetilundecilamina, óxido de
dimetildidecilamina, óxido de dimetiltetradecilamina y óxido de
dimetiltridecilamina.
La adición de uno o más agentes reductores
facilita la recuperación de proteínas en sus conformaciones nativas.
Los métodos de la invención son particularmente adecuados para
producción a gran escala de productos recombinantes. Los métodos de
la invención comprenden cuatro etapas básicas: ajuste de condiciones
de solución voluminosa para conseguir un entorno permisivo,
contacto de células con un agente reductor antes, durante o después
del contacto de las células con ciertos detergentes como se ha
mencionado anteriormente y, finalmente, aclaramiento del extracto
para producir una fracción adecuada para la formulación o
procesamiento adicional. Típicamente, el agente reductor y el
detergente se añaden secuencialmente en cualquier orden, dando como
resultado la exposición concurrente de las células al agente
reductor y al detergente.
Los detergentes se pueden usar a concentraciones
que varían del 0,01% hasta su límite de solubilidad.
Preferiblemente, las concentraciones de los detergentes varían del
0,05% al 5%, del 0,1% al 2% o son aproximadamente el 0,5% de la
solución total. Cuando se añade a células suspendidas en tampón, el
detergente está preferiblemente a una mayor concentración que la
concentración final a la que se lisan las células. Preferiblemente,
el detergente está a una concentración al menos 2 veces, 5 veces,
10 veces o 100 veces superior.
En una realización particular, el uno o más
agentes reductores son los agentes reductores que reducen los
enlaces disulfuro y/o mantienen los restos sulfhidrilo en la forma
reducida. Cualquiera de tales agente o agentes reductores se pueden
usar. En una realización preferida, el uno o más agentes reductores
usados se seleccionan entre el grupo que consiste en Ditiotreitol
(DTT); Ditioeritritol (DTE), Cisteína (Cys) y
Tris[2-carboxietil]fosfina
(TCEP).
Los agentes reductores se pueden usar a
concentraciones que varían de 0,1 mM a 100 mM, de 1 mM a 25 mM, de
2 mM a 10 mM o aproximadamente 5 mM. Cuando se añaden a células
suspendidas en tampón, el agente reductor está preferiblemente a
una mayor concentración que la concentración final a la que se lisan
las células. Preferiblemente, el detergente está a una
concentración al menos 2 veces, 5 veces, veces o 100 veces
superior.
Además del uno o más detergentes y agentes
reductores, en una realización preferida, las células también se
ponen en contacto con glicerol. Preferiblemente, la concentración de
glicerol es al menos el 0,6% o varía del 0,6% al 20%, del 0,6% al
15%, del 0,6% al 12%, del 0,6% al 6%, del 0,6% al 3% o del 0,6% al
1%.
El pH de la solución puede variar de pH 2 a pH
12. Preferiblemente, la solución está a un pH que varía de pH 5,0 a
pH 8,0. Más preferiblemente, el pH varía de pH 5,5 a pH 7,4, de pH 6
a 7,4, de pH 7,0 a 7,4 o es aproximadamente pH 7,3.
La recuperación de proteína de las células con
la solución de la invención se puede realizar a una temperatura de
2ºC a 50ºC. Preferiblemente, la temperatura es de 2ºC a 30ºC, de 2ºC
a 20ºC, de 2ºC a 10ºC, de 3ºC a 10ºC, aproximadamente 4ºC,
aproximadamente 25ºC o es temperatura ambiente.
Las "células hospedadoras" son células que
contienen una proteína de interés. Una "proteína de interés" es
cualquier proteína presente en una célula hospedadora que se desea
liberar de la célula hospedadora y, opcionalmente, aislar o
purificar posteriormente. Preferiblemente, la proteína de interés es
una proteína recombinante. En una realización preferida, la
proteína de interés tiene un peso molecular de menos de 100 kD. En
una realización preferida adicional, la proteína de interés tiene
un peso molecular entre 5 y 75 kD, preferiblemente aproximadamente
50 kD. Las células hospedadoras pueden ser de cualquier tipo,
preferiblemente de mamífero, bacterianas, de levadura, fúngicas,
vegetales, aviares o de reptiles. Más preferiblemente, las células
hospedadoras son células de levadura. En una realización
particular, las células de levadura son de la especie Pichia
pastoris.
Además de liberar proteínas de células
hospedadoras, el proceso de la invención se puede usar para liberar
otras moléculas de células hospedadoras que incluyen ácidos
nucleicos, lípidos, vitaminas, moléculas pequeñas y otras moléculas
o complejos moleculares obtenidos de células, citosólicos o de
orgánulos.
Alternativamente, la presente invención se
refiere a un método para liberar una proteína de interés de células
hospedadoras que comprenden poner en contacto las células
hospedadoras con un detergente, donde el detergente es
dimetiltetradecilamina y que comprende además la etapa de añadir
glicerol a las células hospedadoras.
\vskip1.000000\baselineskip
Las diversas características de la invención
pueden comprenderse más completamente a partir de la siguiente
descripción cuando se lee junto con el dibujo adjunto.
\vskip1.000000\baselineskip
La Figura 1 muestra el efecto del tiempo,
temperatura y el agente reductor sobre la recuperación de una
proteína de interés de una célula hospedadora.
\vskip1.000000\baselineskip
La presente invención se refiere a un proceso
para liberar una proteína, recombinante u otra, de una célula. Los
métodos de la invención comprenden cuatro etapas básicas: ajuste de
condiciones de solución voluminosa para conseguir un entorno
permisivo, contacto de las células con un agente reductor antes,
durante o después del contacto de las células con ciertos
detergentes y, finalmente, aclaramiento del extracto para producir
una fracción adecuada para formulación o procesamiento
adicional.
En una realización particular, las condiciones
de solución se ajustan por 1) sedimentación de la fracción celular
seguido de resuspensión, 2) por intercambio de solución usando
métodos de filtración, 3) por modificación directa de las
condiciones de solución existentes o 4) mediante otros medios de
intercambio de disolvente. Después, las células suspendidas en una
solución apropiada se ponen en contacto con ciertos detergentes que
provocan la alteración de la membrana celular permitiendo de este
modo que los contenidos de la célula difundan a través de la pared
celular y al medio extracelular. Después, los restos celulares se
separan del extracto soluble por sedimentación, floculación,
filtración, métodos cromatográficos u otros de separación.
En una realización preferida, las células de
levadura, por ejemplo, Pichia pastoris tomadas directamente
de un proceso de fermentación se concentran y después se cambian
del medio de cultivo a una solución tamponada específica por
filtración de flujo tangencial usando membranas microporosas.
Después, las células concentradas y ajustadas en solución se ponen
en contacto con detergente, dependiendo del tipo de la célula y las
condiciones de solución. Además, la solución puede contener
detergentes, tales como Triton X-100 o polioles,
tales como glicerol, que mejoran el proceso de extracción. El
extracto de moléculas intracelulares después se separa del
sedimento insoluble remanente por filtración profunda, por ejemplo,
usando tierra de diatomeas en una placa y una prensa de filtro de
marco.
La permisibilidad de la solución depende del pH,
temperatura, fuerza iónica, tiempo, concentración de células y la
adición de ciertos componentes que mejoran la eficacia o la cinética
de la alteración celular o la estabilidad molecular. El pH de la
solución puede ser de pH 3 a 11, más preferiblemente de 5 a 8 o
aproximadamente de 6,5 a 8,0. La temperatura puede variar de 2ºC a
50ºC, o más preferiblemente de 2ºC a 30ºC. La fuerza iónica puede
variar de condiciones hipotónicas a hipertónicas, más
preferiblemente cloruro sódico de 0,001 a 3000 mM u otra sal,
dependiendo de las propiedades de la molécula diana deseada. En
realizaciones preferidas, la fuerza iónica es inferior a 350 mM,
inferior a 250 mM, inferior a 150 mM, inferior a 100 mM, inferior a
50 mM e inferior a 10 mM pero no inferior a 5 mM, 1 mM, 0,01 mM o
0,001 mM.
Las "células hospedadoras" son células que
contienen una proteína de interés. Una "proteína de interés" es
cualquier proteína presente en una célula hospedadora que se desea
liberar de la célula hospedadora y, opcionalmente, aislar o
purificar posteriormente. Preferiblemente, la proteína de interés es
una proteína recombinante. Cuando la proteína de interés es una
proteína recombinante, se puede producir mediante cualquier método
conocido en la técnica. Típicamente, un gen que codifica la
proteína recombinante que se desea se inserta en una molécula
recombinante. Los polinucleótidos que constituyen el gen se pueden
obtener mediante procedimientos convencionales conocidos en la
técnica, tal como a partir de ADN clonado (tal como una
"genoteca" de ADN), síntesis química, clonación de ADNc o por
la clonación de ADN genómico o un fragmento del mismo, de una célula
deseada como se describe en Sambrook, J., et al., Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor
Laboratory Press (1989).
Una vez que se ha aislado el gen que codifica la
proteína recombinante, se inserta en un vector de clonación
apropiado. Se puede usar un gran número de sistemas hospedadores de
vector conocidos en la técnica. Los posibles vectores incluyen,
pero sin limitación, plásmidos o virus modificados, suponiendo que
el sistema de vector sea compatible con la célula hospedadora
usada. Los vectores que se pueden usar incluyen, por ejemplo, un
vector de clonación de E. coli, bacteriófagos tales como
derivados de lambda, plásmidos tales como derivados de pBR322 o
derivados del plásmido pUC. El vector de clonación se puede
introducir en células hospedadoras por transformación,
transfección, infección, electroporación, etc., de tal forma que se
generan muchas copias de la secuencia génica.
La transformación de células hospedadoras con un
vector de clonación que incorpora el gen permite la generación de
múltiples copias del gen. Por lo tanto, el gen se puede obtener en
grandes cantidades cultivando transformantes, aislando el vector de
clonación de los transformantes y, cuando sea necesario, recuperando
el gen insertado del vector de clonación aislado. Una vez que se
han generado suficientes copias de la secuencia génica, el gen que
codifica la proteína recombinante, o un fragmento funcionalmente
activo u otro derivado del mismo, se puede insertar en una molécula
recombinante apropiada. La molécula recombinante es un vector de
expresión de polinucleótidos que contiene los elementos necesarios
para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de
proteína insertada de la proteína recombinante. Preferiblemente, el
vector de expresión también incluye un origen de replicación. Las
señales de transcripción y traducción necesarias también se pueden
suministrar por el gen nativo y/o sus regiones flanqueantes.
Una vez que se ha preparado una molécula
recombinante, se inserta en una célula hospedadora aceptable que se
desarrollará y dividirá para producir clones. Se puede utilizar una
diversidad de sistemas de vector de célula hospedadora para
expresar la proteína recombinante. Los sistemas de vector de célula
hospedadora adecuados incluyen, por ejemplo, sistemas de expresión
bacterianos, sistemas de células de mamífero infectados por un
virus, tales como virus vaccinia o adenovirus, sistemas de células
de insecto infectados por un virus tal como un baculovirus,
microorganismos tales como levaduras que contienen vectores de
levadura y bacterias transformadas con ADN de bacteriófago, ADN de
plásmido o ADN de cósmido.
Las moléculas recombinantes que contienen el gen
de interés se pueden identificar por amplificación por PCR del ADN
plasmídico deseado o ARNm específico, hibridación de ácido nucleico,
presencia o ausencia de funciones de gen marcador y expresión de
las secuencias insertadas.
Las células hospedadoras, tales como células de
E. coli, transformadas con un polinucleótido que codifica
una proteína recombinante de interés, se pueden añadir directamente
a un recipiente de reacción. Para purificar y recuperar la proteína
recombinante, las células hospedadoras se concentran para formar una
suspensión concentrada de células completas. Las células
hospedadoras se pueden concentrar mediante cualquier método conocido
en la técnica. Por ejemplo, las células hospedadoras se pueden
centrifugar. La centrifugación elimina el agua de las células
hospedadoras y concentra las células, formando una pasta celular. La
centrifugación también separa las células hospedadoras del medio de
cultivo. Las células hospedadoras pueden ser de cualquier tipo,
preferiblemente de mamífero, bacterianas, de levadura, vegetales,
aviares o de reptiles. Más preferiblemente, las células
hospedadoras son células de
levadura.
levadura.
Una vez que se ha obtenido una suspensión
concentrada de células, las células se ponen en contacto con una
solución de recuperación de proteína. La solución de recuperación de
proteína comprende uno o más detergentes y uno o más agentes
reductores, donde el detergente se selecciona entre el grupo que
consiste en dimetildecilamina, dimetilundecilamina,
dimetildidecilamina, dimetiltetradecilamina, dimetilhexadecilamina,
óxido de dimetildecilamina, óxido de dimetilundecilamina, óxido de
dimetildidecilamina, óxido de dimetiltetradecilamina y óxido de
dimetiltridecilamina. Los detergentes se pueden usar a
concentraciones que varían del 0,01% hasta su límite de solubilidad.
Preferiblemente, la concentración de los detergentes varía del
0,05% al 5%, del 0,1% al 2% o es aproximadamente el 0,5% o el 1% de
la solución total. Preferiblemente, los detergentes, justo antes de
su adición a las células hospedadoras, son puras en al menos el
90%, al menos el 95% o al menos el 99%. En realizaciones preferidas,
los detergentes a añadir tienen al menos 3 veces, al menos 5 veces,
al menos 10 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos
200 veces la concentración final de los detergentes después de la
adición y dilución en la suspensión celular.
En una realización particular, el uno o más
agentes reductores son los agentes reductores que reducen enlaces
disulfuro y/o mantienen restos sulfhidrilo en la forma reducida.
Cualquiera de tales agente o agentes reductores se puede usar. En
una realización preferida, el uno o más agentes reductores usados se
seleccionan entre el grupo que consiste de Ditiotreitol (DTT);
Ditioeritritol (DTE), Cisteína (Cys) y
Tris[2-carboxietil]fosfina (TCEP).
Los agentes reductores se pueden usar a
concentraciones que varían de 0,1 mM a 100 mM, de 1 mM a 25 mM, de
2 mM a 10 mM o aproximadamente 5 mM. Cuando se añaden a células
suspendidas en tampón, el agente reductor está preferiblemente a
una concentración mayor que la concentración final a la que se lisan
las células. Preferiblemente, el detergente está a una
concentración al menos 2 veces, 5 veces, 10 veces o 100 veces
superior. La eficacia del agente reductor se puede determinar por
titulación de los sulfhidrilos libres usando el reactivo de Ellman.
Preferiblemente, el agente reductor es Ditiotreitol.
Preferiblemente, la concentración del agente reductor es 5 mM.
Preferiblemente, el agente reductor se añade al tampón de extracción
justo antes de la adición del detergente seguido de incubación a
4ºC durante 12 horas. Sin embargo, el agente reductor se puede
añadir antes o después del detergente. Preferiblemente, el agente
reductor se añade antes de la adición del detergente. En otra
realización, el detergente y agente reductor se añaden de forma
conjunta. En otra realización, el detergente se añade antes del
agente
reductor.
reductor.
Además del uno o más detergentes y agentes
reductores, en una realización preferida, las células también se
ponen en contacto con glicerol. Preferiblemente, la concentración de
glicerol es al menos el 0,6% o varía del 0,6% al 20%, del 0,6% al
12%, del 0,6% al 6%, del 0,6% al 3% o del 0,6% al 1%.
Preferiblemente, el glicerol, justo antes de la adición a las
células hospedadoras, es puro al menos en el 90%, al menos en el 95%
o al menos en el 99%. En realizaciones preferidas, el glicerol a
añadir es al menos 3 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al
menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 166 veces la
concentración final del glicerol después de la adición y dilución
en la suspensión celular.
Preferiblemente, la solución está a un pH que
varía de pH 5,0 hasta pH 6,0. Más preferiblemente, el pH varía de
pH 5,5 a 7,4, de pH 6 a 7,4, de pH 7,0 a 7,4 o es aproximadamente pH
7,3.
La recuperación de la proteína de interés de las
células con la solución de la invención se puede realizar a una
temperatura de 2ºC a 50ºC. Preferiblemente, la temperatura es de 2ºC
a 30ºC, de 2ºC a 20ºC, de 2ºC a 10ºC, aproximadamente 4ºC,
aproximadamente 25ºC o a temperatura ambiente.
La cantidad de la solución de detergente y
agente reductor de la invención usada por gramo de células puede
variar ampliamente, por ejemplo, se puede usar cualquiera de 0,5 ml
de solución de detergente y agente reductor por gramo de células a
20 ml por gramo. Preferiblemente se usan 2,5 - 5,0 ml de solución de
detergente y agente reductor por gramo de pasta celular.
La cantidad de tiempo permitido para la lisis de
las células después de poner en contacto dichas células con la
solución de recuperación de proteína se puede determinar por el
especialista en la técnica. Por ejemplo, se pueden incubar células
en presencia de la solución de recuperación de proteína durante 40
minutos hasta 72 horas, preferiblemente 90 minutos, 150 minutos, 8
horas o 16-30 horas. También son apropiados tiempos
más cortos y más largos. En general, la cantidad de tiempo se puede
aumentar cuando la concentración de detergente es baja y disminuir
cuando la cantidad de detergente es alta. Por ejemplo, una solución
de recuperación de proteína con una concentración de detergente del
1% es eficaz después de 40 minutos, mientras que una solución de
recuperación de proteína con una concentración de detergente del
0,1% se debe incubar durante 150 minutos o más. Para la
recuperación óptima de la proteína, la cantidad exacta de tiempo
necesario se puede determinar por un experimento de desarrollo en
el tiempo simple a una concentración dada de detergente, donde la
concentración de la proteína de interés liberada al medio se
determina a lo largo del tiempo. Después de un cierto punto de
tiempo no se observará ningún aumento adicional en la proteína
liberada. Este punto de tiempo es el tiempo óptimo necesario para
la lisis de las células con la concentración elegida de
detergente.
Después de la lisis de las células, la solución
se puede centrifugar para recoger restos celulares en el sedimento,
dejando la proteína de interés liberada en el sobrenadante. El
sobrenadante se puede procesar de acuerdo con métodos conocidos por
los especialistas en la técnica para aislar y purificar
adicionalmente la proteína de interés. Los métodos utilizados para
aislar y/o purificar adicionalmente la proteína de interés dependen
en gran medida de las características y propiedades de la proteína
de interés particular y se tienen que determinar para cada
proteína. En una realización particular, la proteína de interés
tiene sulfhidrilos reactivos. En una realización particular, la
proteína de interés, en su conformación nativa, tiene uno o más
enlaces disulfuro. En una realización particular, la proteína de
interés se purifica en una forma reducida, por ejemplo, con grupos
sulfhidrilo libres. En una realización particular, la proteína
aislada en una forma reducida se pliega después de la purificación
en su conformación oxidada, nativa. Para métodos para plegar
proteínas, véase Chaudhuri JB, Refolding recombinant proteins:
process strategies and novel approaches, Ann N Y Acad Sci 1994 May
2; 721: 374-85.
En una realización preferida, el método de la
invención se aplica a un proceso a gran escala para recuperar una
biomolécula. Un proceso a gran escala es un proceso que implica
grandes cantidades de biomasa de célula hospedadora. En
realizaciones preferidas, la cantidad de biomasa procesada en un
único lote de acuerdo con los métodos de la invención es de 1 kg a
50.000 kg, de 1000 kg a 20.000 kg, de 5000 kg a 10.000 kg o
aproximadamente 40 kg, 100 kg, 1000 kg o 10.000 kg. En otra
realización, la cantidad de biomasa es mayor de 1 kg, mayor de 40
kg, mayor de 100 kg, mayor de 1000 kg, mayor de 5000 kg, mayor de
10.000 kg o mayor de 20.000 kg. Las células hospedadoras
generalmente están en caldo de fermentación al comienzo del proceso.
Las células hospedadoras se concentran en el caldo de fermentación,
por ejemplo, por centrifugación o filtración de flujo tangencial,
después, el caldo de fermentación se intercambia con fosfato sódico
60 mM, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 7,3 (tampón). El intercambio se
puede realizar mediante cualquier medio conocido por el especialista
en la técnica, por ejemplo, mediante filtración de flujo tangencial
usando membranas de 0,45 \mum. La biomasa concentrada se puede
mantener a un volumen constante mientras que se añade tampón a la
biomasa a una velocidad igual a la velocidad a la que se eliminó el
líquido de la biomasa por el proceso de filtración. Se puede usar un
intercambio de tampón mayor del 50%, mayor del 60%, mayor del 70%,
mayor del 80%, mayor del 90%, del 95%, mayor del 95% o
aproximadamente del 100%. Preferiblemente, el intercambio es del 90%
o más. Por ejemplo, para 7,6 litros de caldo de fermentación que
contienen aproximadamente 3 kg de células, aproximadamente 27 l de
tampón se pueden procesar como anteriormente, lo que da como
resultado un intercambio de tampón >95%. La biomasa concentrada
e intercambiada con tampón después se modifica por la adición del
agente reductor, detergente y otros compuestos, por ejemplo,
glicerol y tetradecildimetilamina hasta concentraciones de 5 mM, del
6,0% en peso final y del 0,5% en peso final, respectivamente. Los
compuestos añadidos se pueden añadir por separado o mezclar y
añadir de forma conjunta. También se pueden usar otras
concentraciones, como se ha indicado anteriormente. Después, la
mezcla se puede incubar con agitación. Esta incubación puede ser
para cualquier tiempo y temperatura apropiada, por ejemplo, durante
14,5 horas a 19ºC. Las concentraciones reales de agentes reductores,
detergentes, tiempo y temperatura para cualquier extracción dada se
pueden determinar de forma sencilla por el especialista en la
técnica. Después de la incubación, la fracción soluble de la mezcla
contiene grandes cantidades de proteína, ácidos nucleicos, lípidos
y otras moléculas restringidas previamente a la membrana celular y
el citoplasma. La mezcla se puede centrifugar, por ejemplo, a 4000
x g durante 30 minutos. La fracción de sobrenadante se puede
procesar adicionalmente entonces, por ejemplo, mediante filtración a
través de un filtro de 1,2 \mum y 0,2 \mum en serie.
Alternativamente, la presente invención se
refiere a un método para liberar una proteína de interés de células
hospedadoras que comprende poner en contacto las células
hospedadoras con un detergente, donde el detergente es
dimetiltetradecilamina y que comprende además la etapa de añadir
glicerol a las células hospedadoras.
Los siguientes Ejemplos ilustran la realización
preferida del proceso de la presente invención y no limitan de
ningún modo la memoria descriptiva y las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
Se concentró caldo de fermentación de Pichia
pastoris (12,6 kg) que contenía el 24,4% de biomasa por peso en
húmedo, que tiene una conductancia de 30,2 mS/cm y un pH de 4,86,
hasta 7,6 l. Después, la biomasa concentrada se cambió a fosfato
sódico 60 mM, NaCl 50 mM, EDTA 5 mM, pH 7,3 (tampón) por filtración
de flujo tangencial usando 0,45 m^{2} de membrana de 0,45 \mum.
La biomasa concentrada se mantuvo en 7,6 l mientras que se añadió
tampón a la biomasa a una velocidad igual a la velocidad a la que se
eliminó el líquido de la biomasa por el proceso de filtración.
Aproximadamente 27 l de tampón se procesaron como anteriormente, lo
que da como resultado un intercambio de tampón de >95%. La
biomasa concentrada e intercambiada por tampón después se modificó
por la adición de glicerol y tetradecildimetilamina, por separado,
hasta concentraciones de 6,0 y 0,5 por ciento en peso final,
respectivamente. Después, la mezcla se incubó con agitación durante
14,5 horas a 19ºC. En este punto, la fracción soluble de la mezcla
contenía grandes cantidades de proteína, ácidos nucleicos, lípidos
y otras moléculas restringidas previamente a la membrana celular y
al citoplasma. Después, la mezcla se centrifugó a 4000 x g durante
30 minutos. Después, la fracción de sobrenadante se procesó
adicionalmente por filtración a través de un filtro de 1,2 \mum y
0,2 \mum en serie. El extracto aclarado resultante contenía
aproximadamente 15 g/l de proteína total y 0,8 g/l de la proteína
heteróloga específica de interés. El extracto aclarado también
contenía cantidades significativas de ácido ribonucleico, ácido
desoxirribonucleico y lípidos obtenidos de células.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cambiaron células de Pichia pastoris a
condiciones de tampón permisivas y se pusieron en contacto con
tetradecildimetilamina (DMA-C14) al 0,5% y Triton
X-100 al 1% y glicerol al 6%. Se tomaron muestras
del sobrenadante en diversos momentos después de la incubación a
diferentes temperaturas, 4ºC y 22ºC. Después se determinó la
concentración de una proteína heteróloga específica (Bot B, o
proteína rBoNTB/HC) por un método de HPLC específico para esa
proteína. La heteróloga se libera con una mayor eficacia a lo largo
del tiempo y a la mayor temperatura, aunque a las 25 horas, la
cantidad de proteína liberada a las dos temperaturas era
indistinguible cuando se usaron DMA C14 (tetradecildimetilamina),
tritón y glicerol o DMA-C14 y glicerol. DMA C14 y
Triton y DMA C14 fueron menos eficaces. Otras observaciones
muestran que, glicerol, Triton X-100 o tampón en
solitario no extrajo proteína a un nivel que fuera detectable.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cambiaron células de Pichia pastoris a
condiciones de tampón permisivas y se pusieron en contacto con
tetradecildimetilamina (DMA-C14) al 0,5% y glicerol
al 6%. Se tomaron muestras después de la incubación y después del
aclaramiento (centrifugación a baja velocidad y filtración de 0,2
\mum). La concentración de ARN, ADN, fosfolípidos y proteína
total se midió usando kits de reactivo disponibles en el mercado.
Después se determinó la concentración de una proteína heteróloga
específica (rBoNTB/Hc) de interés mediante HPLC. Los resultados
están en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Los datos muestran que se extrajeron ARN, ADN,
fosfolípidos, una proteína heteróloga específica y proteína total
no específica de las células. Esto muestra que el método no es
selectivo y, por lo tanto, se puede aplicar de forma general a la
recuperación en moléculas intracelulares de células microbianas. Los
datos también muestran que el ADN, ARN y los lípidos se eliminan de
forma sencilla de la fracción de proteína soluble del extracto de
glicerol-DMA-C14 (compárese el
extracto con el extracto aclarado). Esto es a diferencia de métodos
de extracción de células mecánicos que dan como resultado la
formación de suspensiones coloidales altas en contenido de ácido
nucleico y lípidos. Tales materiales coloidales no se separan de
forma sencilla de la fracción de proteína soluble y pueden
complicar los métodos de purificación de proteína. O, por otro lado,
limitar gravemente la recuperación de ADN, ARN, lípidos o moléculas
similares si esas moléculas eran las moléculas de interés. Por
tanto, la característica cuidadosa, de baja cizalla y no selectiva
del método de permeabilización puede facilitar la recuperación de
productos intracelulares no proteicos tales como ácidos nucleicos,
lípidos y otras moléculas, que no se obtienen de forma sencilla de
lisados mecánicos.
\vskip1.000000\baselineskip
Se suspendieron células de P. pastoris
que expresan la proteína rBoNTA (Hc) (350 g de biomasa/l de tampón
de extracción) en una solución que contenía DMA-C14
al 0,5% (p/p) y glicerol al 6% (p/p) a pH 7,2. Después se incubó
una muestra a 21ºC y una segunda muestra a 4ºC. Después se añadió
ditiotreitol (DDT) a una tercera muestra a 4 mM y la muestra se
incubó a 21ºC. Se añadió DTT a una cuarta muestra a 1 mM y la
muestra se incubó a 4ºC. Las alícuotas se eliminaron de cada una de
las cuatro muestras en los tres puntos de tiempo indicados (véase
la Figura 1), las muestras se aclararon y la concentración de rBoNTA
(Hc) se determinó por HPLC. Después, la concentración de rBoNTA
(Hc) se representó como una función del tiempo para los cuatro
tratamientos diferentes. Los datos se resumen en la Figura 1.
Aunque la invención se describe con detalle con
referencia a realizaciones específicas de la misma, se entenderá
que las variaciones que son funcionalmente equivalentes pertenecen
al alcance de esta invención. De hecho, diversas modificaciones de
la invención, además de las mostradas y descritas en este documento,
serán evidentes para los especialistas en la técnica a partir de la
anterior descripción y los dibujos adjuntos. Tales modificaciones
tienen por objeto incluirse en el alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
Claims (12)
1. Un método para liberar una proteína de
interés de células hospedadoras que comprende poner en contacto las
células hospedadoras con un agente reductor y un detergente, en el
que el detergente se selecciona entre el grupo que consiste en:
dimetildecilamina, dimetilundecilamina, dimetildidecilamina,
dimetiltetradecilamina, dimetilhexadecilamina, óxido de
dimetildecilamina, óxido de dimetilundecilamina, óxido de
dimetildidecilamina, óxido de dimetiltetradecilamina y óxido de
dimetiltridecilamina.
2. El método de la reivindicación 1, que
comprende además la etapa de añadir glicerol a las células
hospedadoras suspendidas.
3. El método de la reivindicación 2, en el que
el detergente comprende una concentración final entre el 0,01 por
ciento y el 10 por ciento.
4. El método de la reivindicación 2, en el que
el glicerol comprende una concentración final entre el 0,6 y el 15
por ciento.
5. El método de la reivindicación 4, en el que
el glicerol comprende una concentración final entre el 0,6 y el al
6 por ciento.
6. El método de la reivindicación 1, en el que
el agente reductor se selecciona entre el grupo que consiste en
Ditiotreitol (DDT); Ditioeritritol (DTE); Cisteína (Cys) y
Tris[2 carboxietil]fosfina (TCEP).
7. El método de la reivindicación 6, en el que
el agente reductor está a una concentración de 0,1 mM a 100 mM.
8. El método de la reivindicación 1, que
comprende además la etapa de incubar la célula y la mezcla de
detergente y agente reductor de 90 minutos a 24 horas.
9. El método de la reivindicación 8, en el que
la incubación es de 8 horas a 24 horas.
10. El método de la reivindicación 1, que
comprende además la etapa de incubar la célula y la mezcla de
detergente y agente reductor a una temperatura entre 3ºC y
10ºC.
11. El método de la reivindicación 1, en el que
las células hospedadoras son células de Pichia pastoris.
12. Un método para liberar una proteína de
interés de células hospedadoras que comprende poner en contacto las
células hospedadoras con un detergente, en el que el detergente es
dimetiltetradecilamina y que comprende además la etapa de añadir
glicerol a las células hospedadoras.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/766,043 US7229789B1 (en) | 2001-01-19 | 2001-01-19 | Methods and compositions for extracting proteins from cells |
| US766043 | 2001-01-19 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2336548T3 true ES2336548T3 (es) | 2010-04-14 |
Family
ID=25075221
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES02707529T Expired - Lifetime ES2336548T3 (es) | 2001-01-19 | 2002-01-18 | Metodos y composiciones para extraer proteinas de celulas. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US7229789B1 (es) |
| EP (1) | EP1356076B1 (es) |
| JP (1) | JP4372421B2 (es) |
| AT (1) | ATE452984T1 (es) |
| CA (1) | CA2434844A1 (es) |
| DE (1) | DE60234811D1 (es) |
| ES (1) | ES2336548T3 (es) |
| WO (1) | WO2002057478A1 (es) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7229789B1 (en) * | 2001-01-19 | 2007-06-12 | N.V. Organon | Methods and compositions for extracting proteins from cells |
| US20040048315A1 (en) | 2002-08-28 | 2004-03-11 | Pharmacia Corporation | Method for the preparation of growth hormone and antagonist thereof having lower levels of isoform impurities thereof |
| ZA200502320B (en) | 2002-09-20 | 2006-10-25 | Pharmacia Corp | Process for decreasing aggregate levels of pegylated protein |
| CA2504129A1 (en) | 2002-11-01 | 2004-05-21 | Promega Corporation | Cell lysis compositions, methods of use, apparatus, and kit |
| DE10309691B4 (de) * | 2003-02-28 | 2018-10-04 | Hans-Knöll-Institut für Naturstoff-Forschung e.V. | Gewinnung von löslichen Proteinen aus der Biomasse rekombinanter Mikroorganismen |
| US7935798B2 (en) * | 2004-02-27 | 2011-05-03 | Dow Global Technologies Llc | Method for the extraction of intracellular proteins from a fermentation broth |
| US20060183889A1 (en) * | 2005-01-04 | 2006-08-17 | Bogoev Roumen A | Alkyl phosphine detergent products and extraction processes |
| DE102005015005A1 (de) | 2005-04-01 | 2006-10-05 | Qiagen Gmbh | Verfahren zur Behandlung einer Biomoleküle enthaltenden Probe |
| EP2889370A1 (en) | 2007-12-11 | 2015-07-01 | The Scripps Research Institute | In vivo unnatural amino acid expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5011915A (en) | 1987-10-26 | 1991-04-30 | Merck & Co., Inc. | Process for purifying recombinant hepatitis antigens |
| US5407810A (en) | 1993-08-20 | 1995-04-18 | Genentech, Inc. | Aqueous multiple-phase isolation of polypeptide |
| US7229789B1 (en) * | 2001-01-19 | 2007-06-12 | N.V. Organon | Methods and compositions for extracting proteins from cells |
-
2001
- 2001-01-19 US US09/766,043 patent/US7229789B1/en active Active
-
2002
- 2002-01-18 WO PCT/US2002/001670 patent/WO2002057478A1/en active Application Filing
- 2002-01-18 AT AT02707529T patent/ATE452984T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-01-18 CA CA002434844A patent/CA2434844A1/en not_active Abandoned
- 2002-01-18 DE DE60234811T patent/DE60234811D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-18 JP JP2002558530A patent/JP4372421B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-18 US US10/052,690 patent/US6821752B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-18 ES ES02707529T patent/ES2336548T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-01-18 EP EP02707529A patent/EP1356076B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US7229789B1 (en) | 2007-06-12 |
| US6821752B2 (en) | 2004-11-23 |
| JP2004520040A (ja) | 2004-07-08 |
| DE60234811D1 (de) | 2010-02-04 |
| EP1356076A4 (en) | 2004-03-17 |
| EP1356076A1 (en) | 2003-10-29 |
| EP1356076B1 (en) | 2009-12-23 |
| WO2002057478A1 (en) | 2002-07-25 |
| ATE452984T1 (de) | 2010-01-15 |
| US20030003534A1 (en) | 2003-01-02 |
| JP4372421B2 (ja) | 2009-11-25 |
| CA2434844A1 (en) | 2002-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Feliciello et al. | A modified alkaline lysis method for the preparation of highly purified plasmid DNA from Escherichia coli | |
| Ito et al. | Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations | |
| Anzenbacher et al. | Metabolism of drugs and other xenobiotics | |
| CA1305284C (en) | Method for the recovery of cellular proteins in active form | |
| ES2376173T3 (es) | Método de preparación de adn plasm�?dico de grado farmacéutico. | |
| US7553658B2 (en) | Recovery of plasmids in an aqueous two-phase system | |
| ES2847151T3 (es) | Composiciones y métodos que usan cápsidas resistentes a las hidrolasas | |
| JP6728294B2 (ja) | たんぱく質精製の新規な方法 | |
| ES2336548T3 (es) | Metodos y composiciones para extraer proteinas de celulas. | |
| JPH05500602A (ja) | 微生物学的に生成されたキモシンの回収方法 | |
| KR100486179B1 (ko) | 핵산을 분리하고 정제하기 위한 세포 용해 조성물, 방법 및 키트 | |
| Fedoroff et al. | Factor requirement of the bacteriophage f2 replicase | |
| CN110846326A (zh) | 一种貉细小病毒vp2基因、表达载体、重组菌、制备vp2蛋白的方法和组装方法 | |
| Holck et al. | DNA-and RNA-binding proteins of chromatin from Escherichia coli | |
| JP4610559B2 (ja) | 水性２相系によってプラスミドｄｎａを得る方法 | |
| Brand et al. | Strategies for plasmid DNA production in Escherichia coli | |
| WO2002026966A2 (en) | Transfection using plasmid preparations | |
| KR101775790B1 (ko) | 핵산 분리 및 정제를 위한 세포용해 조성물 | |
| KR100337046B1 (ko) | 연속원심분리기로의 ｄｎａ 의 정제 방법 | |
| CN114672502B (zh) | 温控无细胞反应体系的构建方法和该方法使用的质粒以及用途 | |
| CN116769814B (zh) | 一种大肠杆菌益生菌t7表达系统及其应用 | |
| Anant et al. | [3] Isolation of low molecular weight DNA from bacteria and animal cells | |
| CN116874570A (zh) | 一种去除新冠病毒核衣壳蛋白体系中核酸污染的方法 | |
| CN106867994B (zh) | 应用于质粒dna提取的快速沉淀缓冲液及其应用 | |
| MacBeth | Identification and characterization of an endoribonuclease activity of Leishmaniavirus capsids |