CN102139116B - 禽霍乱外膜蛋白a基因疫苗的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种禽多杀性巴氏杆菌病核酸疫苗的制备方法，以禽多杀性巴氏杆菌基因组序列设计引物，以禽多杀性巴氏杆菌CVCC474菌株基因组为模板通过PCR扩增出目的基因，利用限制性内切酶KpnⅠ和限制性内切酶EcoRⅠ对目的基因和真核表达载体pcDNA3.1(+)进行酶切，后将目的基因和真核表达载体pcDNA3.1(+)进行连接，转化入大肠杆菌感受态JM83中，提取质粒，酶切鉴定后获得禽多杀性巴氏杆菌病核酸疫苗；本发明方法所制备出的禽多杀性巴氏杆菌病核酸疫苗通过动物试验检测表明，可降低禽多杀性巴氏杆菌病的发生，降低禽多杀性巴氏杆菌对禽类侵袭，其制作方法简单，容易操作。
Description
技术领域
本发明涉及一种细菌疾病疫苗的制备方法，具体的说是禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗的制备方法。
背景技术
禽霍乱也称为禽多杀性巴氏杆菌病，是由禽霍乱菌（又称为禽多杀性巴氏杆菌）引起的一种家禽的接触性传染病，在我国是常见的多发性传染病，而且在世界各国均有分布，几乎所有的家禽都能感染该病，其传染流行严重影响家禽业的健康发展，给家禽业带来了巨大的经济损失。
目前我国对于禽霍乱的控制主要采用抗生素药物治疗，但药物治疗存在一定的缺点，停药后容易复发，长期应用可能会对禽体产生明显的毒害作用，引起产蛋鸡的产蛋率下降，而且长期或者反复用药容易导致禽霍乱菌产生耐药性。
目前对于禽霍乱的预防措施主要采用的是疫苗注射，常用的疫苗包括弱毒活疫苗和灭活疫苗两种，但两种疫苗的免疫效果并不是特别理想，弱毒活疫苗的免疫持续期不够长，免疫保护力不够高，而且给家禽注射后具有一定的副作用，甚至可能会造成一些死亡。灭活疫苗存在保护率低和免疫期短的问题，比弱毒活疫苗更为严重，因此灭活疫苗的免疫效果尚不及弱毒活疫苗。
外膜蛋白A基因是禽霍乱菌主要的保护性抗原之一，进入机体后可诱导机体的免疫系统产生一定的免疫应答，为机体提供抗禽霍乱感染的保护力，因此，用禽霍乱菌外膜蛋白A基因可制备相应的疫苗用以预防禽霍乱。
发明内容
本发明针对上述问题，提供了一种可用于预防禽霍乱的禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗的制备方法，通过该方法制备出的疫苗，具有制备简单，操作方便的优点，制得的产品能有效的防止禽霍乱对鸡的伤害。
本发明为解决上述问题，提供的技术方案为
步骤一、引物设计
根据禽霍乱菌基因组序列设计用于扩增禽霍乱菌外膜蛋白A基因的两条引物P1和P2：
P1：5’-GCGGTACCatgaaaaaaacagcaattgc-3’；
P2：5’-CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3’；
步骤二、禽霍乱菌外膜蛋白A基因的PCR扩增及纯化
1）在0.2ml的PCR反应管中加入引物P1和引物P2各1μl，再依次加入DNA聚合酶0.5μl、聚合酶缓冲液2.5μl、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3μl、禽巴氏杆菌的基因组1μl和水16μl，再将含有上述试剂的PCR反应管放入PCR扩增仪中，进行PCR反应，PCR反应程序：首先进行94oC预变性，时间为5分钟，预变性结束后进入循环过程，每个循环的程序为：94oC变性，时间为1分钟，57oC复性，时间为45秒钟，72oC延伸，时间为1分钟，将上述循环程序重复30次，30次循环结束后，72oC再次延伸，时间10分钟，得到PCR扩增的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物，备用；
2）利用琼脂糖凝胶电泳检测禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物，在凝胶成像系统中观察到目的基因后，备用；
3）按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作：取1.5ml的离心管a并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上含有的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物切下来，将切下来的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物放在已称重的1.5ml的离心管a中，称取离心管a的总重并计算出从凝胶上切下来的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物的重量，然后将离心管a中的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管a放置在50oC水浴中加热至离心管a中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱a上，DNA纯化柱a位于收集管a中，在21oC条件下放置1分钟，后将收集管a放在离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a中加入700μl的溶液Ⅱ，在21oC条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，后向DNA纯化柱a上加入500μl的溶液Ⅱ，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，将收集管a在转速为13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a置于1.5ml的离心管b中，在DNA纯化柱a上加入40μl溶液Ⅲ，将离心管b在21oC条件下放置1分钟，将离心管b在转速为13000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱a得到离心管b中的40μl液体，该液体就是纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因；
步骤三、真核表达载体pcDNA3.1+的酶切及纯化：
1）酶切体系的配制：在1.5ml的离心管c中加入真核表达载体pcDNA3.1+ 10μl、限制性内切酶KpnⅠ3μl、限制性内切酶EcoRⅠ3μl、限制性内切酶缓冲液5μl和水29μl，混合均匀止，得到的混合物A，将上述混合物A放入37oC的水浴锅中反应8小时，备用；
2）利用琼脂糖凝胶电泳对混合物A进行检测
利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物A，在凝胶成像系统中进行观察，备用；
3）按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作：取1.5ml的离心管d并称其重量，在紫外灯下将凝胶上的混合物A切下来，将切下来的混合物A放在已称重的1.5ml的离心管d中，称取离心管d的总重并计算出从凝胶上切下来的混合物A的重量，然后将离心管d中的混合物A捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管d放置在50oC水浴中加热至混合物A完全融解，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱b上，DNA纯化柱b位于收集管b中，收集管b在21℃条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，向DNA纯化柱b上加入700μl的溶液Ⅱ，收集管b在21℃条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，向DNA纯化柱b上加入500μl的溶液Ⅱ，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，倒掉收集管b中的液体后将放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b放置于1.5ml的离心管e中，后在DNA纯化柱b上加入40μl溶液Ⅲ，将离心管e在21℃条件下放置1分钟，放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b得到离心管中e中的液体，该液体就是酶切并纯化后的真核表达载体pcDNA3.1+，备用；
步骤四、禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗的制备：
1）在1.5ml的离心管f中依次加入纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因15μl、限制性内切酶KpnⅠ3μl、限制性内切酶EcoRⅠ3μl、限制性内切酶缓冲液5μl和水24μl，混合均匀止，得到的混合物B，将上述混合物B放入37oC的水浴锅中反应5小时，取出备用；
2）利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物B，在凝胶成像系统中进行观察，备用；
3.按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作：取1.5ml的离心管g并称其重量，在紫外灯下将凝胶的混合物B切下来，将切下来的混合物B放在已称重的1.5ml的离心管g中，称取离心管g的总重并计算出从凝胶上切下的混合物B的重量，然后将离心管g中的混合物B捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管g放置在50oC水浴中加热至混合物B完全融解，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱c上，DNA纯化柱c位于收集管c中，收集管c在21℃条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，离心后倒掉收集管c内的液体，向DNA纯化柱c上加入700μl的溶液Ⅱ，收集管c在21℃条件下将放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，向DNA纯化柱c上加入500μl的溶液Ⅱ，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，倒掉收集管c中的液体后将放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱c并放置于1.5ml的离心管h中，后在DNA纯化柱c上加入40μl溶液Ⅲ，将离心管h在21℃条件下放置1分钟，放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱c得到离心管中h中的40μl液体，该液体就是酶切并纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因，备用；
4）在1.5ml的离心管i中，依次加入酶切并纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因10μl、酶切并纯化后的真核表达载体pcDNA3.1+2μl、DNA连接酶1μl、DNA连接酶缓冲液2μl和水5μl，混合均匀止，将离心管i放入16oC的水浴锅中，反应12小时，备用；
5）待反应结束后，在离心管i中加入200μl的大肠杆菌JM83，先将离心管i置于0oC的冰水混合物中，时间30分钟，取出置于42oC条件下，放置90秒，再取出，将离心管i置于0oC的冰水混合物中，放置3分钟，后向离心管i中加入0.5ml的LB液体培养基，形成含有LB液体培养基的混合液，备用；
6）将离心管i置于37oC的摇床中振荡培养，转速200转/分钟，时间为1.5小时，结束后，取100μl含LB液体培养基的混合液涂布于含浓度为50μg/ml氨苄青霉素的LB培养固体培养基上，将涂布后的LB培养固体培养基置于37oC的培养箱内，倒置培养16小时，备用；
7）挑取培养后的LB培养固体培养基上的1个菌落，将菌落放入5ml含氨苄青霉素的的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为50μg/ml，后将含氨苄青霉素的LB液体培养基置于37oC恒温摇床内，在转速为200转/分钟，振荡培养16小时；
8）待振荡培养结束后，取1ml含有菌落的LB液体培养液加到1.5ml的离心管j中，将离心管j放入离心机内离心，转速12000转/分钟，离心5分钟，弃去离心管j中的上层澄清液体，加入100μl的预先冷却至4oC的溶液Ⅳ，均匀混合后，加入200μl的溶液Ⅴ，混合均匀止，后将离心管j置于0oC的冰水混合物中，放置3分钟，后向离心管j中加入150μl的预先冷却至4oC的溶液Ⅵ，混合均匀，后将离心管j放于0oC的冰水混合物中，静置5分钟，取出放入冷冻离心机内，在转速为12000转/分钟，4oC的条件下离心10分钟，后取出，备用；
9）取离心管j中的上层澄清液体400μl，将其加到1.5ml的离心管k中，向离心管k中加入苯酚200μl和氯仿200μl，振荡混匀后，放入冷冻离心机内，在转速为12000转/分钟，4oC条件下离心10分钟，待离心结束后取上层液体400μl移入到1.5ml的离心管m中，加入800μl的无水乙醇，将离心管m于-20oC条件下，放置20分钟，后取出放入冷冻离心机内，转速13000 转/分钟，4oC条件下离心10分钟，弃去离心管m中的上层澄清液体；
10）在离心管m中加入浓度为70％的乙醇0.5ml，放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC条件下离心5分钟，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅰ，该沉淀物Ⅰ为pCA质粒，待pCA质粒干燥后，加入30μl超纯水进行溶解，得到的溶液为pCA质粒溶液；
11）在1.5ml的离心管n中，加入2μl的pCA质粒溶液，后依次向离心管n中加入1μl的限制性内切酶KpnⅠ、1μl的限制性内切酶EcoRⅠ、1μl的限制性内切酶缓冲液和水5μl，混合均匀后，置于37oC条件下，反应2小时，形成酶切液；
12）利用琼脂糖凝胶电泳检测pCA质粒酶，在凝胶成像系统中进行观察，观察到1050bp大小的条带，pCA质粒是本发明制备的禽霍乱菌外膜蛋白A基因疫苗；
步骤五、禽霍乱菌外膜蛋白A基因疫苗即pCA质粒的大量制备：
1）挑取步骤四中含有pCA质粒的大肠杆菌JM83；
2）挑取培养后LB培养固体培养基上的1个菌落，将菌落放入25ml含氨苄青霉素的的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为50μg/ml，后将LB液体培养基，置于37oC恒温摇床内振荡培养，转速200转/分钟，至液体在600纳米处的吸光度，OD600值为0.6止，将振荡培养后的液体转至500ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为50μg/ml，置于37oC恒温摇床内振荡培养，转速200转/分钟，培养15小时；
3）待振荡培养结束后，将含有菌落的500ml LB液体培养基放入1000ml的离心管中，将1000ml的离心管放入冷冻离心机内，转速6000转/分钟，4oC条件下离心时间15分钟，弃去上层澄清液体得到沉淀物Ⅱ，向离心管中加入18ml的预先冷却至4oC的溶液Ⅳ，将沉淀物Ⅱ悬浮，再加入2ml浓度为10mg/ml的溶菌酶，至混合均匀止，再加入40ml的溶液Ⅴ，混合均匀止，将1000ml的离心管置于20oC条件下，放置5分钟，后向1000ml的离心管中加入20ml 预先冷却至4oC的溶液Ⅵ，混合均匀，将其放于0oC的冰水混合物中，静置10分钟， 取出放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC条件下离心20分钟，取上层澄清液体，备用；
4）在200ml的离心管中，加入步骤3中的上层澄清液体80ml，再加入32ml的异丙醇，振荡混匀后在20oC条件下放置10分钟，后放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC的条件下离心20分钟，待离心结束后倒掉上层澄清液体，得到200ml的离心管中的沉淀物Ⅲ，再向200ml的离心管中加入50ml的70%的乙醇，将200ml的离心管放入冷冻离心机内，转速12000 转/分钟，4oC的条件下离心5分钟，弃去澄清液体，待沉淀物Ⅲ干燥后备用；
5）在含有沉淀物Ⅲ的200ml离心管中加入3ml的pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸，TE溶液，使沉淀物Ⅲ溶解，将溶解后的溶液转移至15ml的离心管中，在0oC的冰水混合物中，放置10分钟，后向15ml的离心管中加入3ml的浓度为5mol/l的氯化锂溶液，放入冷冻离心机内，转速10000转/分钟，离心时间10分钟，取上层澄清液体，备用；
6）在10ml的离心管中加入步骤5中的上层澄清液体和等体积的异丙醇，混合均匀止放于20oC条件下，放置10分钟，放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC条件下离心10分钟，弃去上层澄清液体，加入5ml浓度为70%的乙醇，放入冷冻离心机内，转速12000 转/分钟，4oC的条件下离心5分钟，倒掉上层澄清液体，得到沉淀物Ⅳ，干燥，备用；
7）向含有沉淀物Ⅳ的10ml的离心管中加入0.5ml含有浓度为100mg/ml的RNA酶A的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸，TE溶液，将沉淀物Ⅳ溶解，后向溶液中加入0.25ml的苯酚和0.25ml的氯仿，至混合均匀止，将10ml的离心管放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC的条件下离心10分钟，取0.5ml的上层澄清液体转至5ml的离心管内，加入1ml的无水乙醇，置于-20oC条件下，放置20分钟，放入冷冻离心机内，转速13000 转/分钟，4oC条件下离心10分钟，弃去上清液弃掉，得到沉淀物Ⅴ，干燥备用；
8）向含有沉淀物Ⅴ的5ml离心管中加入1ml超纯水，使沉淀物Ⅴ溶解，加入0.5ml的聚乙二醇-氯化镁，PEG-MgCl2溶液，置于20oC条件下，放置30分钟，放入离心机内，转速13000转/分钟，离心20分钟，弃去上层澄清液体，加入0.5ml浓度为70%的乙醇，放入离心机内，转速13000转/分钟，离心5分钟，倒掉上层澄清液体，得到沉淀物Ⅵ，该沉淀物就是大量制备的pCA质粒即大量制备的禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗；
9）向含有沉淀物Ⅵ的5ml离心管中加入1ml浓度为0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液，使沉淀物Ⅵ溶解，溶解后的溶液为大量制备的pCA质粒溶液，后用分光光度计测定溶液中所含的pCA质粒的浓度，备用；
10）对禽霍乱菌的外膜蛋白A基因进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像系统中观察到条带为1050bp时，证明禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗制备成功。
本发明涉及到以下菌种和试剂：
禽霍乱菌（Avian Pasteμrella mμhocida）购买自中国兽医药品监察所，见生物材料保藏证明附件1、附件2、附件4；
大肠杆菌JM83（Escherichia.coli JM83）购买自华美生物工程有限公司，见生物材料保藏证明附件3；
DNA凝胶回收试剂盒由碧云天生物技术研究所提供，该试剂盒中自配有成品的溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ。
有益效果
本发明提供了一种禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗的制备方法，该方法制备简单，容易操作。
本发明所用的真核载体为pcDNA3.1(+)，该载体具有合适的多克隆位点，有高效能稳定和瞬时转染哺乳动物及人类细胞的能力，具有高效率CMV立即早期启动子和增强子、T7启动子、BGH多腺苷酸信号、SV40早期启动子等，有利于外源基因的表达，同时该载体含有氨苄青霉素抗性基因（Ampr），可用作筛选标记，该基因中还含有免疫增强CpG DNA序列，可增强疫苗的免疫效果。
具体实施方式
步骤一、引物设计
根据禽霍乱菌基因组序列设计用于扩增禽霍乱菌外膜蛋白A基因的两条引物P1和P2：
P1：5’-GCGGTACCatgaaaaaaacagcaattgc-3’；
P2：5’-CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3’；
步骤二、禽霍乱菌外膜蛋白A基因的PCR扩增及纯化
1）在0.2ml的PCR反应管中加入引物P1和引物P2各1μl，再依次加入DNA聚合酶0.5μl、聚合酶缓冲液2.5μl、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3μl、禽巴氏杆菌的基因组1μl和水16μl，再将含有上述试剂的PCR反应管放入PCR扩增仪中，进行PCR反应，PCR反应程序：首先进行94oC预变性，时间为5分钟，预变性结束后进入循环过程，每个循环的程序为：94oC变性，时间为1分钟，57oC复性，时间为45秒钟，72oC延伸，时间为1分钟，将上述循环程序重复30次，30次循环结束后，72oC再次延伸，时间10分钟，得到PCR扩增的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物，备用；
2）称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5μl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中观察到目的基因后，备用；
3）按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作：取1.5ml的离心管a并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上含有的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物切下来，将切下来的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物放在已称重的1.5ml的离心管a中，称取离心管a的总重并计算出从凝胶上切下来的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物的重量，然后将离心管a中的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管a放置在50oC水浴中加热至离心管a中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱a上，DNA纯化柱a位于收集管a中，在21oC条件下放置1分钟，后将收集管a放在离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a中加入700μl的溶液Ⅱ，在21oC条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，后向DNA纯化柱a上加入500μl的溶液Ⅱ，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，将收集管a在转速为13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a置于1.5ml的离心管b中，在DNA纯化柱a上加入40μl溶液Ⅲ，将离心管b在21oC条件下放置1分钟，将离心管b在转速为13000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱a得到离心管b中的40μl液体，该液体就是纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因；
步骤三、真核表达载体pcDNA3.1(+)的酶切及纯化：
1）酶切体系的配制：在1.5ml的离心管c中加入真核表达载体pcDNA3.1(+) 10μl、限制性内切酶KpnⅠ3μl、限制性内切酶EcoRⅠ3μl、限制性内切酶缓冲液5μl和水29μl，混合均匀止，得到的混合物A，将上述混合物A放入37oC的水浴锅中反应8小时，备用；
2）利用琼脂糖凝胶电泳对混合物A进行检测
称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5μl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将混合物A加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中进行观察，备用；
3）按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作：取1.5ml的离心管d并称其重量，在紫外灯下将凝胶上的混合物A切下来，将切下来的混合物A放在已称重的1.5ml的离心管d中，称取离心管d的总重并计算出从凝胶上切下来的混合物A的重量，然后将离心管d中的混合物A捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管d放置在50oC水浴中加热至混合物A完全融解，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱b上，DNA纯化柱b位于收集管b中，收集管b在21℃条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，向DNA纯化柱b上加入700μl的溶液Ⅱ，收集管b在21℃条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，向DNA纯化柱b上加入500μl的溶液Ⅱ，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，倒掉收集管b中的液体后将放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b放置于1.5ml的离心管e中，后在DNA纯化柱b上加入40μl溶液Ⅲ，将离心管e在21℃条件下放置1分钟，放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b得到离心管中e中的液体，该液体就是酶切并纯化后的真核表达载体pcDNA3.1(+)，备用；
步骤四、禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗的制备：
1）在1.5ml的离心管f中依次加入纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因15μl、限制性内切酶KpnⅠ3μl、限制性内切酶EcoRⅠ3μl、限制性内切酶缓冲液5μl和水24μl，混合均匀止，得到的混合物B，将上述混合物B放入37oC的水浴锅中反应5小时，取出备用；
2）称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5μl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将混合物B加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中进行观察，备用；
3）按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作：取1.5ml的离心管g并称其重量，在紫外灯下将凝胶的混合物B切下来，将切下来的混合物B放在已称重的1.5ml的离心管g中，称取离心管g的总重并计算出从凝胶上切下的混合物B的重量，然后将离心管g中的混合物B捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管g放置在50oC水浴中加热至混合物B完全融解，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱c上，DNA纯化柱c位于收集管c中，收集管c在21℃条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，离心后倒掉收集管c内的液体，向DNA纯化柱c上加入700μl的溶液Ⅱ，收集管c在21℃条件下将放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，向DNA纯化柱c上加入500μl的溶液Ⅱ，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，倒掉收集管c中的液体后将放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱c并放置于1.5ml的离心管h中，后在DNA纯化柱c上加入40μl溶液Ⅲ，将离心管h在21℃条件下放置1分钟，放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱c得到离心管中h中的40μl液体，该液体就是酶切并纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因，备用；
4）在1.5ml的离心管i中，依次加入酶切并纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因10μl、酶切并纯化后的真核表达载体pcDNA3.1(+) 2μl、DNA连接酶1μl、DNA连接酶缓冲液2μl和水5μl，混合均匀止，将离心管i放入16oC的水浴锅中，反应12小时，备用；
5）待反应结束后，在离心管i中加入200μl的大肠杆菌JM83，先将离心管i置于0oC的冰水混合物中，时间30分钟，取出置于42oC条件下，放置90秒，再取出，将离心管i置于0oC的冰水混合物中，放置3分钟，后向离心管i中加入0.5ml的LB液体培养基，形成含有LB液体培养基的混合液，备用；
6）将离心管i置于37oC的摇床中振荡培养，转速200转/分钟，时间为1.5小时，结束后，取100μl含LB液体培养基的混合液涂布于含浓度为50μg/ml氨苄青霉素的LB培养固体培养基上，将涂布后的LB培养固体培养基置于37oC的培养箱内，倒置培养16小时，备用；
7）挑取培养后的LB培养固体培养基上的1个菌落，将菌落放入5ml含氨苄青霉素的的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为50μg/ml，后将含氨苄青霉素的LB液体培养基置于37oC恒温摇床内，在转速为200转/分钟，振荡培养16小时；
8）待振荡培养结束后，取1ml含有菌落的LB液体培养液加到1.5ml的离心管j中，将离心管j放入离心机内离心，转速12000转/分钟，离心5分钟，弃去离心管j中的上层澄清液体，加入100μl的预先冷却至4oC的溶液Ⅳ，均匀混合后，加入200μl的溶液Ⅴ，混合均匀止，后将离心管j置于0oC的冰水混合物中，放置3分钟，后向离心管j中加入150μl的预先冷却至4oC的溶液Ⅵ，混合均匀，后将离心管j放于0oC的冰水混合物中，静置5分钟，取出放入冷冻离心机内，在转速为12000转/分钟，4oC的条件下离心10分钟，后取出，备用；
9）取离心管j中的上层澄清液体400μl，将其加到1.5ml的离心管k中，向离心管k中加入苯酚200μl和氯仿200μl，振荡混匀后，放入冷冻离心机内，在转速为12000转/分钟，4oC条件下离心10分钟，待离心结束后取上层液体400μl移入到1.5ml的离心管m中，加入800μl的无水乙醇，将离心管m于-20oC条件下，放置20分钟，后取出放入冷冻离心机内，转速13000 转/分钟，4oC条件下离心10分钟，弃去离心管m中的上层澄清液体；
10）在离心管m中加入浓度为70％的乙醇0.5ml，放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC条件下离心5分钟，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅰ，该沉淀物Ⅰ为pCA质粒，待pCA质粒干燥后，加入30μl超纯水进行溶解，得到的溶液为pCA质粒溶液；
11）在1.5ml的离心管n中，加入2μl的pCA质粒溶液，后依次向离心管n中加入1μl的限制性内切酶KpnⅠ、1μl的限制性内切酶EcoRⅠ、1μl的限制性内切酶缓冲液和水5μl，混合均匀后，置于37oC条件下，反应2小时，形成酶切液；
12）称取1.0克琼脂糖粉末加入到100ml的1倍电泳缓冲液中并在微波炉内煮沸使琼脂糖粉末充分溶解，加入5μl的溴化乙锭溶液，至混合均匀止，后倒入制胶板中，插入制胶梳，凝固后的固体称为凝胶，拔去制胶梳，在凝胶上出现一排点样孔；将凝胶放入1倍电泳缓冲液中，将pCA质粒酶切液加入到凝胶的点样孔中，打开电泳仪开关，在电泳仪电压为120伏特时开始电泳，电泳20分钟后关闭电泳仪，在凝胶成像系统中进行观察，观察到1050bp大小的条带，证明该pCA质粒是本发明制备的禽霍乱菌外膜蛋白A基因疫苗；
步骤五、禽霍乱菌外膜蛋白A基因疫苗即pCA质粒的大量制备：
1）挑取步骤四中含有pCA质粒的大肠杆菌JM83；
2）挑取培养后LB培养固体培养基上的1个菌落，将菌落放入25ml含氨苄青霉素的的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为50μg/ml，后将LB液体培养基，置于37oC恒温摇床内振荡培养，转速200转/分钟，至液体在600纳米处的吸光度（OD600值）为0.6止，将振荡培养后的液体转至500ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为50μg/ml，置于37oC恒温摇床内振荡培养，转速200转/分钟，培养15小时；
3）待振荡培养结束后，将含有菌落的500ml LB液体培养基放入1000ml的离心管中，将1000ml的离心管放入冷冻离心机内，转速6000转/分钟，4oC条件下离心时间15分钟，弃去上层澄清液体得到沉淀物Ⅱ，向离心管中加入18ml的预先冷却至4oC的溶液Ⅳ，将沉淀物Ⅱ悬浮，再加入2ml浓度为10mg/ml的溶菌酶，至混合均匀止，再加入40ml的溶液Ⅴ，混合均匀止，将1000ml的离心管置于20oC条件下，放置5分钟，后向1000ml的离心管中加入20ml 预先冷却至4oC的溶液Ⅵ，混合均匀，将其放于0oC的冰水混合物中，静置10分钟， 取出放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC条件下离心20分钟，取上层澄清液体，备用；
4）在200ml的离心管中，加入步骤3中的上层澄清液体80ml，再加入32ml的异丙醇，振荡混匀后在20oC条件下放置10分钟，后放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC的条件下离心20分钟，待离心结束后倒掉上层澄清液体，得到200ml的离心管中的沉淀物Ⅲ，再向200ml的离心管中加入50ml的70%的乙醇，将200ml的离心管放入冷冻离心机内，转速12000 转/分钟，4oC的条件下离心5分钟，弃去澄清液体，待沉淀物Ⅲ干燥后备用；
5）在含有沉淀物Ⅲ的200ml离心管中加入3ml的pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）溶液，使沉淀物Ⅲ溶解，将溶解后的溶液转移至15ml的离心管中，在0oC的冰水混合物中，放置10分钟，后向15ml的离心管中加入3ml的浓度为5mol/l的氯化锂溶液，放入冷冻离心机内，转速10000转/分钟，离心时间10分钟，取上层澄清液体，备用；
6）在10ml的离心管中加入步骤5中的上层澄清液体和等体积的异丙醇，混合均匀止放于20oC条件下，放置10分钟，放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC条件下离心10分钟，弃去上层澄清液体，加入5ml浓度为70%的乙醇，放入冷冻离心机内，转速12000 转/分钟，4oC的条件下离心5分钟，倒掉上层澄清液体，得到沉淀物Ⅳ，干燥，备用；
7）向含有沉淀物Ⅳ的10ml的离心管中加入0.5ml含有浓度为100mg/ml的RNA酶A的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）溶液，将沉淀物Ⅳ溶解，后向溶液中加入0.25ml的苯酚和0.25ml的氯仿，至混合均匀止，将10ml的离心管放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC的条件下离心10分钟，取0.5ml的上层澄清液体转至5ml的离心管内，加入1ml的无水乙醇，置于-20oC条件下，放置20分钟，放入冷冻离心机内，转速13000 转/分钟，4oC条件下离心10分钟，弃去上清液弃掉，得到沉淀物Ⅴ，干燥备用；
8）向含有沉淀物Ⅴ的5ml离心管中加入1ml超纯水，使沉淀物Ⅴ溶解，加入0.5ml的聚乙二醇-氯化镁（PEG-MgCl2）溶液，置于20oC条件下，放置30分钟，放入离心机内，转速13000转/分钟，离心20分钟，弃去上层澄清液体，加入0.5ml浓度为70%的乙醇，放入离心机内，转速13000转/分钟，离心5分钟，倒掉上层澄清液体，得到沉淀物Ⅵ，该沉淀物就是大量制备的pCA质粒即大量制备的禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗；
9）向含有沉淀物Ⅵ的5ml离心管中加入1ml浓度为0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液，使沉淀物Ⅵ溶解，溶解后的溶液为大量制备的pCA质粒溶液，后用分光光度计测定溶液中所含的pCA质粒的浓度，备用；
10）对禽霍乱菌的外膜蛋白A基因进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像系统中观察到条带为1050bp时，证明禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗制备成功；
步骤六、动物免疫实验：
取1日龄的没经过免疫的雏鸡40只，每日按正常日粮饲养，4周龄时将其平均分为试验组和对照组，每组20只，试验组共三次免疫，第一次免疫时间为4周龄，第二次免疫时间为6周龄，第三次免疫时间为8周龄，注射提取的禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗即pCA质粒，每次免疫的剂量200μg/只，采用大腿内侧肌肉注射；对照组的20只鸡不进行任何免疫；
步骤七、动物攻毒实验：
10周龄时，对试验组和对照组进行肌肉注射禽霍乱菌，攻毒剂量为每只鸡注射1×109个禽霍乱菌，攻毒之后，对两组继续饲养至12周龄时止，记录两组在12周龄时的存活量，并计算出试验组和对照组的保护率，保护率越高说明免疫预防效果越好；
试验组的保护率的计算方法如下：
（试验组在12周龄时存活量÷20）×100%
对照组的保护率的计算方法如下：
（对照组在12周龄时存活量÷20）×100%
结果显示，试验组在12周龄时存活13只，试验组的保护率为65%；对照组在12周龄全部死亡，对照组的保护率为0%，说明利用本发明制备出的禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗pCA给鸡进行三次免疫之后能使被免疫鸡有效地预防禽霍乱。
所述的LB培养固体培养基的组成成分为按重量比每升LB培养固体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1.5%的琼脂粉和水。
所述的LB液体培养基的组成成分为按重量比每升LB液体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠，余量为水。
所述的溶液Ⅰ的组成成分为按质量比每升溶液Ⅰ中含有50 mmol/L的葡萄糖、25 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、10 mmol/L的乙二胺四乙酸，余量为水。
所述的溶液Ⅱ的组成成分为按重量比每升溶液Ⅱ中含有10mmol/L的氢氧化钠、10%的十二烷基磺酸钠，余量为水。
所述的溶液Ⅲ的组成成分为按重量比每升溶液Ⅲ中含有60%的5 mol/L的乙酸钾、11.5%的冰醋酸，余量为水。
所述的磷酸盐缓冲液的组成成分为按重量比每升磷酸盐缓冲液中含有0.8%的氯化钠、0.02%的磷酸二氢钾、0.02%的氯化钾、0.29%的十二水合磷酸氢二钠，余量为水。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南科技大学
<120> 禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗的制备方法
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1050
<212> DNA
<213> 禽多杀性巴氏杆菌CVCC474菌株
<400> 1
atgaaaaaaa cagcaattgc attgactatc gttgcactag ccgtggcttc agttgcacaa 60
gctgcaccac aacctaacac attctatgta ggtgctaaag caggttgggc atctttccac 120
gatggtttaa atcaagctaa atatcttgaa gctcctgagg ctacatttgg ctttaaacgt 180
aatagcgtta cttatggcgt gtttggtgaa tatcaaatca ctgataattt tgcagtagag 240
ttaggctatg atgattttgg tcgtgcgaag ttacgtatgg ctgaaaaaga tcaaaaagca 300
aaagatgcag caaaacacac taaccatggt gcgcatttaa gcttaaaagc aagctatcct 360
gtacttgatg gtttagatat ttatgcgcgt gttggagcag cattaattcg ctcagattat 420
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caagtttctc cagtattcgc aggtggttta gaatatgcgt ttatgcctga gttagcttta 540
cgtgttgaat accaatgggt aaacaatgta ggtaaagtta aagatgttct tggagaacgc 600
gtagattaca gaccagatat cggctctgta acagctggtt tcggtcaatc tgtttatgta 660
ccagaagttg tgagcaaaac attcacatta aactctgatg tgacattcgg tttcgataaa 720
gctgacttaa aaccagctgc acaaaacgtg ttagatggta tctacggtga aatcgcccag 780
ttaaaatctg cctctgttgc agttgctggt tacacagacc gtttaggttc tgatgcatac 840
aacttaaaat tatcacaacg tcgtgctgac actgtggcta actacttagt agcgaaaggt 900
gttgcacaaa acgctatcag tgcaacaggt catggtgaag cgaaccctgt aactggtaac 960
aaatgtgatt cagttaaagg tcgtaaagca cttatcgcat gtttagctga cgatcgtcgc 1020
gttgaaatcg ctgttaaagg taacaaataa 1050
Claims (1)
1.一种禽多杀性巴氏杆菌病核酸疫苗的制备方法，其特征在于：
步骤一、引物设计
根据禽霍乱菌基因组序列设计用于扩增禽霍乱菌外膜蛋白A基因的两条引物P1和P2：
P1：5’-GCGGTACCatgaaaaaaacagcaattgc-3’；
P2：5’-CGCGCGAATTCTTATTTGTTACCTTTAACAGCG-3’；
步骤二、禽霍乱菌外膜蛋白A基因的PCR扩增及纯化
1）在0.2ml的PCR反应管中加入引物P1和引物P2各1μl，再依次加入DNA聚合酶0.5μl、聚合酶缓冲液2.5μl、四种双脱氧核糖核苷酸混合物3μl、禽巴氏杆菌的基因组1μl和水16μl，再将含有上述试剂的PCR反应管放入PCR扩增仪中，进行PCR反应，PCR反应程序：首先进行94oC预变性，时间为5分钟，预变性结束后进入循环过程，每个循环的程序为：94oC变性，时间为1分钟，57oC复性，时间为45秒钟，72oC延伸，时间为1分钟，将上述循环程序重复30次，30次循环结束后，72oC再次延伸，时间10分钟，得到PCR扩增的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物，备用；
2）利用琼脂糖凝胶电泳检测禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物，在凝胶成像系统中观察到目的基因后，备用；
3）按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作：取1.5ml的离心管a并称其重量，然后在紫外灯下将凝胶上含有的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物切下来，将切下来的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物放在已称重的1.5ml的离心管a中，称取离心管a的总重并计算出从凝胶上切下来的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物的重量，然后将离心管a中的禽霍乱菌外膜蛋白A基因的产物捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管a放置在50oC水浴中加热至离心管a中的物质完全融解止，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱a上，DNA纯化柱a位于收集管a中，在21oC条件下放置1分钟，后将收集管a放在离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，再向收集管a内的DNA纯化柱a中加入700μl的溶液Ⅱ，在21oC条件下放置1分钟，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，后向DNA纯化柱a上加入500μl的溶液Ⅱ，转速为12000转/分钟，离心1分钟，取出倒掉收集管a内的液体，将收集管a在转速为13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱a置于1.5ml的离心管b中，在DNA纯化柱a上加入40μl溶液Ⅲ，将离心管b在21oC条件下放置1分钟，将离心管b在转速为13000转/分钟，离心1分钟，弃去DNA纯化柱a得到离心管b中的40μl液体，该液体就是纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因；
步骤三、真核表达载体pcDNA3.1+的酶切及纯化：
1）酶切体系的配制：在1.5ml的离心管c中加入真核表达载体pcDNA3.1+ 10μl、限制性内切酶KpnⅠ3μl、限制性内切酶EcoRⅠ3μl、限制性内切酶缓冲液5μl和水29μl，混合均匀止，得到的混合物A，将上述混合物A放入37oC的水浴锅中反应8小时，备用；
2）利用琼脂糖凝胶电泳对混合物A进行检测
利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物A，在凝胶成像系统中进行观察，备用；
3）按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作：取1.5ml的离心管d并称其重量，在紫外灯下将凝胶上的混合物A切下来，将切下来的混合物A放在已称重的1.5ml的离心管d中，称取离心管d的总重并计算出从凝胶上切下来的混合物A的重量，然后将离心管d中的混合物A捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管d放置在50oC水浴中加热至混合物A完全融解，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱b上，DNA纯化柱b位于收集管b中，收集管b在21℃条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，向DNA纯化柱b上加入700μl的溶液Ⅱ，收集管b在21℃条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，向DNA纯化柱b上加入500μl的溶液Ⅱ，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管b内的液体，倒掉收集管b中的液体后将放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b放置于1.5ml的离心管e中，后在DNA纯化柱b上加入40μl溶液Ⅲ，将离心管e在21℃条件下放置1分钟，放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱b得到离心管中e中的液体，该液体就是酶切并纯化后的真核表达载体pcDNA3.1+，备用；
步骤四、禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗的制备：
1）在1.5ml的离心管f中依次加入纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因15μl、限制性内切酶KpnⅠ3μl、限制性内切酶EcoRⅠ3μl、限制性内切酶缓冲液5μl和水24μl，混合均匀止，得到的混合物B，将上述混合物B放入37oC的水浴锅中反应5小时，取出备用；
2）利用琼脂糖凝胶电泳检测混合物B，在凝胶成像系统中进行观察，备用；
3）按照DNA凝胶回收试剂盒的方法进行操作：取1.5ml的离心管g并称其重量，在紫外灯下将凝胶的混合物B切下来，将切下来的混合物B放在已称重的1.5ml的离心管g中，称取离心管g的总重并计算出从凝胶上切下的混合物B的重量，然后将离心管g中的混合物B捣碎，加入等体积的溶液Ⅰ，混合均匀止，将离心管g放置在50oC水浴中加热至混合物B完全融解，将融解后的溶液加入到DNA纯化柱c上，DNA纯化柱c位于收集管c中，收集管c在21℃条件下放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，离心后倒掉收集管c内的液体，向DNA纯化柱c上加入700μl的溶液Ⅱ，收集管c在21℃条件下将放置1分钟，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，向DNA纯化柱c上加入500μl的溶液Ⅱ，放入离心机中，转速为12000转/分钟，离心1分钟，离心后倒掉收集管c内的液体，倒掉收集管c中的液体后将放入离心机内，转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱c并放置于1.5ml的离心管h中，后在DNA纯化柱c上加入40μl溶液Ⅲ，将离心管h在21℃条件下放置1分钟，放入离心机内转速13000转/分钟，离心1分钟，取出DNA纯化柱c得到离心管中h中的40μl液体，该液体就是酶切并纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因，备用；
4）在1.5ml的离心管i中，依次加入酶切并纯化后的禽霍乱菌外膜蛋白A基因10μl、酶切并纯化后的真核表达载体pcDNA3.1+2μl、DNA连接酶1μl、DNA连接酶缓冲液2μl和水5μl，混合均匀止，将离心管i放入16oC的水浴锅中，反应12小时，备用；
5）待反应结束后，在离心管i中加入200μl的大肠杆菌JM83，先将离心管i置于0oC的冰水混合物中，时间30分钟，取出置于42oC条件下，放置90秒，再取出，将离心管i置于0oC的冰水混合物中，放置3分钟，后向离心管i中加入0.5ml的LB液体培养基，形成含有LB液体培养基的混合液，备用；
6）将离心管i置于37oC的摇床中振荡培养，转速200转/分钟，时间为1.5小时，结束后，取100μl含LB液体培养基的混合液涂布于含浓度为50μg/ml氨苄青霉素的LB培养固体培养基上，将涂布后的LB培养固体培养基置于37oC的培养箱内，倒置培养16小时，备用；
7）挑取培养后的LB培养固体培养基上的1个菌落，将菌落放入5ml含氨苄青霉素的的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为50μg/ml，后将含氨苄青霉素的LB液体培养基置于37oC恒温摇床内，在转速为200转/分钟，振荡培养16小时；
8）待振荡培养结束后，取1ml含有菌落的LB液体培养液加到1.5ml的离心管j中，将离心管j放入离心机内离心，转速12000转/分钟，离心5分钟，弃去离心管j中的上层澄清液体，加入100μl的预先冷却至4oC的溶液Ⅳ，均匀混合后，加入200μl的溶液Ⅴ，混合均匀止，后将离心管j置于0oC的冰水混合物中，放置3分钟，后向离心管j中加入150μl的预先冷却至4oC的溶液Ⅵ，混合均匀，后将离心管j放于0oC的冰水混合物中，静置5分钟，取出放入冷冻离心机内，在转速为12000转/分钟，4oC的条件下离心10分钟，后取出，备用；
9）取离心管j中的上层澄清液体400μl，将其加到1.5ml的离心管k中，向离心管k中加入苯酚200μl和氯仿200μl，振荡混匀后，放入冷冻离心机内，在转速为12000转/分钟，4oC条件下离心10分钟，待离心结束后取上层液体400μl移入到1.5ml的离心管m中，加入800μl的无水乙醇，将离心管m于-20oC条件下，放置20分钟，后取出放入冷冻离心机内，转速13000 转/分钟，4oC条件下离心10分钟，弃去离心管m中的上层澄清液体；
10）在离心管m中加入浓度为70％的乙醇0.5ml，放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC条件下离心5分钟，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅰ，该沉淀物Ⅰ为pCA质粒，待pCA质粒干燥后，加入30μl超纯水进行溶解，得到的溶液为pCA质粒溶液；
11）在1.5ml的离心管n中，加入2μl的pCA质粒溶液，后依次向离心管n中加入1μl的限制性内切酶KpnⅠ、1μl的限制性内切酶EcoRⅠ、1μl的限制性内切酶缓冲液和水5μl，混合均匀后，置于37oC条件下，反应2小时，形成酶切液；
12）利用琼脂糖凝胶电泳检测pCA质粒酶，在凝胶成像系统中进行观察，观察到1050bp大小的条带，pCA质粒是本发明制备的禽霍乱菌外膜蛋白A基因疫苗；
步骤五、禽霍乱菌外膜蛋白A基因疫苗即pCA质粒的大量制备：
1）挑取步骤四中含有pCA质粒的大肠杆菌JM83；
2）挑取培养后LB培养固体培养基上的1个菌落，将菌落放入25ml含氨苄青霉素的的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为50μg/ml，后将LB液体培养基，置于37oC恒温摇床内振荡培养，转速200转/分钟，至液体在600纳米处的吸光度，OD600值为0.6止，将振荡培养后的液体转至500ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，其氨苄青霉素的浓度为50μg/ml，置于37oC恒温摇床内振荡培养，转速200转/分钟，培养15小时；
3）待振荡培养结束后，将含有菌落的500ml LB液体培养基放入1000ml的离心管中，将1000ml的离心管放入冷冻离心机内，转速6000转/分钟，4oC条件下离心时间15分钟，弃去上层澄清液体得到沉淀物Ⅱ，向离心管中加入18ml的预先冷却至4oC的溶液Ⅳ，将沉淀物Ⅱ悬浮，再加入2ml浓度为10mg/ml的溶菌酶，至混合均匀止，再加入40ml的溶液Ⅴ，混合均匀止，将1000ml的离心管置于20oC条件下，放置5分钟，后向1000ml的离心管中加入20ml 预先冷却至4oC的溶液Ⅵ，混合均匀，将其放于0oC的冰水混合物中，静置10分钟， 取出放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC条件下离心20分钟，取上层澄清液体，备用；
4）在200ml的离心管中，加入步骤3中的上层澄清液体80ml，再加入32ml的异丙醇，振荡混匀后在20oC条件下放置10分钟，后放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC的条件下离心20分钟，待离心结束后倒掉上层澄清液体，得到200ml的离心管中的沉淀物Ⅲ，再向200ml的离心管中加入50ml的70%的乙醇，将200ml的离心管放入冷冻离心机内，转速12000 转/分钟，4oC的条件下离心5分钟，弃去澄清液体，待沉淀物Ⅲ干燥后备用；
5）在含有沉淀物Ⅲ的200ml离心管中加入3ml的pH值为8.0的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸，TE溶液，使沉淀物Ⅲ溶解，将溶解后的溶液转移至15ml的离心管中，在0oC的冰水混合物中，放置10分钟，后向15ml的离心管中加入3ml的浓度为5mol/l的氯化锂溶液，放入冷冻离心机内，转速10000转/分钟，离心时间10分钟，取上层澄清液体，备用；
6）在10ml的离心管中加入步骤5中的上层澄清液体和等体积的异丙醇，混合均匀止放于20oC条件下，放置10分钟，放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC条件下离心10分钟，弃去上层澄清液体，加入5ml浓度为70%的乙醇，放入冷冻离心机内，转速12000 转/分钟，4oC的条件下离心5分钟，倒掉上层澄清液体，得到沉淀物Ⅳ，干燥，备用；
7）向含有沉淀物Ⅳ的10ml的离心管中加入0.5ml含有浓度为100mg/ml的RNA酶A的三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸，TE溶液，将沉淀物Ⅳ溶解，后向溶液中加入0.25ml的苯酚和0.25ml的氯仿，至混合均匀止，将10ml的离心管放入冷冻离心机内，转速12000转/分钟，4oC的条件下离心10分钟，取0.5ml的上层澄清液体转至5ml的离心管内，加入1ml的无水乙醇，置于-20oC条件下，放置20分钟，放入冷冻离心机内，转速13000 转/分钟，4oC条件下离心10分钟，弃去上清液弃掉，得到沉淀物Ⅴ，干燥备用；
8）向含有沉淀物Ⅴ的5ml离心管中加入1ml超纯水，使沉淀物Ⅴ溶解，加入0.5ml的聚乙二醇-氯化镁，PEG-MgCl2溶液，置于20oC条件下，放置30分钟，放入离心机内，转速13000转/分钟，离心20分钟，弃去上层澄清液体，加入0.5ml浓度为70%的乙醇，放入离心机内，转速13000转/分钟，离心5分钟，倒掉上层澄清液体，得到沉淀物Ⅵ，该沉淀物就是大量制备的pCA质粒即为制备的禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗；
9）向含有沉淀物Ⅵ的5ml离心管中加入1ml浓度为0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液，使沉淀物Ⅵ溶解，溶解后的溶液为大量制备的pCA质粒溶液，后用分光光度计测定溶液中所含的pCA质粒的浓度，备用；
10）对禽霍乱菌的外膜蛋白A基因进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结束后在凝胶成像系统中观察到条带为1050bp时，证明禽霍乱外膜蛋白A基因疫苗制备成功；
所述的载体为真核表达载体pcDNA3.1+；
所述的LB培养固体培养基的组成成分为按重量比每升LB培养固体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠、1.5%的琼脂粉和水；
所述的LB液体培养基的组成成分为按重量比每升LB液体培养基中含有1%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、1%的氯化钠，余量为水；
所述的溶液Ⅰ的组成成分为按质量比每升溶液Ⅰ中含有50 mmol/L的葡萄糖、25 mmol/L的三羟甲基氨基甲烷-盐酸、10 mmol/L的乙二胺四乙酸，余量为水；
所述的溶液Ⅱ的组成成分为按重量比每升溶液Ⅱ中含有10mmol/L的氢氧化钠、10%的十二烷基磺酸钠，余量为水；
所述的溶液Ⅲ的组成成分为按重量比每升溶液Ⅲ中含有60%的5 mol/L的乙酸钾、11.5%的冰醋酸，余量为水；
所述的磷酸盐缓冲液的组成成分为按重量比每升磷酸盐缓冲液中含有0.8%的氯化钠、0.02%的磷酸二氢钾、0.02%的氯化钾、0.29%的十二水合磷酸氢二钠，余量为水。
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