CN107502622A

CN107502622A - Sip基因重组载体、壳聚糖‑PLGA包裹Sip基因DNA疫苗及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN107502622A
Application number: CN201610415590.3A
Authority: CN
Inventors: 马艳平; 梁志凌; 柯浩; 刘振兴; 郝乐; 马江耀
Original assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Health of Guangdong Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2016-06-14
Filing date: 2016-06-14
Publication date: 2017-12-22

Abstract

本发明公开了一种Sip基因重组载体、壳聚糖‑PLGA包裹Sip基因DNA疫苗及其制备方法和应用；采用限制性核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切罗非鱼无乳链球菌Sip基因和pcDNA3.1(+)质粒，然后构建罗非鱼无乳链球菌Sip真核表达重组质粒；以PLGA、PVA、壳聚糖为原料，采用乳化扩散法包裹重组质粒，即得壳聚糖‑PLGA包裹Sip基因DNA疫苗。本发明方法制备的疫苗免疫罗非鱼，其有效免疫保护率在50％‑100％之间，最高血清效价达1:256。而且该疫苗的本质是含重组质粒的纳米颗粒，因此易于保存和运输。

Description

Sip基因重组载体、壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，更具体地，本发明涉及一种罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体及其制备方法和应用，以及壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗及其制备方法和应用。

背景技术

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)是严重的人畜鱼共患传染病之一。近年来，罗非鱼无乳链球菌病在我国南方地区呈大规模爆发，病害发生的范围较广，罗非鱼受感染率与死亡率均较高，个别发病率超过50％，发病鱼死亡率超过95％，造成了严重的经济损失。

目前水产疫苗包括灭活疫苗、弱毒疫苗、基因工程疫苗等，核酸疫苗因其制备简单、安全、稳定性好，在免疫功能及生产、保存上有着诸多优点成为未来疫苗的发展方向，能诱导高水平的体液免疫和细胞免疫应答等，尤其是鱼类疫苗。生物可降解PLGA纳米/微米球及其衍生物作为载体用于疫苗免疫、基因治疗已有大量研究报到。壳聚糖、PLGA具有生物可降解性、生物相容性的特点，特别是壳聚糖自身带正电的特性，能够增强与带负电质粒的吸附，并且增强细胞渗透的作用，因而作为口服免疫载体也被认为有潜在优势。壳聚糖、PLGA包裹DNA疫苗有利于增强免疫效果，增强DNA渗透细胞膜，从而增强基因的递呈效率，具有重要的理论和实际意义。

表面免疫原性蛋白(Surface immunogenic protein,Sip)是由Brodeur等经免疫学筛选获得的，研究表明该蛋白可有效保护小鼠、罗非鱼、牛对无乳链球菌的致死感染，具有较强的免疫保护性。Sip蛋白广泛存在于各血清型中，是细菌重要的粘附和定植因子之一，成为无乳链球菌重要的候选疫苗靶标之一。

有研究报道将无乳链球菌sip基因克隆至核酸疫苗质粒pVAX-1载体上构建了核酸疫苗，经减毒沙门氏菌携带口服免疫罗非鱼后，免疫保护率达到57％以上，然而，血清抗体效价仅有1:16；黎炯等将纯化后的重组sip蛋白免疫罗非鱼,免疫组的相对保护率为70％-87％，免疫剂量为3μg/g和5μg/g时受免鱼血清抗体滴度可达1:128000，虽然纯化蛋白免疫罗非鱼免疫保护率和血清抗体滴度较减毒沙门氏菌口服sip疫苗高，但是限于鱼体免疫方式的限制，基于sip蛋白口服疫苗的研制已成为必然趋势。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种罗非鱼无乳链球菌Sip基因重组真核表达载体及其制备方法和应用，以及壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗及其制备方法和应用。

为了实现以上发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体，所述重组载体包括有如SEQID No:3所示的碱基序列。

本发明还提供了上述罗非鱼无乳链球菌Sip基因重组真核表达载体的制备方法，包括以下步骤：

(1)、将Sip基因与pMD^TMl8-T载体连接，转化感受态细胞，得到重组子；

(2)、采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切步骤(1)的重组子，得到包括有如SEQ ID No:3所示碱基序列的基因片段，再采用HindⅢ和BamHⅠ双酶切质粒pcDNA3.1(+)，连接所述基因片段和酶切后的质粒pcDNA3.1(+)，转化感受态细胞，得到真核表达重组载体-pcDNA-sip。

在其中一些实施例中，步骤(1)所述Sip基因是以罗非鱼无乳链球菌强毒株基因组DNA为模板，SEQ ID No:1和SEQ ID No:2为引物进行PCR扩增目的基因。

在其中一些实施例中，所述PCR扩增的反应体系为：5μL 10×Ex Taq PCR buffer、5μL dNTP、1μL模板DNA、1μL引物SEQ ID No:1、1μL SEQ ID No:2、0.25μL Ex Taq DNApolymerase、加dd H₂O至总体积为50μL；所述PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸10min。

本发明还提供了上述壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，所述疫苗的活性成分包括上述罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体。

在其中一些实施例中，所述疫苗还包括壳聚糖-PLGA包裹微球，所述罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体体积为600μL,浓度0.5～1.5mg/mL。

在其中一些实施例中，所述壳聚糖-PLGA纳米包裹微球是以1～4mg/mL的PLGA、0.3～0.9mg/mL的壳聚糖和0.5～2mg/mL PVA为原料制备而得。

在其中一些实施例中，所述PLGA的浓度为2mg/mL，所述壳聚糖的浓度为0.3mg/mL，所述PVA的浓度为2mg/mL。

本发明还提供了上述壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)、将600μL浓度0.5～1.5mg/mL的罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体滴入以二氯甲烷为溶剂的浓度为1～4mg/mL的PLGA溶液中，充分搅拌混匀，制备成初乳；

(2)、将步骤(1)的初乳滴入含有浓度为0.3～0.9mg/mL的壳聚糖的PVA水溶液中，彻底搅拌，形成水包油包水复乳液；所述PVA的浓度为0.5～2mg/mL；

(3)、磁力搅拌上述水包油包水复乳液，使得二氯甲烷挥发完全，离心，获得壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗；

本发明还提供了上述罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体或壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗在制备防治罗非鱼无乳链球菌病的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明根据罗非鱼无乳链球菌的基因组序列设计用于扩增Sip基因的两条引物，PCR扩增出无乳链球菌Sip基因；采用限制性核酸内切酶HindⅢ和BamHⅠ酶切无乳链球菌Sip基因和pcDNA3.1(+)质粒，然后构建罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组质粒；利用PLGA、PVA和壳聚糖，采用乳化扩散法包裹罗非鱼无乳链球菌Sip基因重组质粒，即得壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗。使用本发明的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗免疫罗非鱼，其有效免疫保护率在50％-100％之间，最高血清效价达1:256。而且该疫苗的本质是含重组质粒的颗粒微球，因此易于保存和运输。

附图说明

图1为本发明实施例1构建的pcDNA3.1-Sip重组载体的酶切鉴定结果；

图2为本发明实施例2中最佳组合壳聚糖-PLGA纳米包裹微球的平均直径和平均Z电位结果；

图3为本发明试验例3中罗非鱼各组织转录水平测定结果，各泳道分别为M:Maker；1-6:10μg肌注免疫组肌肉、肝脏、头肾、脾、鳃、肠组织RNA反转录结果；7-12：20μg口服免疫组肌肉、肝脏、头肾、脾、鳃、肠组织RNA反转录结果；13-18:50μg肌注组肌肉、肝脏、头肾、脾、鳃、肠组织RNA反转录结果；19-24：100μg肌注组肌肉、肝脏、头肾、脾、鳃、肠组织RNA反转录结果。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

以下实施例中的步骤除了特殊说明外，均为本领域常规操作步骤，以下实施例中所使用的原料，均来源于市售。

实施例1罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体的构建

包括以下步骤：

1、无乳链球菌Sip基因片段的扩增

参照GenBank中登录的无乳链球菌(No.CP003810.1)基因序列，设计扩增所预测的免疫原性蛋白基因的引物SEQ ID No:1和SEQ ID No:2(分别在正向引物和反向引物的5’端引入HindⅢ和BamHⅠ酶切位点，见表1，由上海生工生物有限公司合成)。以提取的罗非鱼无乳链球菌强毒株ZX1基因组DNA为模板，参照表2反应体系，利用Ex Taq聚合酶进行相应无乳链球菌Sip基因片段的PCR扩增。

表1扩增无乳链球菌基因片段的引物

表2PCR扩增无乳链球菌基因片段的反应体系

PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸2min，35个循环；72℃终延伸10min。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳，胶回收目的条带，将Sip基因与pMD^TMl8-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。用无菌牙签挑取转化后的单菌落加入到5mL含适当浓度抗生素的LB培养基中，振荡培养过夜，取2μL此菌液作为PCR扩增模板，按上述PCR反应体系进行PCR扩增鉴定，之后取5μL于1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。

挑取菌液PCR鉴定为正确的重组子，转接到含有相应抗生素的液体培养基中，37℃，180rpm/min培养过夜，根据引物设计时所选定的限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ，使用TaKaRa目录推荐使用的缓冲液，采用合适的温度20μL体系酶切鉴定，取5μL于1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。将菌液PCR和酶切鉴定正确的重组子送上海生工有限公司测序，Sip基因片段具有如SEQ ID No:3的碱基序列。

2、罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体的构建

用HindⅢ和BamHⅠ双酶切测序正确的pMD^TM18-T载体，再用HindⅢ和BamHⅠ分别双酶切质粒pcDNA3.1(+)，胶回收得到双酶切的Sip基因全长序列和双酶切的pcDNA3.1(+)，用T4DNA连接酶进行连接反应(16℃,16h)，然后转化DH5α感受态细胞，用无菌牙签挑取转化后的单菌落加入到5mL含适当浓度抗生素的LB培养基中，振荡培养过夜，按步骤1进行PCR和双酶切鉴定。鉴定正确的重组质粒命名为pcDNA-sip，并送上海生工测序。结果如图1显示，pcDNA-sip重组质粒经HindⅢ和BamHⅠ双酶切后，跑胶得到与表达基因相应大小的目的基因片段，表明目的基因成功的连接到表达载体pcDNA3.1(+)上(图1)。

实施例2壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗的制备

具体方法为：

(1)、壳聚糖吸附PLGA包裹微球的制备

采用乳化扩散挥发法(Emulsion-Diffusion-Evaporation technique)，将PLGA溶于二氯甲烷作为有机相，聚乙烯醇(PVA)和壳聚糖溶于超纯水作为水相，然后把有机相一滴一滴缓慢加入到水相，边加边用磁力搅拌器搅拌，在室温下搅拌3h。置于分散机下分散10min，13000rpm/min转速搅拌。然后置于磁力搅拌器上搅拌24h以上使得二氯甲烷挥发完全，获得壳聚糖吸附PLGA微球，测定微球直径和表面电势。

设计不同的壳聚糖用量(0.3mg/mL、0.6mg/mL、0.9mg/mL)，不同PLGA用量(1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL)，不同PVA用量(0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL)安排正交试验，如表3所示，按选择最佳的纳米微粒粒径，确定最佳壳聚糖、PLGA、PVA浓度。

表3正交试验

在光镜下测量30个壳聚糖吸附PLGA纳米包裹微球的直径，计算平均数，结果如表4所示，将直径数据代入SPSS软件，进行极差分析，最佳组合为：PLGA 2mg/mL，壳聚糖0.3mg/mL，PVA 2mg/mL。以最佳组合，制备壳聚糖吸附PLGA纳米微球，送华南理工大学分析测试中心测定微球评价直径和Z电位，结果如图2所示，平均微球直径为846.9nm，平均Z电位为48.0mV。

表4微球直径结果

(2)、罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体大提

挑取含重组质粒的转化细菌的单菌落，接种至5mL含50μg/mL Amp⁺抗性的LB培养基中，37℃培养过夜，第二天按1：100比例接种至200mL含50μg/mL Amp⁺抗性的LB培养基中，37℃培养过夜后，10000rpm/min离心10min，弃掉上清液，dd H₂O洗涤两次，用5mL含100μg/mL RNase A酶的碱裂解液Ⅰ重悬菌体，随后加入10mL新配置的碱裂解液Ⅱ，盖上离心管盖，轻轻颠倒数次，彻底混匀，室温放置5-10min；加入5mL预冷的碱裂解液Ⅲ盖上离心管盖，轻轻颠倒数次，彻底混匀，冰浴10min；4℃，11000rpm/min离心30min，将上清轻轻移入一干净的离心管中，上清液中加入0.6体积异丙醇，充分混匀，室温放置10min；12000rpm/min离心15min，小心弃去上清，将离心管敞开盖，倒置于纸巾上以除去残余的上清，在室温下，用70％乙醇刷洗管底和管壁，12000rpm/min离心15min，弃去上清，将离心管开口倒置于纸巾上使剩余的乙醇挥发完全；用3mL TE缓冲液(pH 8.0)溶解核酸沉淀。溶解完全后用紫外分光光度计测定核酸含量。

(3)、壳聚糖-PLGA包裹sip基因DNA疫苗的制备

按罗非鱼无乳链球菌Sip基因重组载体质量：将重组质粒(600μL,1mg/mL)一滴滴入10mL以二氯甲烷为溶剂的PLGA溶液中(2mg/mL)，充分搅拌混匀，制备成初乳，将获得的初乳滴入150mL的含有壳聚糖(0.3mg/mL)的PVA水溶液中(2mg/mL)，彻底搅拌10min，形成水包油包水复乳液，随后，将水包油包水复乳液倒入500mL玻璃烧杯中，室温下用磁力搅拌器搅拌24h，使得二氯甲烷挥发完全，6000rpm/min离心30min，收获微囊体(即壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗)贮存于4℃冰箱中。用紫外分光光度计测定壳聚糖吸附PLGA包裹罗非鱼无乳链球菌Sip基因重组载体的包裹率，为90.17％。

试验例1壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗的安全性测定

取实施例2的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗4mg，溶于4mL超纯水中，不同浓度壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗10倍梯度稀释5个梯度，每个梯度500μL/尾灌胃罗非鱼，每组10尾，设3个重复，试验观察15d，每天换水，测定口服疫苗对罗非鱼的安全性。

结果表明，各个组均没有观察到死亡，证明实施例2的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗对罗非鱼没有毒性。

试验例2壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗免疫罗非鱼的免疫效价测定

取实施例2的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗按以下两种方式免疫罗非鱼，分别于试验的7d、14d、21d、28d，随机抽取每组3条鱼，采集鱼血清，利用已建立的ELISA方法检测血清效价，分析各个疫苗组效价变化情况：

(1)、口服疫苗免疫罗非鱼

试验鱼大小为20～30g，每组60条，3个重复。按100μg、50μg、20μg口服疫苗剂量/尾口服罗非鱼，并设立空质粒对照，常规养殖罗非鱼30d。每天测定水温、溶氧、氨氮。

(2)、肌注疫苗免疫罗非鱼

试验鱼大小为20～30g，每组30条，3个重复。按10μg注射疫苗剂量/鱼肌肉注射罗非鱼，并设立空质粒对照，常规养殖罗非鱼30d。每天测定水温、溶氧、氨氮。

检测血清效价的具体步骤如下：

(1)采集尾静脉血，37℃静置2h，4℃冰箱过夜使血清充分析出，4000rpm/min离心10min，取上清，得罗非鱼血清；

(2)按100ng Sip纯化蛋白/孔包被ELISA板，4℃过夜；

(3)甩掉包被液，5％脱脂奶粉封闭ELISA板，37℃作用2h；

(4)PBST洗板3次，PBS溶液梯度稀释(1)步所得血清(1:4～1:512)，100μL/孔加入ELISA板中，37℃作用1h；

(5)PBST洗板3次，PBS溶液1:10000稀释兔抗罗非鱼IgM，100μL/孔加入ELISA板中，37℃作用1h；

(6)PBST洗板3次，PBS溶液1:10000稀释的HRP-羊抗兔IgG(鼎国)，100μL/孔加入ELISA板中，37℃作用1h；

(7)PBST洗板3次，每孔加入100μL TMB工作液，37℃作用5min；

(8)每孔加入50μL终止液终止反应，酶标仪读数，确定罗非鱼血清效价。

每隔7d采集血清，20μg口服疫苗免疫组最大效价出现在28d，效价为1:256；50μg口服疫苗组最大效价出现在21d，28d效价有所下降；100μg口服疫苗组最大效价出现在21d，28d效价仍维持在最高值，效价为1:128；肌注疫苗免疫组效价相较于口服疫苗组低，最大效价出现在28d。结果见表5。

表5疫苗效价测定结果

试验例3壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗在各个组织的表达情况

1、组织RNA提取

分别于试验例2试验的7d、14d、21d、28d，随机抽取每组3条鱼，采集鱼肌肉、肝脏、头肾、脾、鳃、肠组织，迅速冻入液氮中。备用。Trizol提取各组织RNA。

2、DNA去除、反转录

提取基因组RNA后，用南京诺唯赞HiScriptⅡqRT superMixⅡ试剂盒操作说明书，DNaseⅠ酶去除基因组DNA污染，然后反转录成cDNA,具体操作体系如表6和表7所示。

表6DNA去除体系

吹打均匀，42℃作用2min。

表7反转录体系

吹打均匀，25℃作用10min，50℃作用30min，85℃作用5min。

(3)、转录水平测定

以上步反转录cDNA为模板，以sip-F/sip-R为引物(sip-F：5’-AAACAGATACGACGTGGACAGC-3’；sip-R：GACATTGCTTCTGAAATAACGC)进行qPCR扩增，利用qPCR技术检测壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗在各个组织的表达情况。具体反应体系如表8所示。

表8qPCR反应体系

吹打均匀，放入ABI qPCR仪，按表9的qPCR反应程序进行qPCR扩增。

表9qPCR反应程序

qPCR均有扩增信号产生，将PCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳，如图3所示，均有明显可见的条带产生，证明各组疫苗均能在罗非鱼体内有效表达。

试验例4壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗的免疫保护率测定

取-80℃冻存的无乳链球菌强毒株接种THB液体培养基(5％新生牛血清)，37℃,220rpm/min震摇12h，用0.85％生理盐水洗涤菌体两次，以适当稀释，涂布THB固体培养基，37℃培养箱培养12h，计数，将菌体调整剂量为1×10⁵cfu/mL、1×10⁶cfu/mL、1×10⁷cfu/mL、1×10⁸cfu/mL、1×10⁹cfu/mL，1×10¹⁰cfu/mL，每个剂量以0.2mL/尾腹腔注射罗非鱼，每个剂量10尾罗非鱼，实验进行48h，以0.85％生理盐水做对照，实验设3个重复，将数据代入SPSS软件中，计算LD₅₀。

实验结束后，以上步测定的LD₅₀数据，以2LD₅₀剂量罗非鱼进行腹腔注射攻毒感染试验，进行人工发病试验，计算存活率，按下列公式计算相对免疫保护率，评价疫苗的保护效果。

相对免疫保护率(RPS,％)＝[1-(免疫组死亡率/对照组死亡率)]×100％

以空载体微球为对照，记录死亡率，计算相对免疫保护率(RPS,％)。结果如表10所示，50μg口服剂量相对免疫保护率最高，为100％；而注射DNA疫苗相对免疫保护率仅为20％。

表10口服疫苗组相对免疫保护率结果

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体，其特征在于，所述重组载体包括有如SEQ ID No:3所示的碱基序列。

2.权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(2)、采用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切步骤(1)的重组子，得到包括有如SEQ ID No:3所示碱基序列的基因片段，再采用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切质粒pcDNA3.1(+)，连接所述基因片段和酶切后的质粒pcDNA3.1(+)，转化感受态细胞，得到罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体。

3.根据权利要求2所述的罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述Sip基因是以罗非鱼无乳链球菌分离强毒株基因组DNA为模板，SEQID No:1和SEQ ID No:2为引物进行PCR扩增得到的。

4.一种壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗的活性成分包括权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体。

5.根据权利要求4所述的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括壳聚糖-PLGA包裹微球，所述壳聚糖-PLGA包裹微球是以1～4mg/mL的PLGA、0.3～0.9mg/mL的壳聚糖和0.5～2mg/mL PVA为原料制备而得。

6.根据权利要求5所述的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述壳聚糖-PLGA包裹微球是以2mg/mL的PLGA、0.3mg/mL的壳聚糖和2mg/mL PVA为原料制备而得。

7.根据权利要求4所述的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体体积为600μL,浓度0.5～1.5mg/mL。

8.根据权利要求7所述的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗，其特征在于，所述罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体体积为600μL,浓度1mg/mL。

9.权利要求4-8任一项所述的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、将600μL浓度0.5～1.5mg/mL的权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体滴入以二氯甲烷为溶剂的浓度为10mL浓度为1～4mg/mL的PLGA溶液中，充分搅拌混匀，制备成初乳；

(2)、将步骤(1)的初乳滴入150mL含有浓度为0.3～0.9mg/mL的壳聚糖的PVA水溶液中，彻底搅拌，形成水包油包水复乳液；所述PVA的浓度为0.5～2mg/mL；

(3)、磁力搅拌上述水包油包水复乳液，使得二氯甲烷挥发完全，离心，获得壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗。

10.权利要求1所述的罗非鱼无乳链球菌Sip基因真核表达重组载体，或权利要求4-8任一项所述的壳聚糖-PLGA包裹Sip基因DNA疫苗在制备防治罗非鱼无乳链球菌病的药物中的应用。