CN110302369A - 以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents

以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110302369A
CN110302369A CN201910575081.0A CN201910575081A CN110302369A CN 110302369 A CN110302369 A CN 110302369A CN 201910575081 A CN201910575081 A CN 201910575081A CN 110302369 A CN110302369 A CN 110302369A
Authority
CN
China
Prior art keywords
escherichia coli
solution
outer membrane
membrane protein
added
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910575081.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110302369B (zh
Inventor
孙红武
顾江
张瑾
赵莉群
杨赟
王颖
高晨
韦金佞
程新
张卫军
邹全明
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Army Medical University
Original Assignee
Army Medical University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Army Medical University filed Critical Army Medical University
Priority to CN201910575081.0A priority Critical patent/CN110302369B/zh
Publication of CN110302369A publication Critical patent/CN110302369A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110302369B publication Critical patent/CN110302369B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/025—Enterobacteriales, e.g. Enterobacter
    • A61K39/0258—Escherichia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A61K9/5153—Polyesters, e.g. poly(lactide-co-glycolide)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明公开了以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗及其制备方法和应用，该纳米粒疫苗粒径为200nm～300nm，PdI值在0.02‑0.3之间；其制备方法如下：将Vo蛋白溶液加入含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中，然后搅拌下加入丙酮溶解的聚乳酸‑羟基乙酸共聚物溶液，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的壳聚糖溶液，充分分散，过滤，离心洗涤获得纳米粒疫苗；制得的该疫苗对大肠杆菌K1感染保护效果好，与Al(OH)3佐剂吸附的Vo疫苗相当，无显著统计学差异，可作为预防大肠杆菌K1感染引起相关疾病的疫苗，对大肠杆菌K1感染引起相关疾病的预防和治疗具有重要意义。

Description

以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗及其制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及纳米疫苗领域，具体涉及以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗，还涉及该疫苗的制备方法和应用。
背景技术
大肠杆菌K1(E.coli K1)是引发新生儿细菌性脑膜炎的第二大病原体,感染后死亡率高，且治愈患儿常并发各种神经系统后遗症，如脑积水、癫痫、智能低下等，为家庭和社会造成严重的负担。文献报道，在Ecoli.K1感染所致新生儿脑膜炎中致死率为5-40％，且恢复的患儿中有30％伴有神经系统后遗症。外膜蛋白A(Outer membrane A,OmpA)是E.coliK1的关键致病因子，其胞外的Loops在E.coli K1感染新生儿脑膜炎中发挥重要作用。在整个新生儿脑膜炎的发病过程中，E.coli K1能对抗机体免疫系统的逃逸并引发菌血症、入侵血脑屏障导致颅内感染，在介导引发感染性疾病过程中发挥重要作用。因此，以OmpA为靶点设计疫苗，理论上可提供良好的免疫保护效果。OmpA为I型跨膜蛋白，其全长346个氨基酸，N端结构域是其主要功能结构域，其暴露在胞外的loop1，loop2，loop3，loop4是其介导OmpA相关病理生理过程的关键结构域。在此基础上，前期以OmpA的胞外Loops为基础的重组蛋白Vo，其结构为loop1-linker-loop2-linker-loop3--linker-loop4-linker-loop1-linker-loop2-linker-loop3--linker-loop4，并通过动物实验发现Vo具有良好的免疫原性和免疫保护效果，是较好的候选疫苗抗原。但由于Vo非天然蛋白、其稳定性有限，且Vo的分子量较低、在体内易被酶解、生物利用度低，这些原因限制了Vo在临床上的进一步应用。
纳米粒(nanoparticle，NP)是指通过各种技术制备的高分子胶体固态粒子，其粒径大小为1～1000nm，可在水中形成近似于胶体溶液，具有界面效应和尺寸效应。自德国科学家Kreuter首次将纳米粒应用于疫苗递送以来，纳米粒尤其是生物可降解材料制备的纳米粒，已经在疫苗研究领域广泛应用。与传统疫苗制剂相比，纳米粒具如下优势：(1)维持药物活性和稳定。对药物有保护作用，可以减少酶对药物的降解，保持药物活性。(2)增强药物作用的靶向性。通过对纳米粒的修饰，可以增强细胞对纳米粒的吞噬，可以将纳米粒靶向到机体的特定器官及组织，优化包裹抗原的免疫途径；(3)纳米粒均一性良好，包裹或吸附抗原后可成为巨噬细胞中和首选的吞噬目标，提高机体对抗原的免疫应答。
PLGA是FDA和SFDA批准的可用于医用手术辅料及埋植剂缓释剂辅料，其具有亲水性、扩散性和在人体内的快速代谢的特点。PLAG纳米粒可以作为抗原载体包裹生物活性大分子药物如多肽、蛋白质或核酸等，达到保护抗原降解的作用。但是其纳米粒表面缺乏可共价修饰的功能基团以及在体内停留时间短，限制了其在疫苗载体领域的应用。壳聚糖是一种具有生物降解性和生物相容性的阳离子聚合物，具有较低的免疫原性。壳聚糖聚合物骨架上的伯氨基可促进其与其他化学试剂的结合。壳聚糖可通过非共价静电吸附对PLGA纳米粒子进行表面修饰。壳聚糖(带正电荷)的胺基与PLGA(带负电荷)核之间的相互作用可以降低静电斥力，导致更大的灵活性，并可形成更紧凑的结构。
因此，有必要开发适应临床应用的利用PLGA和CS的Vo纳米粒疫苗，提高机体对抗原的免疫应答，且能靶向细胞内，安全，稳定性好。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种以壳聚糖修饰PLGA的Vo纳米粒疫苗；本发明的目的之二在于提供以壳聚糖修饰PLGA的Vo纳米粒疫苗的制备方法；本发明的目的之三在于提供所述Vo纳米粒疫苗在制备预防大肠杆菌K1感染引起相关疾病的药物中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、一种以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗，所述纳米粒疫苗粒径为200nm-300nm，所述PdI值在0.02-0.3之间。
优选的，由以下方法制备：将大肠杆菌Vo外膜蛋白溶液加入含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中，然后搅拌下加入丙酮溶解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的壳聚糖溶液，充分分散，过滤，离心洗涤获得大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗；或将大肠杆菌Vo外膜蛋白溶液加入含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中，然后搅拌下加入丙酮溶解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的壳聚糖溶液，充分分散，去除残留乳化剂，冷冻干燥，获得大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗(VoNP)。
优选的，所述大肠杆菌Vo外膜蛋白溶液浓度低于1.25mg/ml，优选为0.25mg/L～1.0mg/L。
优选的，所述含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中聚乙烯醇和多磷酸钠的浓度分别为0.02g/ml和0.002g/ml。
优选的，所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液浓度为0.002～0.02g/ml，加入每45ml含0.01～0.2g聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
优选的，所述壳聚糖溶液的浓度为0.0005～0.01g/ml，加入后每45ml含0.01～0.2g壳聚糖。
优选的，所述搅拌的转速为800转/min；所述充分分散为以800转/min的速度搅拌8h；所述离心为13000rpm离心10min；所述过滤为用0.22μm滤器头过滤。
2、以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗的制备方法，具体步骤如下：将大肠杆菌Vo外膜蛋白溶液加入含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中，然后搅拌下加入丙酮溶解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的壳聚糖溶液，充分分散，过滤，离心洗涤获得大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗；或将Vo蛋白溶液加入含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中，然后搅拌下加入丙酮溶解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的壳聚糖溶液，充分分散，去除残留乳化剂，冷冻干燥，获得大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗。
3、所述大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗在制备预防大肠杆菌K1感染引起相关疾病的药物中的应用。
优选的，所述相关疾病为新生儿细菌性脑膜炎。
本发明的有益效果在于：本发明公开了以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗，通过筛选获得壳聚糖修饰的PLGA纳米粒的最适配方及其制备工艺，摸索到在此工艺条件下大肠杆菌Vo外膜蛋白的最适包裹量，并成功制备了包裹大肠杆菌Vo外膜蛋白的CS修饰的PLGA纳米粒—VoNP。VoNP平均粒径为250.8±2.13nm，具有良好的分散性。通过SEM、TEM及AFM观察发现，VoNP颗粒大小约200nm-300nm，呈球状、表面光滑，无明显聚集现象。通过MALDI-TOF MS证实Vo蛋白在VoNP中稳定存在。长期稳定性实验发现，本工艺制备的VoNP在180天放置后其粒径、分散性及Zeta电位未发生明显变化，具有较好的稳定性。提示VoNP理化性质稳定，质量良好。并且通过L929细胞模型及BALB/c小鼠模型，发现VoNP无显著毒性作用。从免疫应答来看，VoNP免疫小鼠后可引起较强的体液免疫应答反应，且其免疫应答类型以Th2型免疫应答为主。在攻毒保护实验中，VoNP的免疫能通过降低外周血及脾脏中的细菌定植，减轻体重变化等方式抵抗E.coli K1的感染，提高小鼠的生存率。通过动物实验证实长期保存(180天)VoNP不仅具有稳定的理化性质，且其免疫原性和免疫保护效果未见显著变化。表明，VoNP安全性较好，质量稳定。可作为预防大肠杆菌K1感染引起相关疾病的疫苗，对大肠杆菌K1感染引起相关疾病的预防和治疗具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为纳米粒配方筛选(A：不同配方粒径检测结果；B：不同配方的PdI值；C：不同配方制备的纳米粒扫描电镜结果)。
图2为负载不同浓度Vo蛋白对纳米粒的粒径、PDI值影响图(A:SDS-PAGE检测结果；B：包裹不同量Vo蛋白的纳米粒(Vo nanoparticles，VoNP)的粒径分析结果；C：包裹不同浓度Vo蛋白纳米粒的PdI值；D：不同浓度Vo蛋白制备的VoNP包封率检测结果)。
图3为不同工艺纳米粒扫描电镜结果(A：非冻干工艺制作空白纳米粒；B：非冻干工艺制作Vo蛋白的纳米粒；C：冻干工艺制作空白纳米粒；D：冻干工艺制作Vo蛋白纳米粒)。
图4为纳米粒透射电镜观察结果(A：未冻干工艺所制备的BNP；B：未冻干工艺所制备的VoNP；C：冻干工艺所制备的BNP；D：冻干工艺所制备的BNP与VoNP)。
图5为不同工艺纳米粒动态光散射粒径电位结果(A：不同工艺制备的纳米粒粒径比较；B：不同工艺制备的纳米粒PdI比较；C：不同工艺制备的纳米粒Zeta电位值比较)。
图6为Vo纳米粒(VoNP)的表征(A：粒径分布；B：Zeta电位分布；C：透射电子显微镜图像；D：扫描电镜观察)。
图7为VoNP的MALDI-TOF质谱分析结果(A：BNP质谱；B：Vo蛋白质谱；C：VoNP质谱)。
图8为VoNP稳定性观察结果(A：非冻干VoNP与冻干VoNP的粒径变化；B：不同工艺制作的纳米粒在分散性上的变化；C：两种不同工艺制作的纳米粒在在Zeta电位上的变化观察结果)。
图9为纳米粒体外毒性实验(A：VoNP处理L929细胞；B：空白纳米颗粒处理L929；C：DMEM处理L929细胞；D；DMSO处理L929细胞；E：CCK-8细胞活力实验检测结果)。
图10为纳米粒体内毒性实验
图11为抗Vo IgG抗体效价及亚型(A：VoNP、Vo+Al和Vo免疫组小鼠血清抗Vo抗体效价；B：ELISA方法测定了VoNP诱导的IgG抗体亚型)。
图12为VoNP免疫介导的保护效果评价(A：生存率分析结果；B：亚致死剂量E.coliK1感染小鼠体重变化；C：小鼠血液和脾脏中细菌数量；D：免疫24小时后小鼠血液和脾脏中细菌数量)。
图13为抗Vo IgG抗体效价。
图14为长期保存的VoNP的免疫保护效果评价(A：攻毒后小鼠生存率结果；B：体重变化；C：细菌定植量；D：免疫24小时鼠用亚致死剂量的E.coli K1攻毒)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明实施例所用材料如下：GEX-Vo/X-blue：本实验室构建；E.coli K1RS218：来源于ATCC(No.)；BALB/c小鼠：SPF级，雌性，6-8周龄，体重18-22g，购自北京华阜康生物科技股份有限公司；L929细胞：购自美国模式培养物集存库(ATCC)。
实施例1、不同处方纳米粒的制备
为了确定纳米粒的最优配方，本课题分别设计了5组方案：不含PLGA的CS纳米粒(S1)；以二氯甲烷为溶剂的PLGA纳米粒(S2)；以丙酮为溶剂的PLGA纳米粒(S3)；PLGA修饰的CS纳米粒(S4)；CS修饰的PLGA纳米粒(S5)。通过纳米粒度仪和扫描电镜检测纳米粒的粒径、分散性及三维形态，筛选得到最优配方。
处方1：不含PLGA的CS纳米粒(S1)
1)称取0.02g壳聚糖(CS)，加入20ml体积分数为1％冰醋酸中，搅拌至完全溶解，制得壳聚糖溶液。
2)称取5mg多磷酸钠，加入5ml纯水中，搅拌至完全溶解，制得多磷酸钠溶液。
3)在800r磁力搅拌下，将多磷酸钠溶液逐滴加入壳聚糖溶液中。
4)通风厨内(室温，风力60％)800r搅拌8h。
5)样品用0.22μm滤器头过滤。
6)13000rpm离心10min，并用超纯水洗涤，反复两次。
7)弃上清，1ml纯水重悬沉淀。
处方2：以二氯甲烷为溶剂的PLGA纳米粒(S2)
1)称取0.05g聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)，加入1ml二氯甲烷，搅拌至完全溶解，制得PLGA溶液。
2)称取0.05g聚乙烯醇(PVA)，加入5ml纯水中(1％PVA)，搅拌至完全溶解，制得PVA溶液。
3)在800r磁力搅拌下，将PVA溶液逐滴加入PLGA溶液中。
4)通风厨内(室温，风力60％)800r搅拌8h。
5)样品用0.22μm滤器头过滤。
6)13000rpm离心10min，并用超纯水洗涤，反复两次。
7)弃上清，1ml纯水重悬沉淀。
处方3：以丙酮为溶剂的PLGA纳米粒(S3)
1)称取0.05g PLGA，加入5ml丙酮，搅拌至完全溶解，制得PLGA溶液。
2)称取0.4g PVA，加入20ml纯水中(2％PVA)，搅拌至完全溶解，制得PVA溶液。
3)在800r磁力搅拌下，将PVA溶液逐滴加入PLGA溶液中。
4)通风厨内(室温，风力60％)800r搅拌8h。
5)样品用0.22μm滤器头过滤。
6)13000rpm离心10min，并用超纯水洗涤，反复两次。
7)弃上清，1ml纯水重悬沉淀。
处方4：PLGA修饰的CS后对纳米粒的影响(S4)
1)称取0.05g PLGA，加入5ml丙酮，搅拌至完全溶解，制得PLGA溶液。
2)称取0.02g CS，加入20ml 1％冰醋酸中，搅拌至完全溶解，制得CS溶液。
3)称取0.4g PVA、0.04g多磷酸钠，加入20ml纯水中，搅匀，记为溶液3。
4)在800r磁力搅拌下，将CS溶液逐滴加入溶液3中。
5)在800r磁力搅拌下，将PLGA溶液逐滴加入步骤4)的混合溶液中。
6)通风厨内(室温，风力60％)800r搅拌8h。
7)样品用0.22μm滤器头过滤。
8)13000rpm离心10min，并用超纯水洗涤，反复两次。
9)弃上清，1ml纯水重悬沉淀。
处方5：CS修饰PLGA后对纳米粒的影响(S5)
1)分别称取0.01g、0.05g和0.1g PLGA，加入5ml丙酮，搅拌至完全溶解，制得PLGA溶液。
2)分别称取0.01g、0.04g和0.2g CS，加入20ml 1％冰醋酸中，搅拌至完全溶解，制得CS溶液。
3)称取0.4g PVA、0.04g多磷酸钠，加入20ml纯水中，搅匀，记为溶液3。
4)在800r磁力搅拌下，将PLGA溶液逐滴加入溶液3中。
5)在800r磁力搅拌下，将CS溶液逐滴加入步骤4)混合溶液中。
6)通风厨内(室温，风力60％)800r搅拌8h。
7)样品用0.22μm滤器头过滤。
8)13000rpm离心10min，并用超纯水洗涤，反复两次。
9)弃上清，1ml纯水重悬沉淀。
将上述不同处方纳米粒的检测，包括扫描电镜检测和粒度电位仪检测；
(1)扫描电镜检测：将不同配方制成的纳米粒100倍稀释后，取10μl滴于硅片上，停留30s后滤纸吸干液体，使用扫描电镜观察并拍片。
(2)粒度电位仪检测：将不同配方制成的纳米粒200倍稀释后制成1ml样品，使用纳米粒度电位仪检测。
检测结果如图1所示。其中图1中A为不同配方粒径检测结果，S1到S5的粒径分别为496.7±42.6nm，530.3±17.2nm，266.3±6.4nm，265.2±2.1nm，228.5±0.2nm。S1与S2、S3与S4配方所制备的纳米粒粒径间无统计学差异(P＞0.05)。S5中所有配方纳米粒粒径最小，与其他各组相比，有统计学差异(P<0.05)。图1中B所示，从S1到S5的PdI值分别为0.4777±0.1209，0.6600±0.1587，0.2277±0.0228，0.2520±0.057，0.1097±0.0486。作为反映分散性的指标，PdI值越小表明分散性越好，一般认为PdI值小于0.3时即可表明分散体系的分散性较好。与粒径趋势类似，S5PdI值显著低于S1及S2(P<0.05)。图1中C为不同配方制备的纳米粒扫描电镜结果。按S5制作的纳米粒形态为规整的圆球形，分散性好，无聚集现象，大小约在200nm左右，符合预期要求。上述结果说明，S5即以壳聚糖修饰的PLGA纳米粒是目前最优配方选择。
实施例2、Vo蛋白最适包裹量的确定
为了明确此纳米粒制备工艺的最大Vo蛋白包裹量，本研究首先纯化了蛋白Vo，将其稀释至不同浓度(0.25mg/ml，0.50mg/ml，0.75mg/ml，1.0mg/ml，1.25mg/ml，1.5mg/ml)，并制备了包裹不同浓度Vo蛋白的CS-PLGA纳米粒。通过纳米粒度电位仪对其粒径及PdI进行分析，评价负载不同浓度Vo蛋白对纳米粒的粒径、PDI值影响，确定CS-PLGA纳米粒最适包裹量，具体方法如下：
(1)Vo蛋白的纯化
1)取出-80℃冰箱冻存的pGEX-Vo/X-blue菌株(Gu,H.；Liao,Y.；Zhang,J.；Wang,Y.；Liu,Z.；Cheng,P.；Wang,X.；Zou,Q.；Gu,J.,Rational Design and Evaluation of anArtificial Escherichia coli K1Protein Vaccine Candidate Based on theStructure of OmpA.Frontiers in cellular and infection microbiology 2018,8,172.)，待其融化后，在无菌操作台中三线法接种于含Amp抗性的LB琼脂平板上，37℃孵箱中过夜培养。
2)挑取单克隆菌落至20mL LB液体培养基(Amp+)中，37℃、180rpm摇床中培养过夜。
3)取5ml培养过夜的菌液接种只2L LB液体培养基(Amp+)中，37℃、220rpm扩大培养4-5h(OD600≈0.3)，16℃、150rpm降温1h(OD600≈0.5)后加入400μl IPTG低温诱导过夜。
4)将诱导过夜的菌液5000rpm、4℃离心20min，重悬菌泥后进行超声破菌20-25min。
5)破菌后的液体12000rpm、4℃离心20min，按上清：GST填料＝5:1的比例与填料4℃中摇转结合5h。
6)结合后用蛋白洗液及蛋白基础Buffer分别清洗填料5次，按填料：蛋白基础Buffer：PP酶＝1:1:0.5的比例加入PP酶及蛋白基础Buffer，4℃下酶切过夜。
7)收集Vo蛋白液，0.22μm滤器头过滤，进行SDS-PAGE及BCA检测，-80℃保存。SDS-PAGE检测结果如图2中A所示。结果显示，Vo蛋白(纯度＞95％)的分子量大小约为16kD，与理论值相符。
(2)包裹不同量蛋白纳米粒的制备
1)称取0.05g PLGA，加入5ml丙酮，搅拌至完全溶解。
2)称取0.02g CS，加入20ml 1％冰醋酸中，搅拌至完全溶解。
3)称取0.4g PVA、0.04g多磷酸钠，加入15ml纯水中，搅匀。
4)分别稀释Vo蛋白。
5)分别将4)中不同浓度Vo蛋白液加入3)中，纯水定容至20ml，Vo至终浓度为0mg/ml；0.25mg/ml；0.5mg/ml；0.75mg/ml；1.0mg/ml；1.25mg/ml；1.5mg/ml。
6)在800转/min磁力搅拌下，将1)逐滴加入5)中。
7)在800转/min磁力搅拌下，将2)逐滴加入6)中。
8)通风厨内(室温，风力60％)800转/min搅拌8h。
9)样品用0.22μm滤器头过滤。
10)13000rpm离心10min，并用超纯水洗涤，反复两次。
11)弃上清，1ml纯水重悬沉淀。
12)粒度电位仪样品：100倍稀释后成1ml总液体后，使用纳米粒度电位仪观察，结果如2中B所示。结果显示，6种Vo蛋白浓度所制备的纳米粒粒径大小分别为：231.20±0.46nm，230.90±1.47nm，231.90±1.22nm，234.90±1.03nm，280.50±1.95nm，280.60±1.13nm。且随着VoNP载药量增加，纳米粒粒径随之增大，但Vo浓度低于1.25mg/ml时所制备的VoNP粒径无统计学差异(P＞0.05)。当Vo浓度为1.25mg/mL和1.50mg/ml时，VoNP粒径显著增加(P<0.05)。
图2中C为包裹不同浓度Vo蛋白纳米粒的PdI值，其大小分别为：0.04567±0.007753，0.0280±0.01332，0.0530±0.007506，0.04333±0.01938，0.2033±0.005925，0.1787±0.004842。对比发现，当Vo蛋白浓度在1.0mg及以下时，VoNP的PdI值维持在0.02-0.05之间，且各组件无显著差异(P＞0.05)。当Vo蛋白包裹浓度为1.25mg/ml和1.50mg/ml，PdI值显著增加(P<0.05)，提示其分散性较差，易于聚集。
再检测纳米粒包封率，具体方法如下：
1)取1ml样品13000rpm离心10min，并用超纯水洗涤，反复两次。
2)用100μl纯水重悬离心后沉淀，即浓缩10倍处理。
3)13000rpm，10min离心样品后分离上清及沉淀。
4)准备Vo蛋白，稀释为20μg/ml，40μg/ml，80μg/ml。160μg/ml，320μg/ml五个浓度用作标曲线用。
5)BCA法测蛋白浓度(具体方法同前，此时标曲更换为Vo蛋白样品)
6)按如下公式计算包封率
包封率＝(投入药物质量-游离药物质量)/投入药物质量×100％
结果如图2中D所示。由图可见，随着Vo蛋白浓度的增加，包封率亦随之升高，并于1.0mg/ml时达到峰值(59％)，其后随着浓度增加，包封率无显著变化(P＞0.05)。综上所述，在不影响纳米粒粒径及分散性指数的前提下，1.0mg/ml Vo蛋白制备的VoNP具有最大包封率：59％。
实施例3、纳米粒制备工艺的优化
为进一步提高VoNP的稳定性，本研究尝试通过冻干对纳米粒的制备工艺进行优化。
(1)非冻干工艺制作纳米粒
1)称取0.05g PLGA，加入5ml丙酮，搅拌至完全溶解。
2)称取0.02g CS，加入20ml 1％冰醋酸中，搅拌至完全溶解。
3)称取0.4g PVA、0.04g多磷酸钠，加入15ml纯水中，搅匀。
4)向3)中液体加入Vo蛋白1.0mg/5ml(空白对照组仅加5ml纯水)。
5)在800转/min磁力搅拌下，向3)逐滴加入1)中液体。
6)在800转/min磁力搅拌下，向5)逐滴加入2)中液体。
7)通风厨内(室温，风力60％)800r搅拌8h。
8)样品用0.22μm滤器头过滤。
9)13000rpm离心10min。
10)弃上清，2ml纯水重悬沉淀。
11)13000rpm离心10min。
12)重复10)、11)两次
13)离心后弃上清，1ml纯水重悬沉淀，4℃保存备用。
(2)冻干工艺制作纳米粒
1)称取0.05g PLGA，加入5ml丙酮，搅拌至完全溶解。
2)称取0.02g CS，加入20ml 1％冰醋酸中，搅拌至完全溶解。
3)称取0.4g PVA、0.04g多磷酸钠，加入15ml纯水中，搅匀。
4)向3)中液体加入Vo蛋白1.0mg/5ml(空白对照组仅加5ml纯水)。
5)在800转/min磁力搅拌下，向3)逐滴加入1)中液体。
6)在800转/min磁力搅拌下，向5)逐滴加入2)中液体。
7)通风厨内(室温，风力60％)800转/min搅拌8h。
8)搅拌完成后的样品通过离心法去除残留的乳化剂。
9)低温冷冻干燥24h，冻干后的样品密封4℃保存(冷冻3h，干燥22小时)。
扫描电镜检测结果如图3所示。从图3可以看出，与非冻干的BNP及VoNP相比，冻干后的VoNP仍是规整的圆球形，粒径分布在200-300nm之间，表明冻干过程并未对纳米粒的外观形态造成明显改变。
为了进一步明确冻干工艺对纳米颗粒的影响，本研究通过透射电镜对纳米粒进行检测。透射电镜观察到的结果如图4所示。由此可见，纳米粒均形成规整的圆形，粒径分布在200-300nm之间。与扫描电镜观察结果一致，表明冻干过程并未对纳米粒的外观形态造成明显改变。
实施例4、纳米颗粒特征分析
(1)粒径及Zeta电位检测
为了进一步明确冻干工艺对纳米粒特征的影响，本研究使用纳米粒度电位仪对冻干前后的纳米粒的粒径、PdI和Zeta电位进行检测。检测方法以冻干工艺制作VoNP后，将冻干后的纳米粒进行原倍稀释，再以纯水进行100倍稀释，采用Nano ZS动态光散射粒径电位仪在25℃下检测粒径及Zeta电位。结果发现，非冻干工艺所制备的纳米粒粒径在234.9±1.03nm，而冻干后的VoNP纳米粒粒径在249.6±0.87nm。虽然二者在粒径大小上具有统计学差异，但都在纳米级别范围内(图5，A)。同时分散性检测结果显示，冻干对VoNP分散性无显著影响(P＞0.05)(图5，B)。然而，冻干可导致VoNP Zeta电位值发生显著变化，由-13.13±0.60升高至0.84±0.10(P＜0.05)(图5，C)。
确定VoNP的最优制备工艺后，将冻干后的纳米粒进行原倍稀释，再以纯水进行100倍稀释，取10μl液体滴在铜网上，静置1分钟，滤纸吸干水分，再滴加10μl 2％的磷钨酸负染1分钟，自然挥发干净，使用TECNAI10透射电镜观察并采集图像，结果如图6中所示。如图6中A所示，VoNP的粒径主要分布在100nm至1000nm之间，形成一对称的单峰，提示其均一性良好。粒径主要集中在200nm～300nm间，平均值为250.8±2.13nm。同时，VoNP的Zeta电位均一性亦较好，均值为0.6110±0.0267mV(图6中B)。如图6中C所示，VoNP可形成规整的圆形，无聚集现象。同时扫描电镜观察到类似结果：VoNP可形成圆球形，且在不同稀释条件下纳米粒皆无明显聚集(图6，D)。可见VoNP的外观呈球状，表面光滑，大小在200-300nm左右，且分散性良好。上述结果表明VoNP外观为表面光滑的球状结构，大小在200-300nm间，分散性良好，具有较好特征。
(2)VoNP纳米粒的稳定性研究
为了评价Vo蛋白在VoNP中的稳定性，本研究使用MALDI-TOF MS方法对BNP、Vo蛋白溶液及VoNP分别进行检测，通过比对样本的离子峰观察VoNP中蛋白的性质变化。结果如图7中A所示，BNP质谱表现为聚合物特殊峰型，除纳米粒离子峰外，未见其他离子峰。图7中B为Vo蛋白质谱，可见在约m/z＝15245处有一明显主峰。图7中C为VoNP的质谱图，可见除了聚合物特殊峰型外，同时在约m/z＝15245处有一明显离子峰，位置与Vo蛋白所形成的离子峰基本一致。上述结果显示，Vo蛋白在VoNP中稳定存在，提示纳米粒制备过程对Vo蛋白的未造成明显影响。
(3)Vo蛋白长期稳定性研究
为了进一步评价VoNP长期稳定性，本研究将制备的VoNP密封并于4℃保存，分别在第0天，30天，90天，180天取样。通过纳米粒度电位仪对粒径、PdI及Zeta电位进行检测。结果显示，虽然非冻干VoNP与冻干VoNP的粒径差异显著，但均在纳米级范围内，且长期放置后均无明显改变(P＞0.05)(图8，A)。图8中B为两种不同工艺制作的纳米粒在分散性上的变化。其中4个观察点的冻干VoNP PdI值相比较，无显著统计学差异(P＞0.05)，而未冻干VoNP的PdI值随放置时间延长而升高(P＜0.05)，提示冻干VoNP具有较好的稳定性。图8中C为两种不同工艺制作的纳米粒在在Zeta电位上的变化观察结果，其趋势与粒径变化类似。综上所述，冻干工艺所制备的VoNP在长期放置过程中粒径、分散性及Zeta电位未发生明显变化，具有较好的稳定性。
实施例5、体内外评价纳米粒疫苗生物学效应
(1)L929细胞模型评价纳米粒的细胞毒性
安全性是影响新型疫苗及载体开发和应用的关键特征，因此本研究在细胞水平和动物水平对VoNP的安全性进行了初步评估。首先在细胞水平上，本研究将不同浓度的Vo纳米粒及等体积的BNP与L929细胞共培养，用CCK-8实验检测细胞活力，评价VoNP的体外细胞毒性，结果如图9所示。
结果显示，VoNP和BNP处理的细胞与DMEM处理的细胞在形态上无明显差异(图9中A-D)。同时，CCK-8细胞活力实验检测结果显示，纳米粒组OD450nm与DMEM相比，无显著统计学差异(P＞0.05)，而与DMSO组相比，差异有显著差异(P＜0.05)(图9中E)。上述结果表明，VoNP对L929细胞无明显毒性作用。
(2)纳米粒疫苗肌肉注射后对小鼠生物学效应影响
为了进一步评估VoNP的体内毒性，将其肌肉注射小鼠，以PBS为对照，观察7天内小鼠死亡及其它不良反应的发生情况。观察期结束后，观察心、肝、脾、肺和肾的组织病理改变，综合评价VoNP体内细胞毒性。在观察期内，VoNP注射的小鼠无死亡及其它不良反应。此外，病理检测结果显示，VoNP组、BNP组及PBS组小鼠的心、肝、脾、肺和肾的组织学检查结果无明显差异(图10)。上述结果说明，VoNP在小鼠体内无明显毒性。
(3)纳米粒免疫原性评价
为评价VoNP的免疫原性，BALB/c小鼠分别在第0天、第7天及第14天进行肌肉注射免疫VoNP(25μg/mouse)，Al(OH)3佐剂吸附的Vo蛋白(Vo+Al)，纯化的Vo蛋白(Vo)、BNP和Al(OH)3佐剂以同样的方式免疫作为对照。末次免疫后7天检测血清抗Vo IgG效价，评价VoNP的免疫原性。
如图11中A所示，与BNP组、Al(OH)3佐剂组及PBS组相比，VoNP免疫组小鼠血清抗Vo抗体效价显著升高(P＜0.05)，提示VoNP具有良好的免疫原性。同时VoNP免疫后诱导的抗体效价显著高于单独Vo蛋白免疫组(P＜0.05)，提示纳米粒具有良好的佐剂效应。同时VoNP免疫后诱导的抗体效价与Vo+Al佐剂吸附组的无显著统计学差异(P＞0.05)，提示纳米粒得佐剂效应与Al(OH)3佐剂相当。
为进一步评价VoNP的免疫应答类型，本研究通过ELISA方法测定了VoNP诱导的IgG抗体亚型。结果如图11中B所示，抗Vo IgG亚型以IgG1为主，其效价与IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3相比，具有统计学差异(P＜0.05)。提示VoNP诱导的免疫应答类型以Th2型免疫应答为主，与文献报道的Al(OH)3佐剂吸附的Vo疫苗诱导的免疫应答类型类似。
(4)VoNP免疫保护效果评价
为进一步评价VoNP的免疫保护效果，免疫后小鼠感染致死剂量E.coli K1，观察其生存率。同时以亚致死剂量感染小鼠，观察体重变化及在脾脏、血液中的细菌数量，评价VoNP保护机制。从生存率结果如图12中A所示。由图12中A所示，Al(OH)3组及PBS组小鼠分别在60h及36h全部死亡，且BNP组和Vo蛋白组存活率均为20％，提示其无明显保护效果。而VoNP组与Vo+Al(OH)3组存活率分别为80％与100％，与其它组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)，表明其具有很好的保护效果，但两组间无显著差异(P＞0.05)。
用亚致死剂量E.coli K1感染小鼠后发现，BNP组、Vo蛋白组、Al(OH)3组及PBS组体重显著下降(P＜0.05)，并在96小时后才开始恢复，而VoNP组与Vo+Al(OH)3组降低幅度显著低于其余四组，且在48小时后即开始恢复(图12，B)。同时，VoNP组与Vo+Al(OH)3组小鼠血液和脾脏中细菌数量显著低于BNP组、Vo蛋白组、Al(OH)3组及PBS组(P＜0.05),但两组间无显著差异(P＞0.05)(图12，C和D)。上述结果表明，VoNP具有良好的免疫保护效果，且与Al(OH)3吸附的Vo疫苗相比无明显差异。
(5)长期保存的VoNP免疫原性评价
为了评价长期保存的VoNP的免疫原性，将4℃存放180天后的VoNP和Al(OH)3吸附的Vo蛋白按照前述方法免疫小鼠，并于末次免疫后第7天检测血清中抗Vo IgG抗体效价。同样处理的BNP、Al(OH)3作为对照组。结果如图13所示，在经过长期放置后，Al(OH)3吸附的Vo蛋白免疫激发的抗体效价与BNP、Al(OH)3和PBS组间无显著统计学差异(P＞0.05)，提示Al(OH)3制备的Vo疫苗长期稳定性有限。而长期保存的VoNP免疫仍能诱导高效价的抗Vo IgG抗体水平，表明其质量稳定，具有良好的免疫原性。
(6)长期保存的VoNP免疫保护效果评价
按照上述方法，本研究对长期保存的VoNP的免疫保护效果也进行了评价。同时长期保存的Vo+Al(OH)3、BNP和Al(OH)3佐剂作为对照。图14中A为攻毒后小鼠生存率结果。由图可知，Al(OH)3佐剂组和PBS组小鼠分别在60h及48h全部死完。长期保存的Vo+Al(OH)3组存活率仅为20％，与新鲜制备的Vo+Al(OH)3相比，保护效果明显下降，提示Al(OH)3制备的Vo疫苗长期稳定性有限。而VoNP生存率为80％，与其他各组相比，具有显著统计学差异(P＜0.05)，表明其仍具有良好的保护效果。
体重变化观察和细菌定植量结果呈现相同的趋势，即VoNP组小鼠体重变化及细菌定植量显著低于其余各组(P＜0.05)，提示经过长期保存，VoNP仍具有较好的稳定性及保护效果(图14中B、C、D)。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗，其特征在于：所述纳米粒疫苗粒径为200nm-300nm，所述PdI值在0.02-0.3之间。
2.根据权利要求1所述的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗，其特征在于：由以下方法制备：将大肠杆菌Vo外膜蛋白溶液加入含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中，然后搅拌下加入丙酮溶解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的壳聚糖溶液，充分分散，过滤，离心洗涤获得大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗；或将大肠杆菌Vo外膜蛋白溶液加入含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中，然后搅拌下加入丙酮溶解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的壳聚糖溶液，充分分散，去除残留乳化剂，冷冻干燥，获得大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗。
3.根据权利要求2所述的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗，其特征在于：所述大肠杆菌Vo外膜蛋白溶液浓度低于1.25mg/ml。
4.根据权利要求2所述的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗，其特征在于：所述含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中聚乙烯醇和多磷酸钠的浓度分别为0.02g/ml和0.002g/ml。
5.根据权利要求2所述的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗，其特征在于：所述聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液浓度为0.002～0.02g/ml，加入每45ml含0.01～0.2g聚乳酸-羟基乙酸共聚物。
6.根据权利要求2所述的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗，其特征在于：所述壳聚糖溶液的浓度为0.0005～0.01g/ml，加入后每45ml含0.01～0.2g壳聚糖。
7.根据权利要求2所述的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗，其特征在于：所述搅拌的转速为800转/min；所述充分分散为以800转/min的速度搅拌8h；所述离心为13000rpm离心10min；所述过滤为用0.22μm滤器头过滤。
8.以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：将大肠杆菌Vo外膜蛋白溶液加入含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中，然后搅拌下加入丙酮溶解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的壳聚糖溶液，充分分散，过滤，离心洗涤获得大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗；或将Vo蛋白溶液加入含聚乙烯醇和多磷酸钠的溶液中，然后搅拌下加入丙酮溶解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物溶液，接着搅拌下加入冰醋酸溶解的壳聚糖溶液，充分分散，去除残留乳化剂，冷冻干燥，获得大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗。
9.权利要求1～7任一项所述大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗在制备预防大肠杆菌K1感染引起相关疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述相关疾病为新生儿细菌性脑膜炎。
CN201910575081.0A 2019-06-28 2019-06-28 以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗及其制备方法和应用 Active CN110302369B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910575081.0A CN110302369B (zh) 2019-06-28 2019-06-28 以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910575081.0A CN110302369B (zh) 2019-06-28 2019-06-28 以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110302369A true CN110302369A (zh) 2019-10-08
CN110302369B CN110302369B (zh) 2022-04-29

Family

ID=68078602

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910575081.0A Active CN110302369B (zh) 2019-06-28 2019-06-28 以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110302369B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113730562A (zh) * 2021-09-10 2021-12-03 中国人民解放军陆军军医大学 以壳聚糖修饰plga的wt1多肽纳米粒疫苗及其制备方法和应用
CN115025061A (zh) * 2022-03-10 2022-09-09 苏州大学 基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统及其制备方法和应用

Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040013688A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-22 Cambridge Scientific, Inc. Vaccines to induce mucosal immunity
US20040014661A1 (en) * 2000-11-17 2004-01-22 Liliane Goetsch Periplasmic domain of an enterobacterium omp protein and its use as carrier or adjuvant
CN101224300A (zh) * 2007-04-11 2008-07-23 中山大学 大肠杆菌OmpA作为动物免疫调节剂的应用
TW200938220A (en) * 2008-03-11 2009-09-16 Univ Taipei Medical Use of outer membrane protein a in treatment/prevention/diagnosis of bacterial infection in central nervous system and/or peripheral blood circulation
US20100233251A1 (en) * 2007-10-12 2010-09-16 Massachusetts Institute of Technology Massachusetts Vaccine Nanotechnology
CN102580074A (zh) * 2011-01-07 2012-07-18 北京大北农科技集团股份有限公司 鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌外膜蛋白二联疫苗及其制备方法
US20130337066A1 (en) * 2011-06-02 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Membrane Encapsulated Nanoparticles and Method of Use
CN104159572A (zh) * 2011-09-21 2014-11-19 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司 纳米递送系统
CN105288613A (zh) * 2015-11-25 2016-02-03 河北师范大学 一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂及其制备方法
CN106267179A (zh) * 2015-05-20 2017-01-04 中国农业科学院饲料研究所 一种大肠杆菌外膜蛋白疫苗的制备方法
CN107502622A (zh) * 2016-06-14 2017-12-22 广东省农业科学院动物卫生研究所 Sip基因重组载体、壳聚糖‑PLGA包裹Sip基因DNA疫苗及其制备方法和应用
CN108721616A (zh) * 2018-09-05 2018-11-02 广东渔跃生物技术有限公司 一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20040014661A1 (en) * 2000-11-17 2004-01-22 Liliane Goetsch Periplasmic domain of an enterobacterium omp protein and its use as carrier or adjuvant
US20040013688A1 (en) * 2002-07-03 2004-01-22 Cambridge Scientific, Inc. Vaccines to induce mucosal immunity
CN101224300A (zh) * 2007-04-11 2008-07-23 中山大学 大肠杆菌OmpA作为动物免疫调节剂的应用
US20100233251A1 (en) * 2007-10-12 2010-09-16 Massachusetts Institute of Technology Massachusetts Vaccine Nanotechnology
TW200938220A (en) * 2008-03-11 2009-09-16 Univ Taipei Medical Use of outer membrane protein a in treatment/prevention/diagnosis of bacterial infection in central nervous system and/or peripheral blood circulation
CN102580074A (zh) * 2011-01-07 2012-07-18 北京大北农科技集团股份有限公司 鸭疫里氏杆菌和大肠杆菌外膜蛋白二联疫苗及其制备方法
US20130337066A1 (en) * 2011-06-02 2013-12-19 The Regents Of The University Of California Membrane Encapsulated Nanoparticles and Method of Use
CN104159572A (zh) * 2011-09-21 2014-11-19 耶路撒冷希伯来大学伊森姆研究发展有限公司 纳米递送系统
CN106267179A (zh) * 2015-05-20 2017-01-04 中国农业科学院饲料研究所 一种大肠杆菌外膜蛋白疫苗的制备方法
CN105288613A (zh) * 2015-11-25 2016-02-03 河北师范大学 一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂及其制备方法
CN107502622A (zh) * 2016-06-14 2017-12-22 广东省农业科学院动物卫生研究所 Sip基因重组载体、壳聚糖‑PLGA包裹Sip基因DNA疫苗及其制备方法和应用
CN108721616A (zh) * 2018-09-05 2018-11-02 广东渔跃生物技术有限公司 一种禽巴氏杆菌荚膜多糖-蛋白结合疫苗及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HAO GU ET AL: "Rational Design and Evaluation of an Artificial Escherichia coli K1 Protein Vaccine Candidate Based on the Structure of OmpA", 《FRONTIERS IN CELLULAR AND INFECTION MICROBIOLOGY》 *
SAURABH DUBEY ET AL: "Edwardsiella tarda OmpA Encapsulated in Chitosan Nanoparticles Shows Superior Protection over Inactivated Whole Cell Vaccine in Orally Vaccinated Fringed-Lipped Peninsula Carp (Labeo fimbriatus)", 《VACCINES》 *
邹家龙 等: "壳聚糖表面修饰PLGA纳米粒对小鼠骨髓系树突细胞交叉递呈的影响", 《中国医院药学杂志》 *
陈红丽 等: "壳聚糖修饰的ＰＬＧＡ纳米粒作为蛋白多肽类药物载体的研究", 《功能材料》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113730562A (zh) * 2021-09-10 2021-12-03 中国人民解放军陆军军医大学 以壳聚糖修饰plga的wt1多肽纳米粒疫苗及其制备方法和应用
CN113730562B (zh) * 2021-09-10 2024-06-04 中国人民解放军陆军军医大学 以壳聚糖修饰plga的wt1多肽纳米粒疫苗及其制备方法和应用
CN115025061A (zh) * 2022-03-10 2022-09-09 苏州大学 基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统及其制备方法和应用
CN115025061B (zh) * 2022-03-10 2023-09-12 苏州大学 基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110302369B (zh) 2022-04-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Cruz et al. Targeted PLGA nano-but not microparticles specifically deliver antigen to human dendritic cells via DC-SIGN in vitro
JP2022010290A (ja) 粘液浸透性被覆粒子、組成物、医薬組成物、医薬製剤、及びそれらの形成方法
EP3536333B1 (en) Depot system comprising glatiramer acetate
Rose et al. A strong adjuvant based on glycol-chitosan-coated lipid-polymer hybrid nanoparticles potentiates mucosal immune responses against the recombinant Chlamydia trachomatis fusion antigen CTH522
Zhang et al. Development of a chitosan‐modified PLGA nanoparticle vaccine for protection against Escherichia coli K1 caused meningitis in mice
Jain et al. Aquasomes: A novel drug carrier
Luckanagul et al. Plant virus incorporated hydrogels as scaffolds for tissue engineering possess low immunogenicity in vivo
CN108743939A (zh) 共载抗原、mpla与imq的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用
Muttil et al. Pulmonary immunization of guinea pigs with diphtheria CRM-197 antigen as nanoparticle aggregate dry powders enhance local and systemic immune responses
CN106687143A (zh) 纳米颗粒、制备方法、及其用途
WO2006122223A2 (en) Strategies for delivery of active agents using micelles and particles
CN110302369A (zh) 以壳聚糖修饰PLGA的大肠杆菌Vo外膜蛋白纳米粒疫苗及其制备方法和应用
Felder et al. Ultrasonic atomization and subsequent polymer desolvation for peptide and protein microencapsulation into biodegradable polyesters
Goyal et al. Aquasomes—a nanoparticulate approach for the delivery of antigen
Colonna et al. Sub-unit vaccine against S. aureus-mediated infections: Set-up of nano-sized polymeric adjuvant
US20120107268A1 (en) Lymph node-targeting nanoparticles
CN110139826A (zh) 具有负的表面电荷的微粒和纳米颗粒
Subbarao Nanoparticle sterility and sterilization of nanomaterials
Chu et al. Chitosan-based particles as biocompatible delivery vehicles for peptide and protein-based vaccines
KR101873506B1 (ko) 양친매성 폴리 아미노산 고분자 기반 백신 면역보조제 조성물
KR20190024849A (ko) 자가 조립형 백신 및 이의 제조방법
Mohammed et al. Poly (Lactide-co-Glycolide) Nanoparticle-Mediated Vaccine Delivery of Encapsulated Surface Antigen Protein of Hepatitis B Virus Elicits Effective Immune Response
Wang et al. PEI‐PLGA nanoparticles significantly enhanced the immunogenicity of IsdB137‐361 proteins from Staphylococcus aureus
Aghaie Evaluation of mPEG-PLA nanoparticles as vaccine delivery system for modified protective antigen of Bacillus anthracis
TWI756948B (zh) 胜肽奈米管之製備方法、用途及其免疫組成物

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant