CN115025061A - 基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统及其制备方法和应用。以生物可降解的高分子材料为基础载体，表面包裹功能化改造后去除内毒素的大肠杆菌K1外膜，该纳米给药系统基于源自细菌外膜的外膜蛋白A和血脑屏障内皮细胞上的gp96之间的相互作用，介导血液循环中的纳米给药系统跨过该屏障并最终分布于颅内间质。这种可通过跨细胞囊泡转运途径穿透血脑屏障到达深层脑实质的脑靶向仿生纳米给药系统，其制备方法简单，兼具良好的生物安全性和优越的递送效率，具有较高的操作性和经济效益。

Description

基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米 给药系统及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于纳米生物医药技术领域，具体涉及一种基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统及其制备方法和应用。

背景技术

血脑屏障(BBB)是一种由内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞组成的神经血管系统，可精确调节物质向大脑的转运，对大脑进行强有力的保护。例如，BBB特有的紧密连接结构完全阻断物质通过细胞旁空间进行的细胞旁扩散，而BBB内皮细胞的低转胞率严重限制了跨细胞囊泡运输。只有小的疏水分子(分子量<450)可以利用跨细胞扩散途径穿透BBB。其他可溶性营养素(例如葡萄糖、氨基酸和转铁蛋白形式的铁离子)必须通过特定的转运体和受体进入大脑。血脑屏障对于大多数药物的阻碍直接导致许多脑部疾病的药物治疗失败。因此，开发能够有效地将药物递送到大脑的药物递送系统是当务之急。到目前为止，已有许多将药物递送到大脑的研究报道。其中一种重要的策略是对于纳米颗粒(NPs)的工程化改造，比如对其进行靶向肽的修饰，这种靶向肽能够识别BBB内皮细胞上的受体(例如转铁蛋白受体和葡萄糖转运体-1)，以启动跨细胞作用，或者是修饰具有能够打开紧密连接或抑制主动外排转运的功能分子。然而，静脉给药后，大多数工程化纳米粒在大脑中的蓄积不超过1.0％。因此，基于纳米粒的递送策略需要创新的方法。

革兰氏阴性菌大肠杆菌K1(EC-K1)可穿过BBB并定植于大脑，从而诱发细菌性脑膜炎。外膜蛋白A(OmpA)是一种325个氨基酸组成的蛋白质，具有8个跨膜结构域和4个细胞外的环结构，是细菌外膜的重要组成部分。gp96(也称为GRP94)是热休克蛋白90的内质网同源物，这种蛋白不仅在内质网表达，也在BBB内皮细胞表面表达。据广泛报道，OmpA暴露在表面的环与BBB内皮细胞上的gp96相互作用之后，EC-K1结合BBB内皮细胞并随后侵入大脑。此外，外膜蛋白NlpI和IbeA也促进EC-K1对BBB 内皮细胞的侵袭。因此，EC-K1外膜具有介导脑靶向递药的潜力。仿生给药系统，例如细胞膜包裹的纳米粒，由于其能够复制高度复杂但精确的生物过程而引起了相当大的关注，并在最新技术方面取得了迅速的进展。革兰氏阴性细菌分泌的非复制性的天然细菌外膜囊泡(OMV)已被成功地设计成疫苗和肿瘤靶向药物递送载体。然而，使用EC-K1外膜或OMV进行脑靶向给药尚未被报道。

因此，针对上述问题，有必要提出进一步的解决方案。

发明内容

本发明目的是研究一种基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统及其制备方法和应用。

本发明的技术方案是：

一种基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统，利用生物可降解的高分子材料制备可装载药物的纳米粒作为基础载体，所述纳米粒表面包裹去除内毒素的大肠杆菌K1外膜，所述生物可降解的高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸。

本发明的另一技术方案是：

一种基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)去毒细菌外膜囊泡的提取；

(1.1)在培养基中过夜培养大肠杆菌K1，使其OD 600值达到1.5，离心收集菌体沉淀；

(1.2)将所述菌体沉淀重悬于磷酸盐缓冲液，超声破碎，获得破碎菌液；

(1.3)将所述破碎菌液离心，获得沉淀；

(1.4)向所述沉淀中加入Tris缓冲液，高速离心，收集上清液；

(1.5)将所述上清液再次高速离心，获得去毒细菌外膜囊泡；

(1.6)将所述去毒细菌外膜囊泡沉淀分散于水中，储存备用；

(2)纳米粒的制备：

(2.1)称取高分子材料，溶于有机溶剂中，形成油相；

(2.2)将药物溶解在油相中，成为油相的一部分，水相为水本身，或将药物溶解于水中，形成水相；

(2.3)将所述水相逐滴加入涡旋的油相中，超声乳化形成油包水的乳剂；

(2.4)再将所述乳剂逐滴加入涡旋的外水相中，超声乳化形成水包油包水型的复乳；

(2.5)迅速将所述复乳倒入挥发水相中，搅拌过夜挥发，形成纳米粒混悬液；

(2.6)所述纳米粒混悬液通过高速离心提纯，获得纳米粒沉淀；

(2.7)将所述纳米粒沉淀超声分散于水中，高速离心，获得最终沉淀纳米粒；

(2.8)将所述最终沉淀纳米粒分散于水中，备用；

(3)去毒细菌外膜包裹纳米粒系统的制备：将所述去毒细菌外膜囊泡超声后，与所述最终沉淀纳米粒混合，使用聚碳酸酯膜多次挤出，得到基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统。

进一步的，在步骤(1.1)中，所述培养基为含100μg/ml利福平的pH 7.4 LB培养基。

进一步的，在步骤(1.2)中，所述菌体沉淀与所述磷酸盐缓冲液的体积比为1：4，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.3。

进一步的，在步骤(1.4)中，所述向所述沉淀中加入Tris缓冲液具体为：向所述沉淀中加入7.5倍体积于细菌湿重的0.1M Tris缓冲液，所述Tris缓冲液含10mM EDTA和5mg/ml脱氧胆酸钠。

进一步的，在步骤(2.1)中，所述高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸，所述有机溶剂为乙酸乙酯。

进一步的，在步骤(2.2)中，所述药物为成像剂，所述成像剂与高分子材料的质量比为0.02:1-0.2:1，溶于油相的成像剂为DiR、IR780、SPIO中的任意一种，溶于水相的成像剂为阿霉素。

进一步的，在步骤(2.4)中，所述外水相为2.5％聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液；在步骤(2.5)中，所述挥发水相为0.3％聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液。

进一步的，在步骤(3)中，所述去毒细菌外膜囊泡与所述最终沉淀纳米粒的质量比为1：5。

本发明的另一技术方案是：基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统在制备靶向脑内皮细胞的药物制剂中的应用。

上述技术方案的优点在于：该制备方法简单，原材料易得，适于研究与应用转化，脑靶向仿生膜包裹纳米给药系统通过跨细胞囊泡转运途径穿透血脑屏障，设计新颖，且成本低、效率高，可以发挥很好的脑靶向作用，具有较高的操作性，新颖性和经济效益。

附图说明

图1为本发明所述的基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统的构建及其体内行为示意图；

图2为透射电镜对去毒细菌外膜包裹纳米粒结构的表征图；

图3为通过SDS-PAGE表征天然细菌外膜包裹纳米粒、去毒细菌外膜包裹纳米粒、未包裹纳米粒的全蛋白分布图；

图4为通过western blot表征天然细菌外膜包裹纳米粒、去毒细菌外膜包裹纳米粒、未包裹纳米粒的外膜蛋白OmpA表达图；

图5为通过鲎试剂终点显色法检测天然细菌外膜包裹纳米粒、去毒细菌外膜包裹纳米粒、红细胞膜包裹纳米粒、未包裹纳米粒的内毒素水平图；

图6为通过动态光散射法表征去毒细菌外膜包裹纳米粒和未包裹纳米粒的粒径图；

图7为定量表征的载DiR的各种膜包裹纳米给药系统(DiR的浓度为 1.5μg/mL，给药时间为6h)在脑微血管内皮细胞上的摄取图；

图8为定量表征的经由不同体积OmpA抗体处理后载阿霉素的去毒细菌外膜包裹纳米系统(阿霉素的浓度为5μg/mL，给药时间为1.5h)在脑微血管内皮细胞上的摄取图；

图9为定量表征的经由不同体积gp96抗体处理后载阿霉素的去毒细菌外膜包裹纳米系统(阿霉素的浓度为5μg/mL，给药时间为1.5h)在脑微血管内皮细胞上的摄取图；

图10为载阿霉素的去毒细菌外膜包裹纳米系统与脑微血管内皮细胞内溶酶体在不同时间的定位的共聚焦显微镜图，其中，阿霉素的浓度为12μ g/mL，给药时间为1h，标尺为5μm；

图11为定量表征的载阿霉素的各种膜包裹纳米给药系统(阿霉素的浓度为5μg/mL，给药时间为6h)跨过体外体外血脑屏障模型的比例图；

图12为定量表征的载DiR的各种膜包裹纳米给药系统(DiR的浓度为 1.5μg/mL，给药时间为3h)在巨噬细胞上的摄取图；

图13为小动物成像法定性表征的不同时间IR780在载IR780的各种膜包裹纳米给药系统处理的正常鼠脑上的蓄积图，其中，IR780的剂量为2.5 μg每只小鼠，给药时间为12h和24h；

图14为电感耦合等离子体-质谱法定量表征的铁元素在载SPIO的各种膜包裹纳米给药系统处理的正常鼠脑上的蓄积图，其中，SPIO的剂量为5 mg/kg小鼠，给药时间为8h；

图15为定量表征的不同时间IR780在载IR780的去毒细菌外膜包裹纳米粒系统处理的正常鼠脑上的蓄积图，其中，IR780的剂量为2.5μg每只小鼠，给药时间为8h和24h；

图16为共聚焦显微镜表征的载阿霉素的各种膜包裹纳米给药系统在正常鼠脑内不同脑区的分布图，其中，阿霉素的剂量为5mg/kg小鼠，共注射两次，间隔12h，第二次注射12h后灌流。大图标尺为100μm，小图标尺为 50μm；

图17为共聚焦显微镜表征的载阿霉素的去毒细菌外膜包裹纳米粒系统在正常鼠脑内不同脑区的不同细胞中的分布图，其中，阿霉素的剂量为5 mg/kg小鼠，共注射两次，间隔12h，第二次注射12h后灌流。大图标尺为 20μm，小图标尺为10μm；

图18为实时荧光定量RCR法定量表征的促炎因子TNF-α,IL-6,and IL-1β在生理盐水、去毒细菌外膜包裹纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒系统处理的正常鼠脑上的mRNA相对表达水平图；

图19为酶联免疫吸附测定法定量表征的促炎因子TNF-α,IL-6,and IL-1β在生理盐水、去毒细菌外膜包裹纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒系统与内毒素处理的正常鼠脑上的浓度图；

图20为酶联免疫吸附测定法定量表征的促炎因子TNF-α,IL-6,and IL-1β在生理盐水、去毒细菌外膜包裹纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒系统与内毒素处理的正常鼠血清中的浓度图；

图21为试剂盒法定量表征的肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶与肾功能指标尿素氮、肌酐在生理盐水、去毒细菌外膜包裹纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒系统处理的正常鼠血清中的浓度图。

具体实施方式

受细菌外膜对细菌性脑膜炎中大肠杆菌K1(EC-K1)结合和侵袭BBB 内皮细胞的启发，本发明将EC-K1外膜的BBB侵袭能力应用到脑靶向药物递送中，并构建出一种基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统。

本发明提供一种基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统，选用生物可降解的高分子材料作为基础载体，超声乳化- 溶剂挥发法制备内部装载药物的纳米粒，纳米粒表面修饰具有脑靶向入侵能力的去除内毒素的大肠杆菌EC-K1外膜，从而构建出一种基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统，仿生纳米颗粒的BBB 穿透被证明是通过跨细胞囊泡运输途径发生的，该途径至少部分依赖于内化、内体逃逸和由外膜蛋白A和BBB内皮细胞上可上调的gp96之间的相互作用介导的跨细胞作用，这种仿生纳米工程策略赋予负载药物延长循环、颅内间质分布和极高的生物相容性，可提高以纳米仿生系统为基础的药物递送系统的脑靶向效率。

上述基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统的制备方法如下：

一种基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统的制备方法，包括：

步骤一，去毒细菌外膜囊泡的提取：

(1)在含抗生素的LB培养基中过夜培养大肠杆菌K1，离心收集细菌沉淀；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：在含抗生素的LB培养基中过夜培养大肠杆菌K1，离心收集细菌沉淀，其中，所述抗生素为利福平，浓度为100μg/ml；在pH 7.4LB培养基中过夜培养大肠杆菌K1，使其OD 600 值达到1.5，离心收集细菌沉淀，离心参数为4℃，5000g，10min。

(2)将所述菌体沉淀重悬于pH 7.3磷酸盐缓冲液，超声破碎，获得破碎菌液；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将所述菌体沉淀重悬于四倍体积的pH 7.3磷酸盐缓冲液，300W超声破碎30min，获得破碎菌液。

(3)将所述破碎菌液离心，获得沉淀；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将所述破碎菌液以4℃， 2900g离心1h，获得沉淀。

(4)将所述沉淀分散于Tris缓冲液，高速离心，收集上清液；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将所述沉淀分散于Tris 缓冲液，高速离心；其中，Tris缓冲液含10mM EDTA和5mg/ml脱氧胆酸钠，7.5倍体积于细菌湿重，浓度为0.1M；离心参数为4℃，20000g，1h，收集上清液。

(5)收集所述上清液，高速离心两次，获得去毒细菌外膜囊泡；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：收集所述上清液，4℃， 150000g，2h高速离心两次，获得去毒细菌外膜囊泡。

(6)将所述去毒细菌外膜囊泡沉淀分散于水中，储存于-80℃，待以后使用。

步骤二，去毒细菌外膜包裹纳米粒系统的制备：

(1)称取高分子材料，溶于有机溶剂中，形成油相；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：称取合成的高分子材料，溶于有机溶剂中，形成油相。其中，所述高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸，所述有机溶剂为乙酸乙酯。

(2)将药物溶解在油相中，成为油相的一部分，水相为水本身，或将药物溶解于水中，形成水相；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将药物溶解在油相中，成为油相的一部分，其水相为水本身；或将药物溶解于水中，形成水相。其中，所述药物为各种成像剂，所述成像剂与高分子材料反应的质量比为 0.02:1-0.2:1，所述溶于油相的成像剂为DiR、IR780、SPIO，溶于水相的成像剂为阿霉素；

(3)将所述水相逐滴加入涡旋的油相中，超声乳化形成油包水乳剂，其中，所述外水相为2.5％聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，所述挥发水相为0.3％聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液；

(4)再将所述乳剂逐滴加入涡旋的外水相中，超声乳化形成水包油包水型的复乳；

(5)迅速将所述复乳倒入挥发水相中，搅拌过夜挥发除去乙酸乙酯，形成纳米粒混悬液；

(6)所述纳米粒混悬液通过高速离心提纯，获得纳米粒沉淀；

(7)将所述沉淀纳米粒超声分散于水中，高速离心，重复两次，获得最终沉淀纳米粒；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：所述沉淀纳米粒经过离心，离心速度为30000rpm，离心时间20min，沉淀用pH 7.3磷酸盐缓冲液超声悬起，获得最终沉淀纳米粒。

(8)将所述最终沉淀纳米粒分散于水中，供后续使用。

步骤三，去毒细菌外膜包裹纳米粒系统的制备：将所述去毒细菌外膜囊泡超声后，与所述最终沉淀纳米粒混合，使用聚碳酸酯膜多次挤出，得到基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统。

将所述去毒细菌外膜囊泡超声30s后，与所述最终沉淀纳米粒按照质量比1：5混合，使用200nm聚碳酸酯膜挤出11次，得到基于去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米系统，新鲜制备使用。

上述制备好的基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统可用于制备靶向脑内皮细胞的药物制剂。

上述制备好的基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统请参阅图1。图1为本发明所述的基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统的构建及其体内行为示意图，如图 1所示，本发明所述的基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统利用EC-K1的去毒外膜靶向大脑微血管内皮细胞，在大脑的血管中，该系统通过OmpA-gp96相互作用介导的跨细胞作用穿透BBB，并进一步分布在颅内间质间隙。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。

首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

其次，本发明利用结构示意图等进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，示意图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是实例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。

实施例1

提取去毒细菌外膜囊泡。在含100μg/ml利福平的pH 7.4LB培养基中过夜培养大肠杆菌K1，使其OD 600值达到1.5，离心收集细菌沉淀，离心参数为4℃，5000g，10min；将沉淀重悬于四倍体积的pH 7.3磷酸盐缓冲液，300W超声破碎30min；将破碎菌液以4℃，2900g离心1h；向沉淀加入7.5倍体积于细菌湿重的0.1M Tris缓冲液(含10mM EDTA和5mg/ml 脱氧胆酸钠)，4℃，20000g，1h高速离心；收集上清，4℃，150000g，2h 高速离心两次；将上述的最终去毒细菌外膜囊泡沉淀分散于水中，储存于 -80℃待以后使用。

制备被包裹的纳米粒内核。称取50mg聚乳酸-羟基乙酸于2mL乙酸乙酯中作为油相，将100μl水逐滴加入涡旋的油相中，超声乳化形成油包水乳剂；再将所述乳剂逐滴加入涡旋的4mL 2.5％聚乙烯醇溶液中，超声乳化形成水包油包水型复乳；迅速将此复乳倒入100mL 0.3％聚乙烯醇溶液，搅拌过夜挥发除去乙酸乙酯；将所得纳米粒混悬液经过30000rpm的高速离心20 min提纯；将所述的提纯的未修饰纳米粒超声分散于适量水中，高速离心水洗两次；再将所述的最终沉淀纳米粒分散于水中。采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析。

将所得的去毒细菌外膜囊泡超声30s后，与最终的纳米粒按照质量比1： 5混合，使用200nm聚碳酸酯膜挤出11次，得到基于去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米系统，新鲜制备使用。

实施例2

提取去毒细菌外膜囊泡。在含100μg/ml利福平的pH 7.4LB培养基中过夜培养大肠杆菌K1，使其OD 600值达到1.5，离心收集细菌沉淀，离心参数为4℃，5000g，10min；将沉淀重悬于四倍体积的pH 7.3磷酸盐缓冲液，300W超声破碎30min；将破碎菌液以4℃，2900g离心1h；向沉淀加入7.5倍体积于细菌湿重的0.1M Tris缓冲液(含10mM EDTA和5mg/ml 脱氧胆酸钠)，4℃，20000g，1h高速离心；收集上清，4℃，150000g，2h 高速离心两次；将上述的最终去毒细菌外膜囊泡沉淀分散于水中，储存于 -80℃待以后使用。

制备被包裹的纳米粒内核。称取50mg聚乳酸-羟基乙酸于2mL乙酸乙酯中作为油相，将100μl水逐滴加入涡旋的油相中，超声乳化形成油包水乳剂；再将所述乳剂逐滴加入涡旋的4mL 2.5％聚乙烯醇溶液中，超声乳化形成水包油包水型复乳；迅速将此复乳倒入100mL 0.3％聚乙烯醇溶液，搅拌过夜挥发除去乙酸乙酯；将所得纳米粒混悬液经过30000rpm的高速离心20 min提纯；将所述的提纯的未修饰纳米粒超声分散于适量水中，高速离心水洗两次；再将所述的最终沉淀纳米粒分散于水中。采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析。

将所得的去毒细菌外膜囊泡超声30s后，与最终的纳米粒按照质量比1： 5混合，使用200nm聚碳酸酯膜挤出11次，得到基于去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米系统，新鲜制备使用。

为了考察本方案所构建的纳米系统结构，制得去毒细菌外膜包裹纳米粒，通过透射电镜考察该纳米系统结构。请参阅图2，图2为透射电镜对去毒细菌外膜包裹纳米粒结构的表征图。如图2所示，透射电镜结果显示本方案成功构建了具有壳核结构的膜包裹纳米系统。

实施例3

为了考察本方案所构建的纳米系统的蛋白表达，制得天然细菌外膜包裹纳米粒、去毒细菌外膜包裹纳米粒、未包裹纳米粒，通过SDS-PAGE考察所述纳米系统蛋白表达。请参阅图3，图3为通过SDS-PAGE表征天然细菌外膜包裹纳米粒、去毒细菌外膜包裹纳米粒、未包裹纳米粒的全蛋白分布图。如图3所示，SDS-PAGE结果显示去毒细菌外膜包裹纳米粒与天然细菌外膜包裹纳米粒蛋白表达一致。

实施例4

为了考察本方案所构建的纳米系统外膜蛋白OmpA的表达，制得天然细菌外膜包裹纳米粒、去毒细菌外膜包裹纳米粒、未包裹纳米粒，通过western blot考察所述纳米系统外膜蛋白OmpA的表达。请参阅图4，图4为通过 western blot表征天然细菌外膜包裹纳米粒、去毒细菌外膜包裹纳米粒、未包裹纳米粒的外膜蛋白OmpA表达图。如图4所示，SDS-PAGE结果显示去毒细菌外膜包裹纳米粒与天然细菌外膜包裹纳米粒都有大肠杆菌K1特征性外膜蛋白OmpA的表达。

实施例5

为了考察去毒细菌外膜包裹纳米粒的内毒素活性，将天然细菌外膜包裹纳米粒、去毒细菌外膜包裹纳米粒、红细胞膜包裹纳米粒、未包裹纳米粒，通过鲎试剂终点显色法检测上述纳米粒的内毒素水平。请参阅图5，图5为通过鲎试剂终点显色法检测天然细菌外膜包裹纳米粒、去毒细菌外膜包裹纳米粒、红细胞膜包裹纳米粒、未包裹纳米粒的内毒素水平图。如图5所示，结果显示去毒细菌外膜包裹纳米粒的内毒素活性显著低于天然细菌外膜包裹纳米粒。

实施例6

提取去毒细菌外膜囊泡。在含100μg/ml利福平的pH 7.4LB培养基中过夜培养大肠杆菌K1，使其OD 600值达到1.5，离心收集细菌沉淀，离心参数为4℃，5000g，10min；将沉淀重悬于四倍体积的pH 7.3磷酸盐缓冲液，300W超声破碎30min；将破碎菌液以4℃，2900g离心1h；向沉淀加入7.5倍体积于细菌湿重的0.1M Tris缓冲液(含10mM EDTA和5mg/ml 脱氧胆酸钠)，4℃，20000g，1h高速离心；收集上清，4℃，150000g，2h 高速离心两次；将上述的最终去毒细菌外膜囊泡沉淀分散于水中，储存于 -80℃待以后使用。

制备被包裹的纳米粒内核。称取50mg聚乳酸-羟基乙酸于2mL乙酸乙酯中作为油相，将100μl水逐滴加入涡旋的油相中，超声乳化形成油包水乳剂；再将所述乳剂逐滴加入涡旋的4mL 2.5％聚乙烯醇溶液中，超声乳化形成水包油包水型复乳；迅速将此复乳倒入100mL 0.3％聚乙烯醇溶液，搅拌过夜挥发除去乙酸乙酯；将所得纳米粒混悬液经过30000rpm的高速离心20 min提纯；将所述的提纯的未修饰纳米粒超声分散于适量水中，高速离心水洗两次；再将所述的最终沉淀纳米粒分散于水中。采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析。

将所得的去毒细菌外膜囊泡超声30s后，与最终的纳米粒按照质量比1： 5混合，使用200nm聚碳酸酯膜挤出11次，得到基于去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米系统，新鲜制备使用。

请参阅图6，图6为通过动态光散射法表征去毒细菌外膜包裹纳米粒和未包裹纳米粒的粒径图。如图6所示，去毒细菌外膜包裹纳米粒(119.3nm) 比未包裹纳米粒的粒径(109.5nm)增加约10nm，与文献中报道的膜厚度相符，再次印证膜包裹的成功。

实施例7

为了考察载DiR的各种膜包裹纳米给药系统在脑微血管内皮细胞上的摄取，将小鼠脑内皮细胞(bEND.3)接种于6孔板中，分别加入未包裹纳米粒、Angiopep 2修饰纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒、去毒细菌外膜包裹纳米粒孵育6h，DiR的浓度为1.5μg/mL，通过流式细胞仪FL4通道检测细胞摄取情况。该实施例的结论请参阅图7，图7为定量表征的载DiR的各种膜包裹纳米给药系统(DiR的浓度为1.5μg/mL，给药时间为6h)在脑微血管内皮细胞上的摄取图。如图7所示，相比于未包裹纳米粒、Angiopep 2 修饰纳米粒和天然细菌外膜包裹纳米粒，去毒细菌外膜包裹纳米粒被 bEND.3细胞摄取更多，说明其更易富集于内皮细胞。

实施例8

为了考察抗OmpA抗体处理后去毒细菌外膜包裹纳米粒在脑微血管内皮细胞上的摄取，将小鼠脑内皮细胞(bEND.3)接种于6孔板中，分别加入无OmpA抗体、7.5μl OmpA抗体、15μl OmpA抗体、30μl OmpA抗体预处理1h,再加入载阿霉素的去毒细菌外膜包裹纳米粒孵育1.5h，阿霉素的浓度为5μg/mL，通过流式细胞仪FL2通道检测细胞摄取情况。该实施例的结论请参阅图8，图8为定量表征的经由不同体积OmpA抗体处理后载阿霉素的去毒细菌外膜包裹纳米系统(阿霉素的浓度为5μg/mL，给药时间为1.5 h)在脑微血管内皮细胞上的摄取图。如图8所示，抗OmpA抗体能抑制内皮细胞摄取去毒细菌外膜包裹纳米粒，最多可抑制36.5％，证实了OmpA参与了去毒细菌外膜包裹纳米粒的脑内皮细胞摄取。

实施例9

为了考察抗gp96抗体处理后去毒细菌外膜包裹纳米粒在脑微血管内皮细胞上的摄取，将小鼠脑内皮细胞(bEND.3)接种于6孔板中，分别加入无gp96抗体、0.24μg gp96抗体、1.2μg gp96抗体预处理1h,再加入载阿霉素的去毒细菌外膜包裹纳米粒孵育1.5h，阿霉素的浓度为5μg/mL，通过流式细胞仪FL2通道检测细胞摄取情况。该实施例的结论请参阅图9，图9为定量表征的经由不同体积gp96抗体处理后载阿霉素的去毒细菌外膜包裹纳米系统(阿霉素的浓度为5μg/mL，给药时间为1.5h)在脑微血管内皮细胞上的摄取图。如图9所示，抗gp96抗体能抑制内皮细胞摄取去毒细菌外膜包裹纳米粒，最多可抑制44.1％，证实了gp96抗体参与了去毒细菌外膜包裹纳米粒的脑内皮细胞摄取,结合案例9，说明OmpA和gp96之间的相互作用密切参与血脑屏障内皮细胞摄取去毒细菌外膜包裹纳米粒。

实施例10

为了考察去毒细菌外膜包裹纳米粒在脑微血管内皮细胞上的定位情况，将小鼠脑内皮细胞(bEND.3)接种于6孔板中，加入载阿霉素的去毒细菌外膜包裹纳米粒孵育1h，阿霉素的浓度为12μg/mL；吸弃培养基，在与新鲜培养基进一步孵育不同时间后，使用共焦激光扫描显微镜成像。该实施例的结论请参阅图10，图10为载阿霉素的去毒细菌外膜包裹纳米系统与脑微血管内皮细胞内溶酶体在不同时间的定位的共聚焦显微镜图。如图10所示，去毒细菌外膜包裹纳米粒信号与溶酶体信号随着时间推移，共定位程度逐渐降低，证实了该系统具有溶酶体逃逸的能力，这可以归因于OmpA介导的内体逃逸。

实施例11

为了考察载阿霉素的各种膜包裹纳米给药系统跨过血脑屏障的能力，将小鼠脑内皮细胞(bEND.3)接种于12孔板transwell小室中，分别加入未包裹纳米粒、Angiopep 2修饰纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒、去毒细菌外膜包裹纳米粒孵育6h，阿霉素的浓度为5μg/mL，通过流式细胞仪FL2通道检测下腔的摄取情况。该实施例的结论请参阅图11，图11为定量表征的载阿霉素的各种膜包裹纳米给药系统(阿霉素的浓度为5μg/mL，给药时间为6h)跨过体外体外血脑屏障模型的比例图。如图11所示，相比于未包裹纳米粒和Angiopep 2修饰纳米粒，天然细菌外膜包裹纳米粒和去毒细菌外膜包裹纳米粒有更强的血脑屏障跨越能力，有利于实现高效的脑靶向。

实施例12

为了考察载DiR的各种膜包裹纳米给药系统在巨噬细胞上的摄取，将巨噬细胞接种于6孔板中，分别加入未包裹纳米粒、Angiopep 2修饰纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒、去毒细菌外膜包裹纳米粒孵育3h，DiR的浓度为1.5μg/mL，通过流式细胞仪FL4通道检测细胞摄取情况。该实施例的结论请参阅图12，图12为定量表征的载DiR的各种膜包裹纳米给药系统(DiR 的浓度为1.5μg/mL，给药时间为3h)在巨噬细胞上的摄取图。如图12所示，相比于未包裹纳米粒和Angiopep 2修饰纳米粒，去毒细菌外膜包裹纳米粒被巨噬细胞细胞摄取更少，表明该药物的隐形效应以及或许会有更好的的体内药代动力学表现。

实施例13

为了定性考察不同时间IR780在载IR780的各种膜包裹纳米给药系统处理的正常鼠脑上的蓄积，给正常小鼠分别尾静脉注射生理盐水、红细胞膜包裹纳米粒、Angiopep 2修饰纳米粒和去毒细菌外膜包裹纳米粒，注射12h或 24h后灌流固定，取小鼠脑组织，用小动物成像系统观察纳米粒在正常脑组织的蓄积。IR780的剂量为2.5μg每只小鼠。该实施例的结论请参阅图13，图13为小动物成像法定性表征的不同时间IR780在载IR780的各种膜包裹纳米给药系统处理的正常鼠脑上的蓄积图。如图13所示，去毒细菌外膜包裹在小鼠的脑组织中纳米粒蓄积最多，表明它有最好的血脑屏障渗透能力。红细胞膜包裹纳米粒没有明显的蓄积，这可能是因为红细胞膜不能显著影响血脑屏障，因为红细胞膜只能通过磷脂双层而不是去毒细菌外膜的功能结构来模拟血脑屏障。经典的脑靶向多肽Angiopep 2修饰纳米粒也显示出更弱的颅内荧光信号强度，这可以归因于血脑屏障内皮细胞中受体LRP1的低表达。

实施例14

为了定量考察不同时间SPIO中铁元素在载SPIO的各种膜包裹纳米给药系统处理的正常鼠脑上的蓄积，给正常小鼠分别尾静脉注射生理盐水、红细胞膜包裹纳米粒、Angiopep 2修饰纳米粒、去毒细菌外膜包裹纳米粒(未预给gp96抗体)、去毒细菌外膜包裹纳米粒(预给gp96抗体)，注射8h 后灌流，取小鼠脑组织，用电感耦合等离子体-质谱法定量观察纳米粒中铁元素在正常脑组织的蓄积。SPIO的剂量为5mg/kg小鼠。该实施例的结论请参阅图14，图14为电感耦合等离子体-质谱法定量表征的铁元素在载SPIO 的各种膜包裹纳米给药系统处理的正常鼠脑上的蓄积图。如图14所示，去毒细菌外膜包裹在小鼠的脑组织中纳米粒蓄积最多，且抗gp96抗体的预处理使去毒细菌外膜包裹在小鼠的脑组织中纳米粒蓄积显著降低，进一步证明了gp96介导的跨细胞转运在该纳米系统跨越血脑屏障行为中的作用。

实施例15

为了定量考察不同时间IR780在载IR780的各种膜包裹纳米给药系统处理的正常鼠脑上的蓄积，给正常小鼠尾静脉注射去毒细菌外膜包裹纳米粒，注射8h或24h后灌流固定，取小鼠脑组织，用小动物成像系统观察纳米粒在正常脑组织的蓄积。IR780的剂量为2.5μg每只小鼠。该实施例的结论请参阅图15，图15为定量表征的不同时间IR780在载IR780的去毒细菌外膜包裹纳米粒系统处理的正常鼠脑上的蓄积图。如图15所示，在8h和24h, 去毒细菌外膜包裹在小鼠的脑组织中纳米粒均有优越的蓄积，分别为0.83％剂量/g-brain和1.11％剂量/g-brain，表明它有出色的血脑屏障渗透能力。

大多数纳米载体，即使是那些设计用于增强BBB渗透的载体，在静脉给药后，其脑累积率较低(<1％剂量/g-brain)。因此1.11％剂量/g-brain的累积率很有吸引力，因为它明显高于迄今为止报道的使用受体介导的细胞转运策略的其他载体系统的累积率。

实施例16

为了考察载阿霉素的各种膜包裹纳米给药系统在正常鼠脑内不同脑区的分布，给正常小鼠分别尾静脉注射红细胞膜包裹纳米粒、Angiopep 2修饰纳米粒和去毒细菌外膜包裹纳米粒，共注射两次，间隔12h，第二次注射12h 后灌流，取小鼠脑组织，蔗糖脱水，冰冻切片，用共聚焦显微镜观察纳米粒在正常脑组织不同脑区的分布。每次注射阿霉素的剂量为5mg/kg小鼠。该实施例的结论请参阅图16，图16为共聚焦显微镜表征的载阿霉素的各种膜包裹纳米给药系统在正常鼠脑内不同脑区的分布图。如图16所示，与 Angiopep 2修饰纳米粒和红细胞膜包裹纳米粒相比，去毒细菌外膜包裹纳米粒在各个脑区的摄取更多。

实施例17

为了考察载阿霉素的去毒细菌外膜包裹纳米粒系统在正常鼠脑内不同脑区的不同细胞中的分布，给正常小鼠尾静脉注射去毒细菌外膜包裹纳米粒，共注射两次，间隔12h，第二次注射12h后灌流，取小鼠脑组织，蔗糖脱水，冰冻切片，用共聚焦显微镜观察纳米粒在正常脑组织不同脑区的分布。每次注射阿霉素的剂量为5mg/kg小鼠。该实施例的结论请参阅图17，图 17为共聚焦显微镜表征的载阿霉素的去毒细菌外膜包裹纳米粒系统在正常鼠脑内不同脑区的不同细胞中的分布图。如图17所示，去毒细菌外膜包裹纳米粒在各个脑区的各个细胞的分布并不显著，而是更多的分布于颅内间隙，这表明改纳米给药系统具有良好的生物安全性。

实施例18

为了定量考察促炎因子TNF-α,IL-6,and IL-1β在生理盐水、去毒细菌外膜包裹纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒系统处理的正常鼠脑上的mRNA 相对表达水平，给正常小鼠尾静脉注射上述各种载IR780的纳米粒，注射24h 后灌流，取小鼠脑组织，用实时荧光定量RCR法定量检测促炎因子TNF-α, IL-6,and IL-1β的表达。IR780的剂量为2.5μg每只小鼠。该实施例的结论请参阅图18，图18为实时荧光定量RCR法定量表征的促炎因子TNF-α,IL-6,and IL-1β在生理盐水、去毒细菌外膜包裹纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒系统处理的正常鼠脑上的mRNA相对表达水平图。如图18所示，在mRNA 水平上天然细菌外膜包裹纳米粒显著增加颅内TNF-α、IL-1β和IL-6的产生，而去毒细菌外膜包裹纳米粒没有引起任何明显的炎症变化，这表明改纳米给药系统具有良好的生物安全性。

实施例19

为了定量考察促炎因子TNF-α,IL-6,and IL-1β在生理盐水、去毒细菌外膜包裹纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒系统处理和内毒素处理的正常鼠脑上的蛋白表达水平，给正常小鼠尾静脉注射上述各种纳米粒，注射24h后灌流，取小鼠脑组织，用酶联免疫吸附测定法定量检测脑组织和血清中促炎因子TNF-α,IL-6,and IL-1β的蛋白表达水平。蛋白给药剂量为6.86mg/kg, LPS给药剂量为0.823μg/kg小鼠。该实施例的结论请参阅图19-20，图19为酶联免疫吸附测定法定量表征的促炎因子TNF-α,IL-6,and IL-1β在生理盐水、去毒细菌外膜包裹纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒系统与内毒素处理的正常鼠脑上的浓度图；图20为酶联免疫吸附测定法定量表征的促炎因子TNF-α,IL-6,and IL-1β在生理盐水、去毒细菌外膜包裹纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒系统与内毒素处理的正常鼠血清中的浓度图。如图19-20 所示，在蛋白水平上LPS和天然细菌外膜包裹纳米粒显著增加颅内TNF-α和IL-6的产生，而去毒细菌外膜包裹纳米粒没有引起任何明显的炎症变化，这表明改纳米给药系统具有良好的生物安全性。

实施例20

为了定量考察肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶与肾功能指标尿素氮、肌酐在生理盐水、去毒细菌外膜包裹纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒系统处理的正常鼠血清中的浓度，给正常小鼠尾静脉注射上述各种载IR780 的纳米粒，注射24h后灌流，取小鼠血清，用试剂盒法定量检测肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶与肾功能指标尿素氮、肌酐在正常鼠血清中的浓度。 IR780的剂量为2.5μg每只小鼠。该实施例的结论请参阅图21，图21为试剂盒法定量表征的肝功能指标谷丙转氨酶、谷草转氨酶与肾功能指标尿素氮、肌酐在生理盐水、去毒细菌外膜包裹纳米粒、天然细菌外膜包裹纳米粒系统处理的正常鼠血清中的浓度图。如图21所示，天然细菌外膜包裹纳米粒显著增加各项肝肾功能指标的产生，而去毒细菌外膜包裹纳米粒没有引起任何明显的变化，说明它并未造成肝肾功能损伤，这表明改纳米给药系统具有良好的生物安全性。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明公开了一种基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统及其制备方法和应用，以生物可降解的高分子材料为基础载体，表面包裹功能化改造后去除内毒素的大肠杆菌K1外膜，该纳米给药系统基于源自细菌外膜的外膜蛋白 A和血脑屏障内皮细胞上的gp96之间的相互作用，介导血液循环中的纳米给药系统跨过该屏障并最终分布于颅内间质。本发明公开的这种可可通过跨细胞囊泡转运途径穿透血脑屏障到达深层脑实质的脑靶向仿生膜包裹纳米给药系统，其制备方法简单，兼具良好的生物安全性和优越的递送效率，具有较高的操作性和经济效益。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统，其特征在于：利用生物可降解的高分子材料制备可装载药物的纳米粒作为基础载体，所述纳米粒表面包裹去除内毒素的大肠杆菌K1外膜，所述生物可降解的高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸。

2.基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)去毒细菌外膜囊泡的提取；

(1.1)在培养基中过夜培养大肠杆菌K1，使其OD 600值达到1.5，离心收集菌体沉淀；

(1.2)将所述菌体沉淀重悬于磷酸盐缓冲液，超声破碎，获得破碎菌液；

(1.3)将所述破碎菌液离心，获得沉淀；

(1.4)向所述沉淀中加入Tris缓冲液，高速离心，收集上清液；

(1.5)将所述上清液再次高速离心，获得去毒细菌外膜囊泡；

(1.6)将所述去毒细菌外膜囊泡沉淀分散于水中，储存备用；

(2)纳米粒的制备：

(2.1)称取高分子材料，溶于有机溶剂中，形成油相；

(2.2)将药物溶解在油相中，成为油相的一部分，水相为水本身，或将药物溶解于水中，形成水相；

(2.3)将所述水相逐滴加入涡旋的油相中，超声乳化形成油包水的乳剂；

(2.4)再将所述乳剂逐滴加入涡旋的外水相中，超声乳化形成水包油包水型的复乳；

(2.5)迅速将所述复乳倒入挥发水相中，搅拌过夜挥发，形成纳米粒混悬液；

(2.6)所述纳米粒混悬液通过高速离心提纯，获得纳米粒沉淀；

(2.7)将所述纳米粒沉淀超声分散于水中，高速离心，获得最终沉淀纳米粒；

(2.8)将所述最终沉淀纳米粒分散于水中，备用；

(3)去毒细菌外膜包裹纳米粒系统的制备：将所述去毒细菌外膜囊泡超声后，与所述最终沉淀纳米粒混合，使用聚碳酸酯膜多次挤出，得到基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统。

3.根据权利要求2所述的基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统的制备方法，其特征在于：在步骤(1.1)中，所述培养基为含100μg/ml利福平的pH7.4LB培养基。

4.根据权利要求2所述的基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统的制备方法，其特征在于：在步骤(1.2)中，所述菌体沉淀与所述磷酸盐缓冲液的体积比为1：4，所述磷酸盐缓冲液的pH值为7.3。

5.根据权利要求2所述的基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统的制备方法，其特征在于，在步骤(1.4)中，所述向所述沉淀中加入Tris缓冲液具体为：向所述沉淀中加入7.5倍体积于细菌湿重的0.1M Tris缓冲液，所述Tris缓冲液含10mM EDTA和5mg/ml脱氧胆酸钠。

6.根据权利要求2所述的基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统的制备方法，其特征在于：在步骤(2.1)中，所述高分子材料为聚乳酸-羟基乙酸，所述有机溶剂为乙酸乙酯。

7.根据权利要求2所述的基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统的制备方法，其特征在于：在步骤(2.2)中，所述药物为成像剂，所述成像剂与高分子材料的质量比为0.02:1-0.2:1，溶于油相的成像剂为DiR、IR780、SPIO中的任意一种，溶于水相的成像剂为阿霉素。

8.根据权利要求2所述的基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统的制备方法，其特征在于：在步骤(2.4)中，所述外水相为2.5％聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液；在步骤(2.5)中，所述挥发水相为0.3％聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液。

9.根据权利要求2所述的基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统的制备方法，其特征在于：在步骤(3)中，所述去毒细菌外膜囊泡与所述最终沉淀纳米粒的质量比为1：5。

10.基于可穿透血脑屏障的去毒细菌外膜包裹的脑靶向仿生纳米给药系统在制备靶向脑内皮细胞的药物制剂中的应用。

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