CN109893662A - 抑制Mfsd2a的载前药脑转移瘤靶向给药系统的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制Mfsd2a的载前药脑转移瘤靶向给药系统的制备方法及应用，以生物可降解的高分子材料为基础载体构建纳米给药系统，在其内部装载功能分子以抑制Mfsd2a和脑转移瘤胞内酶特异性的前体药物，表面修饰脑微血管内皮细胞靶向配体和脑转移瘤靶向配体；该纳米给药系统可在脑微血管内皮细胞靶向配体和Mfsd2a抑制功能分子的作用下高效穿透血脑屏障；在跨越血脑屏障后，纳米给药系统可在脑转移瘤靶向配体的指引下靶向进入肿瘤细胞；纳米给药系统中前体药物可在靶向递送的基础上进一步特异性作用于肿瘤细胞，降低对正常脑组织和周围组织的副作用，上述方法简单，具有可操作性和经济效益。

Description

抑制Mfsd2a的载前药脑转移瘤靶向给药系统的制备方法及 应用

技术领域

本发明属于纳米生物医药技术领域，具体涉及一种可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法及其应用。

背景技术

脑转移瘤是一种身体其他部位的恶性肿瘤转移到颅内的病症，在癌症病人中脑转移瘤发生率可达24-45％，目前已成为肿瘤科常见的临床问题。各种治疗手段(如手术治疗、立体定向放射外科、全脑放疗、免疫治疗、光动力治疗等)在治疗脑转移瘤方面存在一系列的问题，使得脑转移瘤致死率居高不下，预后差，复发率高，患者的平均生存期短。

药物治疗是一种高效的周围组织肿瘤临床治疗模式，近年来，纳米给药系统应用于肿瘤靶向药物治疗已成为肿瘤药物治疗领域的研究热点。相比游离药物，纳米给药系统具有多重载药优势，可高效装载小分子和大分子蛋白基因药物，可介导主动靶向摄取和调控释放等。然而，血脑屏障的存在，使得对周围组织原发瘤或转移瘤有效的纳米给药系统无法在脑肿瘤特别是脑转移瘤区域达到治疗浓度。血脑屏障严格控制物质进出大脑，保持脑组织内环境的基本稳定，对维持中枢神经系统正常生理状态具有重要的生物学意义，但这也正是绝大多数治疗药物无法进入脑内的重要原因。更重要的是，许多脑转移瘤沿着血管基底膜生长，血脑屏障仍然保持高度完整性。因此针对脑转移瘤，开发有效穿透血脑屏障的脑转移瘤靶向纳米给药系统迫在眉睫并具有极大的临床意义。

因此，针对上述问题，有必要提出进一步的解决方案。

发明内容

本发明目的是针对传统纳米给药系统无法有效跨越血脑屏障从而有效治疗脑转移瘤和降低毒副作用大等问题，即无法在脑肿瘤区域达到有效治疗浓度和减轻对正常脑组织和周围组织毒性，提出一种可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法及应用。

本发明的技术方案是：

一种可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)称取高分子材料溶于有机溶剂作为油相，静置，使其完全溶解；

(2)称取药物，溶解，作为内水相；

(3)配置外水相和挥发水相；

(4)将所述内水相加入涡旋状态下的油相，超声，形成油包水型乳剂；

(5)在所述外水相涡旋的条件下，逐滴加入所述油包水型乳剂，超声，形成水包油包水乳剂；

(6)迅速将所述水包油包水乳剂倒入所述挥发水相中，搅拌挥发有机溶剂，形成纳米粒混悬液；

(7)所述纳米粒混悬液经过第一次离心，沉淀，用pH值为7.3的磷酸盐缓冲液超声悬起，在纳米粒表面修饰功能连接分子，室温反应1h，形成第一体系；

(8)将所述第一体系再次离心，除去未反应的功能连接分子，沉淀，用pH值为7.3的磷酸盐缓冲液超声悬起，通过功能连接分子连接靶向配体，室温反应1h，形成第二体系；

(9)将所述第二体系再次离心，去除未反应的靶向配体，沉淀用水超声悬起，再次离心，所得纳米粒沉淀用水悬起，加入冻干保护剂，冻干，获得可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统。

进一步的，步骤(1)中所述高分子材料为聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚己内酯中的任意一种，所述有机溶剂为乙酸乙酯或二氯甲烷。

进一步的，步骤(2)中所述药物为Mfsd2a抑制功能分子和抗肿瘤药物，所述Mfsd2a抑制功能分子和抗肿瘤药物与高分子材料反应的质量比分别为0.01:1-0.2:1和0.01:1-0.5:1。

进一步的，步骤(3)中所述外水相为2.5％聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，所述挥发水相为0.3％聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液。

进一步的，步骤(7)中所述功能连接分子为琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺，分子量分别为2000、3500、5000和7000，所述功能连接分子与高分子材料反应的质量比为0.05:1-0.5:1。

进一步的，步骤(8)所述靶向配体为脑转移瘤靶向配体，所述脑转移瘤靶向配体包括巯基化透明质酸和跨细胞转运靶向肽，所述靶向配体与琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺反应的摩尔比均为0.05:1-1:1，TCEP与靶向配体摩尔比为1:1-50:1。

进一步的，步骤(7)～(9)中所述离心速度为30000rpm，时间为20min。

进一步的，步骤(9)中所述冻干保护剂为海藻糖，所述冻干保护剂与高分子材料的质量比为1:5。

上述方式所制备的可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统能够应用于靶向人体来源或动物来源的肿瘤细胞制剂中。

本发明提供了一种可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，其优点在于，该明制备方法简单，不需要特殊的处理，经灭菌，可直接用于细胞和动物实验。本发明提到的通过抑制Mfsd2a来增强受体介导的纳米给药系统跨过血脑屏障，这种设计比较新颖，且效率高；本发明提到的透明质酸-阿霉素，制作工艺简单，成本低，但其可以发挥很好的肿瘤靶向和减少正常组织蓄积的作用。所以本发明获得的纳米给药系统具有较高的操作性，新颖性和经济效益。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中，

图1为一种可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统的体内作用示意图；

图2为游离透明质酸的氢谱图(上)，游离阿霉素的氢谱图(中)，透明质酸-阿霉素的氢谱图(下)；

图3为在激发波长为480nm时，游离阿霉素(左)，透明质酸-阿霉素(中)和被透明质酸酶酶解并被超滤的透明质酸-阿霉素(右)，发射波长在490-800nm范围内与DNA反应的荧光光谱图，其中，阿霉素的浓度为2.4μg/Ml,DNA的浓度为0、1、2、4、8、16pmol/mL，所用超滤管的分子量为3000Da；

图4为激发波长为480nm时，发射波长为595nm时，游离阿霉素，透明质酸-阿霉素和被透明质酸酶解并超滤的透明质酸-阿霉素与DNA反应的荧光定量图，其中，阿霉素的浓度为2.4μg/mL，DNA的浓度为0，1，2，4，8，16pmol/mL，所用超滤管的分子量为3000Da；

图5为经透明质酸酶酶解并超滤所得透明质酸-阿霉素氢谱图(上)，超滤所得透明质酸-阿霉素氢谱图(中)，未经任何处理的透明质酸-阿霉素氢谱图(下)，所用超滤管的分子量为3000Da。

图6为激发波长为480nm，发射波长为595nm，0到24h内，经分子量为3500Da和7000Da的透析袋透析后，透明质酸-阿霉素被透明质酸酶降解效率荧光定量图，其中，透明质酸酶终浓度为4mg/mL，透明质酸-阿霉素终浓度为1mg/mL；

图7为荧光显微镜定性表征游离阿霉素，透明质酸-阿霉素在脑转移瘤细胞(231Br)和星形胶质细胞中的摄取图，其中阿霉素的浓度为3μg/mL，药物孵育时间为1.5h，标尺:50μm；

图8为荧光显微镜定性表征包载入羧基端的聚乳酸羟基乙酸的阿霉素和透明质酸-阿霉素在脑转移瘤细胞(231Br)和星形胶质细胞中的摄取图，其中阿霉素的浓度为3μg/mL，Hoechst 33342的浓度为2μg/mL，药物孵育时间为12h，标尺：50μm；

图9为MTT实验表征游离阿霉素，透明质酸-阿霉素在脑转移瘤细胞(231Br)毒性的区别；

图10为MTT实验表征游离阿霉素，透明质酸-阿霉素在星形胶质细胞中毒性的区别；

图11为单独包载阿霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒，共包阿霉素和衣霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒和共包载衣霉素和透明质酸-阿霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒的包封率，载药量，粒径，电位，多分散系数，功能连接分子分子量5000Da的琥珀酰亚胺－聚乙二醇－马来酰亚胺(NHS-PEG-MAL)的修饰数，靶向配体透明质酸和跨细胞转运靶向肽在每个纳米粒上的修饰数；

图12为阿霉素从包载衣霉素和阿霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米载体中的释放行为图(上)和透明质酸-阿霉素从包载衣霉素和透明质酸-阿霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米载体中的释放行为图(下)；

图13为定量表征的游离阿霉素和包载阿霉素修饰不同比例跨细胞转运靶向肽的纳米粒在脑微血管内皮细胞上的摄取图，其中，阿霉素的浓度为3μg/mL，药物孵育时间为1.5h；

图14为MTT实验表征不同浓度游离衣霉素在脑微血管内皮细胞中毒性，药物孵育时间为24h；

图15为荧光定量PCR定量表征的主要促进因子超级家族成员Mfsd2a在脑微血管内皮细胞上的表达水平图；

图16为定量表征在正常的和主要促进因子超级家族成员Mfsd2a过表达的在脑微血管内皮细胞上，在有无游离衣霉素存在的情况下，游离阿霉素，载阿霉素未修饰跨细胞转运靶向肽的纳米粒和载阿霉素修饰跨细胞转运靶向肽的纳米粒的摄取图，药物孵育时间为1.5h；

图17为定量表征的包载衣霉素且修饰跨细胞转运靶向肽的纳米粒，在不同时间内，对包载阿霉素且修饰了跨细胞转运靶向肽的纳米粒在脑微血管内皮细胞上的摄取的影响；

图18为荧光显微镜定性表征不同载体在正常小鼠脑组织的蓄积程度，其中阿霉素的浓度为5mg/kg，衣霉素浓度为0.5mg/kg，标尺分别为1.5mm和310μm；

图19为荧光显微镜定性(上)和BCA蛋白定量(下)游离阿霉素和包载阿霉素修饰不同靶向配体的纳米粒在脑转移瘤细胞(231Br)中的摄取图，药物孵育时间为1.5h；

图20为荧光显微镜定性(左)和酶标仪荧光定量(右)表征包载阿霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米给药系统抑制细胞外排阿霉素的情况图；

图21为在整脑水平上荧光显微镜定性表征游离阿霉素和不同载体在荷瘤小鼠脑转移瘤的靶向效果，其中阿霉素的浓度为5mg/kg，衣霉素浓度为0.5mg/kg，标尺为1.5mm；

图22为Image J定量的阿霉素在荷瘤鼠整体脑组织中正常脑区域和脑转移瘤区域的分布图；

图23为在脑组织局部放大水平上荧光显微镜定性表征游离阿霉素和不同载体在荷瘤小鼠脑转移瘤的靶向效果，其中阿霉素的浓度为5mg/kg，衣霉素浓度为0.5mg/kg，标尺为50μm；

图24为在脑组织局部放大水平上用Image pro plus定量的荷瘤鼠脑组织肿瘤和阿霉素共定位图指数图；

图25为MTT实验表征游离衣霉素，未包载药物修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒和包载衣霉素修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒在脑转移瘤细胞(231Br)中毒性，药物孵育时间为48h；

图26为MTT实验表征游离阿霉素，包载衣霉素修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒和共包载衣霉素和阿霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒在脑转移瘤细胞(231Br)中毒性，药物孵育时间为48h；

图27为共包载阿霉素和衣霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米给药系统的治疗效果图；

图28为共包载阿霉素和衣霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米给药系统治疗过程中小鼠体重变化图；

图29为共包载透明质酸-阿霉素和衣霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米给药系统的治疗效果图；

图30为共包载透明质酸-阿霉素和衣霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米给药系统治疗过程中小鼠体重变化图。

具体实施方式

细胞膜表面小窝是一种质膜内陷结构，富含胆固醇和鞘脂，在脑微血管内皮跨细胞转运过程中发挥重要作用。物质被小窝摄取属于一种胞吞胞吐过程，区别于传统的溶酶体降解途径。脑靶向药物传递系统大多利用小窝介导的跨细胞转运。据报道，纳米给药系统表面修饰一种跨细胞转运靶向肽后，可通过小窝介导的内吞和跨细胞转运途径，提高跨越血脑屏障的能力。

主要促进因子超级家族成员Mfsd2a在脑微血管内皮细胞上特异性高表达，在周围组织血管内皮细胞上极低表达。Mfsd2a在血脑屏障上的跨细胞转运过程中发挥重要作用，通过抑制小窝囊泡的形成和小窝介导的跨细胞转运来保持血脑屏障的功能。脑靶向药物传递系统大多利用小窝介导的跨细胞转运来克服血脑屏障。因此，抑制Mfsd2a可有效促进受体介导脑靶向药物传递系统的在脑微血管内皮上的跨细胞转运，从而提高血脑屏障穿透能力。有报道指出衣霉素导致的未折叠蛋白反应与Mfsd2a密切相关，可有效抑制Mfsd2a；衣霉素可提高病毒的入脑，当使用病毒感染小鼠时，预给衣霉素小鼠脑内的病毒量是衣霉素未处理小鼠的1000倍，衣霉素并未改变病毒的特征，也未改变病毒自身在脑内的复制。考虑到衣霉素可脱离Mfsd2a入脑，因此，衣霉素可能是Mfsd2a的有效可逆抑制剂。

CD44受体在乳腺癌脑转移瘤细胞上特异性高表达。水溶性、生物可降解低分子量透明质酸作为CD44特异性配体，可作为脑转移瘤靶向配体修饰纳米给药系统，以实现脑转移瘤靶向摄取。

脑转移瘤细胞内存在特异性的透明质酸酶1，其可以降解分子量小于20000的透明质酸。广谱抗肿瘤药物阿霉素常用于治疗乳腺癌，本发明拟合成透明质酸-阿霉素作为脑转移瘤胞内酶特异性的前体药物，并装载于脑转移瘤靶向纳米给药系统中。在纳米给药系统靶向输送的前提下，该前药可进一步被脑转移瘤细胞特异性激活，诱导脑转移瘤凋亡，显著降低对正常神经细胞和周围组织的毒副作用。

本发明在受体介导跨细胞转运促进脑靶向递送的基础上，进一步通过抑制Mfsd2a提高给药系统的血脑屏障穿透效率，并设计和装载特异性激活的前体药物，靶向治疗脑转移瘤。

本发明选用高分子材料、功能连接分子、脑微血管内皮细胞靶向配体、脑转移瘤靶向配体，可Mfsd2a抑制功能分子和抗脑转移瘤前体药物，以生物可降解的高分子材料为基础载体，制备内部携载Mfsd2a抑制功能分子和抗脑转移瘤前体药物、表面修饰脑微血管内皮细胞靶向配体和脑转移瘤靶向配体，该纳米给药系统可通过抑制Mfsd2a提高纳米给药系统跨越血脑屏障的效率，并在脑转移瘤靶向配体的作用下靶向脑转移瘤；内部装载的抗脑转移瘤前药还可以特异性诱导脑转移瘤细胞的凋亡，减轻对正常脑组织和周围组织的毒性。本发明有望提高以纳米粒为基础的药物传递系统的脑转移瘤靶向效率。本发明提供一种可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法，以聚乳酸-羟基乙酸-聚赖氨酸作为基础载体，采用超声乳化溶剂挥发法制备内部包载Mfsd2a抑制功能分子衣霉素和抗肿瘤前体药物透明质酸-阿霉素的纳米粒，再通过高速离心和化学反应表面修饰上功能连接分子聚乙二醇以及靶向配体透明质酸和跨细胞转运靶向肽，成功构建一种基于跨细胞途径克服血脑屏障的脑转移瘤靶向纳米给药系统。该纳米给药系统可在脑微血管内皮细胞靶向配体跨细胞转运靶向肽和Mfsd2a抑制功能分子衣霉素的作用下高效穿透血脑屏障。在跨越血脑屏障后，纳米给药系统可在脑转移瘤靶向配体透明质酸的指引下靶向进入肿瘤细胞。纳米给药系统中前体药物可在靶向递送的基础上进一步特异性作用于肿瘤细胞，降低对正常脑组织和周围组织的副作用。本发明所述方面纳米给药系统的制备方法简单，具有较高的可操作性和经济效益。

下面具体介绍可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统的结构、制备方法及应用。

本发明提供一种可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统，以生物可降解的高分子材料为基础载体，制备内部携载Mfsd2a抑制功能分子、表面修饰脑微血管内皮细胞靶向配体和脑转移瘤靶向配体的纳米粒，同时将该纳米粒装载抗脑转移瘤前体药物，可实现治疗浓度的药物递送，其特征在于，由高分子材料、聚乙二醇、跨细胞转运靶向肽和透明质酸、Mfsd2a抑制功能分子和抗脑转移瘤前体药物组成；

其中，所述高分子材料与聚乙二醇的摩尔比为1:0.05-1:0.5；聚乙二醇和跨细胞转运靶向肽和透明质酸的摩尔比均为1:0.05-1:1；高分子材料与Mfsd2a抑制功能分子的质量比为1:0.01-1:0.2；高分子材料与抗肿瘤药物的质量比为1:0.01-1:0.5；

所述的高分子材料为聚乳酸(分子量为0.3-1.5万、1.5-3万、3-5.5万、5.5-9万)、聚乳酸-羟基乙酸(分子量为0.1-1.5万、1.5-2.4万、2.4-3.8万、3.8-5.3万、5.3-7万、7-8.8万，丙交酯和乙交酯的比例为75/25、50/50或者25/75)、聚己内酯(分子量为0.4-4万，4-10.6万)；

所述的聚乙二醇为马来酰亚胺-聚乙二醇-琥珀酰亚胺(NHS-PEG-MAL)，分子量分别为2000、3500、5000和7000；

所述的跨细胞转运靶向肽序列为LRQRRRLYC；

所述透明质酸为分子量4000～20000；

所述的Mfsd2a抑制功能分子为衣霉素；

所述的抗肿瘤药物为抗肿瘤药物为透明质酸-阿霉素或其它脑转移瘤胞内酶特异性前体药物，本发明的一个实施例中以透明质酸-阿霉素为模式药物。

本发明的靶向纳米给药系统适用于靶向人体来源和动物来源的脑转移瘤细胞及其他细胞。

本发明按下述方法制备一种可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统：

步骤一：称取高分子材料溶于有机溶剂作为油相，静置，使其完全溶解；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：称取高分子材料溶于有机溶剂作为油相，静置，使其完全溶解，其中，所述的高分子材料为聚乳酸(分子量为0.3-1.5万、1.5-3万、3-5.5万、5.5-9万)、聚乳酸-羟基乙酸(分子量为0.1-1.5万、1.5-2.4万、2.4-3.8万、3.8-5.3万、5.3-7万、7-8.8万，丙交酯和乙交酯的比例为75/25、50/50或25/75)、聚己内酯(分子量为0.4-4万，4-10.6万)，所述有机溶剂为乙酸乙酯或二氯甲烷。

步骤二：称取药物，溶解，作为内水相；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：称取药物，溶解，作为内水相，其中，所述药物为抑制Mfsd2a.小分子药物衣霉素，所述抗肿瘤药物透明质酸-阿霉素或其他脑转移瘤胞内酶特异性前体药物，所述Mfsd2a抑制功能分子和抗肿瘤药物与高分子材料反应的质量比分别为0.01:1-0.2:1和0.01:1-0.5:1。

步骤三：配置外水相和挥发水相；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：配置外水相和挥发水相，所述外水相为2.5％聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，挥发水相为0.3％聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液

步骤四：将所述内水相加入涡旋状态下的油相，超声，形成油包水型乳剂；

步骤五：在外水相涡旋的条件下，逐滴加入油包水乳剂中，超声，形成水包油包水乳剂；

步骤六：迅速将所述水包油包水乳剂倒入挥发水相中，搅拌挥发有机溶剂，形成纳米粒混悬液；

步骤七：所述纳米粒混悬液经过第一次离心，沉淀用pH 7.3磷酸盐缓冲液超声悬起，在纳米粒上修饰功能连接分子，室温反应1h；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：所述纳米粒混悬液经过第一次离心，离心速度为30000rpm，离心时间20min，沉淀用pH 7.3磷酸盐缓冲液超声悬起，在纳米粒上修饰功能连接分子，室温反应1h，功能连接分子为琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺(NHS-PEG-MAL)，分子量分别为2000、3500、5000和7000，其与高分子材料反应的质量比为0.05:1-0.5:1。

步骤八：将上述反应后的体系再次离心，除去未反应的功能连接分子，沉淀用pH7.3磷酸盐缓冲液超声悬起，通过功能连接分子连接靶向配体，室温反应1h；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将上述反应后的体系再次离心，除去未反应的功能连接分子，沉淀用pH 7.3磷酸盐缓冲液超声悬起，通过功能连接分子连接靶向配体，室温反应1h，靶向配体分别为脑转移瘤靶向配体包括巯基化的透明质酸和跨细胞转运靶向肽，其与琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺反应的摩尔比均为0.05:1-1:1，TCEP与靶向配体的摩尔比为1:1-50:1，其中加入TCEP的目的是打开靶向配体形成的分子内或者分子间二硫键。

步骤九：将反应后的体系再次离心，去除未反应的靶向配体，沉淀用水超声悬起，再次离心。所得纳米粒沉淀用水悬起，加入冻干保护剂，冻干，以备后用；

在一个实施例中，该步骤可以具体如下执行：将反应后的体系再次离心，去除未反应的靶向配体，沉淀用水超声悬起，再次离心。所得纳米粒沉淀用水悬起，加入海藻糖，其与高分子材料的质量比为1:5，冻干，以备后用。

上述制备好的可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统可用于制备靶向人体来源或动物来源的肿瘤细胞制剂。

上述制备好的可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统请参阅图1。如图1所示，该纳米给药系统一方面可以在跨细胞转运靶向肽的作用下，通过受体介导的途径跨越血脑屏障，另一方面，纳米给药系统中释放的衣霉素可以抑制Mfsd2a从而进一步促进纳米给药系统跨越血脑屏障的效率。在跨越血脑屏障后，纳米给药系统在透明质酸的作用下靶向脑转移瘤，内部装载的透明质酸-阿霉素可以特异性的被脑转移瘤细胞内的透明质酸酶降解，从而进一步进入细胞核杀死细胞。

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和实施例进一步说明本发明的技术方案。但是本发明不限于所列出的实施例，还应包括在本发明所要求的权利范围内其他任何公知的改变。

首先，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

其次，本发明利用结构示意图等进行详细描述，在详述本发明实施例时，为便于说明，示意图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是实例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间。

实施例1

称取50mg聚乳酸-羟基乙酸-聚赖氨酸溶于1mL乙酸乙酯中作为油相，称取0.5mg衣霉素溶于25μL二甲基亚砜中，称取0.5mg透明质酸-阿霉素溶于75μL水中，将衣霉素溶液逐滴加入涡旋的油相中，然后逐滴加入50μL水，接着将透明质酸-阿霉素溶液逐滴加入涡旋的油相中，超声乳化形成油包水乳剂；再将所述乳剂逐滴加入涡旋的2.5％聚乙烯醇溶液中，超声乳化形成水包油包水乳剂；迅速将此乳剂倒入0.3％聚乙烯醇溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味；将所得纳米粒混悬液经过30000rpm的高速离心20min以获得纳米粒沉淀；将所述的纳米粒沉淀超声分散于适量pH 7.3磷酸盐缓冲液里，用适量该缓冲液溶解2.5mg功能连接分子即分子量为5000的琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺，室温下反应1h，通过高速离心除去未反应的功能连接分子；将所得的纳米粒沉淀超声分散于上述缓冲液里，加入靶向配体即4.8mg透明质酸，0.625mg跨细胞转运靶向肽和14.3mg TCEP,室温下反应1h,高速离心除去未反应的靶向配体；所得的纳米粒沉淀超声分散于水中，高速离心以沉淀最终的纳米粒；再将所述的最终纳米粒沉淀超声分散于水中，加入冻干保护剂10mg海藻糖，冻干。取冻干纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析。

实施例2

称取50mg聚乳酸-羟基乙酸-聚赖氨酸溶于1mL乙酸乙酯中作为油相，称取0.5mg衣霉素溶于25μL二甲基亚砜中，称取0.5mg透明质酸-阿霉素溶于75μL水中，将衣霉素溶液逐滴加入涡旋的油相中，然后逐滴加入50μL水，接着将透明质酸-阿霉素溶液逐滴加入涡旋的油相中，超声乳化形成油包水乳剂；再将所述乳剂逐滴加入涡旋的2.5％聚乙烯醇溶液中，超声乳化形成水包油包水乳剂；迅速将此乳剂倒入0.3％聚乙烯醇溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味；将所得纳米粒混悬液经过30000rpm的高速离心20min以获得纳米粒沉淀；将所述的纳米粒沉淀超声分散于适量pH 7.3磷酸盐缓冲液里，用适量该缓冲液溶解2.5mg功能连接分子即分子量为5000的琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺，室温下反应1h，通过高速离心除去未反应的功能连接分子；将所得的纳米粒沉淀超声分散于上述缓冲液里，加入靶向配体即4.8mg透明质酸，0.031mg跨细胞转运靶向肽和0.15mg TCEP,室温下反应1h,高速离心除去未反应的靶向配体；所得的纳米粒沉淀超声分散于水中，高速离心以沉淀最终的纳米粒；再将所述的最终纳米粒沉淀超声分散于水中，加入冻干保护剂10mg海藻糖，冻干。取冻干纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析。

实施例3

称取50mg聚乳酸-羟基乙酸-聚赖氨酸溶于1mL乙酸乙酯中作为油相，称取0.5mg衣霉素溶于25μL二甲基亚砜中，称取0.5mg透明质酸-阿霉素溶于75μL水中，将衣霉素溶液逐滴加入涡旋的油相中，然后逐滴加入50μL水，接着将透明质酸-阿霉素溶液逐滴加入涡旋的油相中，超声乳化形成油包水乳剂；再将所述乳剂逐滴加入涡旋的2.5％聚乙烯醇溶液中，超声乳化形成水包油包水乳剂；迅速将此乳剂倒入0.3％聚乙烯醇溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味；将所得纳米粒混悬液经过30000rpm的高速离心20min以获得纳米粒沉淀；将所述的纳米粒沉淀超声分散于适量pH 7.3磷酸盐缓冲液里，用适量该缓冲液溶解2.5mg功能连接分子即分子量为5000的琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺，室温下反应1h，通过高速离心除去未反应的功能连接分子；将所得的纳米粒沉淀超声分散于上述缓冲液里，加入靶向配体即0.24mg透明质酸，0.0625mg跨细胞转运靶向肽和7.51mg TCEP,室温下反应1h,高速离心除去未反应的靶向配体；所得的纳米粒沉淀超声分散于水中，高速离心以沉淀最终的纳米粒；再将所述的最终纳米粒沉淀超声分散于水中，加入冻干保护剂10mg海藻糖，冻干。取冻干纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析。

实施例4

称取50mg聚乳酸-羟基乙酸-聚赖氨酸溶于1mL乙酸乙酯中作为油相，称取0.5mg衣霉素溶于25μL二甲基亚砜中，称取0.5mg透明质酸-阿霉素溶于75μL水中，将衣霉素溶液逐滴加入涡旋的油相中，然后逐滴加入50μL水，接着将透明质酸-阿霉素溶液逐滴加入涡旋的油相中，超声乳化形成油包水乳剂；再将所述乳剂逐滴加入涡旋的2.5％聚乙烯醇溶液中，超声乳化形成水包油包水乳剂；迅速将此乳剂倒入0.3％聚乙烯醇溶液，搅拌挥发至无乙酸乙酯气味；将所得纳米粒混悬液经过30000rpm的高速离心20min以获得纳米粒沉淀；将所述的纳米粒沉淀超声分散于适量pH 7.3磷酸盐缓冲液里，用适量该缓冲液溶解2.5mg功能连接分子即分子量为5000的琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺，室温下反应1h，通过高速离心除去未反应的功能连接分子；将所得的纳米粒沉淀超声分散于上述缓冲液里，加入靶向配体即0.24mg透明质酸，0.031mg跨细胞转运靶向肽和0.014mg TCEP,室温下反应1h,高速离心除去未反应的靶向配体；所得的纳米粒沉淀超声分散于水中，高速离心以沉淀最终的纳米粒；再将所述的最终纳米粒沉淀超声分散于水中，加入冻干保护剂10mg海藻糖，冻干。取冻干纳米粒重悬于水中，采用马尔文纳米粒度-电位分析仪进行粒径和电位的分析。

实施例5

称取250mg透明质酸溶于10mL PBS 7.4，37.5mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶于3mL PBS 7.4，42.5mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶于2mL PBS 7.4,盐酸阿霉素136mg溶于5mL二甲基亚砜，另外补加10mL二甲基亚砜，室温搅拌反应48小时。反应产物用分子量为3500Da的透析袋在PBS 7.4和水中透析，然后冻干。冻干产物以5mg/mL的浓度溶于D2O，进行核磁共振氢谱分析。该实施例的结论如图2所示，该实施例结论为本合成方案成功合成透明质酸-阿霉素。在激发波长为480nm，发射波长为595nm的情况下，对合成产物进行荧光定量，可得每分子透明质酸上接枝了4.05个阿霉素。

实施例6

根据阿霉素插入细胞核DNA从而杀死细胞的机制，为了探索合成上的透明质酸是否影响阿霉素插入DNA，我们比较了游离阿霉素，透明质酸-阿霉素和被透明质酸酶降解的透明质酸-阿霉素插入DNA的效率。将等量的DNA与样品反应，涡旋1min，室温静置孵育29min，在激发波长为480nm的条件下，比较490-800nm的发射图谱，且比较各样品在595nm的荧光值。DNA浓度和体积：0、1、2、4、8和16pmol/mL，500μL。阿霉素浓度和体积：2.4μg/mL，500μL。被透明质酸酶降解的透明质酸-阿霉素反应前需要经过如下处理。1mg/mL的透明质酸-阿霉素和4mg/mL的透明质酸酶在PBS 5.35，37℃的条件下反应12小时，反应产物用分子量3000Da的超滤管超滤，超滤所得产物一方面用于和DNA反应(浓度体积如上所述)，另一方面以8.3mg/mL的浓度溶于d6-DMSO，进行核磁共振氢谱分析。同时，用于核磁检测的样品装于1.5mL离心管中拍照。该实施例的结论由图3和图4可看出，被透明质酸酶降解的透明质酸-阿霉素插入DNA的效率高于透明质酸-阿霉素，可比于游离阿霉素。该实施例的结论由图5上可得，化学位移值在5.4-5.5处出现属于透明质酸的吡喃糖环峰，化学位移值在7.0-8.0处出现属于阿霉素的蒽环峰，说明被降解的产物可能是低分子量透明质酸偶联的阿霉素。

实施例7

为了进一步证明透明质酸-阿霉素被降解。终浓度为1mg/mL的透明质酸-阿霉素与终浓度为4mg/mL透明质酸酶在37℃，PBS 5.35中反应2小时。接着，分别取1mL的反应产物，装于分子量为3500Da和7000Da的透析袋中，在37℃，100mL PBS 7.4的条件下透析24小时。每个时间点降解的百分比由透析袋外的被降解的量除以总的透明质酸-阿霉素的量。该实施例的结论由图6结果可知，24小时后，被降解的透明质酸的量达到26.1％。

实施例8

为了考察游离阿霉素和透明质酸-阿霉素的在脑转移瘤细胞(231Br)和星形胶质细胞中的摄取。将脑转移瘤细胞(231Br)和星形胶质细胞接种于24孔板中，分别加入游离阿霉素，透明质酸-阿霉素孵育90min，阿霉素的浓度为3μg/mL；吸去药液，用2μg/mL Hoechst33342染色30min，通过荧光显微镜定性观察细胞摄取情况。该实施例的结论如图7所示，相比于星形胶质细胞，透明质酸-阿霉素被231Br细胞摄取更多，说明其更易富集于肿瘤细胞。然而，实际情况中，在到达肿瘤区域之前，药物从纳米给药系统中的泄露是不可避免的，所以我们用分子量为41000Da的羧基端的聚乳酸-羟基乙酸包载阿霉素和透明质酸-阿霉素来在体外模拟这一过程，由图8可以看到，即使是从纳米给药系统中泄露的透明质酸-阿霉素在肿瘤细胞的摄取依旧强于星形胶质细胞。

实施例9

为了评价透明质酸-阿霉素的毒性，将脑转移瘤细胞(231Br)和星形胶质细胞接种于96孔板上，贴壁后分别给药不同浓度的游离阿霉素，透明质酸-阿霉素，孵育48h，用MTT法测定细胞存活率。该实施例的结论如图9和图10，透明质酸-阿霉素对星形胶质细胞的毒性小于231Br肿瘤细胞。

实施例10

采用马尔文纳米粒度-电位分析仪对不同类型的纳米粒进行粒径，电位和多分散指数的分析，并计算聚乙二醇，跨细胞转运靶向肽和透明质酸在每个纳米粒上的修饰量。在激发波长为480nm，发射波长为595nm的条件下，测定纳米给药系统载药量和包封率。该实施例的结论如图11所示。

实施例11

为了评价脑转移瘤靶向纳米给药系统在体外生理条件下释放药物的能力，采用透析法考察药物释放。分别将新鲜制备的2mL包载阿霉素和透明质酸-阿霉素并修饰跨细胞转运靶向肽和透明质酸的纳米粒置于截留分子量为14000Da的透析袋中，分别以100mL含0.5％十二烷基硫酸钠的pH 7.4的PBS缓冲液为释放介质，在37℃、100r/min条件下释放。其中阿霉素的浓度为150μg/mL，透明质酸-阿霉素的浓度为0.68mg/mL。在不同的时间点，以1mL新鲜的上述缓冲液代替释放介质。采用全波长酶标仪测定各时间点释放的阿霉素和透明质酸-阿霉素的量。其中全波长酶标仪采用激发波长480nm，发射波长595nm。如图12所示，该实施例结论为该纳米给药系统具有缓释功能，且透明质酸-阿霉素比阿霉素从纳米给药系统中释放慢。

实施例12

为了考察该纳米给药系统中靶向配体的靶向作用，将脑微血管内皮细胞接种于24孔板中，分别加入游离阿霉素和包载阿霉素修饰不同跨细胞转运靶向肽量的纳米粒，孵育1.5小时，阿霉素的浓度为3μg/mL；用细胞裂解液裂解细胞，用全波长酶标仪在537nm激发波长和584nm发射波长下测定阿霉素荧光，定量检测细胞内摄取的阿霉素。用BCA法检测细胞中的蛋白含量，从而归一化处理细胞摄取的阿霉素，并扣除未给药的细胞中的荧光/蛋白值。如图13所示，在每个纳米粒上修饰上1092个跨细胞转运靶向肽时，脑微血管内皮细胞对纳米粒的摄取最多。该实施例说明跨细胞转运靶向肽修饰的纳米粒对脑微血管内皮细胞具有靶向作用。

实施例13

为了评价衣霉素的毒性，将脑微血管内皮细胞接种于96孔板上，贴壁后分别给药不同浓度的游离衣霉素，孵育24h，用MTT法测定细胞存活率。该实施例的结论如图14，在0.05-1μg/mL的浓度范围内，细胞活性大于95％。

实施例14

为了解释衣霉素是否可以增强纳米粒在脑微血管内皮细胞中的摄取和其相应的机制，并且更客观的反映体内胞吞作用，我们制造了一种Mfsd2a过表达的脑微血管内皮细胞。将脑微血管内皮细胞接种于24孔板中，分别采用不同浓度的星形胶质细胞生长因子(bFGF)刺激脑微血管内皮细胞，采用荧光定量PCR技术检测Mfsd2a基因的表达。该实施例的结论如图15，各浓度均可诱导Mfsd2a的表达上升，其中150ng/mL的bFGF的诱导效果最好。

实施例15

为了验证衣霉素是否可以通过抑制Mfsd2a从而增加脑微血管内皮细胞对纳米粒的摄取。分别给予正常的脑微血管内皮细胞和Mfsd2a过表达的正常的脑微血管内皮细胞游离阿霉素，载阿霉素未修饰跨细胞转运靶向肽的纳米粒和载阿霉素修饰跨细胞转运靶向肽的纳米粒孵育1.5小时，阿霉素的浓度为3μg/mL；用细胞裂解液裂解细胞，用全波长酶标仪在537nm激发波长和584nm发射波长下测阿霉素荧光，定量检测细胞内摄取的阿霉素。用BCA法检测细胞中的蛋白含量，从而归一化处理细胞摄取的阿霉素，并扣除未给药的细胞中的荧光/蛋白值。该实施例如图16所示，说明衣霉素是可以通过抑制Mfsd2a从而增加脑微血管内皮细胞对纳米粒的摄取，尤其是增加脑微血管内皮细胞对修饰了跨细胞转运靶向肽的纳米粒的摄取。

实施例16

为了考察包载入纳米给药系统的衣霉素是否仍能发挥促进脑微血管内皮细胞对纳米粒摄取的作用，将脑微血管内皮细胞接种于96孔板，预孵育包载衣霉素且修饰跨细胞转运靶向肽的纳米粒，时间分别为0、12、24、36和60小时，吸弃药液，再给药包载阿霉素且修饰跨细胞转运靶向肽的纳米粒，孵育1.5小时，阿霉素的浓度为3μg/mL；用细胞裂解液裂解细胞，用全波长酶标仪在537nm激发波长和584nm发射波长下测定阿霉素荧光，定量检测细胞内摄取的阿霉素。用BCA法检测细胞中的蛋白含量，从而归一化处理细胞摄取的阿霉素，并扣除未给药的细胞中的荧光/蛋白值。该实施例的结论请参阅图17，如图17所示，随着给药时间的延长，衣霉素逐渐释放，发挥其促进脑微血管内皮细胞摄取纳米粒的作用。

实施例17

为了考察衣霉素体内抑制Mfsd2a从而促进跨细胞转运靶向肽修饰的纳米粒跨过血脑屏障的作用，预给以正常小鼠生理盐水，游离衣霉素或者包载衣霉素修饰跨细胞转运靶向肽的纳米粒。注射方式为每隔12小时注射一次，一共注射两次。在第二次预给药0.5小时后，再给正常小鼠分别注射游离阿霉素，包载阿霉素未修饰跨细胞转运靶向肽的纳米粒，包载阿霉素修饰跨细胞转运靶向肽纳米粒。衣霉素浓度为0.5mg/kg，阿霉素浓度为5mg/kg。24小时后灌流固定，取小鼠脑组织，蔗糖脱水，冰冻切片，用荧光显微镜观察纳米粒在正常脑组织的蓄积。该实施例的结论请参阅图18，如图18所示，注射方式为每隔12小时预给以两次载衣霉素且修饰跨细胞转运靶向肽的纳米粒加上包载阿霉素并修饰跨细胞转运靶向肽的纳米粒在小鼠的脑组织中纳米粒蓄积最多。

实施例18

为了考察该纳米给药系统中靶向配体透明质酸的靶向作用，将脑转移瘤细胞231Br接种于24孔板中，分别加入游离阿霉素和包载阿霉素的各种纳米粒，孵育1.5小时，阿霉素的浓度为3μg/mL；首先采用荧光显微镜进行定性观察，然后用细胞裂解液裂解细胞，用全波长酶标仪在537nm激发波长和584nm发射波长下测定阿霉素荧光，定量检测细胞内摄取的阿霉素。用BCA法检测细胞中的蛋白含量，从而归一化处理细胞摄取的阿霉素，并扣除未给药的细胞中的荧光/蛋白值。如图19所示，透明质酸修饰的纳米给药系统被231Br摄取的较多。该实施例说明经透明质酸修饰的纳米给药系统对CD44过表达的脑转移瘤细胞231Br具有靶向作用。

实施例19

为了考察纳米给药系统可以抑制外排的作用，将231Br细胞接种于24孔板，给药游离阿霉素和包载阿霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒，孵育1.5小时，阿霉素的浓度为3μg/mL；吸去药液，加入新鲜培养基分别孵育2h，4h，8h，用全波长酶标仪在537nm激发波长和584nm发射波长下测定培养基中外排的阿霉素荧光；通过荧光显微镜观察细胞内未外排的纳米粒的量。该实施例的结论请参阅图20，如图20所示，随着时间的延长，在8h时，游离阿霉素大多被外排到培养基中，而载阿霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米给药系统则在细胞内仍有较强的荧光，该实施例证明纳米给药系统能抑制阿霉素的外排。

实施例20

为了测定纳米给药系统体内靶向脑转移瘤效率，脑转移瘤模型小鼠通过尾静脉注射预给以生理盐水，包载衣霉素修饰跨细胞转运靶向肽的纳米粒和包载衣霉素修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒。注射方式为预先注射两次，间隔时间为12小时。在第二次预给药后0.5h注射游离阿霉素或者各种形式的载阿霉素的纳米粒。衣霉素浓度为0.5mg/kg，阿霉素浓度为5mg/kg。最后一次注射12h后，灌流固定，取小鼠脑组织，蔗糖脱水，冰冻切片，用宏观荧光显微镜和微观荧光显微镜观察纳米粒在脑转移瘤区域的蓄积。用Image J定量在整个脑组织水平的阿霉素的平均光密度。用Image proplus定量局部放大区域阿霉素和肿瘤的共定位指数。该实施例的结论请参阅图21-24，如图21-24，给药方式为包载衣霉素修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒加上包载阿霉素修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒在脑转移瘤区域的蓄积明显强于其他给药组。

实施例21

为了评价载衣霉素的靶向纳米给药系统的毒性，将脑转移瘤231Br细胞接种于96孔板上，贴壁后分别给药不同浓度的游离衣霉素，未包载药物修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒及包载衣霉素修饰修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒，孵育48h，用MTT法测定细胞存活率。该实施例的结论如图25，载衣霉素的靶向纳米给药系统的细胞毒性较低，衣霉素浓度即使达到0.2μg/mL时也对细胞几乎无毒性。游离衣霉素和包载衣霉素修饰修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒IC50分别为2.184μg/mL和3.817μg/mL。

实施例22

为了评价载衣霉素和阿霉素的脑转移瘤靶向纳米给药系统的毒性，将231Br细胞接种于96孔板上，贴壁后分别给药不同浓度的游离阿霉素、包载衣霉素修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒及共载衣霉素和阿霉素修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒，孵育48h，用MTT法测定细胞存活率。该实施例的结论如图26，共载衣霉素和阿霉素修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒的细胞毒性低于游离阿霉素，IC50分别为1.187μg/mL和0.199μg/mL。

实施例23

为了评价本发明所述的脑转移瘤靶向纳米给药系统对脑转移瘤的治疗效果，在裸鼠心脏注射脑转移瘤细胞5天后分别尾静脉给药游离阿霉素、透明质酸-阿霉素，共载衣霉素和阿霉素修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒、共载衣霉素和透明质酸-阿霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒，每次注射按照每只小鼠80μg阿霉素，2μg衣霉素，1.2mg纳米粒的剂量给药。一周一次，治疗七周，记录脑转移瘤模型小鼠的生存期及体重变化情况。该实施例的结论如图27-30，共载衣霉素和透明质酸-阿霉素且修饰透明质酸和跨细胞转运靶向肽的纳米粒可显著的延长其生存期，具有良好的治疗脑转移瘤的潜力。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明公开了一种可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统的制备方法及其应用，以生物可降解的高分子材料为基础载体，内部装载衣霉素以抑制Mfsd2a和脑转移瘤胞内酶特异性的前体药物透明质酸-阿霉素，表面修饰脑微血管内皮细胞靶向配体跨细胞转运靶向肽和脑转移瘤靶向配体透明质酸。该纳米给药系统可在脑微血管内皮细胞靶向配体跨细胞转运靶向肽和Mfsd2a抑制功能分子衣霉素的作用下高效穿透血脑屏障。在跨越血脑屏障后，纳米给药系统可在脑转移瘤靶向配体透明质酸的指引下靶向进入肿瘤细胞。纳米给药系统中前体药物透明质酸-阿霉素可在靶向递送的基础上进一步特异性作用于肿瘤细胞，降低对正常脑组织和周围组织的副作用。本发明所述纳米给药系统的制备方法简单，具有较高的可操作性和经济效益。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (9)

1.抑制Mfsd2a的载前药脑转移瘤靶向给药系统的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)称取高分子材料溶于有机溶剂作为油相，静置，使其完全溶解；

(2)称取药物，溶解，作为内水相；

(3)配置外水相和挥发水相；

(4)将所述内水相加入涡旋状态下的油相，超声，形成油包水型乳剂；

(5)在所述外水相涡旋的条件下，逐滴加入所述油包水型乳剂，超声，形成水包油包水乳剂；

(6)迅速将所述水包油包水乳剂倒入所述挥发水相中，搅拌挥发有机溶剂，形成纳米粒混悬液；

(7)所述纳米粒混悬液经过第一次离心，沉淀，用pH值为7.3的磷酸盐缓冲液超声悬起，在纳米粒表面修饰功能连接分子，室温反应1h，形成第一体系；

(8)将所述第一体系再次离心，除去未反应的功能连接分子，沉淀，用pH值为7.3的磷酸盐缓冲液超声悬起，通过功能连接分子连接靶向配体，室温反应1h，形成第二体系；

(9)将所述第二体系再次离心，去除未反应的靶向配体，沉淀用水超声悬起，再次离心，所得纳米粒沉淀用水悬起，加入冻干保护剂，冻干，获得可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统。

2.根据权利要求1所述的抑制Mfsd2a的载前药脑转移瘤靶向给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述高分子材料为聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚己内酯中的任意一种，所述有机溶剂为乙酸乙酯或二氯甲烷。

3.根据权利要求1所述的抑制Mfsd2a的载前药脑转移瘤靶向给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述药物为Mfsd2a抑制功能分子和抗肿瘤药物，所述Mfsd2a抑制功能分子和抗肿瘤药物与高分子材料反应的质量比分别为0.01:1-0.2:1和0.01:1-0.5:1。

4.根据权利要求1所述的抑制Mfsd2a的载前药脑转移瘤靶向给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述外水相为2.5％聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液，所述挥发水相为0.3％聚乙烯醇或维生素聚乙二醇琥珀酸酯溶液。

5.根据权利要求1所述的抑制Mfsd2a的载前药脑转移瘤靶向给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(7)中所述功能连接分子为琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺，分子量分别为2000、3500、5000和7000，所述功能连接分子与高分子材料反应的质量比为0.05:1-0.5:1。

6.根据权利要求1所述的抑制Mfsd2a的载前药脑转移瘤靶向给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(8)所述靶向配体为脑转移瘤靶向配体，所述脑转移瘤靶向配体包括巯基化透明质酸和跨细胞转运靶向肽，所述靶向配体与琥珀酰亚胺-聚乙二醇-马来酰亚胺反应的摩尔比均为0.05:1-1:1，三(2-羧乙基)膦与靶向配体摩尔比为1:1-50:1。

7.根据权利要求1所述的抑制Mfsd2a的载前药脑转移瘤靶向给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(7)～(9)中所述离心速度为30000rpm，时间为20min。

8.根据权利要求1所述的抑制Mfsd2a的载前药脑转移瘤靶向给药系统的制备方法，其特征在于：步骤(9)中所述冻干保护剂为海藻糖，所述冻干保护剂与高分子材料的质量比为1:5。

9.根据权利要求1—8所述的抑制Mfsd2a的载前药脑转移瘤靶向给药系统的制备方法所制备的可抑制Mfsd2a促进血脑屏障跨细胞转运的载前药脑转移瘤靶向纳米给药系统在靶向人体来源或动物来源的肿瘤细胞制剂中的应用。