CN105125522A - 一种透明质酸-阳离子药物离子对微粒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种透明质酸-阳离子药物离子对微粒及其制备方法和应用，以带正电的阳离子药物为疏水内核，带负电的透明质酸为亲水外壳，具有主动靶向和被动靶向双靶向性。

Description

一种透明质酸-阳离子药物离子对微粒

技术领域

本发明涉及一种新型的透明质酸-阳离子药物离子对微粒及其制备方法和应用，具体涉及以带负电荷的透明质酸与带正电荷的药物形成壳核结构的微粒，属于医药和纳米材料技术领域。

背景技术

透明质酸是一种酸性多聚粘多糖，由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸反复交联而成(如下式1)，广泛分布于软结缔组织细胞外基质中。透明质酸具有许多天然粘多糖共有的性质：呈白色、无臭无味、为无定形固体、溶于水、有强烈的吸湿性。

式1：透明质酸的结构

目前，透明质酸主要被用于化妆品和医学领域。透明质酸是人体皮肤的组成成分，人体中含有的透明质酸大部分分布在表皮与真皮中，透明质酸的含量与皮肤中的含水量直接相关。由于透明质酸具有强大的保湿性，含有透明质酸的护肤品涂在皮肤表面时，可以形成一层水化膜，能够润湿角质层，保持皮肤水分。如美国Revlon公司的“MOONDROPS”保湿剂、日本资生堂公司的“BH-24”精华素等都添加有透明质酸，深受消费者的喜爱。此外，由于透明质酸具有高度粘弹性和生物相容性，其在医学上也有广泛应用。如透明质酸是眼科手术中的理想原料，可以用于眼球晶体移植术、眼角膜修复术、视网膜剥离手术等，还可以用作隐形眼镜的保湿剂。透明质酸还可以治疗骨关节疾病，对于减轻关节疼痛、调节关节功能具有良好的效果。

相比于化妆品和医学领域，透明质酸在药学方面的应用并不十分广泛和成熟。然而，透明质酸所具有的生物可降解性、生物相容性和安全性，完全可以使其在药学领域得到广泛应用。透明质酸还是肿瘤细胞表面CD44蛋白的配体，与肿瘤的生长、浸润及转移密切相关。研究表明，透明质酸有抗肿瘤、促进血管生成、免疫调节和创伤修复等作用，这也赋予了透明质酸在药学领域的应用前景。

目前，透明质酸在药学方面的应用主要是以下几个方面：

一是对透明质酸进行结构改造，制备出多种透明质酸衍生物，在保留其生物可降解性和相容性的同时，提高其稳定性，用作药物的载体材料。透明质酸结构中含有丰富的羧基、羟基等基团，可以作为化学修饰的位点，通过酰胺化、酯化、开环、接枝、交联等各种化学改性方法，制备出多种功能化的透明质酸衍生物。专利文献201210568694.X提供了一类透明质酸轭合物，该类轭合物由透明质酸的羧基和碱性药物的氨基通过酰胺化反应而成，以提高药物的治疗能力。

二是将透明质酸制备成凝胶、磷脂复合物等，以达到缓释、提高生物利用度等目的。专利文献200510044067.6提供了一种透明质酸磷脂复合物及其制备方法，该复合物延长了透明质酸的作用时间，并提高了透明质酸的生物利用度。

三是透明质酸可以用于制备纳米粒或脂质体。目前，透明质酸在纳米粒和脂质体方面的应用，主要是通过化学修饰将透明质酸耦合到纳米粒或脂质体表面，以达到靶向性、增加生物相容性的目的。专利文献201210240543.1提供了一种透明质酸纳米药物载体材料及其制备方法，该发明将透明质酸偶联到接有己二酸酰肼的氧化石墨烯表面，具有良好的靶向性和生物相容性，有潜力用作药物传输载体。另一种方法是将透明质酸侧链用疏水基团加以修饰，使其自发形成以侧链为疏水内核、透明质酸为亲水外壳的纳米粒。专利文献200810200452.9提供了一种透明质酸修饰聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒及其制备方法和应用，该发明将聚氰基丙烯酸烷基酯修饰透明质酸侧链，使其自发形成纳米粒。然而，不管是对透明质酸进行结构改造，还是用透明质酸修饰纳米粒，其本质都是对透明质酸进行化学修饰。经过化学修饰后的透明质酸是一种新材料，是否还具有良好的生物相容性、可降解性和安全性，以及未知治疗风险均不得而知。

现有微粒的制备方法均是根据相似相溶原理，通过使用两种互不相溶的溶剂，利用超声、均质等手段制备微粒，如薄膜分散法、溶剂蒸发法等。微粒的制备过程中不可避免地使用二氯甲烷等毒性较大的有机溶剂。

此外，传统微粒的制备不仅工艺较为复杂，而且在制备过程中需要加入大量辅料，以保证微粒的圆整、粒径适宜和分散均匀。辅料的使用不仅会降低微粒的载药量，还会产生一定的毒性。

因此，探索一类制备工艺简单、不用或少用辅料的新型微粒制备方法在微粒研究领域是非常有必要的。

发明内容

本发明的目的之一，提供一种新型的透明质酸-阳离子药物离子对微粒。

本发明的目的之一，提供一种双靶向作用的透明质酸-阳离子药物离子对微粒。其中，较小的粒径保证微粒可以通过EPR效应达到被动靶向；同时，作为微粒外壳的透明质酸具有肿瘤靶向作用，此为主动靶向。两种作用相互结合，能够使微粒最大限度地靶向至肿瘤细胞，释放出药物达到抗肿瘤的目的。

本发明的目的之一，提供一种具有缓释效果的双靶向作用的透明质酸-阳离子药物离子对微粒。

本发明人通过研究透明质酸的结构发现，透明质酸带有大量呈现负电荷的羧基基团，因此创造性的研发，将透明质酸能与带有正电基团的药物通过离子对的方式结合到一起，从而形成内核为带正电的药物、外壳为带负电的透明质酸的微粒。

本发明的目的之一提供一种透明质酸-阳离子药物离子对微粒，以带正电的药物为疏水内核，带负电的透明质酸为亲水外壳；优选地，透明质酸与阳离子药物的比例按透明质酸的羧酸数与阳离子药物的摩尔比优选为1:5~20:1。

进一步研究，透明质酸是带有多个羧基的长链，带负电的透明质酸与多个带正电的药物在溶剂中自发形成离子对，水溶性显著降低，因此就会形成以药物为核心、透明质酸为外壳的微粒。

作为本发明的具体实施方案，本发明的透明质酸-阳离子药物离子对微粒，以带正电的阳离子药物为疏水内核，透明质酸为亲水外壳。

所述的透明质酸分子量优选为5,000~1000,000Da，分子量增大则粒径较大。

所述的透明质酸-阳离子药物离子对微粒，其粒径优选为20nm~100μm。

本发明的目的之一，提供上述透明质酸-阳离子药物离子对微粒的制备方法。

作为具体的实施方案之一，本发明的透明质酸-阳离子药物离子对微粒的制备方法如下：

（1）将带正电荷的阳离子药物溶于水或有机溶剂中，得溶液Ⅰ；

（2）将透明质酸溶于水中，得溶液Ⅱ；

（3）将溶液Ⅰ缓慢滴加至溶液Ⅱ中，搅拌反应即得。

优选地，所述水包括去离子水、蒸馏水等。

优选地，步骤（1）或步骤（2）中也可以加入表面活性剂，如磷脂、吐温80、F68、白蛋白、聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯（SolutolHS15）等，可进一步提高所制备微粒的稳定性；优选加入量为0.5-1%（m/v）。

步骤（1）中，对于水不溶性药物，先将其溶解到乙醇、丙酮等有机溶剂中，形成微粒后通过旋转蒸发、透析等方法除去有机溶剂。

步骤（3）中，优选采用超声、高压均质等手段，改变微粒的粒径并使其均一。

步骤（3）中的反应温度优选为20℃~50℃，温度增加对微粒粒径无显著影响，优选室温25℃。

步骤（3）中的透明质酸与阳离子药物的比例按透明质酸的羧酸数与阳离子药物的摩尔比优选为1:5~20:1，微粒的粒径随透明质酸用量的增加而增大。

步骤（3）中药物溶液的滴加方式优选为缓慢滴加。

步骤（3）中的反应时间优选为5min~72h，反应时间越长，微粒的粒径越大。

本发明目的之一提供了透明质酸-阳离子药物离子对微粒在制备药物中的的应用，所述药物优选自蛋白多肽类两性离子药物、生物碱类药物、抗肿瘤药物。

适用于本发明的带正电基团的阳离子药物包括但不限于如下：

抗肿瘤药物，包括但不限于，阿巴瑞克、别嘌呤钠、六甲蜜胺、氨磷汀、阿那曲唑、阿扎胞苷、博莱霉素、硼替佐米、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯法拉滨、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、达沙替尼、柔红霉素、地西他滨、右雷佐生、多柔比星（又名阿霉素）、表阿霉素、厄洛替尼、芬太尼、氟达拉滨、吉非替尼、吉西他滨、戈舍瑞林、组胺瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、伊立替康、拉帕替尼、来那度胺、曲来唑、亮丙瑞林、左旋咪唑、氮芥、美法仑、巯嘌呤、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托蒽醌、奈拉滨、奥沙利铂、喷司他丁、丙卡巴肼、舒尼替尼、他莫昔芬、替莫唑胺、硫鸟嘌呤、拓扑替康、托瑞米芬、乌拉莫司汀、长春新碱、长春瑞滨、阿柔比星、腺嘌呤、氨鲁米特、氮甲、甘磷酰芥、高三尖杉酯碱、培洛霉素、吡柔比星、长春地辛、长春碱、异芳芥、硝卡芥、泊非罗霉素等，或上述提及的药物的药学上可接受的盐形式。

其他生物碱类药物，包括但不限于，吡咯烷类生物碱（如：古豆碱、红古豆碱、党参碱等）、托品烷类生物碱（如：托品醇、可卡因、莨菪碱、阿托品等）、吡咯里西丁类生物碱（如：野百合碱、迷迭香裂碱、千里光裂碱等）、哌啶类生物碱（如：石榴皮碱、山扁豆碱、白刺胺、刺茉莉碱等）、石松碱类生物碱（如：石松烷、石杉碱甲、马尾杉碱等）、吲哚里西丁类生物碱（如：一叶萩碱等）、喹诺里西丁类生物碱（如：金雀花碱、苦参碱、苦豆碱等）、吖啶酮类生物碱（如：东风桔碱、酒饼勒碱、去甲异蜜茱萸碱等）、苯丙胺类生物碱（如：麻黄碱、伪麻黄碱、阿拉伯茶宁、多巴胺等）、苄基四氢异喹啉类生物碱（如：厚朴碱、罂粟碱、吗啡、可待因、小檗碱等）、苯乙基四氢异喹啉类生物碱（如：秋水仙胺、三尖杉碱等）、苄基苯乙胺类生物碱（如：石蒜碱、水仙花碱、加兰他敏等）、吐根碱类生物碱（如：吐根碱、O-甲基吐根微碱等）、β-卡波林类生物碱（如：β-卡波林、四氢β-卡波林等）、半萜吲哚碱类生物碱（如：棒麦角素、溴隐亭、培高利特、司来吉兰等）、单萜吲哚生物碱（如：毛钩藤碱、长春胺、依波加因等）、喹啉类生物碱（如：喜树碱、奎宁、奎尼定等）、单萜生物碱（如：甲氧基角蒿酯碱、猕猴桃碱、黄钟花碱等）、倍半萜生物碱（如：石斛碱、萍蓬草碱等）、二萜生物碱（如：乌头碱、紫乌定、高乌宁碱等）、三萜生物碱（如：虎皮楠生物碱、黄杨生物碱等）、孕甾烷生物碱（如：康里新、箭毒蛙毒素、螺富贵草碱等）、环孕甾烷生物碱（环维黄杨星D、黄杨协宁等）、胆甾烷生物碱（藜芦碱、浙贝乙素、β-苦茄碱等）等，或上述提及的药物的药学上可接受的盐形式。

某些多肽类药物，包括但不限于，蜂毒肽、人生长激素、抗菌肽、奥曲肽等，或上述提及的药物的药学上可接受的盐形式。

本发明的目的之一，提供上述透明质酸-阳离子药物离子对微粒在制药中的用途。

有益效果

（1）本发明的微粒，载药量大，有很好的水溶性、生物相容性和生物可降解性。

（2）本发明的微粒，粒径多样，可以通过控制反应条件得到粒径20nm~100μm的微粒。

（3）本发明的微粒，亲水外壳是未经任何化学修饰的透明质酸，透明质酸是生物内源性物质，无毒性，不会导致自身免疫排斥反应。透明质酸其本身也有抗肿瘤作用，可以与所载的抗肿瘤药物一起发挥作用。

（4）本发明的微粒具有双靶向性。较小的粒径保证微粒可以通过EPR效应达到被动靶向。同时，作为微粒外壳的透明质酸具有肿瘤靶向作用，此为主动靶向。两种作用结合，可以使微粒最大限度地靶向至肿瘤细胞，释放出药物达到抗肿瘤的目的。

（5）本发明的微粒具有一定的缓释效果。特别是较大粒径的微粒，可以注射到皮下或肌肉组织中，通过离子交换，缓慢地释放出药物，达到长效的目的。

（6）本发明的制备工艺简单、易控，对于水溶性药物无需使用有机溶剂，无需添加辅料或只添加少量辅料。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1表示实施例1中微粒的透射电镜图（放大倍数为8万倍）。

图2表示实施例1中微粒的体外释放实验结果。

图3表示实施例1中微粒的大鼠体内药代动力学实验结果。

图4表示实施例1中微粒在小鼠黑色素瘤细胞（B16F10，有CD44受体表达）中摄取2h的实验结果。（**：p<0.01）

图5表示实施例1中微粒在B16F10细胞中摄取2h后的共聚焦显微镜照片，其中DAPI标记细胞核，FITC标记细胞骨架。

图6表示实施例1中微粒在不同浓度下（以DOX浓度）对B16F10细胞的杀伤力实验。

图7表示HA-DOX离子对微粒和载DOX的HA-Lys-LA聚合物纳米粒肿瘤细胞摄取对比（**：p<0.01）。

图8表示HA-DOX离子对微粒和载DOX的HA-Lys-LA聚合物纳米粒对正常细胞的杀伤力对比。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，但绝不是对本发明范围的限制。下面参照实施例进一步详细阐述本发明，但是本领域技术人员应当理解，本发明并不限于这些实施例以及使用的制备方法。而且，本领域技术人员根据本发明的描述可以对本发明进行等同替换、组合、改良或修饰，但这些都将包括在本发明的范围内。

实施例1

分子量100,000Da的透明质酸（HA）溶于去离子水，阿霉素（DOX）溶于去离子水。25℃下，将阿霉素溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与阿霉素摩尔比1:1投料，搅拌反应30min，探头超声即得透明质酸-阿霉素离子对微粒，粒径180nm，通过静脉注射用于肿瘤靶向。

实施例2

分子量5,000Da的透明质酸和0.5%（m/v）聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯（SolutolHS15）溶于去离子水，卡铂溶于去离子水。20℃下，将卡铂溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与卡铂摩尔比1:5投料，搅拌反应5min，探头超声、高压均质即得透明质酸-卡铂离子对微粒，粒径20nm，通过静脉注射用于肿瘤靶向。

实施例3

分子量1000,000Da的透明质酸和1%（m/v）F68溶于去离子水，吡柔比星溶于无水乙醇。50℃下，将吡柔比星溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与吡柔比星摩尔比20:1投料，搅拌反应72h，旋蒸除去乙醇，即得透明质酸-吡柔比星离子对微粒，粒径100μm，通过肌肉或皮下注射使药物缓释，达到长效抗肿瘤效果。

实施例4

分子量300,000Da的透明质酸溶于去离子水，顺铂溶于去离子水。30℃下，将顺铂溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与顺铂摩尔比10:1投料，搅拌反应24h，即得透明质酸-顺铂离子对微粒，粒径2μm，通过肌肉或皮下注射使药物缓释，达到长效抗肿瘤效果。

实施例5

分子量500,000Da的透明质酸和0.5%（m/v）白蛋白溶于去离子水，柔红霉素溶于去离子水。40℃下，将柔红霉素溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与柔红霉素摩尔比1:2投料，搅拌反应15min，得透明质酸-柔红霉素离子对微粒，粒径130nm，通过静脉注射用于急性白血病治疗。

实施例6

分子量400,000Da的透明质酸和0.5%（m/v）吐温80溶于去离子水，石杉碱甲溶于无水乙醇。35℃下，将石杉碱甲溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与石杉碱甲摩尔比8:1投料，搅拌反应48h，旋蒸除去乙醇，即得透明质酸-石杉碱甲离子对微粒，粒径1μm，通过肌肉或皮下注射使药物缓释，达到长效效果。

实施例7

分子量10,000Da的透明质酸和1%（m/v）磷脂溶于去离子水，氧化石蒜碱溶于去离子水中。45℃下，将氧化石蒜碱溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与氧化石蒜碱摩尔比2:1投料，搅拌反应45min，，即得透明质酸-氧化石蒜碱离子对微粒，粒径200nm，通过静脉注射用于肿瘤靶向。

实施例8

分子量20,000Da的透明质酸和0.5%（m/v）F68溶于去离子水，蜂毒肽溶于去离子水。25℃下，将蜂毒肽溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与蜂毒肽摩尔比6:1投料，搅拌反应1h，即得透明质酸-蜂毒肽离子对微粒，粒径150nm，通过静脉注射用于肿瘤靶向。

实施例9

分子量1000,000Da的透明质酸溶于去离子水，蜂毒肽溶于去离子水。50℃下，将蜂毒肽溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与蜂毒肽摩尔比15:1投料，搅拌反应36h，即得透明质酸-蜂毒肽离子对微粒，粒径50μm，通过肌肉或皮下注射使药物缓释，达到长效抗肿瘤效果或治疗风湿性关节炎。

实施例10

分子量15,000Da的透明质酸和0.5%（m/v）磷脂溶于去离子水，奥曲肽溶于去离子水。45℃下，将奥曲肽溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与奥曲肽摩尔比5:1投料，搅拌反应12h，即得透明质酸-奥曲肽离子对微粒，粒径500nm，通过肌肉或皮下注射使药物缓释，治疗消化系内分泌肿瘤、消化道出血和胰腺疾病等。

实施例11

分子量300,000Da的透明质酸溶于去离子水，拉帕替尼溶于无水乙醇。25℃下，将拉帕替尼溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与拉帕替尼摩尔比1:4投料，搅拌反应20min，旋蒸除去乙醇，即得透明质酸-拉帕替尼离子对微粒，粒径160nm，通过静脉注射用于乳腺癌治疗。

实施例12

分子量200,000Da的透明质酸溶于去离子水，苯丁酸氮芥溶于无水乙醇。30℃下，将苯丁酸氮芥溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与苯丁酸氮芥摩尔比9:1投料，搅拌反应8h，旋蒸除去乙醇，即得透明质酸-苯丁酸氮芥离子对微粒，粒径300nm，通过肌肉或皮下注射使药物缓释，治疗慢性淋巴性白血病、淋巴肉瘤和何杰金氏病等。

实施例13

分子量800,000Da的透明质酸溶于去离子水，人生长激素溶于去离子水。25℃下，将人生长激素溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与人生长激素摩尔比3:1投料，搅拌反应18h，即得透明质酸-人生长激素离子对微粒，粒径5μm，通过肌肉或皮下注射使药物缓释，治疗内源性生长激素缺乏等疾病。

实施例14

分子量20,000Da的透明质酸和1%聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯（SolutolHS15）溶于去离子水，阿霉素溶于去离子水。40℃下，将阿霉素溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与阿霉素摩尔比10:3投料，搅拌反应20h，即得透明质酸-阿霉素离子对微粒，粒径800nm，通过肌肉或皮下注射使药物缓释，达到长效抗肿瘤效果。

实施例15

分子量100,000Da的透明质酸溶于去离子水，卡铂溶于去离子水。20℃下，将卡铂溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与卡铂摩尔比17:2投料，搅拌反应60h，即得透明质酸-卡铂离子对微粒，粒径10μm，通过肌肉或皮下注射使药物缓释，达到长效抗肿瘤效果。

实施例16

分子量50,000Da的透明质酸溶于去离子水，顺铂溶于去离子水。35℃下，将顺铂溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与顺铂摩尔比4:1投料，搅拌反应10min，即得透明质酸-顺铂离子对微粒，粒径50nm，通过静脉注射用于肿瘤靶向。

实施例17

分子量150,000Da的透明质酸溶于去离子水，吡柔比星溶于无水乙醇。25℃下，将吡柔比星溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与吡柔比星摩尔比14:3投料，搅拌反应10h，旋蒸除去乙醇，探头超声、高压均质即得透明质酸-吡柔比星离子对微粒，粒径400nm，通过肌肉或皮下注射使药物缓释，达到长效抗肿瘤效果。

实施例18

分子量5,000Da的透明质酸和1%（m/v）吐温80溶于去离子水，阿霉素溶于去离子水。30℃下，将阿霉素溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与阿霉素摩尔比7:1投料，搅拌反应2h，探头超声、高压均质即得透明质酸-阿霉素离子对微粒，粒径350nm，通过肌肉或皮下注射使药物缓释，达到长效抗肿瘤效果。

实施例19

分子量10,000Da的透明质酸溶于去离子水，奥曲肽溶于去离子水。25℃下，将奥曲肽溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与奥曲肽摩尔比3:2投料，搅拌反应15min，即得透明质酸-奥曲肽离子对微粒，粒径100nm，通过静脉注射治疗消化系内分泌肿瘤。

实施例20

分子量300,000Da的透明质酸和1%白蛋白溶于去离子水，阿霉素溶于去离子水。40℃下，将阿霉素溶液缓慢滴加至透明质酸溶液中，按透明质酸的羧酸数与阿霉素摩尔比18:1投料，搅拌反应60h，即得透明质酸-阿霉素离子对微粒，粒径60μm，通过肌肉或皮下注射使药物缓释，达到长效抗肿瘤效果。

实验例1

透明质酸-阿霉素（HA-DOX）离子对微粒的形态、粒径测定。将实施例1中HA-DOX微粒混悬液的浓度稀释成1mg/ml，于透射电镜下观察微粒的形态和粒径大小。

图1为HA-DOX微粒的透射电镜图。结果表明，HA-DOX微粒外观圆整，粒径均一。在此实施例下，HA-DOX微粒的粒径约为50~100nm。

实验例2

HA-DOX微粒的体外释放。将0.5mlDOX原药溶液（5mg/ml）和0.5mlHA-DOX微粒混悬液（5mg/ml，按DOX浓度计算）分别置于透析袋中（分子截留量为8000Da）。将透析袋置于含100mlPBS（pH7.4）的棕色广口瓶中，于37℃恒温摇床（100rpm）中振摇。每隔一段时间取1.0ml透析袋外的透析液测荧光值，同时向广口瓶中补加1.0ml新鲜PBS。将荧光值代入标准曲线计算出DOX的浓度，进而计算出DOX原药和HA-DOX微粒在各个时间点的释放度。

图2为实施例1中HA-DOX微粒的体外释放实验结果。结果表明：HA-DOX微粒在体外比DOX原药有更好的缓释效果。

实验例3

HA-DOX微粒的体内药代动力学实验。将SD雄性大鼠（180-200g）随机分为2组，每组5只。分别静脉注射DOX原药溶液和HA-DOX微粒混悬液（2mg/kg，按DOX浓度计算），每隔一段时间眼眶取血，收集300μl血液。离心，取100μl血浆，加入400μl乙腈沉淀蛋白，12000rpm离心10min，取上清液，用LC-MS测定样品中DOX的浓度。

图3为实施例1中HA-DOX微粒的大鼠体内药代动力学实验结果。结果表明：HA-DOX微粒在体内比DOX原药有更好的缓释效果。

实验例4

HA-DOX微粒的肿瘤细胞摄取实验。将小鼠黑色素瘤细胞（B16F10，CD44受体高表达）接种在12孔板中，每孔1×10⁵个细胞，用RPMI-1640培养基（含10%胎牛血清，50U/ml青霉素，50U/ml链霉素）在37℃5%CO₂培养箱中培养过夜，使细胞的单层覆盖率达到80%。吸去培养基，每孔分别加入1mlDOX原药溶液或HA-DOX微粒混悬液（用培养基将浓度稀释成5μg/ml，按DOX浓度计算）。原药组和微粒组各做三个复孔，另设三孔作为对照。继续培养2h后，弃去培养基，PBS洗两遍，用胰酶消化细胞。1min后终止消化，将细胞转移至2ml离心管中离心，弃去上清，加入300μlPBS重悬，用流式细胞仪测定DOX的荧光强度。

图4为实施例1中HA-DOX微粒的肿瘤细胞摄取结果。结果表明：肿瘤细胞对HA-DOX微粒的摄取要明显高于DOX原药。这是因为HA是肿瘤细胞表面CD44受体的配体，HA-DOX微粒可以被CD44受体介导进入到肿瘤细胞中。

实验例5

HA-DOX微粒的肿瘤细胞摄取共聚焦实验。细胞摄取2h后，弃去培养基，PBS洗三次。每孔加入1ml4%多聚甲醛固定细胞，15min后弃去多聚甲醛，PBS洗三次。每孔加入1ml封闭液（含1%胎牛血清的PBS）封闭30min，弃去，PBS洗三次。每孔加入100μlFITC标记的鬼笔环肽工作液，30min后弃去，PBS洗三次。每孔加入100μlDAPI染色液，5min后弃去，PBS洗三次。于激光共聚焦显微镜下观察肿瘤细胞对DOX原药和HA-DOX微粒的摄取情况。

图5为实施例1中HA-DOX微粒的肿瘤细胞摄取共聚焦图。结果进一步表明，肿瘤细胞对HA-DOX微粒的摄取要明显高于DOX原药。

实验例6

HA-DOX微粒对肿瘤细胞的毒性测试。DOX原药和HA-DOX微粒在B16F10细胞中的毒性通过MTT法测定。首先将100μl的细胞1640悬浮液（1640培养基中含10%胎牛血清，50U/ml青霉素，50U/ml链霉素）铺于96孔培养板中，使细胞的最终浓度为1×10⁴个/孔,并置于37℃5%CO₂培养箱中培养24h，使单层细胞的覆盖率达到80%。吸掉培养基，向每孔中加入100μl不同浓度的DOX原药溶液或HA-DOX微粒混悬液（用培养基稀释）。继续培养24h后，向每孔中加入20μlMTT溶液（5mg/ml），并放入培养箱中继续培养4h，使MTT与活细胞作用。随后弃去培养基，向每孔中加入150μlDMSO以溶解活细胞与MTT产生的紫色甲瓒结晶，并使用酶标仪测定每个孔在570nm处的吸收。细胞相对存活率与只有空白细胞的对照孔在570nm处的吸收相比得到。

图6为实施例1中HA-DOX微粒的肿瘤细胞毒性实验结果。结果表明：HA-DOX微粒对肿瘤细胞的杀伤性明显优于DOX原药。

对比实验

目前对HA肿瘤靶向的应用，绝大部分是将HA侧链用疏水基团修饰，使其变为两亲性物质，能在水中自组装成为纳米粒。然后再将抗肿瘤药物包载到纳米粒中，用于肿瘤靶向治疗。但是将HA进行化学修饰，势必会破坏HA的结构，可能会影响其肿瘤靶向效果，而且修饰后的HA其安全性也有待于评价。

本发明中的HA-阳离子药物离子对微粒完整地保留了HA的结构。为了研究HA的结构完整对其肿瘤靶向效果及安全性的影响，本发明特设置了对比实验，以比较本发明中HA-阳离子药物离子对微粒和其他大多数发明中经疏水修饰的HA纳米粒的优劣。本发明选择与专利文献CN104497171A的透明质酸-赖氨酸甲酯-硫辛酰基聚合物（HA-Lys-LA）纳米粒做对比，以阿霉素（DOX）为模型药物。

（1）肿瘤细胞摄取实验

分别按照本发明实施例1中的方法和专利文献CN104497171A的方法制备HA-DOX离子对微粒和载DOX的HA-Lys-LA聚合物纳米粒。按照本发明实验例4做B16F10细胞的摄取实验。实验结果见图7。

从图7中可以看出，肿瘤细胞对HA-DOX离子对微粒的摄取比载DOX的HA-Lys-LA聚合物纳米粒要明显增多，说明对HA结构进行化学修饰会降低HA的肿瘤靶向效果，进一步说明本发明的HA-阳离子药物离子对微粒肿瘤靶向性要高于其他经化学修饰的HA纳米粒。

（2）对正常细胞的体外毒性实验

理想的肿瘤靶向载体应只杀伤肿瘤细胞，而不应对正常细胞产生影

响，否则就会产生毒副作用。本发明选择人近曲小管上皮细胞（HK2）作为正常细胞，按照实验例6做MTT实验。实验结果见图8。

从图8中可以看出，HA-DOX离子对微粒对正常细胞的杀伤力要明显低于载DOX的HA-Lys-LA聚合物纳米粒，说明对HA结构进行化学修饰会使HA产生毒性，进一步说明本发明的HA-阳离子药物离子对微粒安全性要好于其他经化学修饰的HA纳米粒。

Claims (9)

1.一种透明质酸-阳离子药物离子对微粒，其特征在于以带正电的药物为疏水内核，带负电的透明质酸为亲水外壳。

2.根据权利要求1所述的微粒，其特征在于透明质酸的羧酸数与所载药物的摩尔比为1:5~20:1；优选地，微粒粒径为20nm~100μm；优选地，透明质酸的分子量为5,000~1000,000Da。

3.一种根据权利要求1所述的透明质酸-阳离子药物离子对微粒的制备方法，其特征在于制备步骤如下：

（1）带正电荷的阳离子药物溶于水或有机溶剂中，得溶液Ⅰ；

（2）透明质酸溶于水中，得溶液Ⅱ；

（3）将溶液Ⅰ缓慢滴加至溶液Ⅱ中，搅拌反应即得。

4.根据权利要求3所述的微粒的制备方法，其特征在于步骤（1）中，优选将水不溶性阳离子药物溶解到乙醇、丙酮等有机溶剂中，形成微粒后通过旋转蒸发、透析等方法除去有机溶剂。

5.根据权利要求3所述的微粒的制备方法，其特征在于步骤（1）或步骤（2）中可以加入磷脂、吐温80、F68、白蛋白、聚乙二醇-15-羟基硬脂酸酯等表面活性剂。

6.根据权利要求3所述的微粒的制备方法，其特征在于步骤（3）中加入的透明质酸的羧酸数与所载活性药物的摩尔比为1:5~20:1。

7.根据权利要求3所述的微粒的制备方法，其特征在于步骤（3）中搅拌反应时间为5min~72h。

8.一种根据权利要求1所述的透明质酸-阳离子药物离子对微粒作为活性成分载体的应用，其特征在于活性成分为蛋白多肽类药物，生物碱类药物或抗肿瘤药物。

9.一种根据权利要求1所述的透明质酸-阳离子药物离子对微粒在制备具有被动靶向和主动靶向双靶向性的药物中的应用。