KR101751595B1

KR101751595B1 - 생체적합성 친수성 고분자를 포함한 구형 약물 전달체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101751595B1
Application number: KR1020150103784A
Authority: KR
Inventors: 이은성; 이민지
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2015-07-22
Filing date: 2015-07-22
Publication date: 2017-07-11
Also published as: KR20170011332A

Abstract

본 발명은 풀러렌을 포함한 코어 및 생체적합성 친수성 고분자를 포함한 쉘로 이루어진 구형의 나노 케이지와, 약물을 포함하는 약물 전달체에 관한 것으로, 보다 상세하게는 풀러렌의 기본구조에 친수성 쉘 역할을 하는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합하여 속이 텅 빈 중심부를 갖는 구형의 나노 케이지(globular PEG) 형태의 약물 전달체에 클로린 e6(Ce6)을 접합하여 형성한 구형 PEG₃₀-Ce6은 기존의 클로린 e6보다 우수한 용해도를 나타내었으며, 일항산소 발생 수준을 개선하여 높은 광활성을 나타내었고, 세포 내 유입이 강화되어 증가된 광역학 항암 치료 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 구형 PEG₃₀-Ce6은 효과적인 광역학 항암 치료제로 사용될 수 있으며, 본 발명의 구형 나노 케이지는 약물 전달체로 다양한 의약품 분야에서 사용될 수 있다.

Description

생체적합성 친수성 고분자를 포함한 구형 약물 전달체 및 이의 용도{Globular drug delivery system comprising biocompatible and hydrophilc polymers and uses thereof}

본 발명은 풀러렌을 포함한 코어 및 생체적합성 친수성 고분자를 포함한 쉘로 이루어진 구형의 나노 케이지 및 이의 용도에 관한 것이다.

생물학적 분야에 있어서, 나노 크기 합성물질을 정밀하게 조작하기 위한 끊임없는 노력들은 여러 약제와 화장품에 적합한 기술을 개발하는 데 집중되어 있다.

지금까지 고분자 나노 운반체는 체계적인 방법으로 기능을 수행하여 표적 세포나 조직으로 생물학적 탑재물질을 운반하기 위해, 정교하면서 고도화된 물리/화학적 구조로 발전해왔다. 이러한 나노 운반체는 생물학적 약물, 진단 시약, 유전자 제품을 위한 운반체로 잠재적인 기능을 가지고 있으며, 가용화 개선, 선택적인 조직 침투 및 세포의 생체 활성 물질 조절 강화 등의 다양한 장점을 가지고 있다.

이에 따라, 최근에는 매우 작은 크기의 입자 개발에 대한 관심이 증가하고 있으며, 이러한 작은 크기의 입자들은 생체 의학 및 화장품 분야에 있어서 다양한 가능성을 제공하고 있다. 이러한 입자는 근소한 나노미터 단위 이내로 발생하는 다양한 생물학적 신호나 세포의 유전자 변화를 탐지하거나 반영할 수 있으며, 콜로이드 안정화, 약물 가용화, 약물 치료학 및 분자 진단을 크게 개선할 수 있다.

그러나 대부분의 연구는 크기가 매우 작은 합성 금속입자와 분해되지 않는 무기물 입자 개발을 목표로 하고 있으므로, 다양한 약제 또는 화장품을 개발하기 위해서는 3 차원 나노구조를 형성하며 생체적합성 및 생분해성 고분자로 구성되어 있는 매우 작은 크기의 입자에 대한 개발이 필요하다. 이러한 입자는 약제 또는 화장품 개발뿐만 아니라 과학 및 기술 등의 다양한 분야에서 널리 사용될 수 있을 것이다.

한국등록특허 제 10-1336501호(2013.11.27)

본 발명은 풀러렌(C₆₀)에 생체적합성을 지니며 친수성인 폴리에틸렌클리콜(PEG)을 접합하여 침투력 및 용해도가 우수한 매우 작은 크기의 약물 전달체를 제조하여 작은 분자의 약물, 단백질, 유전자 및 진단시약 등의 약물을 운반하는데 이용하고자 한다.

본 발명은 풀러렌을 포함한 코어 및 생체적합성 친수성 고분자를 포함한 쉘로 이루어진 구형의 나노 케이지와, 약물을 포함하는 약물 전달체를 제공한다.

본 발명은 풀러렌을 포함한 코어 및 생체적합성 친수성 고분자를 포함한 쉘로 이루어진 구형의 나노 케이지와, 약물을 포함하는 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 촉매 하에서 생체적합성 친수성 고분자와 풀러렌을 접합하여 구형의 나노 케이지를 제조하는 단계; 및 상기 생체적합성 친수성 고분자의 카르복실기를 활성화하고 링커를 이용하여 약물을 구형의 나노 케이지 표면에 결합시키는 단계를 포함하는 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 풀러렌의 기본구조에 친수성 쉘 역할을 하는 폴리에틸렌글리콜(PEG)이 결합하여 속이 텅 빈 중심부를 갖는 구형의 나노 케이지(globular PEG) 형태의 약물 전달체에 클로린 e6(Ce6)을 접합하여 형성한 구형 PEG₃₀-Ce6은 기존의 클로린 e6보다 우수한 용해도를 나타내었으며, 일항산소 발생 수준을 개선하여 높은 광활성을 나타내었고, 세포 내 유입이 증가되어 향상된 광역학 항암 치료 효과를 나타내는 것이 확인됨에 따라, 본 발명의 구형 PEG₃₀-Ce6은 효과적인 광역학 항암 치료제로 사용될 수 있으며, 상기 구형의 나노 케이지는 효과적인 약물 전달체로 다양한 의약품 분야에서 사용될 수 있다.

도 1a는 Ce6이 연결된 구형 PEG의 모식도이며, 도 1b는 구형 PEG₃₀-Ce6의 합성 과정을 나타낸 모식도이며, 도 1c는 구형 PEG₃₀-Ce6의 ¹H-NMR 피크 분석 결과이며, 도 1d는 PBS(150 mM, pH 7.4)상에서의 구형 PEG₃₀-Ce6의 크기 분포와 TEM 이미지 분석결과이다.
도 2a는 PBS(pH 7.4)상에서의 gPEGC3 및 free Ce6 UV/visible spectra 결과이며, 도 2b는 DMSO상에서의 gPEGC1, gPEGC2, gPEGC3 및 free Ce6(10 μg/mL) 방출 스펙트럼(λ_ex 400 nm, λ_em 600-750 nm) 결과이며, 도 2c는 PBS(150 mM, pH 7.4)에 분산된 gPEGC1, gPEGC2, gPEGC3(Ce6 10 μg/mL) 또는 free Ce6(10 μg/mL)의 9,10-dimethylanthracene(DMA) 형광 변화(λ_ex 360 nm, λ_em 380-550 nm)를 확인하고 일항산소 발생 정도를 DMA 형광 세기로 확인한 결과이며, 도 2d는 gPEGC2(Ce6 0.1-10 μg/mL) 또는 free Ce6(0.1-10 μg/mL)를 4시간 동안 KB 세포에 처리한 후 모든 세포에 670 nm 파장, 5.2 mW/cm² 세기의 레이저를 이용해 10분 동안 광을 조사하고 12시간 동안 배양함(n=7)(^**p<0.01 free Ce6에 비교)하고, CCK-8 분석법으로 세포생존율을 측정하여 광 독성을 확인한 결과이며, 도 2e는 gPEGC2(1-100 ㎍/mL)를 처리하고 광을 조사하지 않은 상태에서 24시간 동안 배양하였을 때의 KB 세포 생존율을 확인한 결과이다.
도 3은 gPEGC2(Ce6 10 ㎍/mL) 또는 free Ce6(10 ㎍/mL)를 처리한 KB 세포를 DAPI와 WGA-Alex Fluor 488로 염색하고 공초점 현미경으로 촬영한 이미지이다.
도 4a는 gPEGC2 또는 free Ce6를 KB 종양 유발 누드마우스의 꼬리 정맥으로 주사하고 1, 2, 4, 8 및 12시간 후 in vivo 비침습적 형광 이미지를 확인한 결과로, 종양 위치는 점선으로 된 원으로 표시되었으며, 도 4b는 주사 12시간 후에 적출한 장기내의 gPEGC2 또는 free Ce6 분포를 확인한 결과이며, 도 4c는 gPEGC2 또는 free Ce6를 처리한 KB 종양 유발 누드마우스에서 적출한 장기(주사 후 12시간 경과)의 total photon counts(형광 세기)/centimeter squared/steradian(p/s/cm²/sr)(n=3)를 확인한 결과이며, 도 4d는 gPEGC2 또는 free Ce6를 주사하고 12시간 후에 KB 종양 유발 누드마우스에서 적출한 in vivo 종양 조직 절편의 형광 이미지로, gPEGC2 또는 free Ce6의 주사 용량은 모든 실험에서 동일하게 수행한 결과이다: gPEGC2(i.v. 용량 : Ce6 0.5 mg/kg) 또는 free Ce6(i.v. 용량 : 2.5 mg/kg).
도 5a는 gPEGC2(i.v. 용량: Ce6 0.5 mg/kg) 또는 free Ce6(i.v. 용량: 2.5 mg/kg) 또는 대조군(PBS)을 주사하고 12시간 후 종양 위치에 광을 조사하여 KB 종양 유발 누드마우스의 종양 크기 변화를 비교한 결과(V/V₀ _, V: 시간에 따른 종양 크기의 변화, V₀ _:초기 종양 크기)이며, 도 5b는 KB 종양 유발 누드마우스의 광학 사진으로 종양 위치를 점선의 원으로 표시한 결과이다.

본 발명은 풀러렌을 포함한 코어 및 생체적합성 친수성 고분자를 포함한 쉘로 이루어진 구형의 나노 케이지와, 약물을 포함하는 약물 전달체를 제공할 수 있다.

상기 생체적합성 친수성 고분자는 1개의 구형의 나노 케이지에 대하여 25 내지 50 mol로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 30 mol일 수 있으나, 이에 한정되지는 않으며, 상기 생체적합성 친수성 고분자는 폴리에틸렌글리콜일 수 있다.

상기 구형의 나노 케이지는 평균직경이 1 내지 10 nm일 수 있다.

보다 상세하게는 상기 약물 전달체는 속이 텅 빈 중심부와 생체적합성 친수성 고분자인 폴리에틸렌글리콜(PEG) 쉘로 이루어진 나노 크기의 케이지로, 상기 구조는 풀러렌(C₆₀)의 모든 π-π 탄소 결합이 깨지고 이를 기반으로 PEG가 연결된 형태로 도 1a와 같은 구형 나노 케이지가 형성된다.

본 발명은 풀러렌을 포함한 코어 및 생체적합성 친수성 고분자를 포함한 쉘로 이루어진 구형의 나노 케이지와, 약물을 포함하는 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물을 제공할 수 있다.

상기 약물은 광감작제, 단백질, 유전자 및 화합물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 항암제일 수 있다.

상기 광감작제는 빛에 의해 반응하여 일항산소를 발생시키며, 클로린류(chlorins), 박테리오클로린류(bacteriochlorins), 포피린류(phophyrins) 및 포피센류(porphycenes)로 이루어진 군에서 선택될 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 약물은 생체적합성 친수성 고분자로 이루어진 쉘에 화학적으로 결합될 수 있다.

상기 암질환은 구강암, 피부암, 자궁암, 폐암, 간암, 전립선암 및 위암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면, 도 1b와 같이 클로린 e6(Ce6)가 링커로 연결된 구형 나노 케이지 또는 free Ce6을 사람 비인두표피세포암종 KB 세포에 처리하고 광을 조사한 결과, 도 2c와 같이 free Ce6 보다 나노 케이지에 연결된 Ce6가 처리된 세포군에서 일항산소의 발생이 증가하였으며, 그에 따라 도 2d와 같이 높은 암세포 사멸 효과가 나타났다.

또한, KB 종양이 유발된 누드마우스의 꼬리 정맥에 클로린 e6(Ce6)가 연결된 구형 나노 케이지(gPEGC2) 또는 free Ce6을 주사하고 1, 2, 4, 8 및 12 시간 후 근적외선 형광을 확인한 결과, 도 4b와 같이 본 발명의 클로린 e6(Ce6)가 연결된 구형 나노 케이지는 종양 조직에서 형광이 강하게 나타난 것이 확인됨에 따라, 정상조직보다 종양에 우세하게 축적되는 것이 확인된 반면, free Ce6는 종양 조직보다 정상 조직이나 기관에서 형광이 나타나는 것이 확인됨에 따라, 정상 조직에 비특이적으로 유입되는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들로부터 본 발명의 약물 전달체는 매우 작은 크기의 구조로 종양 과 같은 표적 세포 또는 조직에 깊이 침투할 수 있음이 확인되었으므로 약물을 전달하기 위한 효과적인 운반체로 사용될 수 있으며, 본 발명의 구형의 나노 케이지와, 약물을 포함하는 조성물은 효과적인 암질환 치료용 약학조성물로 사용될 수 있다.

본 발명의 한 구체예에서, 상기 구형의 나노 케이지 및 약물을 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물은 통상적인 방법에 따라 주사제, 과립제, 산제, 정제, 환제, 캡슐제, 좌제, 겔, 현탁제, 유제, 점적제 또는 액제로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 제형을 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 구형의 나노 케이지 및 약물을 유효성분으로 함유하는 암질환 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제, 붕해제, 감미제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제, 향미제, 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

구체적으로 담체, 부형제 및 희석제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 사용할 수 있으며, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 있으며 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기재로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 대상체로 투여할 수 있다.

상기 구형의 나노 케이지 및 약물의 바람직한 투여량은 대상체의 상태 및 체중, 질환의 종류 및 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 본 발명의 일실시예에 따르면 이에 제한되는 것은 아니지만 1일 투여량이 0.01 내지 200 mg/kg, 구체적으로는 0.1 내지 200 mg/kg, 보다 구체적으로는 0.1 내지 100 mg/kg 일 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고 수회로 나누어 투여할 수도 있으며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 '대상체'는 인간을 포함하는 포유동물일 수 있으나, 이들 예에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 촉매 하에서 생체적합성 친수성 고분자와 풀러렌을 접합하여 구형의 나노 케이지를 제조하는 단계; 및 상기 생체적합성 친수성 고분자의 카르복실기를 활성화하고 링커를 이용하여 약물을 구형의 나노 케이지 표면에 결합시키는 단계를 포함하는 암질환 치료 또는 예방용 약학조성물의 제조방법을 제공할 수 있다.

보다 상세하게는 상기 활성화를 위해 생체적합성 친수성 고분자를 N-하이드록시숙신이미드(NHS), 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 이용하여 카르복실기를 활성화하고, 링커로는 3-아미노-1-프로판올을 사용할 수 있으며, 촉매는 LiOH를 사용할 수 있다.

상기 생체적합성 친수성 고분자는 1개의 구형의 나노 케이지에 대하여 25 내지 50 mol로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

<참고예> 실험물질

풀러렌(C₆₀)은 NanoLab Inc.(Waltham, MA, USA)에서 구입하였다.

수산화리튬(Lithium hydroxide; LiOH), N,N′-디시클로헥실카르보디이미드(N,N′-dicyclohexylcarbodiimide; DCC), N-히드록시숙신이미드(N-hydroxysuccinimide; NHS), 3-아미노-1-프로판올(3-amino-1-propanol; AP), 4-디메틸아미노피리딘(4-dimethylaminopyridine; DMAP), 다이메틸설폭시드(dimethyl sulfoxide; DMSO), 트리에틸아민(triethylamine; TEA), 피리딘(pyridine),톨루엔( toluene), 4′,6-디아미디노-2-페닐인돌디하이드로클로라이드(4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; DAPI), _L-글루타민(_L-glutamine), 9,10-디메틸안트라센(9,10-dimethylanthracene; DMA)은 Sigma-Aldrich(USA)에서 구입하였으며, 클로린 e6(Chlorin e6; Ce6)는 Frontier Scientific Inc.(USA)에서 구입하여 사용하였다. RPMI-1640, 태아소혈청(fetal bovine serum; FBS), 페니실린(penicillin), 트립신(trypsin), EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 및 스트렙토마이신(streptomycin)은 Welgene Inc.(Korea)에서 구입하였으며, The Cell Counting Kit-8(CCK-8)는 Dojindo Molecular Technologies Inc(Japan)에서 구입하였으며, Wheat Germ Agglutinin Alexa Fluor 488 Conjugate(WGA-Alexa Fluor 488)는 Life Technologies(USA)에서 구입하여 사용하였다. 모노카르복실레이트 폴리(에틸렌 글리콜)[Monocarboxylated poly(ethylene glycol); PEG-COOH, Mw~2K Daltons]은 이전에 본 발명자들이 발표한 논문(U. Y. Lee, N. M. Oh, D. S. Kwag, K. T. Oh, Y. T. Oh, Y. S. Youn and E. S. Lee, Angew . Chem . Int . Ed., 2012, 51, 7287-7291.)의 방법대로 준비하여 사용하였다.

< 실시예 1> 구형 PEG ₃₀ 합성

PEG-COOH(1.5g)를 풀러렌(C₆₀)에 접합시켜 도 1a와 같은 속이 텅 빈 중심부와 생체적합성/친수성의 PEG 쉘(shell)로 이루어진 나노 크기의 구형(globular) 폴리에틸렌글리콜(PEG, M_w ~ 2K)을 계발하였다.

먼저, DMSO(10 mL)/톨루엔(toluene; 10 mL) 공용매상에서 LiOH(100 mg)를 촉매제로 사용하여 실온에서 2일 동안 반응시켰다. 그 후, 용매상의 톨루엔은 회전증발기를 이용하여 증발시키고, 반응 안 된 물질을 제거하기 위해서 최종 용액을 투석막(Spectra/Por MWCO 50K)에 옮겨 증류수로 투석하고, 투석막 안의 용액을 2일간 동결건조하였다. 그 후 ¹H-NMR 피크 분석을 수행하였다. 구형 PEG₃₀의 수 평균 분자량(M_n)과 질량 평균 분자량(M_w)은 410 시차굴절계(differential refractometer)가 갖추어진 HPLC system(Waters, USA)와 겔 투과 크로마토그래피(GPC) KF-804 또는 GPC KF-805 column(Shodex, Tokyo, Japan)을 사용하여 실온에서 mobile phase로 DMF에 1.0 mL/min의 유속으로 측정하였다.

그 결과, 도 1b와 같이 PEG-COOH가 C₆₀의 모든 π-π 탄소 결합에 접합된 것을 확인할 수 있었으며, C₆₀ 1 mol 당 PEG가 30 mol이 접합되어 구형 PEG₃₀이 합성되어진 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 본 발명의 구형 PEG₃₀의 구조는 풀러렌(C₆₀)의 모든 π-π 탄소 결합이 깨지고 이를 기반으로 PEG가 연결된 형태로, 30 mol PEG가 1 mol C₆₀ 에 LiOH을 촉매로 하여 접합되는 것을 확인할 수 있었다.

또한, ¹H-NMR 피크 분석 결과 도 1c와 같이 δ 4.60(-O-CH₂-CO-, PEG와 대응) 피크와 δ 1.25 (-CH-, 축구공 모양의 기본 구조와 대응) 피크의 적분비로 확인되었으며, 구형 PEG의 M_n과 M_w는 겔 투과 크로마토그래피(GPC) 기기로 분석한 결과, 각각 65.5 kDa과 65.6 kDa으로 확인되었다.

< 실시예 2> 구형 PEG ₃₀ - Ce6 합성 및 특성 확인

1. 구형 PEG ₃₀ - Ce6 합성

약제로써의 가능성을 평가하기 위하여 광감각제 모델 약물(클로린 e6; Ce6)을 3-아미노-1-프로판올(AP, 연결고리), N-히드록시숙신이미드(NHS), 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 사용하여 구형 PEG₃₀의 표면에 연결하였다.

구형 PEG₃₀(300 mg)와 pre-activated Ce6(12, 24, 80 mg)[Ce6(10 mM), AP(5 mM), DCC(5 mM), NHS(5 mM), TEA(1 mL)를 DMSO(20 mL)상에 실온에서 12시간 동안 화학 반응시켜 stock 용액으로 준비]를 DMSO(10 mL)상에 DMAP(100 mg), DCC(100 mg), 피리딘(1 mL)을 첨가하여 실온에서 2일 동안 반응켰다. 그 후, 반응 안 된 물질을 제거하기 위해서 최종 용액을 투석막(Spectra/Por MWCO 50K)에 옮겨 DMSO(2일간)와 증류수(1일간)로 투석하고 투석막 안의 용액을 2일간 동결건조시켰다.

pre-activated Ce6를 반응시킨 양에 따라, 세 종류의 구형 PEG₃₀-Ce6[gPEGC1(Ce6 12 mg 반응), gPEGC2(Ce6 24 mg 반응), gPEGC3(Ce6 80 mg 반응)]를 얻었다.

상기 Ce6의 양을 다르게 하여 합성한 세 종류의 구형 PEG₃₀-Ce6의 ¹H-NMR 피크 분석을 수행한 결과, 도 1c와 같이δ 0.85(-CH₃, Ce6와 대응) 피크와 δ 1.25(-CH-, 축구공 모양의 기본 구조와 대응) 피크의 적분비로 확인하였으며, 구형 PEG₃₀ 1 mol당 Ce6는 평균 1.4(gPEGC1), 2.4(gPEGC2) 및 4.8(gPEGC3)mol이 연결되었으며, 구형 PEG₃₀-Ce6(구형 PEG₃₀의 반응 양을 고려할 때)의 최종 생산물 산출량은 78-89%이었다.

2. 구형 PEG ₃₀ - Ce6 특성 확인

인산완충식염수(phosphate buffered saline; PBS, 150 mM, pH 7.4)에 분산시킨 구형 PEG₃₀-Ce6(0.1 mg/mL)의 입자 크기 분포는 제타사이저[Zetasizer 3000 instrument(Malvern Instruments, USA)]로 확인하였다. 구형 PEG₃₀-Ce6의 형태는 투과 전자 현미경[transmission electron microscope; TEM(JEM 1010, Japan)]으로 확인하였으며, PBS(pH 7.4)상에서의 구형 PEG₃₀-Ce6(0.1 mg/mL) 제타 전위는 제타사이저[Zetasizer 3000 instrument(Malvern Instruments, USA)]로 확인하였다.

그 결과, 투과 전자 현미경[Transmission electron microscope(TEM)]의 이미지에서 구형 PEG₃₀-Ce6(gPEGC3: 평균 지름 3.6 nm, Zetasizer 3000 instrument를 사용하여 측정)은 도 1d와 같이 거의 구형으로 나타났으며, Ce6를 붙이지 않은 구형 PEG₃₀의 TEM 이미지와도 동일한 것으로 확인되었으며, 구형 PEG₃₀, gPEGC1 및 gPEGC2의 평균 지름은 각각 3.4 nm, 3.4 nm 및 3.5 nm으로 나타났다.

특히, 구형 PEG₃₀-Ce6(gPEGC1, gPEGC2, gPEGC3) 분자는 나노 입자를 제조하기 위한 단계인 diafiltration, film-rehydration, sonication과 같은 과정 없이도 PBS(pH 7.4)상에 쉽게 분산되는 것으로 확인되었다.

일반적으로 C₆₀에 PEG 또는 생물고분자를 접합할 경우, 수상에서 큰 크기의 입자(30-50 nm)가 생성되는데 이는 PEG 또는 생물고분자가 C₆₀를 중심으로 자가 조립하여 불완전하게 둘러싸기 때문일 것으로 제안될 수 있다.

마지막으로 gPEG₃₀, gPEGC1, gPEGC2 및 gPEGC3의 제타 전위는 각각 8.1 mV, -7.9 mV, -7.8 mV 및 -7.6 mV로 확인되었다.

상기 결과들로부터 구형 PEG₃₀은 Ce6 분자를 위한 약물 전달체로 사용될 수 있으며, 상기 결과와 같은 매우 작은 크기의 입자 제조방법은 지금까지 개발되어 알려져왔던 어떠한 제조방법보다 유용한 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 3> 구형 PEG ₃₀ - Ce6 의 in vitro 광 활성 확인

PBS(150 mM, pH 7.4)상에서의 각 구형 PEG₃₀-Ce6(Ce6 10 ㎍/mL) 또는 free Ce6(10 ㎍/mL) UV/visible spectrum을 300-800 nm 파장범위에서 확인하였으며, DMSO 상에서의 각 샘플(10 ㎍/mL) 발광 스펙트럼을 분광형광계[Shimadzu RF-5301PC spectrofluorometer(USA)]를 사용하여 λ_ex 400 nm, λ_em 600-750 nm에서 측정하였다.

그 결과, 도 2a와 같이 구형 PEG₃₀-Ce6는 400, 500 및 670 nm 파장에서 구별되는 흡광 곡선을 나타내었으며, free Ce6과 동일한 것으로 확인되었다. 또한, DMSO상에서 구형 PEG₃₀-Ce6의 광 발광 스펙트럼(λ_ex 400 nm, λ_em 600-750 nm)를 확인한 결과, 도 2b와 같이 구형 PEG₃₀-Ce6의 발광 스펙트럼(gPEGC1, gPEGC2 및 gPEGC3)는 670 nm에서 Ce6 발광(emission) 곡선과 구별되며, 구형 PEG₃₀에 연결된 Ce6 비율과 비례한 것을 확인할 수 있었다. 또한, Ce6가 연결되어 있지 않은 구형 PEG₃₀는 600-750 nm의 범위에서 어떠한 발광 곡선도 확인되지 않았다.

또한, PBS(150 mM, pH 7.4)에 분산된 각 구형 PEG₃₀-Ce6(Ce6 10 ㎍/mL) 또는 free Ce6(10 ㎍/mL)의 일항산소 발생 정도를 9,10-디메틸안트라센(dimethylanthracene; DMA)를 이용하여 확인하였다. 먼저, DMA(20 mmol)를 PBS(150 mM, pH 7.4)에 분산된 각 샘플(Ce6 10 ㎍/mL) 또는 free Ce6(10 ㎍/mL)에 혼합하고, 상기 용액에 670 nm 파장, 5.2 mW/cm² 세기의 레이저를 이용해 10분 동안 광을 조사하였다. 1시간 후 DMA 형광 세기가 안정기에 이르면 Shimadzu RF-5301PC spectrofluorometer로 측정(λ_ex 360 nm, λ_em 380-550 nm)하였다. DMA 형광 세기 변화(F_f-F_s)는 각 샘플에 광을 조사하기 전 일항산소가 발생하지 않은 DMA 형광 세기(F_f)에서 광 조사 후 안정된 DMA 형광 세기(F_s)를 빼주었다(Ce6 없을 경우, 일항산소 발생 없음).

그 결과, 도 2c와 같이 gPEGC2의 경우 Ce6 분자 사이의 거리가 멀기 때문에, Ce6 분자 간의 탈퀀싱(dequenching) 효과로 가장 높은 일항산소 발생을 나타내었으며, gPEGC3는 Ce6 분자 사이의 거리가 가깝기 때문에, Ce6 분자 간의 오토퀀싱(autoquenching) 효과로 일항산소 발생이 상대적으로 낮은 것을 확인할 수 있었다. 흥미롭게도, gPEGC1은 일항산소 발생이 더 낮게 나타나는 것으로 확인되었으며 이는 거대한 PEG shell의 영향으로 광 침투에 제한을 받기 때문인 것으로 확인되었다. PBS 상에서의 free Ce6의 일항산소 발생 산출량은 모든 구형 PEG₃₀-Ce6의 일항산소 발생 산출량보다 낮게 나타났으며, 이러한 결과는 PBS상에서 불규칙적으로 친유성 응집이 형성되기 때문이다. 또한, Ce6가 연결되지 않은 구형 PEG₃₀는 광을 조사하였을 때 어떠한 일항산소도 발생시키지 않았다.

상기 결과로부터 본 발명자들은 in vitro / in vivo 실험을 위하여 구형 PEG₃₀-Ce6분자 중 Ce6 운반체로 최적화된 gPEGC2를 선택하였다.

< 실시예 4> 구형 PEG ₃₀ - Ce6 의 in vitro 세포 광 독성 확인

사람 비인두표피세포암종 KB 세포(Korean Cell Line Bank)를 2 mM _L-glutamine, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 10% 태아소혈청(FBS)를 첨가한 RPMI-1640 배지에서 5% CO₂ 농도,37℃ 조건으로 배양하였다. 실험 전, 0.25%(w/v) 트립신/0.03%(w/v) EDTA 용액을 이용하여 단층상태의 세포(1×10⁵cells/mL)를 수거하고 RPMI-1640 배지에 분산시킨 후 well에 분주하고 RPMI-1640 배지에 분산시킨 구형 gPEGC2(Ce6 0.1-10 ㎍/mL) 또는 free Ce6(0.1-10 ㎍/mL)를 세포에 처리하고 37℃ 조건으로 4시간 동안 배양한 후 PBS(pH 7.4)로 세 번 세척하였다. 그 후, 세포에 670 nm 파장, 5.2 mW/cm² 세기의 레이저를 이용해 10분 동안 광을 조사하고 37℃ 조건으로 12시간 동안 추가 배양하였다. 세포 생존율은 Cell Counting Kit-8(CCK-8 assay)을 이용해 측정하였다.

그 결과, 도 2d와 같이 gPEGC2가 처리된 KB 세포에 광을 조사한 경우, gPEGC2는 Ce6 농도 0.1-10 ㎍/mL에서 상대적으로 높은 암세포 사멸을 나타낸 반면, free Ce6(PRMI-1640 배지에서 응집됨, 지름 평균 386 nm)는 낮은 일항산소 발생 때문에 KB 세포에 대한 광 독성이 낮게 나타났다.

또한, 구형 PEG₃₀-Ce6 자체의 독성을 평가하기 위해, 빛을 조사하지 않은 상태에서 각 구형 PEG₃₀-Ce6(1-100 ㎍/mL)을 KB 세포에 24시간 동안 처리하여 세포 생존율을 확인하였다.

그 결과, 도 2e와 같이 광이 조사되지 않은 경우, gPEGC2는 1-100 μg/mL 농도에서 독성이 거의 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 구형 PEG₃₀은 비독성을 나타내는 것으로 확인되었다.

추가로, 구형 PEG₃₀-Ce6의 세포 내 유입 및 분포를 확인하기 위해서, 구형 gPEGC2(Ce6 10 ㎍/mL) 또는 free Ce6(10 ㎍/mL)를 처리한 KB 세포를 37℃ 조건으로 4시간 동안 배양한 후, 세포핵과 세포막 관찰을 위해 DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride)와 WGA-Alexa Fluor 488을 사용하여 각각 세포핵과 세포막을 염색하고 세포를 PBS(pH 7.4)로 3회 세척한 후 공초점 레이저 현미경[confocal laser scanning microscope (CarlZeiss Meta LSM510, Germany)]으로 확인하였다.

그 결과, 도 3과 같이 free Ce6보다 gPEGC2가 세포내 유입이 더 우수한 것을 확인할 수 있었으며, 특이하게도, gPEGC2는 주로 핵에서 관찰되었다. 비록 gPEGC2가 어떻게 핵으로의 축적이 증가했는지는 확인할 수 없었으나, gPEGC2는 KB 암세포에 Ce6를 효율적으로 전달하는 약물 전달체로 유용하게 사용될 수 있다.

< 실시예 5> 구형 PEG ₃₀ - Ce6 의 in vivo 분포 확인

구형 PEG₃₀-Ce6의 in vivo 사용 가능성을 확인하기 위해, 가톨릭대학교 동물실험윤리위원회(IACUC)로부터 승인된 지침에 따라 사육된 7주령 암컷 누드마우스(BALB/c, nu/nu mice, Institute of Medical Science, Japan)에 종양을 in vivo 이종 이식하였다. 먼저, KB 종양 세포( 1×10⁷cells, PBS pH 7.4)를 암컷 누드마우스에 피하 주사하였다. 종양 크기가 100 mm³까지 커지면, PBS(150 mM, pH 7.4)에 분산시킨 각 구형 gPEGC2(i.v. 용량: Ce6 0.5 mg/kg) 또는 free Ce6(i.v. 용량: 2.5 mg/kg)를 종양 유발 누드마우스의 꼬리 정맥으로 주사하였다. 주사 후 1, 2, 4, 8 및 12시간 후, Image Station 4000 MM(Kodak, USA)으로 마우스의 형광 이미지를 촬영하였다.

또한, 마우스에서 적출한 장기(주사 후 12시간 경과)를 Image Station 4000 MM으로 분석하였으며, 주사 후 12시간이 지난 KB 종양 유발 누드마우스에서 적출한 각 장기(암, 간, 심장, 폐, 비장, 신장)의 total photon counts(형광 세기)/centimeter squared/steradian(p/s/cm²/sr)을 Image Station 4000 MM을 이용하여 산출하였다. 추가로, 마우스에서 추출한 종양 조직(주사 후 12시간 경과)을 microtome을 이용해 얇게 조각내어 Image Station 4000 MM으로 분석하였다.

그 결과, 도 4a와 같이 PBS에 분산시킨 gPEGC2(Ce6 0.5 mg/kg) 또는 free Ce6 응집체(2.5 mg/kg)를 KB 종양 유발 누드마우스의 꼬리 정맥으로 주사하고 1, 2, 4, 8 및 12시간 후 근적외선 형광[near infrared(NIR) photoluminescence]을 확인한 결과, 주사 2시간 후 gPEGC2를 처리한 누드마우스의 KB 종양 위치에서 Ce6 형광세기가 강하게 나타났으며, gPEGC2가 종양 조직에 우세하게 축적되는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 도 4a, 4b 및 4c와 같이 free Ce6는 오토퀀싱(autoquenching)과 정상 조직이나 세망 내피계 시스템(간이나 비장)으로의 비특이적 유입 때문에 Ce6 형광 세기가 낮게 나타났다.

또한, 주사 12시간 후 마우스의 장기(암, 간, 심장, 폐, 비장, 신장)를 적출하여 Ce6 형광 세기를 측정한 결과, 도 4b와 같이 in vivo 종양에서 gPEGC2의 축적이 매우 우수한 것을 확인할 수 있었다. 또한, gPEGC2가 처리된 누드마우스에서 적출한 장기의 스테라디안당 제곱 센티미터당 전체 광자 수(Ce6 형광 세기)를 확인한 결과, 도 4c와 같이 gPEGC2가 in vivo 종양 안으로 다량 침투한 것을 확인할 수 있었다.

마지막으로 microtome을 이용하여 in vivo 종양 조직을 얇게 조각내고 Ce6 형광을 확인한 결과, 도 4d와 같이 free Ce6가 처리된 실험군보다 매우 작은 크기의 gPEGC2는 종양 조직에 깊이 침투한 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과로부터 작은 크기의 gPEGC2 입자는 in vivo 종양의 침투에 매우 적합한 것으로 나타났으며, in vivo 종양 치료를 위한 약물 운반체로 유용하게 사용될 수 있음이 확인되었다.

< 실시예 6> in vivo 광역학 항암 치료 효과 확인

PBS(150 mM, pH 7.4)에 분산시킨 구형 PEG₃₀-Ce6(i.v. 용량: Ce6 0.5 mg/kg), free Ce6(i.v. 용량: 2.5 mg/kg) 및 대조군인 PBS(150 mM, pH 7.4)를 KB 종양 유발 누드마우스의 꼬리 정맥으로 주사하였다. 주사 12시간 후, 누드마우스의 종양 위치에 국소적으로 670 nm 파장, 5.2 mW/cm² 세기의 레이저를 40분 동안 조사하고, 시간에 따라 종양 크기의 변화를 관찰하였으며, 종양 크기를 하기식으로 계산하였다:

종양 크기= length×(width)²/2.

상대적인 종양 크기 변화(V/V₀)는 시간에 따른 종양 크기의 변화 V를 초기 종양 크기 V₀로 나눠서 계산하였으며, 모든 결과는 p < 0.01(^**)의 유의수준에서 student's t-test 또는 ANOVA로 분석하였고, MINITAB release 14 통계 소프트웨어 프로그램으로 모든 통계를 분석하였다.

그 결과, 도 5와 같이 gPEGC2가 처리된 마우스에서 종양 크기가 상당히 감소된 것을 확인할 수 있었다. 특히, gPEGC2를 처리한 누드마우스의 종양 크기 변화(V/V_o)는 free Ce6(gPEGC2의 용량과 비교 시 용량이 5배 많음)를 처리한 누드마우스의 종양 크기 변화보다 약 2.7배 감소한 것을 확인할 수 있었다. 반면, gPEGC2 또는 free Ce6 응집체를 처리한 누드마우스의 바이탈 양상은 아무것도 처리하지 않은 누드마우스와 동일하였으며, 체중 변화도 거의 나타나지 않았다.

상기 결과로부터 구형 PEG₃₀-Ce6는 정상세포에 독성을 나타내지 않으면서 효과적인 종양치료제로 사용될 수 있다.

상기 결과들로부터 구형 PEG₃₀은 작은 분자의 약물, 단백질, 유전자, 진단 탐침자 등의 생체활성 물질을 운반하기 위한 생체적합성을 지닌 매우 작은 크기의(용해성 높음) 나노 운반체로 사용될 수 있으며, 특히, 생체의약분야에서 효과적으로 사용될 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

풀러렌을 포함한 코어 및 폴리에틸렌글리콜을 포함한 쉘로 이루어지며, 풀러렌의 모든 π-π 탄소 결합이 깨지면서 풀러렌에 폴리에틸렌글리콜이 연결된 구형의 나노 케이지; 및
3-아미노-1-프로판올을 링커로 하여 상기 나노 케이지 중 폴리에틸렌글리콜과 연결된 클로린 Ce6를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
청구항 1에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 1개의 구형의 나노 케이지에 대하여 25 내지 50 mol로 포함되는 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
삭제
청구항 1에 있어서, 상기 약물 전달체는 평균직경이 3 내지 4 nm인 것을 특징으로 하는 약물 전달체.
풀러렌을 포함한 코어 및 폴리에틸렌글리콜을 포함한 쉘로 이루어지며, 풀러렌의 모든 π-π 탄소 결합이 깨지면서 풀러렌에 폴리에틸렌글리콜이 연결된 구형의 나노 케이지; 및
3-아미노-1-프로판올을 링커로 하여 상기 나노 케이지 중 폴리에틸렌글리콜과 연결된 클로린 Ce6를 유효성분으로 함유하는 광역학 항암 치료 또는 예방용 약학조성물.
삭제
삭제
삭제
LiOH 촉매 하에서 풀러렌 표면에 폴리에틸렌글리콜을 접합하여 풀러렌의 모든 π-π 탄소 결합이 깨지면서 풀러렌에 폴리에틸렌글리콜이 연결된 구형의 나노 케이지를 제조하는 단계; 및
상기 나노 케이지에 N-하이드록시숙시이미드(NHS) 및 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 처리하여 폴리에틸렌글리콜의 카르복실기를 활성화시키고, 상기 활성화된 폴리에틸렌글리콜의 카르복실기에 링커로서 3-아미노-1-프로판올을 사용하여 클로린 Ce6를 결합시키는 단계를 포함하는 제1항의 약물 전달체 제조방법.
청구항 9에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 1개의 구형의 나노 케이지에 대하여 25 내지 50 mol로 포함되는 것을 특징으로 하는 제조방법.