KR101336501B1

KR101336501B1 - 친수성 양이온 고분자 광감각제 유도체 및 음이온성 다당류 소광제 유도체를 포함하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체

Info

Publication number: KR101336501B1
Application number: KR1020110097904A
Authority: KR
Inventors: 나건; 박우람
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2011-09-28
Filing date: 2011-09-28
Publication date: 2013-12-03
Also published as: KR20130034079A

Abstract

본 발명은 친수성 양이온 고분자 광감각제 유도체 및 음이온성 다당류 소광제 유도체를 포함하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 나노 이온 복합체는 소수성인 광감작제에 친수성을 부여하기 위해 양이온 고분자와 결합된 형태를 포함하고, 암세포 특이적으로 내재화가 가능한 음이온성 다당류를 소광제와 결합시킨 결합체를 포함하여 암 조직에 대한 선택도를 증가시키고 광독성을 부작용을 줄일 수 있으며 레이져 조사 시 자유라디컬의 생성에 의해 암 치료 효과를 유도할 수 있는 종래 광역학 치료제보다 그 효능이 개선된 새로운 광역학 치료용 나노 이온 복합체이다. 또한 본 발명에 따른 나노 이온 복합체는 기존에 광역학 치료에 쓰이는 광감작제의 문제점인 응집현상을 해결하고 불용성과 암세포 표적 특이성을 월등하게 높일 수 있는 효과가 있다.

Description

친수성 양이온 고분자 광감각제 유도체 및 음이온성 다당류 소광제 유도체를 포함하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체{Nano ion-complex for photodynamic theraphy comprising hydrophile cationic polymer photosensitizer derivatives and anionic polysaccharide quencher derivatives}

본 발명은 암세포 특이적으로 내재화가 가능하여 광조사시 암세포 특이적으로 세포 독성을 유발하여 암을 효과적으로 치료할 수 있는 광역학 치료용 나노 이온 복합체에 관한 것으로서, 친수성 양이온 고분자 광감각제 유도체 및 음이온성 다당류 소광제 유도체를 포함하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체에 관한 것이다.

광역학 치료법(photodynamic therapy, PDT)이란, 각종 종양에 대해 선택성 및 광증감성이 있는 광민감성 물질(photosensitizer)을 이용해 수술 없이 암 등의 난치병을 치료할 수 있는 기술의 하나로서, 화학요법제와 같은 부작용이 없는 일종의 근치법이다. 예컨대 상기 광민감성 물질을 정맥주사에 의해 대상자에 투여하고, 이에 적절한 광(light)을 조사함으로써, 야기된 광민감성 물질이 산소분자를 활성화시켜 단일항(singlet) 상태의 산소로 변환 혹은 새로운 라디칼을 만들어 암세포나 각종 종양조직만을 선택적으로 공격, 궤멸시키는 것이다. 이러한 광역학 치료는 정상 세포를 보존하면서 병든 세포만 선택적으로 제거 할 수 있어, 대부분의 경우에 전신마취의 위험성을 배제할 수 있고, 간단하게 국소마취만으로도 수술할 수 있기 때문에 시술이 용이하다. 따라서 손상 장기의 적출이 필요 없고 최소 침습의 시술 후 회복이 빠르고 입원 기간을 단축시켜 환자의 복지를 증진시키는 등의 장점이 있다.

이러한 광민감성 물질로는 포르피린(porphyrin)류의 화합물이 대표적인데, 잠분이나 뽕잎, 녹조류 등에서 추출되는 포르피린계 화합물은 광민감성 물질로 사용하기에 적합한 분광학적 특성을 갖고 있고, 가장 중요한 성질은 비교적 세포투과력이 큰 적색광(700-900nm)에 의해 전자 전이를 일으키는 성질과 그에 따른 여기상태를 효율적으로 생성할 수 있다는 것이다.

광민감성 물질로서의 포르피린 유도체는 암세포나 종양조직에 선택적으로 침투, 축적될 뿐만 아니라 화합물의 특징상 형광이나 인광을 나타내므로 종양의 초기 진단으로 활용되기도 한다. 포르피린의 암세포 선택성은 체내에서 포르피린의 수송을 담당하고 있는 저밀도지방단백질(low density lipoprotein (LDL))에 대한 수용체가 정상세포보다 암세포에 많이 발현되어 있다는 사실로써 설명되고 있다. 그러나 대부분의 광감작제들은 난용성이며, 인체 잔류시간이 길어 광독성이 크다. 또한 광감작제가 고가이고 인체 내에서 대사가 느려 광독성의 부작용이 발견되고 있으며, 체내 투입시 광감작제의 뭉침에 의해 치료 효율이 저하된다.

한편, 광감작제를 이용한 현재의 광역학 치료법은 광감작제를 정맥주사에 의해 대상자에게 투여하고, 이후 적절한 빛(light)을 조사함으로써 암세포나 종양조식을 선택적으로 공격 또는 사멸을 유도하는 것이었으나, 현재의 광역학 치료법은 빛의 투과 제한으로 부피가 큰 종양에는 사용되고 있지 못하며, 특히, 광감작제의 인체 내 대사가 느려 광독성의 부작용이 발견되고 있다. 또한, 종양 내의 광감작제의 농도가 낮아 효율적인 치료 효과를 보이지 못하고 있다.

이에 본 발명자들은 암 조직에 대한 선택성 및 축적률이 높으면서도 기존 광감작제가 갖고 있는 광독성의 부작용이 현저히 감소된 새로운 광감작제를 발명하게 되었다.

본 발명의 목적은 암 조직에 대한 선택도 및 축적률을 현저히 높이고 레이저조사에 의해 단일항산소 또는 자유라디컬 생성이 가능한 광역학 치료용 친수성 광감작제를 제조하려는 것으로서, 이러한 목적을 위해 본 발명은 친수성 양이온 고분자 광감각제 유도체 및 음이온성 다당류 소광제 유도체를 포함하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체를 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 친수성 양이온 고분자 광감각제 유도체 및 음이온성 다당류 소광제 유도체를 포함하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 친수성 양이온 고분자 광감각제 유도체는 친수성 양이온 고분자와 광감작제가 결합된 공중합체일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 친수성 양이온 고분자는 글라이콜 키토산(GC), 키토산, 폴리-L-리신 (PLL), 폴리-베타-아미노 에스터 고분자, 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리에틸렌글리콜, 폴리(아미도아민) (PAMAM) 덴드리머 및 이들의 유도체로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 광감작제는 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminoevuline esters) 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 친수성 양이온 고분자 광감각제 유도체는 폴리에틸렌글리콜, 폴리에틸렌이민 및 광감작제의 공중합체로 구성되고, 상기 광감작제는 폴리에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌이민에 의해 친수성을 갖는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량이 300~50,000(Da)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리에틸렌이민은 가지형이며 분자량이 100~25,000(Da)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 음이온성 다당류 소광제 유도체는 음이온성 기질 고분자 및 소광제가 결합된 결합체일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 음이온성 기질 고분자는 에스테라제 효소 및 암세포에 특이적이고, 음이온성 기질 고분자가 콘드로이틴-6-설페이트(C6S), 헤파란 설페이트(HS), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(HSPG), 헤파린, 콘드로이틴-4-설페이트(C4S), 콘드로이틴-6-설페이트(C6S), 더마탄 설페이트(DS), 케라탄 설페이트(KS) 및 히알루론산(HA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 소광제는 블랙홀 소광제(blackhole quencher, BHQ) 또는 블랙베리 소광제(blackberry quencher, BBQ)일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 친수성 양이온 고분자와 광감작제는 친수성 양이온 고분자 1몰에 대해 상기 광감작제를 1~30몰의 몰비로 결합된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 음이온성 기질 고분자와 소광제는 음이온성 기질 고분자 1몰에 대해 상기 소광제를 1~30몰의 몰비로 결합된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노 이온 복합체는 친수성 양이온 고분자 광감각제 유도체 대 음이온성 다당류 소광제 유도체의 혼합비가 1:0.1~1:10의 중량비로 혼합되어 결합된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 나노 이온 복합체는 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 암을 예방 또는 치료할 수 있다.

본 발명에 따른 친수성 양이온 광감작제는 수상에서 기존의 소수성 광감작제 보다 높은 형광과 레이져 조사시 높은 일항 산소발생을 보인다. 이는 생체내에서의 소수성 광감작제의 문제점인 응집현상과 광독성 등의 부작용을 막고 표적화율을 향상시키는 데 기여할 수 있다. 또한 암세포 표적 음이온성 소광체와 나노 이온 복합체를 형성하였을 경우 소광상태였다가 암세포에만 특이적으로 내재화 되며 또한 분해되어 기존의 광역학 치료제의 문제점인 정상세포내 부작용을 감소시키고 암세포 표적화를 강화하여 치료 효과를 높일 수 있다.

도1a는 소수성 광감작제(free drug) 와 친수성 양이온성 광감작제(WPS)의 용해도 결과를 나타낸 사진이다. 여기서 (ⅰ)은 Ce6(0.2mg/ml), (ⅱ)는 WPS(Ce6, 0.2mg/ml), (ⅲ)은 WPS(Ce6, 0.3mg/ml)의 농도로 처리하였다.
도1b는 소수성 광감작제와 친수성 양이온성 광감작제의 삼차증류수에서 형광강도를 나타낸 그래프 및 Ce6, 1 ug/ml에서의 근적외선 형광 영상 사진이다.
도1c는 대조군인 증류수(DDW)와 소수성 광감작제, 친수성 양이온성 광감작제의 근적외선 형광 영상 그래프이다.
도1d는 수상에서 소수성 광감작제와 친수성 양이온성 광감작제의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도1e는 유기용매(dimethyl sulfoxide)에서 소수성 광감작제와 친수성 양이온성 광감작제의 UV-Vis 흡수 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도2a는 음이온성 고분자 소광체(BHQ-CS)/친수성 양이온성 광감작제 (WPS)의 질량비에 따른 근적외선 형광 소광 특성 (λex = 650nm, λex = 670nm)을 나타내는 그래프 및 근적외선 형광 영상이다. 여기서 F0는 친수성 양이온성 광감작제의 형광강도을 나타내고 Fi는 나노 이온 복합체(NPS)의 형광강도를 나타낸다.
도2b는 삼차 증류수에서의 입자 크기와 제타-포텐셜 (n=3)을 나타낸 그래프이다.
도2c는 나노 이온 복합체의 입자 분포도를 나타낸 그래프이다.
도2d는 나노 이온 복합체의 전계방출형주사전자현미경 영상 사진이다.
도3a은 나노 이온 복합체 (NPS5)의 이온강도에 따른 분해 특성 (n=3)을 나타낸 그래프이다.
도3b는 나노 이온 복합체 (NPS5)의 이온강도에 따른 근적외선 형광 영상 사진이다.
도4a는 에스터라아제 처리에 따른 나노 이온 복합체의 형광 강도 변화를 나타낸 그래프 및 근적외선 형광 영상이다.
도4b는 히알루로니다아제 type 2 처리에 따른 나노 이온 복합체의 형광 강도 변화를 나타낸 그래프 및 근적외선 형광 영상이다.
도4c는 효소 처리에 따른 나노 이온 복합체의 일항산소발생 (Esterase 또는 Hyaluronidase type 2, 10 U/ml, n=3)을 나타내는 그래프이다.
도5a는 유세포 분석기(FACS)를 이용한 나노 이온 복합체 (NPS5)의 암세포내 유입을 나타낸 그래프이다. 여기서 (ⅰ)은 소수성 광감작제의 시간에 따른 세포 유입을 나타낸다. (ⅱ)는 나노 이온 복합체(NPS5)의 시간에 따른 세포 유입을 나타낸다.
도5b는 공초점 현미경을 이용한 나노 이온 복합체의 세포내 분포를 나타낸 사진이다.
도5c는 나노 이온 복합체의 시험관내 세포 독성을 측정한 그래프이다.
도6a는 암 유도된 누드 마우스의 등 왼쪽 아래 부분(종양)과 오른쪽 위 부분(정상)부분에 각각 NPS5 (0.1mg/kg of Ce6)를 주입한 후 시간에 따른 형광영상 관찰한 사진이다. 여기서 (ⅰ)은 주입 후 10분 후 촬영하였고 (ⅱ)는 주입 후 10시간 후, (ⅲ) 주입 후 20시간 후에 관찰한 것이다.
도6b는 암 유도된 누드마우스에서 나노 이온 복합체 주입 후 종양부위에서 정상조직 대비 형광 회복율을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 광역학 치료에 사용되고 있는 광감작제가 대부분 소수성이라는 점을 극복하기 위해 소수성 광감작제에 친수성을 부여할 수 있도록 친수성 양이온 고분자를 광감작제와 공유 결합시키고, 여기에 암세포 특이적이며 음이온성을 띄는 소광제의 결합물을 포함하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체를 제공함에 그 특징이 있다.

보다 구체적으로 본 발명은 친수성 양이온 고분자, 광감각제 및 음이온성 다당류 소광제 유도체를 포함하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체를 제공할 수 있다.

본 발명에서 상기 친수성 양이온 고분자로는 글라이콜 키토산, 키토산, 폴리-L-리신(PLL), 폴리-베타-아미노 에스터 고분자, 폴리 에틸렌이민(PEI), 폴리(아미도아민) (PAMAM)덴드리머 및 이들의 유도체로 이루어진 군 중에서 선택된 것을 사용할 수 있으며, 상기 친수성 양이온 고분자는 음이온성 기질 고분자와 정전기적 인력에 의해 이온 복합체 나노 입자를 형성할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 친수성 양이온 고분자로서 폴리에틸렌글리콜 및 폴리에틸렌이민을 사용하였는데, 상기 폴리에틸렌글리콜(PEG)은 HO-(CH₂CH₂O)n-H로 표현되는 구조식을 가지며, 반복 연결되는 에틸렌 옥사이드((CH₂CH₂O)-)를 가지는 구조적 특성으로 인해 강한 친수성을 나타내며, 또한 이러한 특성이 단백질 또는 화합물과 결합하는 경우에 생체친화성을 부여하게 되는 특징을 가진다.

또한, 폴리에틸렌글리콜은 한쪽 말단이 메톡시기(CH₃O-)로 치환된 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG)의 형태로도 존재하는데 그 구조식은 CH₃O-(CH₂CH₂O)n-H로 표현된다. 특히, 의약품의 개발에 있어서, 폴리에틸렌글리콜-단백질의 형태를 가지는 제제의 경우, 상기 폴리에틸렌글리콜로 대부분 메톡시폴리에틸렌글리콜 유도체들이 사용되고 있다. 이는 폴리에틸렌글리콜의 말단이 메톡시기로 보호되어 있어 구조의 안정성을 유지할 수 있기 때문이다.

본 발명에 있어서, 사용 가능한 상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량이 300 내지 50,000인 말단에 카르복실기를 갖는 폴리에틸렌글리콜일 수 있다. 또한, 폴리에틸렌글리콜은 한쪽 말단이 메톡시기로 치환된 메톡시 폴리에틸렌글리콜일 수 있다.

또한, 상기 친수성 양이온 고분자인 폴리에틸렌이민은 이미 오래 전부터 제지분야에서 활용되고 있는 양이온성 고분자 전해질이다. 일반적으로 폴리에틸렌이민은 그 구조에 따라 선형과 가지형으로 나뉘는데, 이 둘의 합성 방법은 서로 다르다. 일반적으로 사용되고 있는 폴리에틸렌이민은 가지형으로, 여기에는 일차 아민, 이차 아민, 삼차 아민의 수가 1:2:1의 비율로 존재한다. 가지형 폴리에틸렌이민의 가지사슬은 주사슬 질소 원자의 3~3.5 개당 하나 정도 존재하는 것으로 알려져 있으며, 이러한 폴리에틸렌이민은 물, 알코올, 글리콜, 디메틸포름아미드, 테트라하이드로퓨란, 에스테르류 등에 용해되는 한편, 고분자량의 탄화수소류, 올릭산(oleic acid), 디에틸에테르에는 용해되지 않는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 사용할 수 있는 상기 폴리에틸렌이민은 독성이 없는 가지형 폴리에틸렌이민을 사용할 수 있으며, 폴리에틸렌이민의 분자량이 100미만일 경우에는 본 발명에 따라 생성된 공중합체가 유용한 생리활성물질과 잘 결합할 수 없으며, 분자량이 25,000이상일 경우에는 체내에서 신장을 통해 몸 밖으로 배출되기 어려운 문제점이 있다. 따라서 상기 폴리에틸렌이민은 분자량이 100 내지 25,000, 바람직하게는 100 내지 2000인 것을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 나노 이온 복합체에서 상기 광감작제는 포르피린계(phorphyrins) 화합물, 클로린계(chlorins) 화합물, 박테리오클로린계(bacteriochlorins) 화합물, 프탈로시아닌계(phtalocyanine) 화합물, 나프탈로시아닌계(naphthalocyanines) 화합물 및 5-아미노레불린 에스테르계(5-aminoevuline esters) 화합물로 이루어진 군 중 에서 선택된 것을 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 음이온성 다당류 소광제 유도체는 효소, 특히 에스테라제에 의해 특이적으로 분해되고 암세포에 특이적인 특징을 가지며, 음이온성 기질 고분자로 콘드로이틴-6-설페이트 (C6S), 헤파란 설페이트(HS), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 (HSPG), 헤파린, 콘드로이틴-4-설페이트(C4S), 콘드로이틴-6-설페이트 (C6S), 더마탄 설페이트 (DS), 케라탄 설페이트 (KS) 및 히알루론산 (HA)로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있다.

또한 상기 소광체로는 블랙홀 소광체(blackhole quencher, BHQ), 블랙베리 소광체(blackberry quencher, BBQ) 및 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 사용할 수 있다.

이와 같이 본 발명에서는 광역학 치료용 나노 이온 복합체로서 기존에 사용된 바 없었던 양이온성 고분자, 즉, 친수성 양이온 고분자를 이용하여 소수성을 갖는 광감작제에 친수성을 부여함으로써 광학 치료 시 용액 또는 물에 잘 용해되어 침전물이 생기지 않도록 하는 특징이 있다.

또한, 본 발명에 따른 광역학 치료용 나노 이온 복합체는 음이온성 고분자(다당류) 소광제를 포함하고 있는데, 음이온성 고분자(다당류) 소광제는 종양 세포 특이적인 수용체에 결합이 가능하기 때문에 암세포를 특이적으로 타겟팅하여 내재화 될 수 있고 효소, 특히 에스테라제에 의해 특이적으로 분해될 수 있는 특징이 있다.

상기 본 발명의 나노 이온 복합체에 함유된 음이온성 고분자 소광제는 음이온성 기질 고분자에 소광제가 결합된 형태로 구성되며 음이온성 기질 고분자와 소광제로 사용할 수 있는 물질들은 상기 기술된 바와 같다.

나아가 본 발명은 친수성 양이온 고분자, 광감각제 및 음이온성 다당류 소광제 유도체를 포함하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체의 제조방법을 제공할 수 있다.

상기 광역학 치료용 나노 이온 복합체의 제조방법은, 친수성 양이온 고분자와 광감작제의 공중합체를 합성하는 단계; 음이온성 고분자와 소광제의 복합체를 형성하는 단계; 및 상기 친수성 양이온 고분자와 광감작제의 공중합체와 음이온성 고분자와 소광제의 복합체를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 나노 이온 복합체의 제조과정에서 상기 친수성 양이온 고분자와 광감작제는 앞서 기술한 바와 같은 종류의 물질들을 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에 따르면, 먼저 폴리에틸렌글리콜을 활성화 시킨 후, 활성화된 폴리에틸렌글리콜이 용해된 용액과 폴리에틸렌이민이 용해된 용액을 반응시켜 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌이민의 공유결합체를 수득하였다.

상기 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌이민이 공유결합된 결합체는 이후 소수성을 띄는 광감작제가 용해된 용액과 혼합하여 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민- 광감작제가 결합된 공중합체를 제조한다.

이렇게 결합된 공중합체에서 소수성 광감작제는 양이온을 띄는 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민에 의한 친수성이 부여된다.

폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민- 광감작제가 결합된 공중합체의 제조가 완료되면 이후 음이온성 고분자와 소광제의 복합체를 제조한다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 음이온성 고분자로 콘드로이친 설페이트를 사용하였고 소광제로 BHQ3를 사용하였으며 증류수에 녹인 콘드로이친 설페이트와 DMSO에 용해된 BHQ3를 혼합하고 교반하여 음이온성 고분자와 소광제의 복합체를 제조하였다.

또한 본 발명에 따른 나노 이온 복합체의 제조를 위해 상기 양이온 고분자 또는 음이온성 고분자 1몰에 대하여 결합할 수 있는 광감작제 또는 소광제는 1~30몰의 비로 사용할 수 있다. 이 몰비를 벗어난 양으로 사용할 경우, 사용된 광감작제 또는 소광제로 인해 구조의 변화 또는 전하의 변화로 인해 고분자의 특성이 변화될 가능성이 있으며 광활성 또는 소광 효과도 일어나지 않을 수 있는 문제점이 있으므로 상기 범위 이내로 사용하는 것이 바람직하다.

앞서 기술한대로 제조된 친수성 양이온 고분자와 광감작제의 공중합체 및 음이온성 고분자와 소광제의 복합체는 1:01~1:10의 중량비로 혼합하여 본 발명에 따른 나노 이온 복합체를 형성할 수 있다.

본 발명의 나노 이온 복합체를 제조하기 위해 사용하는 양이온성 고분자와 음이온성 고분자는 정전기적 인력에 의해 결합되는 것이므로 상기 기재된 중량비의 범위 내에서 혼합하는 것이 바람직하며 이러한 범위를 벗어날 경우에는 두 고분자간의 결합이 발생하지 않아 나노 이온 복합체가 형성되지 않을 가능성도 있다.

따라서 상기 기재된 중량비의 범위 내로 반응시키는 것이 바람직하다.

또한 상기 방법으로 제조된 본 발명의 나노 이온 복합체의 입자 크기는 50~800nm의 크기를 가질 수 있으며, 상기 나노 이온 복합체에서 광감작제와 소광제의 거리는 20nm이내를 유지하게 된다.

이렇게 제조된 본 발명의 나노 이온 복합체는 광역학 치료를 통한 암 치료에 이용될 수 있으며, 상기 암은 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암,뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 구성된 군에서 선택된 것일 수 있다.

본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

암세포 특이적 나노 이온 복합체의 제조

<1-1> 친수성 양이온성 광감각제인 폴리에틸렌글리콜 -폴리에틸렌이민 공중합체의 합성

<1-1-1> 폴리에틸렌글리콜의 활성화

환류 응축기 설치 후 메톡시 폴리에틸렌 글리콜(mPEG-COOH)(시그마, 5000Da) 10g을 250ml의 플라스크를 이용하여 메틸렌클로라이드(CHCl₂) 50ml에 용해시켰다. 이후 0.52 g의 N-하이드록시숙시닐이미드와 0.74 g의 다이사이클로카보다이이미드를 첨가한 후 20시간 동안 상온에서 반응시켰다. 다이사이클로헥실우레아를 필터 과정을 통해서 제거한 후 디에틸에테르(diethylether)에 침전시킴으로써 활성화 형태의 폴리에틸렌글리콜 (mPEG-NHS)을 수득하였다.

<1-1-2> 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌이민의 공유결합체 형성

상기 실시예 <1-1-1>에서 수득한 활성화 형태의 폴리에틸렌글리콜 2g을 200ml의 클로로포름에 녹였다. 이후, 0.5g의 폴리에틸렌이민(Alfa Aesar, 1800da)을 50ml의 클로로포름에 녹인 다음, 여기에 상기 폴리에틸렌글리콜을 녹인 용액을 한 방울씩 떨어뜨림으로써 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌이민의 공유결합 반응을 수행하였다. 이때, 상기 반응은 24시간 동안 수행하였으며, 반응 완료 후 진공농축 장치를 이용하여 총 부피가 30ml이 되도록 농축한 다음, 디에틸에테르(diethyl ether)에 침전시킴으로써 폴리에틸렌글리콜과 폴리에틸렌이민의 공유결합체를 수득하였다.

<1-1-3> 친수성 양이온성 광감각제인 폴리에틸렌글리콜 -폴리에틸렌이민- 광감각제의 합성

상기 실시예 <1-1-2>에서 수득한 공유결합체인 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민(mPEG-PEI) 1g을 Ce6 (e.q., 0.07 mmol), DCC (1.2*Ce6 in moles) 그리고 N-하이드록시석시닐이미드(HOSu; 1.2*Ce6 in moles)을 20ml인 DMSO에 각각 녹인 후 3시간 동안 교반시켰다. 이후 각각 두 용액을 섞은 후에 상온에서 24시간 반응시켰다. 비수용성의 디사이클로헥실우레아를 제거하기 위해 필터링을 한 후 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 1,000)을 이용하여 2일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석한 다음, 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조시켰다. 이러한 과정을 통해 하기 화학식 2의 친수성 양이온성 광감각제를 수득하였다.

[화학식 2]

<1-2> 암세포 특이적 음이온성 다당류 소광제인 BHQ3 접합 콘드로이친 설페이트의 합성

콘드로이친 설페이트 0.1g을 20ml의 증류수에 녹였다. 건조된 DMSO에 BHQ3를 녹인 후 N-(3-디메틸아미노프로필)-N′-에틸카르보디이민 하이드로클로라이드(EDC), 4-디메틸아미노피리딘(DMAP)을 각각 BHQ의 몰비에 대해 1.5배로 첨가하였다. 이후 두 용액을 각각 상온에서 3시간 동안 교반 한 후 섞고 24시간 동안 반응시켰다. 미 반응된 소광체(BHQ3)의 제거는 투석막 (Spectra/Por; mol. wt. cutoff size, 1,000)을 이용하여 2일 동안 1차 증류수를 이용하여 투석함으로써 제거하였고, 투석 후 최종 반응물을 동결건조를 통해 건조시켰다. 이러한 과정을 통해 하기 화학식 3과 같은 암세포 특이적 음이온성 다당류 소광제를 수득하였다.

[화학식 3]

<1-3> 나노 이온 복합체의 제조

상기 실시예 <1-1>과 실시예 <1-2>에서 제조된 친수성 양이온성 광감각제와 암세포 특이적 음이온성 고분자 소광체를 3차 증류수에 각각 녹인 후 각각의 질량비를 기준으로 1.0:0.0, 1.0:0.3, 1.0:0.6, 1.0:1.2, 1.0:2.5 및 1.0:5.0 의 비율로 각각 혼합시켰다. 2 시간 후 상기 혼합하여 형성된 암세포 특이적 나노 이온 복합체를 0.8μm 주사기 필터를 이용하여 필터링함으로써 수득하였다.

< 실험예 1> 친수성 양이온 광감작제의 수상에서 물리/화학적 특성 분석

본 발명자들은 본 발명에서 사용한 친수성 양이온 광감작제의 수상에서의 특성을 분석하기 위해 대조군으로 소수성 광감작제만을 사용하였다. 즉, 0.2mg/ml의 소수성 광감제와 친수성 양이온성 광감작제(Ce6 0.2mg/ml, 0.3mg/ml)를 증류수에 녹인 후 용해도를 확인한 결과 소수성 광감각제는 수상에서 용해도가 낮아 침전이 되는 반면에 친수성 양이온 광감작제는 0.3mg/ml의 농도에서도 침전 없이 거의 모두 용해되어 높은 수용성 특징을 갖는 것을 확인할 수 있었다(도 1a 참조).

또한 친수성 양이온 광감작제의 수상에서의 형광 특성을 분석하기 위하여 형광 영상 장치 (12-bit CCD camera, Kodak)와 형광형광분석기(RF-5301PC; Shimadzu, Japan)를 이용하여 형광강도를 측정한 결과 수상에서 친수성 양이온성 광감작제는 소수성 광감작제 보다 형광강도가 강함을 확인하였다(도1b 참조).

뿐만 아니라 친수성 양이온 광감작제의 일항 산소 발생 특성을 확인하기위해 시약 (Singlet oxygen sensor green, Molecular Probe Inc. Eugene, OR, USA)을 이용하여 레이저를 조사한 후 일항산소발생을 측정한 결과 수상에서 친수성 양이온성 광감작제는 소수성 광감작제 보다 일항산소발생이 높음을 확인하였다(도 1c 참조).

나아가 수상과 유기용매에서 각각 양이온성 광감작제의 분광학적 특성을 분석하기 위하여 UVVis 분광광도계 (Shimadzu, Japan)를 이용하여 분석한 결과 수상에서 친수성 양이온 광감작제의 UVVis 흡광은 Soret Peak (404 nm)가 소수성 광감작제에 비해 약 3배 정도 향상되는 것을 확인할 수 있었으며(도 1d 참조), 유기용매(DMSO)에서는 친수성 양이온성 광감작제의 흡광형태가 소수성 광응감작제와 거의 유사함을 확인하였다(도 1e 참조).

이를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 사용한 친수성 양이온성 광감작제가 소수성 광감작제보다 수상에서의 물리 화학적 특성이 우수하다는 사실을 알 수 있었다.

< 실험예 2> 나노 이온 복합체 입자의 특성 및 형태 분석

상기 실시예 1에 의해 제조된 본 발명의 나노 이온 복합체의 입자 특성 및 형태를 분석하기 위하여 친수성 양이온 광감작제와 암세포 특이적 음이온성 고분자 소광체의 혼합 비율에 따른 광학특성 및 입자 특성을 분석하였다. 이를 위해 형광영상장치와 형광분석기를 이용하여 소광특성을 분석한 결과, 친수성 양이온 광감작제와 암세포 특이적 음이온성 고분자 소광체의 질량비가 1:0~1:5의 비로 음이온성 고분자 소광체의 질량비가 증가할수록 소광 특성이 강해지는 것을 확인할 수 있었다(도 2a 참조).

또한, 상기 질량비 범위에서 나노 이온 복합체의 입자사이즈와 제타포텐셜을 측정하기 위하여 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., UK)를 이용하여 분석한 결과 입자사이즈는 약 150nm 정도로 일정한 형태를 유지하는 것으로 나타났으며, 제타포텐셜은 음이온성 고분자 소광체의 질량비가 증가할수록 약 -20 정도로 강한 음전하를 띄는 것을 확인할 수 있었다(도 2b 참조).

이러한 실험 결과를 바탕으로 입자사이즈 분포와 입자 형태의 분석은 친수성 양이온 광감작제와 음이온성 고분자 소광체의 혼합 비율이 1:5의 질량비로 혼합하여 제조된 것을 가지고 관찰하였으며, 입자사이즈 분포는 상기와 같이 Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., UK)를 이용하여 분석하였는데, 도 2c에 나타낸 바와 같이, 약 150nm 정도의 균일한 입도 분포를 확인 할 수 있었다. 입자 형태는 주사전자현미경 (FE-SEM; S-4700; Hitachi, Japan)을 이용하여 관찰하였는데, 그 결과, 도 2d에 나타낸 바와 같이, 구형의 균일한 형태의 나노 이온 복합체를 확인 할 수 있었다.

< 실험예 3> 이온강도에 따른 나노 이온 복합체의 안정성 측정

본 발명에서 제조된 나노 이온 복합체의 이온강도에 따른 안정성을 확인하기 위하여 probe-probe quenching-dequenching 방법을 이용하여 안정성을 측정하였다. 이를 위해 먼저 각각 다른 농도의 NaCl을 나노 이온 복합체와 2시간 동한 혼합시킨 후, 형광 강도(ex650, em670)를 분석하였다. 전체 형광 강도(I)는 친수성 양이온성 광감각제의 형광강도(If)와 복합체를 형성하였을 때의 친수성 양이온성 광감작제의 형광강도 (IC)의 합이라고 가정하였을 때, 하기 수식 1을 이용하여 분해된 복합체의 백분율(x)를 구하였다.

[수식1] I = If + Ic = If0 * x /100 + Ic0*(100 x)/100

(If0: 어떤 고분자와도 복합체를 형성하지 않았을 경우에 친수성 양이온 광감작제의 형광강도; Im0: 이온 복합체를 형성하였을 때 초기의 형광강도; x: 분해된 복합체의 백분율)

그 결과, 300mM의 NaCl농도에서 나노 이온 복합체는 10%이하의 탈복합체를 확인할 수 있었고, 600mM의 농도에서는 40%정도 탈복합체가 일어나는 것을 확인할 수 있었다(도 3a 참조).

또한, 형광 영상기를 이용하여 이온강도에 따른 나노 이온 복합체의 안정성을 확인한 결과, 600mM 이전까지는 거의 탈복합체 없이 안정한 복합체를 형성하여 소광상태를 유지하는 것으로 나타났고, 600mM의 농도에서는 강한 형광을 보이는 것을 보아 탈복합체 형태가 발생된다는 것을 알 수 있었다(도 3b 참조).

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명의 나노 이온 복합체의 경우 강한 이온 강도에서도 안정성을 보임을 확인 할 수 있었고, 특히 생체내의 이온강도가 150mM인 것으로 미루어 볼 때 본 발명은 생체 내에서 안정한 형태를 유지하면서 작용할 수 있는 나노 복합체임을 알 수 있었다.

< 실험예 4> 나노 이온 복합체의 효소 특이적 활성분석

본 발명의 나노 이온 복합체의 효소 특이적 활성화를 분석하기 위하여 나노 이온복합체가 분산된 2ml의 인산 완충용액 (pH7.4)에 효소인 에스테라아제 및 히알루로니다아제 type 2를 각각 함유한 용액 2ml을 첨가하였다. 이때 효소의 농도 1 또는 10 Units/ml로 하였다. 상기의 용액은 항온 교반 수조 (100rpm, 37 °C)에서 12시간 반응 후 각 샘플을 상기의 형광분석기, 형광영상기, 일산산소측정 방법을 통해 분석하였다.

분석 결과, 나노 이온 복합체의 에스테라아제에 의한 활성은 사용한 효소 농도에 의존적으로 강한 형광강도와 영상을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 4a 참조).

또한, 나노 이온 복합체의 히알루로니다아제 type 2에 의한 활성을 보았을 때 도 4a에서의 에스테라아제보다는 약하게 형광강도와 영상을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 4b 참조).

효소에 의한 일항산소발생 활성을 확인한 결과, 도 4a 및 도 4b와 유사하게 에스테라아제에 의해 분해된 후 레이저를 조사하였을 경우 일항산소발생율이 높아짐을 확인할 수 있었다(도 4c 참조).

본 결과로 볼 때 본 발명의 나노 이온 복합체는 암세포 내에 유입되었을 때 에스테라아제에 의해 특이적으로 분해되어 활성을 나타낸다는 사실을 알 수 있었다.

< 실험예 5> 나노 이온 복합체의 암세포내 유입과 세포 독성 테스트

본 발명의 나노 이온 복합체가 암세포 특이적으로 유입되고 레이져를 조사하였을 경우 암 세포에 독성을 유발하여 암을 치료할 수 있는 활성이 있는지를 조사하기 위해, 시험관내에서 배양된 암세포를 대상으로 하기 실험을 수행하였다. 즉, 인간대장암 세포(HCT-116)을 배양한 다음, 본 발명에 따른 나노 이온 복합체를 1 μg/ml의 농도로 세포에 처리한 후 30분과 2시간 후에 완충용액으로 세척한 후 유세포 분석기 (Beckman, San Jose, CA, USA)를 이용하여 본 발명의 나노 이온 복합체의 시간에 따른 내포 유입 특성을 분석하였다. 또한 공초점 현미경(LSM 510 Meta; Zeiss, Germany)을 이용하여 상기와 같은 조건에서 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정 후에 세포내 나노 이온 복합체의 분포를 시각적으로 확인하였다. 또한 나노 이온 복합체의 광역학치료시 암세포 독성을 확인하기 위해 인간대장암 세포(HCT-116)를 96well plate에 하루 동안 배양한 후 100μl의 SF-media에 0.16 10 μg/ml의 농도로 나노 이온 복합체와 함께 2시간 동안 배양하였고, 이후 레이저 (HeNe laser, 633 nm, 5 mW/cm²)를 4 분 동안 세포에 조사한 다음, 12시간 동안 세포를 배양한 후 MTT 시험법을 이용하여 세포 생존율을 대조군과 비교하여 계산하였으며 대조군으로 소수성 광감작제만을 사용한 군을 사용하였다.

세포내 유입을 유세포 분석기를 통해 확인한 결과, 도 5a의 ⅰ도면에 나타낸 바와 같이, 단순 확산에 의해서 유입된 광감작제와 비교하였을 때 본 발명의 나노 이온 복합체(도 5a의 ⅱ) 또한 시간에 의존적으로 유사하게 세포 내로 유입됨을 알 수 있었다(도 5a 참조). 따라서 본 발명의 나노 이온 복합체는 암세포에 유입되어 진다는 것을 알 수 있었다.

또한, 공초점 현미경을 이용하여 나노 이온 복합체의 세포내 분포 양상을 확인 한 결과, 도 5b에 나타낸 바와 같이 나노 이온 복합체 처리 후, 30분에서는 약한 형광을 띄는 반면 2시간 후에는 강한 형광을 나타내었고 세포내 세포질 부분에서 분포하는 것을 확인하였다(도 5b 참조). 따라서 이러한 결과를 통해 본 발명의 나노 이온 복합체가 세포내에서 효소에 의한 분해에 의해 소광효과가 사라지는 것을 알 수 있다.

또한, 레이저를 조사하지 않았을 경우 대조군으로 사용한 소수성 광감작제(free drug, Ce6), 친수성 양이온성 광감작제(WS-Ce6), 본 발명의 나노 이온 복합체(NPS5) 모두 거의 독성을 나타내지 않았으며, 레이저를 조사하였을 경우 모두 유사하게 세포 독성을 나타내는 것을 확인하였다(도 5c 참조).

따라서 상기의 실험 결과를 통해 본 발명의 나노 이온 복합체는 암세포 내에 효과적으로 유입이 되며 암세포 내 효소에 의해 분해되어 활성화 되고 레이져에 의해 일항산소 발생을 유발시켜 암세포에 독성을 유도하여 암을 치료할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.

< 실험예 6> 암 유도된 누드 마우스에서 나노 이온 복합체의 암세포 특이성 확인

본 발명의 나노 이온 복합체의 생체내 암세포 특이적 활성을 확인하기 위해 상기의 인간대장암 세포(HTC-116)가 이식된 6주령의 수컷 누드 마우스 (Balb/C-nu mice, Institute of Medical Science, Tokyo)를 이용하였다. 인간대장암 세포(HCT-116) 를 1.0 × 10으로 마우스 등쪽에 이식한 후 종양의 크기가 150200 mm³이 되었을 때 본 발명의 나노 이온 복합체를 0.1 mg/kg 의 양으로 종양과 정상조직에 각각 투여하였다. 나노 이온 복합체의 암세포 특이성을 실시간으로 관찰하기 위하여 상기의 형광영상장치를 이용하여 시간에 따른 형광양상을 관찰하였다.

관찰 결과, 본 발명의 나노 이온 복합체는 시간에 비례하여 정상조직에 비해 암세포에서 강한 활성을 보였으며(도 6a 참조), 형광 영상을 수치화 시켰을 때 나노 이온 복합체의 활성은 정상조직에 비해 암세포에서 강한 활성을 보였고, 20시간 후에 약 3배 정도의 형광강도 차이를 보이는 것을 확인하였다(도 6b 참조).

따라서 본 발명의 나노 이온 복합체는 생체 내에서 특히 암세포 특이적으로 활성을 띄는 것을 상기의 실험을 통해 확인하였고, 궁극적으로 본 발명의 나노 이온 복합체는 새로운 암세포 표적 치료제로서 큰 가능성을 제시한다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

친수성 양이온 고분자와 광감각제가 결합된 공중합체; 및 음이온성 기질 고분자와 소광제가 결합된 결합체를 포함하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체로서,
상기 공중합체는 폴리에틸렌글리콜-폴리에틸렌이민-클로린 e6로 구성되며,
상기 결합체는 콘드로이틴 설페이트-블랙홀 소광제(blackhole quencher, BHQ)로 구성되는 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체.
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서,
상기 광감각제는 친수성 양이온 고분자에 의해 친수성을 갖는 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체.
제1항에 있어서,
상기 폴리에틸렌글리콜은 분자량이 300~50,000(Da)인 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체.
제1항에 있어서,
상기 폴리에틸렌이민은 가지형이며 분자량이 100~250,000(Da)인 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체.
삭제
제1항에 있어서,
상기 음이온성 기질 고분자는 에스테라제 효소 및 암세포에 특이적인 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체.
삭제
제1항에 있어서,
상기 친수성 양이온 고분자와 광감작제는 친수성 양이온 고분자 1몰에 대해 상기 광감작제를 1~30몰의 몰비로 결합된 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체.
제1항에 있어서,
상기 음이온성 기질 고분자와 소광제는 음이온성 기질 고분자 1몰에 대해 상기 소광제를 1~30몰의 몰비로 결합된 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체.
제1항에 있어서,
상기 광역학 치료용 나노 이온 복합체는 친수성 양이온 고분자와 광감각제가 결합된 공중합체 대 음이온성 기질 고분자와 소광제가 결합된 결합체의 혼합비가 1:0.1~1:10의 중량비로 혼합되어 결합된 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체.
제1항에 있어서,
상기 나노 이온 복합체는 편평상피세포암, 자궁암, 자궁경부암, 전립선암, 두경부암, 췌장암, 뇌종양, 유방암, 간암, 피부암, 식도암, 고환암, 신장암, 대장암, 직장암, 위암, 방광암, 난소암, 담관암 및 담낭암으로 이루어진 군 중에서 선택되는 하나 이상의 암을 예방 또는 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는 광역학 치료용 나노 이온 복합체.