ES2607802T3 - Partículas lipidadas de glicosaminoglicano y su uso en el suministro de fármacos y genes para diagnóstico y terapia - Google Patents

Partículas lipidadas de glicosaminoglicano y su uso en el suministro de fármacos y genes para diagnóstico y terapia Download PDF

Info

Publication number
ES2607802T3
ES2607802T3 ES02761287.8T ES02761287T ES2607802T3 ES 2607802 T3 ES2607802 T3 ES 2607802T3 ES 02761287 T ES02761287 T ES 02761287T ES 2607802 T3 ES2607802 T3 ES 2607802T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
glycosaminoglycan
carrier
drug
lipid
free
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES02761287.8T
Other languages
English (en)
Inventor
Rimona Margalit
Dan Peer
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tel Aviv University Future Technology Development LP
Original Assignee
Tel Aviv University Future Technology Development LP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tel Aviv University Future Technology Development LP filed Critical Tel Aviv University Future Technology Development LP
Application granted granted Critical
Publication of ES2607802T3 publication Critical patent/ES2607802T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/5005—Wall or coating material
    • A61K9/5021—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/5036—Polysaccharides, e.g. gums, alginate; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/16—Amides, e.g. hydroxamic acids
    • A61K31/165—Amides, e.g. hydroxamic acids having aromatic rings, e.g. colchicine, atenolol, progabide
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/407—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. ketorolac, physostigmine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A61K31/7034—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin
    • A61K31/704—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages attached to a carbocyclic compound, e.g. phloridzin attached to a condensed carbocyclic ring system, e.g. sennosides, thiocolchicosides, escin, daunorubicin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/21—Interferons [IFN]
    • A61K38/212—IFN-alpha
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/22—Hormones
    • A61K38/28—Insulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/38—Albumins
    • A61K38/385—Serum albumin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/543—Lipids, e.g. triglycerides; Polyamines, e.g. spermine or spermidine
    • A61K47/544—Phospholipids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6927—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores
    • A61K47/6929—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle
    • A61K47/6931—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer
    • A61K47/6939—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a solid microparticle having no hollow or gas-filled cores the form being a nanoparticle, e.g. an immuno-nanoparticle the material constituting the nanoparticle being a polymer the polymer being a polysaccharide, e.g. starch, chitosan, chitin, cellulose or pectin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0041—Xanthene dyes, used in vivo, e.g. administered to a mice, e.g. rhodamines, rose Bengal
    • A61K49/0043—Fluorescein, used in vivo
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0063—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres
    • A61K49/0069—Preparation for luminescence or biological staining characterised by a special physical or galenical form, e.g. emulsions, microspheres the agent being in a particular physical galenical form
    • A61K49/0089—Particulate, powder, adsorbate, bead, sphere
    • A61K49/0091—Microparticle, microcapsule, microbubble, microsphere, microbead, i.e. having a size or diameter higher or equal to 1 micrometer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K51/00—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo
    • A61K51/12—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules
    • A61K51/1241—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins
    • A61K51/1244—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins microparticles or nanoparticles, e.g. polymeric nanoparticles
    • A61K51/1251—Preparations containing radioactive substances for use in therapy or testing in vivo characterised by a special physical form, e.g. emulsion, microcapsules, liposomes, characterized by a special physical form, e.g. emulsions, dispersions, microcapsules particles, powders, lyophilizates, adsorbates, e.g. polymers or resins for adsorption or ion-exchange resins microparticles or nanoparticles, e.g. polymeric nanoparticles micro- or nanospheres, micro- or nanobeads, micro- or nanocapsules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0043—Nose
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1629—Organic macromolecular compounds
    • A61K9/1652—Polysaccharides, e.g. alginate, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5192—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4725—Proteoglycans, e.g. aggreccan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Dermatology (AREA)

Abstract

Portador de glicosaminoglicano lipidado en partículas en forma de una esfera con la porción de glicosaminoglicano de la partícula formando una cubierta en el exterior y la porción lipídica del portador formando el interior, no siendo dicho portador un liposoma, comprendiendo dicho portador al producto de reacción de al menos un glicosaminoglicano con fosfatidiletanolamina, en donde la relación de la fosfatidiletanolamina con respecto a al menos un glicosaminoglicano está en el intervalo de 1:1 p/p o en el intervalo de 5:1 a 20:1 p/p, y en donde el glicosaminoglicano es ácido hialurónico que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 x 105 hasta aproximadamente 1 x 107 daltons.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
DESCRIPCION
Partfculas lipidadas de glicosaminoglicano y su uso en el suministro de farmacos y genes para diagnostico y terapia Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un sistema de administracion de farmacos basado en partfculas de glicosaminoglicanos lipidados que encapsulan farmacos para su posterior administracion para uso en terapia y diagnostico.
Antecedentes de la invencion
Los glicosaminoglicanos, o mucopolisacaridos, junto con el colageno, son los principales elementos estructurales de todos los tejidos conectivos. Los glicosaminoglicanos, o gags, son complejos grandes de cadenas de polisacaridos asociadas con una pequena cantidad de proteina. Estos compuestos tienen la capacidad de unir grandes cantidades de agua, produciendo de este modo una matriz tipo gel que forma los tejidos conectivos del cuerpo. Los gags son cadenas largas compuestas de unidades repetitivas de disacaridos (unidades de repeticion de azucares aminoazucares acidos). El aminoazucar es tipicamente glucosamina o galactosamina. El aminoazucar tambien puede ser sulfatado. El azucar acido puede ser acido D-glucuronico o acido L-iduronico. In vivo, los gags distintos del acido hialuronico estan unidos covalentemente a una proteina, formando monomeros de proteoglicano. Las cadenas de polisacaridos son alargadas por la adicion secuencial de azucares acidos y aminoazucares.
Entre los gags mas comunes se encuentran acido hialuronico, sulfato de queratano, sulfato de condroitina, sulfato de heparina y sulfato de dermatina. Los gags pueden modificarse quimicamente para contener mas grupos de azufre que en su forma inicialmente extraida. Ademas, los gags pueden ser parcial o completamente sintetizados y pueden ser de origen vegetal o animal.
El acido hialuronico es un miembro natural de la familia de los glicosaminoglicanos que esta presente en una concentracion particularmente alta en el cartflago y el liquido sinovial de las articulaciones articulares, asi como en el humor vitreo, en las paredes de los vasos sanguineos y en el cordon umbilical y otros tejidos conectivos. El acido hialuronico puede estar en forma libre, tal como en el fluido sinovial, y en una forma unida, tal como un componente de matriz extracelular. Este polisacarido consiste de residuos de N-acetil-D-glucosamina y acido D-glucuronico alternantes unidos mediante enlaces beta-1,3-glucuronidico y beta-1,4-glucosaminidico alternantes. En agua, el acido hialuronico se disuelve para formar un liquido altamente viscoso. El peso molecular del acido hialuronico aislado a partir de fuentes naturales generalmente cae dentro del intervalo de 5 x 104 hasta 107 daltons. El acido hialuronico tiene una alta afinidad por la matriz extracelular y por una variedad de tumores, incluyendo los de mama, cerebro, pulmon, piel y otros organos y tejidos.
Se utiliza un sistema de suministro de farmacos para mantener un nivel constante en sangre de un farmaco durante un largo periodo de tiempo mediante la administracion de un farmaco al cuerpo o para mantener una concentracion optima de un farmaco en un organo objetivo especifico por medio de administracion local o sistemica, y durante un periodo prolongado de tiempo.
El acido hialuronico quimicamente modificado se puede usar para liberacion controlada de farmacos. Balazs y colaboradores, en la patente estadounidense No. 4.582.865, establecieron que "los geles entrecruzados de acido hialuronico pueden retardar la liberacion de una sustancia de bajo peso molecular dispersada en ella pero no unida covalentemente a la matriz macromolecular de gel".
Se utilizan diversas formas de preparaciones farmaceuticas como sistemas de suministro de farmacos, incluyendo el uso de una delgada membrana de un polimero o el uso de un liposoma como portador para un farmaco.
Existen dos clases basicas de portadores de farmacos: sistemas de material formado por partfculas, tales como celulas, microesferas, envolturas virales y liposomas; y sistemas de material no formado por partfculas que suelen ser sistemas solubles, que consisten de macromoleculas tales como proteinas o polimeros sinteticos.
Generalmente, los portadores de partfculas microscopicas y submicroscopicas tienen varias ventajas distintas. Pueden actuar como depositos de liberacion sostenida o de liberacion controlada de farmacos, contribuyendo asi a mejorar la eficacia del farmaco y permitir la reduccion de la frecuencia de dosificacion. Proporcionando proteccion tanto del farmaco atrapado como del entorno biologico, estos portadores reducen los riesgos de inactivacion del farmaco y degradacion del mismo. Dado que la farmacocinetica de la liberacion de farmaco libre de las partfculas es diferente del farmaco libre administrado directamente, estos portadores pueden usarse para reducir la toxicidad y los efectos secundarios indeseables.
A pesar de las ventajas ofrecidas, existen algunas dificultades asociadas con el uso de biopolimeros que encapsulan el farmaco. Por ejemplo, biopolimeros estructurados como microparticulas o nanoparticulas tienen capacidades de direccionamiento limitadas, retencion limitada y estabilidad en circulacion, toxicidad potencial tras administracion cronica y la incapacidad de extravasar. Se han hecho numerosos intentos de unir diferentes sustancias de reconocimiento, 5 incluyendo anticuerpos, glicoproteinas y lectinas, a sistemas de particulas, tales como liposomas, microesferas y otros, con el fin de conferirles una cierta medida de direccionamiento. Aunque la union de estos agentes de reconocimiento con el sistema de particulas ha tenido exito, los sistemas modificados de particulas resultantes no funcionaron como se esperaba, particularmente in vivo.
Otras dificultades han surgido tambien cuando se usan tales sustancias de reconocimiento. Por ejemplo, los anticuerpos 10 pueden ser especificos del paciente, y por lo tanto agregar costo a la terapia con farmaco. Ademas, no todas las uniones entre el sustrato de reconocimiento y el portador son covalentes. La union covalente es esencial, ya que la union no covalente puede dar como resultado la disociacion de las sustancias de reconocimiento del sistema de particulas en el sitio de administracion, debido a la competencia entre el sistema de particulas y las contrapartidas de reconocimiento del sitio objetivo para la sustancia de reconocimiento. Tras dicha disociacion, el sistema de particulas 15 modificado administrado puede retornar a un sistema de particulas regulares, con lo que se anula el proposito de administracion del sistema de particulas modificado.
El documento WO 01/39815 describe vehiculos de suministro de farmacos que tienen un ligando de hialuronano de bajo peso molecular.
Sumario de la invencion
20 Un objetivo de la presente invencion es superar las deficiencias de la tecnica anterior.
Otro objetivo de la presente invencion es formar particulas a base de glicosaminoglicanos para encapsular farmacos.
Otro objetivo de la presente invencion es suministrar farmacos encapsulados en una particula a base de glicosaminoglicano.
Un objeto adicional de la presente invencion es proporcionar metodos de suministro de farmacos utilizando particulas de 25 glicosaminoglicanos lipidados como vehiculos de suministro de farmacos.
Se describe un portador de glicosaminoglicano lipidado de material en particulas en forma de una esfera con la porcion de glicosaminoglicano de la particula que forma una cubierta en el exterior y la porcion de lipido del portador que forma el interior, no siendo dicho portador un liposoma, comprendiendo dicho portador el producto de reaccion de al menos un glicosaminoglicano con fosfatidiletanolamina, en donde la relacion de la fosfatidiletanolamina con respecto al menos un 30 glicosaminoglicano esta en el intervalo de 1:1 p/p o en el intervalo de 5: 1 a 20: 1 p/p, y en donde el glicosaminoglicano es acido hialuronico que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 x 105 hasta aproximadamente 1 x 107 daltons.
En una realizacion preferida, el suministro es mediante administracion oral de la formulacion en particulas. En otra realizacion preferida, el suministro es mediante administracion intranasal de la formulacion en particulas, especialmente para uso en terapia del cerebro y organos relacionados (por ejemplo, meninges y medula espinal) que pretende evadir 35 la barrera hematoencefalica (BBB). En este sentido, tambien es posible la administracion intraocular. En otra realizacion preferida, el medio de suministro es por administracion intravenosa (i.v.) de la formulacion en particula, lo que es especialmente ventajoso cuando se desea una formulacion de administracion i.v. de larga duracion.
Aun otro objetivo de la presente invencion es proporcionar un suministro de genes utilizando particulas de glicosaminoglicanos lipidados como materiales de administracion genica.
40 La presente invencion proporciona un nuevo gen de multiples productos y tecnologia de suministro de farmacos asi como metodos de preparacion y uso de los mismos. El sistema de suministro comprende glicosaminoglicanos lipidados, tambien conocidos como gagomeros, que son biopolimeros bioadhesivos producidos por entrecruzamiento de un lipido que tiene un grupo amino primario a un glicosaminoglicano que contiene acido carboxilico. Las microparticulas o nanoparticulas se forman de manera controlada, con intervalos de diametros de particula dominantes de 45 aproximadamente 2-5 micrometros para microparticulas y aproximadamente 50-200 nanometros para nanoparticulas. Ya sean farmacos pequenos o grandes, agentes bioactivos o ingredientes activos tales como antibioticos, quimioterapeuticos, proteinas y acidos nucleicos pueden ser atrapados en estas particulas con una alta eficiencia, usualmente superior al 50%, incluso para macromoleculas grandes. Por ejemplo, para el ADN de plasmido, las nanoparticulas proporcionan aproximadamente un 66% de atrapamiento y las microparticulas proporcionan un 50 atrapamiento de aproximadamente 75%.
Para los propositos de la presente invencion, "farmaco" significa cualquier agente que pueda afectar el cuerpo terapeuticamente o que puede usarse in vivo para el diagnostico. Ejemplos de farmacos terapeuticos incluyen
5
10
15
20
25
30
35
40
45
quimioterapeuticos para el tratamiento del cancer, antibioticos para el tratamiento de infecciones y antifungicos para el tratamiento de infecciones fungicas. Ejemplos de farmacos de diagnostico incluyen isotopos radiactivos tales como 99Tc, 127I, y 67Gd, y moleculas fluorescentes que se usan para visualizar sitios de interes en el cuerpo.
La preparacion de los biopolimeros de la presente invencion y el atrapamiento de farmacos son procesos sencillos y rentables. Estos nuevos portadores actuan como depositos de farmacos de liberacion sostenida, con semividas en el intervalo de 19-35 horas para el eflujo de antibioticos y quimioterapeuticos. Estas propiedades, junto con su naturaleza bioadhesiva, proporcionan a estos nuevos portadores de farmacos la capacidad de actuar como depositos de farmacos de liberacion sostenida, adheridos al sitio, retenidos en el sitio, para administraciones sistemicas, que incluyen administracion oral, topica y regional, incluyendo intranasal.
Adicionalmente, los gagomeros de la presente invencion no son toxicos. Cuando los farmacos quimioterapeuticos fueron atrapados y ensayados en un modelo de cultivo celular, los sistemas mostraron un alto potencial en el tratamiento de tumores, incluso superando el bien conocido impedimento de la resistencia a farmacos. De este modo, los gagomeros pueden utilizarse como sistemas de suministro de farmacos microscopicos y submicroscopicos para una amplia gama de actividades terapeuticas, tales como cancer, enfermedades infecciosas, cicatrizacion de heridas, terapia enzimatica, terapia genica y otros.
Inesperadamente, las particulas vacias (que contienen solo gagomeros y ningun farmaco u otra formulacion terapeutica) tambien parecen tener importantes efectos inhibidores de tumores. Por lo tanto, tales particulas pueden ser utiles para la terapia del cancer, especialmente para el cancer metastasico, ya sea como agente quimioterapeutico principal o adyuvante.
Breve descripcion de los dibujos
Las figuras 1A y 1B son imagenes de microscopia electronica de barrido de campos de particulas del mismo lote a dos diferentes aumentos. La Figura 1A esta a una ampliacion de 5000x. La Figura 1B esta a una ampliacion de 3000x.
Las Figuras 2A-2C son micrografias confocales que muestran celulas individuales incubadas con tres formulaciones diferentes. La Figura 2A muestra celulas de la linea C6 (glioma de rata) que se incubaron con bromuro de etidio libre (EtBr). La Figura 2B muestra celulas de la linea C6 que se incubaron con gagomeros "vacios" (es decir, solo atrapando regulador) suspendidos en una solucion de EtBr libre. La Figura 2C muestra celulas de la linea C6 que se incubaron con gagomeros que atrapan EtBr.
La Figura 3A muestra celulas de la linea celular PANC-1 (de adenocarcinoma pancreatico humano) tratadas con EtBr encapsulado en gagomero.
La Figura 3B, muestra celulas de la linea celular PANC-1 tratadas con EtBr libre.
La Figura 4A es una micrografia confocal de un sistema similar al de la Figura 3B, pero con un aumento mayor.
La Figura 4B es una micrografia confocal de un sistema similar al de la Figura 3A, pero con un aumento mayor.
La Figura 5 muestra los resultados de los estudios de turbidez del acido hialuronico libre y un gagomero basado en acido hialuronico en funcion de la concentracion macromolecular, despues de cambios de absorbencia a 600 nm en forma de grafico que representa la concentracion de acido hialuronico libre y un gagomero con base en acido hialuronico.
Las Figuras 6A y 6B muestran microscopia de microgagomeros y nanogagomeros. La Figura 6A muestra microscopia de fluorescencia de microgagomeros que atrapan una proteina modelo, BSA-FITC, factor de aumento: 2000. La Figura 6B muestra microscopia optica de nanogagomeros que atrapan ADN de plasmido, factor de aumento: 2000.
La Figura 7 es un grafico que ilustra el eflujo de doxorrubicina de microgagomeros (circulos) y nanogagomeros (cuadrados) en condiciones de flujo unidireccional. La variable independiente es el tiempo. La variable dependiente (f) es el porcentaje de farmaco liberado en el tiempo = t con respecto al farmaco total en el sistema en el tiempo t = 0. Los simbolos representan los datos experimentales y las curvas de linea continua son las expectativas teoricas de acuerdo con un mecanismo de flujo de combinacion multiple.
La Figura 8 es un grafico que muestra la supervivencia de celulas C6 48 horas despues del tratamiento mediante microgagomeros libres (es decir, solo regulador de encapsulacion, como en "vacio" definido en la descripcion de la Figura 2B), una dosis dada de un farmaco quimioterapeutico libre, y una dosis equivalente del mismo farmaco atrapada en el microgagomero. Los estudios se realizaron con mitomicina c (MMC), doxorrubicina (DOX) y vinblastina (VIN), y los resultados se organizaron en tres conjuntos de datos, uno para cada farmaco. Cada barra es un promedio de tres
5
10
15
20
25
30
35
40
45
experimentos independientes, cada uno de los cuales comprendia 20 mediciones separadas. Las barras de error representan las desviaciones estandar respectivas.
La Figura 9 muestra los potenciales zeta (carga superficial efectiva) de las nanoparticulas y microparticulas en funcion de la concentracion. Los potenciales Zeta reflejan las fuerzas de interaccion totales entre las particulas de tamano coloidal en suspension.
La Figura 10 representa los resultados de las pruebas de toxicidad de las nanoparticulas del sistema de suministro de farmaco libre (DDS). La dosis de DDS fue de 1 mg/mL y el tiempo de incubacion fue de 24 horas. Cada barra es un promedio de 32-64 determinaciones independientes, y las barras de error representan las desviaciones estandar.
Las Figuras 11A y 11B muestran los efectos citotoxicos de MMC (Figura 11A) y de DOX (Figura 11B), formulados en DDS-(nanoparticulas) en celulas C26 expuestas al medio de tratamiento durante 4 horas, en comparacion con el farmaco libre y el sistema de suministro del farmaco libre (DDS). *** indica p <0,001, que compara cada especie de farmaco y dosis del portador versus las formulaciones libres.
La Figura 12 representa las concentraciones de MMC en sangre, en funcion del tipo de formulacion y del tiempo de inyeccion. Cada simbolo es un promedio de 5 animales y las barras de error representan el error estandar de la media (SEM). Las lineas no son teoricas, dibujadas para enfatizar las tendencias de los datos.
La Figura 13 ilustra el aumento del volumen tumoral con el tiempo. Los puntos son experimentales, cada uno con un promedio de 5 animales; las barras de error son el SEM y las curvas no son teoricas, lo que indica las tendencias de los datos. Las flechas y los numeros arriba de ellas indican dias de tratamiento. Los numeros junto a los simbolos son dias de aparicion del tumor.
La Figura 14 ilustra la supervivencia de los animales en la prueba 1. Cada animal recibio 3 inyecciones de la formulacion seleccionada. Los datos para los grupos de solucion salina y MMC libre son de 10 animales/grupo; los datos para el DDS libre y el MMS/DDS son de 5 animales/grupo.
La Figura 15 ilustra la supervivencia de los animales en la prueba 2. Cada animal recibio 4 inyecciones de la formulacion seleccionada. Los datos para el DDS libre son de 3 animales y para el MMC/DDS de 5 animales.
La Figura 16 es un grafico de barras que muestra la acumulacion en el cerebro de MMC, usada como marcador, despues de administracion intranasal (IN) de MMC libre y MMC atrapada en nanoparticulas de DDS. Los datos son de la prueba 1, un experimento con ratas.
La Figura 17 es un grafico de barras que muestra la acumulacion en el cerebro de MMC, usada como marcador, despues de la administracion intranasal (IN) de MMC libre y MMC atrapada en nanoparticulas de DDS. Los datos son de la prueba 2, un experimento con ratones.
La Figura 18 muestra el numero de metastasis encontradas en los pulmones de los ratones C57BL/6 inyectados en forma i.v. con celulas B16F10. El grupo de control representa animales sanos que no fueron inyectados con celulas tumorales. Cada barra es un promedio de los cinco animales del grupo y la barra de error es la desviacion estandar.
La Figura 19 muestra el aumento de peso de los pulmones de ratones inyectados con tumor calculado a partir de los datos no procesados del peso de los pulmones, de acuerdo con la formula enumerada en la seccion experimental. Cada barra es un promedio para los 5 animales del grupo y las barras de error son la desviacion estandar.
La figura 20 representa un nuevo grafico de los datos de las Figuras 18 y 19 (solo promedios). Los puntos son los datos experimentales, y las lineas continuas son no teoricas, dibujadas para enfatizar las tendencias.
La Figura 21 representa la captacion de gagomeros que atraparon BSA-FITC en celulas MCF7 usando microscopia de luz y fluorescente. Los dos paneles superiores muestran la captacion de proteina libre y union no especifica. Los dos paneles inferiores representan la entrada de proteinas en el citosol y el nucleo.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion se refiere a la preparacion y usos de sistemas de suministro microscopicos y submicroscopicos, asi como a materiales que pueden usarse para la modificacion genetica de tejidos y el andamiaje de tejidos. Los sistemas de suministro de farmacos de la presente invencion son nuevos biopolimeros adhesivos que toman la forma de un portador en particulas, tambien denominado gagomero, elaborado a partir de un lipido que contiene al menos una amina primaria y un glicosaminoglicano, es decir, glicosaminoglicanos lipidados.
Las particulas de la presente invencion son particularmente rentables cuando se comparan con otros portadores en particulas, como se muestra en la Tabla 1.
Como se usa en la presente solicitud, el termino acido hialuronico, o HA, se refiere al acido hialuronico y a cualquiera de sus sales hialuronato, incluyendo, por ejemplo, hialuronato de sodio, hialuronato de potasio, hialuronato de magnesio y 5 hialuronato de calcio. De manera similar, para cualquiera de los glicosaminoglicanos, las sales asi como los acidos libres se incluyen en el termino glicosaminoglicano.
Los gagomeros de la presente invencion son sistemas de administracion de farmacos en microparticulas y nanoparticulas, tambien denominados MDDS y NDDS, respectivamente, que utilizan biopolimeros adhesivos que atrapan farmacos. Estos portadores, cuando se cargan con farmacos, mejoran los resultados clinicos en comparacion 10 con los mismos farmacos administrados en su forma libre. Los gagomeros estan hechos de materiales naturales que son biocompatibles y biodegradables.
Tabla 1
Ventajas de la presente invencion: Aspectos de un produccion rentable
Gagomeros
Otros portadores en particulas
Produccion rentable: Materias primas
Estable, disponible, relativamente economica, se ajusta a una amplia poblacion de pacientes
Algunos o todos los componentes tienen limitaciones de estabilidad y disponibilidad, algunos pueden encajar solo a poblaciones de pacientes estrechas
Produccion rentable: Fabricacion
Las metodologias de fabricacion utilizadas para R&D son susceptibles de escalado con poca o ninguna modificacion
La mayoria de los casos requieren grandes inversiones en el desarrollo de metodos de produccion escalados
Gagomeros
Otros portadores en particulas
Produccion rentable: Lineas de produccion
Dado que la produccion del GAG lipidado y el atrapamiento del farmaco son procesos separados, una sola linea de produccion del GAG lipidado se adapta a todos los productos. Dos poblaciones de tamanos de particula pueden fraccionarse mediante un procedimiento simple, del mismo lote.
La produccion de particulas y el atrapamiento de farmacos se realizan, la mayoria de las veces, en el mismo proceso, requiriendo una linea de productos separada para cada formulacion final. Igualmente para diferentes tamanos de particula.
Produccion rentable: Preparacion de la formulacion para uso
La formulacion final es mediante simple rehidratacion del polvo seco de GAG lipidado en una solucion acuosa del farmaco deseado. Puede hacerse al lado de la cama del paciente, en casa, etc.
La formulacion final, incluyendo el farmaco atrapado, tiene que ser proporcionada por el fabricante.
Produccion rentable: Estabilidad y vida util
El farmaco y el GAG lipidado se pueden almacenar por separado en forma seca, hasta su reconstitucion para uso, proporcionando una alta estabilidad y una vida util a largo plazo.
El almacenamiento es de la formulacion final, es decir, del portador cargado con farmaco. La forma seca no esta disponible en todos los casos. Como resultado, existen limitaciones tanto en la estabilidad como en la vida util.
Los gagomeros de la presente invencion tienen una serie de otras ventajas sobre otros portadores en particulas, 15 incluyendo aspectos de su destino in vivo, como se muestra en la Tabla 2.
Tabla 2
Ventajas de la presente invencion - Aspectos del destino in vivo
Gagomeros
Otros portadores en particulas
Destino in vivo: Biodegradabilidad y biocompatibilidad
Todos los componentes son biomateriales, por lo tanto proporcionan estas propiedades
Algunos portadores tienen componentes no biologicos que desmejoran estas propiedades
Destino in vivo: Toxicidad e inmunogenicidad
Basandose en la naturaleza de las materias primas, no se esperan toxicidad y baja o ninguna inmunogenicidad. Los estudios in vitro e in vivo no confirman toxicidad.
Varia de un portador a otro. Aceptable en los pocos sistemas aprobados para uso clinico.
Destino in vivo tras administracion i.v.: Retencion en circulacion
Se confirmo retencion buena y suficiente, ya que el componente GAG ya tiene la capa externa hidrofila encontrada para retrasar la opsonizacion y absorcion por el RES.
Retencion obtenida pobre e insuficiente, a menos que el portador sea modificado en la superficie para portar un ligando apropiado en su superficie para retrasar tanto la opsonizacion como la absorcion por el RES.
Los gagomeros de la presente invencion tambien proporcionan una actividad biologica y terapeutica superior en comparacion con otros portadores en particulas. Algunas de estas ventajas se muestran en la Tabla 3.
5 Tabla 3
Ventajas de la presente invencion: Aspectos de actividad biologica/terapeutica
Gagomeros
Otros portadores en particulas
Actividad biologica/terapeutica:
Eficiencia del atrapamiento del farmaco
Capacidad de atrapamiento de alta eficacia independiente del tamano del farmaco hasta e incluyendo proteinas y material genetico, debido a una naturaleza "envolvente" o de "ajuste inducido".
Las eficiencias de atrapamiento van desde pobres hasta altas, con baja eficiencia de entidades de alto peso molecular.
Actividad biologica/terapeutica: Retencion en el sitio y direccionamiento
La naturaleza bioadhesiva del componente GAG confiere a los sistemas la capacidad de adherirse con alta afinidad a los sitios de reconocimiento in vivo y confiere medidas de direccionamiento activo.
Se requiere una modificacion adicional del portador, que no siempre es posible y en algunos casos es contraproducente para la produccion y aspectos de destino in vivo para dotar a los sistemas con estas propiedades.
Se pueden sintetizar dos tipos basicos de gagomero: uno con una relacion de lipidos a glicosaminoglicanos baja, [1:1, p/p] denominada LLG y uno con una relacion alta de lipido a glicosaminoglicano, [5:1 a 20:1, p/p ] denominado HLG. Al cambiar los pasos especificos en la preparacion, el resultado puede ser dirigido a formar microparticulas o 10 nanoparticulas.
Los gagomeros de la presente invencion, glicosaminoglicanos lipidados, se pueden usar como sistemas de suministro para terapia con farmacos para tratar una afeccion patologica en un animal que lo necesite. El termino "animal" usado en la presente invencion incluye seres humanos y otros mamiferos tales como ganado vacuno, perros, gatos, ratas, ratones; asi como las aves; reptiles; y pescado.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Para la presente invencion, las condiciones patologicas adecuadas para el tratamiento por medio de los gagomeros incluyen, pero no se limitan a, cancer, infecciones por hongos o bacterias, incluidas las secundarias a traumatismos tales como quemaduras, infecciones causadas por parasitos o virus, infecciones por priones, y similares.
Los gagomeros de la presente invencion tambien pueden tener uso en preparaciones de vacunas y terapia genica. La preparacion de vacunas que contienen un polipeptido inmunogenico como ingrediente activo es conocida por un experto en la tecnica. Del mismo modo, la preparacion de vectores para insercion genica es tambien conocida por un experto en la tecnica.
Los gagomeros formados por los procedimientos de la presente invencion pueden ser liofilizados o deshidratados en diversas etapas de formacion. Por ejemplo, la pelicula de lipidos se puede liofilizar despues de eliminar el disolvente y antes de anadir el farmaco. Alternativamente, la pelicula de lipido-farmaco se puede liofilizar antes de hidratar los gagomeros. Dicha deshidratacion puede llevarse a cabo mediante la exposicion del lipido o el gagomero a presion reducida, eliminando de este modo todo el disolvente de la suspension.
Alternativamente o adicionalmente, la preparacion de gagomero hidratada tambien puede deshidratarse colocandola en medio circundante en nitrogeno liquido y congelandola antes de la etapa de deshidratacion. La deshidratacion con congelacion previa puede realizarse en presencia de uno o mas agentes protectores, tales como azucares. Tales tecnicas mejoran el almacenamiento a largo plazo y la estabilidad de las preparaciones.
Despues de la rehidratacion, puede calentarse la preparacion. Pueden utilizarse otros metodos adecuados en la deshidratacion de las preparaciones de gagomeros. Los gagomeros tambien pueden deshidratarse sin congelacion previa. Una vez que se han deshidratado los gagomeros, se pueden almacenar durante largos periodos de tiempo hasta que se van a utilizar. La temperatura apropiada para el almacenamiento dependera de la formulacion de lipidos de los gagomeros y de la sensibilidad a la temperatura de los materiales encapsulados.
Cuando se van a utilizar los gagomeros deshidratados, la rehidratacion se consigue simplemente anadiendo una solucion acuosa, tal como agua destilada o un regulador apropiado, a los gagomeros y permitiendoles que se rehidraten. Esta rehidratacion puede realizarse a temperatura ambiente o a otras temperaturas apropiadas para la composicion de los gagomeros y su contenido interno.
Los gagomeros de la presente invencion, glicosaminoglicanos lipidados, se preparan preferiblemente mediante union covalente de un lipido que tiene al menos un grupo amino primario a un glicosaminoglicano que contiene acido carboxilico mediante el siguiente metodo:
(a) Se proporciona un recipiente de reaccion en el que se esparce el lipido en una capa delgada sobre el fondo y las paredes del recipiente. Esto puede efectuarse disolviendo el lipido en un disolvente organico y evaporando el lipido a sequedad a baja presion en un evaporador rotatorio.
(b) El glicosaminoglicano se activa por preincubacion en pH acido con un entrecruzador.
(c) El glicosaminoglicano activado se anade al recipiente de reaccion.
(d) La mezcla de reaccion del lipido y del glicosaminoglicano activado se regula a un pH basico de 8,6.
(e) Las mezclas de reaccion reguladas se incuban, con agitacion continua, durante un periodo de tiempo suficiente para formar el glicosaminoglicano lipidado, tal como durante la noche a 37°C. Dado que los gags lipidados estan disenados para usarse in vivo, deben ser estables a aproximadamente 37°C. Aunque pueden usarse temperaturas mas altas para la lipidacion, los lipidos experimentan cambios fisicos con temperaturas crecientes, generalmente alrededor de 620C. Por lo tanto, la lipidacion se lleva a cabo preferiblemente a temperaturas de aproximadamente 30-40°C.
(f) El glicosaminoglicano lipidado se regula a un pH neutro y se anaden otros iones y aditivos solubles en agua de acuerdo con la necesidad para elevar la fuerza ionica hasta niveles fisiologicos con iones o sales presentes en fluidos biologicos (tales como NaCl, KCl, Ca2+ y Mg2+).
(g) Las particulas se fraccionan por centrifugaciones sucesivas, cada una a 4°C, durante 40 minutos a una fuerza g de 1,3 x 105, de la siguiente manera: El precipitado despues de 3 series es la fraccion enriquecida con microparticulas, el sobrenadante de la fraccion enriquecida en microparticulas sometida a 3 series adicionales es la fraccion enriquecida en nanoparticulas.
(h) El glicosaminoglicano lipidado resultante se liofiliza.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Para atrapar farmacos u otros ingredientes activos en los gagomeros, se disuelve el material de interes en agua pura libre de iones. El gagomero en polvo seco liofilizado obtenido como se menciono anteriormente se reconstituye entonces en la solucion acuosa del material que se va a atrapar.
Se pueden realizar estudios de turbidez, despues de la dispersion de luz en un espectrofotometro, para concentraciones iguales de acido hialuronico soluble y de un gagomero preparado a partir de acido hialuronico y fosfatidiletanolamina para obtener una idea de si la sintesis realmente produce materia en particulas. Los resultados representativos de tales estudios se muestran en la Figura 5. Como era de esperar, en el intervalo de concentracion probado el acido hialuronico libre es soluble, y sus soluciones no dispersan la luz. Por el contrario, las muestras que contienen gagomeros son turbias, aumentando la dispersion de la luz con la concentracion de gagomero, dejando claro que el biopolimero es un material insoluble.
Las muestras de los gagomeros que atrapan macromoleculas son visibles tanto por microscopia optica como de fluorescencia. Un campo tipico observado bajo el microscopio fluorescente, de microparticulas de entre 2 y 5 micras de diametro, preparado a partir de HLG y atrapando una proteina modelo, BSA-FITC, se muestra en la Figura 6, panel superior. Estas microparticulas se preparan como se ha descrito anteriormente. Antes de la observacion bajo el microscopio, la proteina no atrapada se elimina de la preparacion por ultracentrifugacion a 4°C durante 30 minutos y una fuerza g de 1,2 x 105. El precipitado que contiene las particulas con su proteina atrapada se resuspende en solucion salina regulada con fosfato (PBS).
Un campo tipico de nanoparticulas (entre 50 y 200 nm de diametro) visto bajo el microscopio optico preparado a partir de HLG que atrapa un ADN de plasmido se muestra en la Figura 6, panel inferior. Las nanoparticulas se preparan como se ha descrito anteriormente para el FITC-BSA.
Las particulas hechas de glicosaminoglicanos tienen una amplia gama de aplicaciones, ya que las mismas particulas pueden usarse solas, o con cualquier tipo de material encapsulado en ellas. Las particulas de glicosaminoglicano se elaboran preferiblemente sin ningun material encapsulado y despues se liofilizan para formar un polvo. Las particulas de glicosaminoglicano en polvo se mezclan entonces con un polvo del material a encapsular. Alternativamente, las particulas de glicosaminoglicano en polvo se reconstituyen mezclando con una solucion acuosa del material a encapsular. Una vez que se reconstituye la mezcla, las particulas habran capturado el material con el que fue mezclado. De este modo, las moleculas pequenas, tales como antibioticos y farmacos quimioterapeuticos, y moleculas grandes, tales como proteinas, pueden encapsularse con esta tecnica. Las particulas se pueden utilizar para encapsular ADN, y las particulas mas grandes pueden incluso encapsular celulas enteras y lineas celulares. Por lo tanto, tambien se pueden utilizar particulas como un andamio para la modificacion genetica de tejidos.
Las particulas de la presente invencion se preparan haciendo reaccionar al menos un glicosaminoglicano en la forma larga, es decir, el gag no se ha cortado en tamanos mas pequenos. Todos los glicosaminoglicanos, excepto el acido hialuronico, estan naturalmente en forma de una unidad estructural proteica unida covalentemente a una unidad estructural de polisacarido. Los metodos para hidrolizar el enlace de proteina-azucar son bien conocidos por los expertos en la tecnica, tanto quimicamente como enzimaticamente. Ademas, estan disponibles algunos productos comerciales en los que la unidad estructural de proteina ya ha sido removida.
El polimero de glicosaminoglicano se hace reaccionar con un lipido que tiene al menos un grupo amino primario para entrecruzar el residuo carboxilico del glicosaminoglicano con una amina primaria en el lipido. Una vez que se produce esta reaccion, la estabilidad termodinamica hace que los lipidos interactuen entre si para convertir el producto en una esfera que tiene al glicosaminoglicano en el exterior y los lipidos en el interior. Estas particulas se utilizan entonces para encapsular otros materiales, incluyendo farmacos, aDn, celulas, proteinas, etc.
En una realizacion de la presente invencion, se elimina la parte de proteina del glicosaminoglicano y solo se hace reaccionar la cadena principal de azucar con los lipidos.
Se conoce en la tecnica como unir acido hialuronico al exterior de liposomas para dirigir o para hacer que los liposomas sean mas bioadhesivos. En la presente invencion, no hay liposoma, en vez de eso, las moleculas de lipido estan unidas covalentemente al acido hialuronico.
En otra realizacion de la presente invencion, se pueden unir otras moleculas primero al glicosaminoglicano, que despues se hace reaccionar con lipidos. Estas particulas tienen las otras moleculas que aparecen en el exterior de las particulas. Estas otras moleculas pueden ser, por ejemplo, anticuerpos, folato, porfirinas o lectinas, y pueden usarse para direccionamiento.
El glicosaminoglicano reivindicado es acido hialuronico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Las fuentes naturales de glicosaminoglicanos incluyen tanto fuentes vegetales como animales, incluyendo pero no limitandose a arboles de haya y formas de cartilago animal, incluyendo cartilago de tiburon, traquea bovina, septo de ballena, narices de porcino y moluscos como Perna canaliculus y pepino de mar.
Se ha encontrado que los farmacos encapsulados en las particulas de glicosaminoglicano de la presente invencion son mucho mas eficaces que los farmacos libres, particularmente para las celulas cancerosas que se han vuelto resistentes a farmacos. Parece que los gagomeros se unen a las celulas cancerosas y se convierten asi en depositos de farmacos que pueden entrar en las celulas mas rapidamente de lo que son excretados. Estos farmacos tienen por lo tanto un efecto toxico sobre las celulas a pesar de los mecanismos resistentes a farmacos que se han desarrollado, abrumando a las celulas cancerosas.
Los gagomeros de la presente invencion pueden encapsular casi cualquier tipo de molecula sin ser modificados. Por el contrario, los liposomas, por ejemplo, deben cargarse primero positivamente para formar complejo con el ADN, mientras que los liposomas que encapsulan muchos otros materiales no se cargan positivamente. Es una ventaja de la presente invencion que los gagomeros puedan encapsular practicamente cualquier tipo de molecula.
Los glicosaminoglicanos se utilizan en los tamanos obtenidos cuando se purifican a partir de sus fuentes biologicas y que no han sido sometidos a degradacion quimica y/o biologica. Por ejemplo, para el acido hialuronico, esto corresponde a un intervalo de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1 x l07 daltons.
Las composiciones farmaceuticas que utilizan gagomeros de acuerdo con la presente invencion pueden administrarse por cualquier via conveniente, incluyendo parenteral, por ejemplo, subcutanea, intravenosa, topica, intramuscular, intraperitoneal, transdermica, rectal, vaginal, intranasal o intraocular. Alternativamente o concomitantemente, la administracion puede ser por via oral.
La administracion parenteral puede ser por inyeccion en bolo o por perfusion gradual a lo largo del tiempo. La administracion parenteral se caracteriza generalmente por inyeccion, mas tipicamente subcutanea, intramuscular o intravenosa.
Las formulaciones topicas compuestas de los constructos de gagomeros de la presente invencion, reforzadores de penetracion y otros farmacos o medicamentos biologicamente activos pueden aplicarse de muchas maneras. La solucion se puede aplicar gota a gota, desde un dispositivo de administracion adecuado, al area apropiada de piel o de piel enferma o membranas mucosas y se frota a mano o simplemente se deja secar al aire. Se puede anadir un agente gelificante adecuado a la solucion y se puede aplicar la preparacion al area apropiada y se frota. Para administracion a heridas o quemaduras, los gagomeros se pueden incorporar en formas de dosificacion tales como aceites, emulsiones y similares. Tales preparaciones pueden aplicarse directamente a la zona afectada en forma de lociones, cremas, pastas, unguentos y similares.
Alternativamente, la formulacion en solucion topica puede colocarse en un dispositivo de atomizacion y ser suministrada como un aerosol. Este tipo de dispositivo de administracion de farmacos esta particularmente adaptado para su aplicacion a grandes areas de piel afectadas por patologias dermicas, a piel altamente sensible o a cavidades nasales u orales. Opcionalmente, los gagomeros se pueden administrar en forma de un unguento o parche transdermico.
Se entiende que las vias orales de administracion incluyen vias de administracion bucal y sublingual.
Los gagomeros de la presente invencion tambien se pueden administrar por otras vias que optimizan la captacion por la mucosa. Por ejemplo, vaginal (especialmente en el caso de tratar patologias vaginales), rectal e intranasal son las vias de administracion preferidas. Ademas, los gagomeros son particularmente adecuados para el suministro a traves de tejido mucoso o epitelio. Si se administran en forma intranasal, los gagomeros se administraran tipicamente en forma de aerosol, o en forma de gotas. Esto puede ser especialmente util para tratar patologias pulmonares. Se pueden encontrar formulaciones adecuadas en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 y 18 Ed., Mack Publishing, Easton, Pa. (1980 y 1990), e Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 4a Edicion, Lea & Febiger, Filadelfia (1985), cada una de las cuales se incorpora aqui como referencia.
Dependiendo del modo de administracion pretendido, las composiciones utilizadas pueden estar en formas de dosificacion solidas, semisolidas o liquidas, tales como, por ejemplo, tabletas, supositorios, pildoras, capsulas, polvos, liquidos, suspensiones, o similares, preferiblemente en formas de dosificacion unitarias adecuadas para administracion unica de dosificaciones precisas. Las composiciones farmaceuticas incluiran el constructo de gagomero tal como se ha descrito y un excipiente farmaceuticamente aceptable y, opcionalmente, pueden incluir otros agentes medicinales, agentes farmaceuticos, vehiculos, coadyuvantes, etc. Se prefiere que el portador farmaceuticamente aceptable sea uno que sea quimicamente inerte a los compuestos activos y que no tenga efectos secundarios perjudiciales ni toxicidad bajo las condiciones de uso. La eleccion del portador se determina en parte por el ingrediente activo particular, asi como por el metodo particular usado para administrar la composicion. Por consiguiente, hay una amplia variedad de formulaciones adecuadas de las composiciones farmaceuticas de la presente invencion.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Los excipientes adecuados son, en particular, rellenos tales como sacaridos, por ejemplo, lactosa o sacarosa, manitol o sorbitol, preparaciones de celulosa y/o fosfatos de calcio, por ejemplo, fosfato tricalcico o fosfato acido de calcico, asi como aglutinantes tales como pasta de almidon usando, por ejemplo, almidon de maiz, almidon de trigo, almidon de arroz, almidon de patata, gelatina, tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa sodica y/o polivinil pirrolidina.
Las formulaciones inyectables para administracion parenteral se pueden preparar como soluciones o suspensiones liquidas, formas solidas adecuadas para solucion o suspension en liquido antes de la inyeccion, o como emulsiones. Excipientes adecuados son, por ejemplo, agua, solucion salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares. Ademas, si se desea, las composiciones farmaceuticas a administrar pueden contener tambien cantidades menores de sustancias auxiliares no toxicas tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes reguladores del pH y similares, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, monolaurato de sorbitan, oleato de trietanolamina, etc.
Las suspensiones para inyeccion acuosa tambien pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspension, incluyendo, por ejemplo, carboximetilcelulosa sodica, sorbitol y/o dextrano. Opcionalmente, la suspension puede contener tambien estabilizantes.
Las formulaciones parenterales pueden estar presentes en recipientes sellados de dosis unitarias o de dosis multiples, tales como ampollas y viales, y pueden almacenarse en una condicion de secado por congelacion (liofilizada) que requiere solamente la adicion del portador liquido esteril, por ejemplo, agua, para inyecciones inmediatamente antes del uso. Las soluciones y suspensiones inyectables extemporaneas pueden prepararse a partir de polvos, granulos y comprimidos esteriles del tipo anteriormente descrito.
Para la administracion oral, se forma una composicion no toxica farmaceuticamente aceptable mediante la incorporacion de cualquiera de los excipientes normalmente empleados, tales como, por ejemplo, manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, talco, celulosa, croscarmelosa sodica, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Tales composiciones incluyen soluciones, suspensiones, comprimidos, comprimidos dispersables, pastillas, capsulas, polvos, formulaciones de liberacion sostenida y similares. Las formulaciones adecuadas para administracion oral pueden consistir en soluciones liquidas tales como cantidades eficaces del compuesto o compuestos disueltos en diluyentes tales como agua, solucion salina o jugo de naranja; bolsitas, grageas y pastillas, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del ingrediente activo como solidos o granulos; polvos, suspensiones en un liquido apropiado; y emulsiones adecuadas. Las formulaciones liquidas pueden incluir diluyentes tales como agua y alcoholes, por ejemplo, etanol, alcohol bencilico y los alcoholes de polietileno, con o sin la adicion de un surfactante farmaceuticamente aceptable, agentes de suspension o agentes emulsionantes.
Cuando la composicion es una pildora o comprimido, contendra, junto con el ingrediente activo, un diluyente tal como lactosa, sacarosa, fosfato dicalcico o similares; un lubricante tal como estearato de magnesio o similar; y un aglutinante tal como almidon, goma acacia, gelatina, polivinil pirrolidina, celulosa y sus derivados, y similares.
Las formas de comprimidos pueden incluir uno o mas de lactosa, sacarosa, manitol, almidon de maiz, almidon de patata, acido alginico, celulosa microcristalina, goma arabiga, gelatina, goma guar, dioxido de silicio coloidal, croscarmelosa sodica, talco, estearato de magnesio, estearato calcico, estearato de zinc, acido estearico y otros conservantes, agentes saborizantes y agentes desintegrantes farmaceuticamente aceptables, agentes humectantes, conservantes, y portadores farmacologicamente compatibles.
Las formas en capsula pueden ser del tipo ordinario de gelatina dura o blanda que contiene, por ejemplo, surfactantes, lubricantes y rellenos inertes, tales como lactosa, sacarosa, fosfato de calcio y almidon de maiz.
Las formas de grageas pueden comprender el ingrediente activo en un portador, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto, asi como pastillas que comprenden el ingrediente activo en una base inerte tal como gelatina o glicerina, o sacarosa y acacia.
Para determinar las dosificaciones de las particulas de gagomero a administrar, se selecciona la dosificacion y frecuencia de administracion en relacion con las propiedades farmacologicas de los ingredientes activos especificos. Normalmente, deben usarse al menos tres niveles de dosificacion. En los estudios de toxicidad en general, la dosis mas alta debe alcanzar un nivel toxico pero no alcanzar a ser letal para la mayoria de los animales del grupo. Si es posible, la dosis mas baja debe inducir un efecto biologicamente demostrable. Estos estudios deben realizarse en paralelo para cada compuesto seleccionado.
Adicionalmente, el nivel de ED50 (dosis efectiva para el 50% de la poblacion de prueba) del ingrediente activo en cuestion debe ser uno de los niveles de dosificacion seleccionados y los otros dos seleccionados para alcanzar un nivel toxico. La dosis mas baja es aquella dosis que no presenta un efecto biologicamente demostrable. Las pruebas toxicologicas deben repetirse utilizando nuevas dosis adecuadas calculadas con base en los resultados obtenidos.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Los ratones jovenes sanos o las ratas pertenecientes a una cepa bien definida son la primera eleccion de la especie, y los primeros estudios usan generalmente la vfa de administracion preferida. Los grupos de control que recibieron placebo o no fueron tratados estan incluidos en los ensayos. Los ensayos de toxicidad general, como se ha indicado anteriormente, deberfan normalmente repetirse en otras especies no roedoras, por ejemplo, un conejo o un perro. Los estudios tambien pueden repetirse usando rutas alternativas de administracion.
Los ensayos de toxicidad de una dosis unica deben realizarse de tal manera que se revelen signos de toxicidad aguda y se determine el modo de muerte. La dosificacion a administrar se calcula con base en los resultados obtenidos en los ensayos de toxicidad antes mencionados. Puede ser deseable no continuar estudiando todos los compuestos inicialmente seleccionados.
Los datos sobre la toxicidad de una dosis unica, por ejemplo LD50, la dosis a la que mueren el 50% de los animales de experimentacion, se expresan en unidades de peso o volumen por kg de peso corporal y se deben suministrar generalmente a al menos dos especies con diferentes modos de administracion. Ademas del valor de LD50 en roedores, es deseable determinar la dosis mas alta tolerada y/o la dosis letal mas baja para otras especies, es decir, perro y conejo.
Cuando se ha establecido un nivel de dosificacion adecuado y presumiblemente seguro como se ha descrito anteriormente, tambien se pueden requerir estudios sobre la toxicidad cronica del farmaco, su efecto sobre la reproduccion y potencial mutagenicidad para asegurar que el intervalo de dosificacion apropiado calculado sera seguro, tambien con respecto a estos peligros.
Se llevan a cabo entonces estudios farmacologicos en animales sobre la farmacocinetica que revelan, por ejemplo, la absorcion, distribucion, biotransformacion y excrecion del ingrediente activo y metabolitos. Utilizando los resultados obtenidos, se disenan estudios sobre farmacologfa humana.
Los estudios de la farmacodinamia y la farmacocinetica de los compuestos en seres humanos deben realizarse en sujetos sanos utilizando las vfas de administracion destinadas a uso clfnico, y pueden repetirse en pacientes. La relacion dosis-respuesta cuando se administran diferentes dosis, o cuando se administran varios tipos de conjugados o combinaciones de conjugados y compuestos libres, debe ser estudiada con el fin de dilucidar la relacion dosis-respuesta (dosis versus concentracion en plasma versus efecto), el intervalo terapeutico y el intervalo optimo de dosis. Tambien deben realizarse estudios sobre la relacion tiempo-efecto, por ejemplo, estudios sobre el curso en el tiempo del efecto y estudios sobre diferentes organos con el fin de dilucidar los efectos farmacologicos deseados e indeseados del farmaco, en particular sobre otros sistemas de organos vitales.
Los compuestos de la presente invencion estan entonces listos para ensayos clfnicos para comparar la eficacia de los compuestos con la terapia existente. Una relacion dosis-respuesta con el efecto terapeutico y efectos secundarios puede establecerse mas finamente en este punto.
La cantidad de compuestos de la presente invencion que se va a administrar a cualquier paciente dado debe determinarse emprncamente y variara dependiendo de la condicion de los pacientes. En primer lugar se pueden administrar cantidades relativamente pequenas del ingrediente activo, con dosis cada vez mayores si no se observan efectos adversos. Por supuesto, nunca se debe exceder la dosis maxima de toxicidad segura determinada en las pruebas de toxicidad de rutina con animales.
Las composiciones dentro del alcance de la presente invencion incluyen todas las composiciones en las que el ingrediente activo esta contenido en una cantidad eficaz para lograr el proposito previsto. Aunque las necesidades individuales varfan, la determinacion de los intervalos optimos de cantidades efectivas de cada compuesto esta dentro de la maestrfa en la tecnica. La dosis administrada dependera de la edad, el estado de salud y el peso del individuo receptor de la misma, asf como sobre la naturaleza de cualquier tratamiento concurrente y el efecto deseado. Las dosificaciones tfpicas comprenden de 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal. Las dosis preferidas que comprenden 0,1 a 100 mg/kg de peso corporal. Las dosificaciones mas preferidas comprenden de 1 a 50 mg/kg de peso corporal.
Los gagomeros pueden formularse para atrapar composiciones terapeuticas para farmacos o terapia genica, o pueden estar vacfos, para uso en el tratamiento de cancer, especialmente cancer metastasico.
Ejemplo 1: Estudios estructurales de microgagomeros
Los datos estructurales proporcionados aquf (Figuras 1A y 1B) se obtuvieron por medio de microscopfa electronica de barrido (SEM). Ambas partes de la Figura 1 son campos del mismo lote, con dos aumentos diferentes (ver informacion estampada por el propio dispositivo en la parte inferior de cada figura). Tres caracterfsticas son demostradas por estos resultados: (1) estos datos constituyen una confirmacion de la naturaleza en partfculas de estos polfmeros; (2) estos datos tambien constituyen una confirmacion del intervalo de tamanos (vease una barra de 1 pm en la Figura 1A); y (3) se proporcionan algunos detalles sobre la forma de las partfculas.
Se observa que las particulas son heterogeneas con respecto al tamano. Esto se observa en la Figura 1A y mas aun en la Figura 1B. Este es un resultado esperado, ya que la microscopia se realizo en toda la preparacion, antes del fraccionamiento en las poblaciones de nano y microparticulas. Los intervalos de ampliacion aplicados bajo el microscopio para uso en SEM favorecen el de las microparticulas.
5 Ejemplo 2: Union quimica
Puesto que el grupo amino lipidico se entrecruzo con los residuos carboxilicos del acido hialuronico, deberia haber una disminucion en el numero de acidos carboxilicos libres del acido hialuronico libre para el gagomero. Cuanto mas ligado a los lipidos, mas extensa debe ser la disminucion de los grupos de acido carboxilico libres. Ademas, a partir del grado de perdida de acido carboxilico libre, es posible medir la estequiometria de lipido con respecto a acido hialuronico. 10 Usando un ensayo de acido carboxilico, fue posible medir la disminucion esperada. Tambien se podria estimar que, en las microparticulas, alrededor del 33% de los residuos de acido glucuronico estan ocupados por moleculas lipidicas, en las que en las nanoparticulas solo aproximadamente el 20% de los residuos de acido glucuronico estan ocupados por moleculas lipidicas.
Ejemplo 3: Detalles fisicoquimicos y propiedades de la formulacion de gagomero de EtBr
15 La eficacia de atrapamiento de farmacos u otros agentes bioactivos en los gagomeros y la cinetica de eflujo del farmaco para farmacos de pequeno peso molecular se determinaron usando absorbencia en un lector de placas de ELISA, con longitudes de onda apropiadas para cada entidad atrapada dada.
Los resultados tipicos de la eficacia de atrapamiento se muestran en las Tablas 4 y 5 de las microparticulas y nanoparticulas, respectivamente.
20 Tabla 4
Microgagomeros: Eficacia del atrapamiento de farmaco y la semivida del eflujo de farmaco
Entidad atrapada
Eficacia de encapsulacion (%) Semivida del eflujo de farmaco (horas)
Por termodinamica
Por cinetica
Fluoresceina
49,6 ± 4,8 40,6 ± 5,8 7,9
Cloranfenicol
39,3 ± 3,9 30,5 ± 1,9 28,2
Mitomicina c
49,4 ± 2,5 44,3 ± 2,7 20,1
Doxorubicina
52,4 ± 6,3 50,2 ± 1,2 35,3
BSA
32,0 ± 2,5
ADN
74,5 ± 2,8
Tabla 5
Microgagomeros: Eficacia del atrapamiento de farmaco y la semivida del eflujo de farmaco
Entidad atrapada
Eficacia de encapsulacion (%) Semivida del eflujo de farmaco (horas)
Por termodinamica
Por cinetica
Fluoresceina
37,4 ± 1,2 29,1 ± 6,1 21,9
Cloranfenicol
47,4 ± 0,3 47,1 ± 1,5 14,8
5
10
15
20
25
30
35
40
Mitomicina c
54,8 ± 0,9 41,7 ± 1,6 29,8
Doxorubicina
57,0 ± 3,7 53,6 ± 0,9 22,3
BSA
35,0 ± 1,8
ADN
65,8 ± 4,8
La concentracion de EtBr atrapado por gagomero fue de 25 pM. La eficacia del atrapamiento fue 49,8 (± 3,1) (%). La semivida del eflujo de EtBr del gagomero fue de 27,7 horas.
Ejemplo 4: Estudios de toxicidad in vitro
Se ensayaron los gagomeros libres de farmaco de tamano micro y nano para determinar la toxicidad en cultivos celulares tanto para gagomeros de bajo contenido de lipidos y alto contenido de lipidos. Se ensayaron dos lineas celulares, la linea celular de glioma de rata C6 y la linea de fibroblastos de raton NIH3T3. En todos los casos se encontro que los gagomeros no tenian toxicidad en el intervalo de concentraciones de 100 veces de 0,02 a 2 mg/mL de polimero.
Ejemplo 5: Actividad terapeutica ejemplificada por tratamiento de una linea celular de glioma resistente a farmacos (MDR)
Debido a su localizacion y pobre respuesta a farmacos quimioterapeuticos, los tumores cerebrales, particularmente los gliomas, son muy dificiles de tratar (Wolff y colaboradores, 1999; Nutt y colaboradores, 2000). La pobre respuesta del farmaco se debe en parte a la falta de acceso y en parte a la resistencia inherente a multiples farmacos (MDR) de estos tumores (Larsen, 2000; Gottesman y colaboradores, 1995).
En tumores cerebrales, la resistencia a multiples farmacos es un impedimento incluso en los casos en los que se ha proporcionado el acceso al tumor, tal como mediante administracion local o dejando un deposito local al final de un procedimiento quirurgico. En este mecanismo prevalente de resistencia a farmacos, que aparece tanto en un modo adquirido como inherente, los farmacos no pierden su actividad toxica intrinseca, ni tampoco las celulas resistentes encontraron una manera de metabolizar los farmacos hasta entidades no toxicas. Mas bien, el farmaco que entra en la celula a traves de la difusion pasiva a traves de la membrana celular se bombea activamente hacia fuera, reduciendo los niveles intracelulares por debajo de su umbral letal. La linea de glioma C6, que muestra MDR inherente, sirvio como el sistema modelo para probar si el tratamiento con gagomeros que encapsulaba un farmaco quimioterapeutico ofreceria cualquier ventaja sobre un tratamiento similar con el farmaco libre.
Metodologia
Las celulas se sembraron en placas de 96 pozos, y se inicio el experimento en semiconfluencia, usualmente 24 horas despues de la siembra. A las celulas se les suministro una dosis seleccionada del farmaco de eleccion, atrapado en una formulacion de gagomero a la que se le lavo el exceso de farmaco no atrapado antes del uso. Los sistemas de control eran la misma dosis de farmaco libre y una dosis de gagomero libre de farmaco a una dosis similar a aquella del sistema de ensayo. La supervivencia celular se determino 48 horas despues del tratamiento, utilizando el ensayo MTT (Nutt y colaboradores, 2000, Larsen y colaboradores, 2000).
Resultados
Los resultados para tres farmacos quimioterapeuticos se muestran en la Figura 8 en tres conjuntos de datos. Los datos para el gagomero libre (la barra mas a la izquierda en cada uno de los tres conjuntos de datos) es una confirmacion adicional de los datos discutidos anteriormente con respecto a los gagomeros que no son toxicos. Dependiendo del farmaco especifico, con cada farmaco operando en su propio intervalo de dosis, puede observarse que incluso dosis relativamente altas de farmaco libre permiten que el 20-60% de las celulas sobreviva. Tales resultados, mostrados en la barra media de cada conjunto de datos, son tipicos para la forma inherente de celulas resistentes a multiples farmacos. El reemplazo del farmaco libre con la misma dosis de farmaco atrapado por gagomero genero una diferencia dramatica, como puede verse en la barra mas a la derecha de cada conjunto de datos. Para cada uno de los tres farmacos, la nueva formulacion genera un aumento de 3 a 4 veces de muerte celular en comparacion con el farmaco libre correspondiente. Dos hallazgos vinculan estrechamente esta respuesta mejorada en el tratamiento con la novedosa formulacion de suministro de farmaco de la presente invencion: la naturaleza no toxica del gagomero libre y el aumento de muerte celular obtenido para tres farmacos diferentes que tienen un mecanismo citotoxico unico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Para superar la resistencia a multiples farmacos, debe encontrarse un mecanismo para elevar las dosis intracelulares de un farmaco quimioterapeutico por encima del umbral letal. El enfoque tradicional adoptado en el intento de alcanzar esta elevacion es reducir el bombeo utilizando agentes de inversion que tambien se conocen como quimiosensibilizadores. Aunque varios de estos agentes han sido identificados, el mas prominente entre ellos verapamilo, ninguno de los quimiosensibilizadores disponibles actualmente puede ser utilizado clinicamente. Ademas, el tratamiento requiere una orquestacion cuidadosa, ya que las dos entidades activas, el farmaco quimioterapeutico y los quimiosensibilizadores, deben alcanzar el objetivo juntos para ser eficaces. Esto no es un asunto sencillo en la practica clinica.
Otra forma de elevar la dosis de farmaco intracelular es aumentar la afluencia, tanto en magnitud como en duracion. Parece que el aumento sobresaliente en la respuesta al farmaco para los gagomeros de atrapamiento de farmacos de la presente invencion funciona aumentando la afluencia. La naturaleza bioadhesiva de los gagomeros los posiciono como depositos de farmacos unidos a la membrana celular. Esto aumento tanto el gradiente electroquimico del farmaco a traves de la membrana celular en comparacion con el farmaco libre, asi como el intervalo de tiempo durante el cual se produce la entrada del farmaco. Por lo tanto, el tratamiento solo requiere una entidad, la composicion farmaco- gagomero. Estas nuevas formulaciones tambien beneficiaran a los tumores no resistentes al permitir un tratamiento exitoso con dosis de farmaco significativamente mas bajas.
Ejemplo 6: Interaccion de microgagomeros con celulas
Se sabe que las celulas son impermeables a EtBr (bromuro de etidio), un marcador fluorescente sensible a acido nucleico. Su emision de fluorescencia se incrementa significativamente tras la union a ADN y ARN, lo que permite determinar si un portador ha hecho que las celulas sean permeables a EtBr y, en particular, si ha alcanzado el nucleo.
Con el fin de examinar las interacciones de estos nuevos polimeros con celulas, se prepararon gagomeros que encapsulan EtBr, se determinaron las propiedades fisicoquimicas de estos gagomeros y despues se incubaron los gagomeros con celulas. Los resultados fueron escaneados usando microscopia confocal.
Se ensayaron dos lineas celulares, C6, una linea celular de glioblastoma de rata, y PANC-1, una linea celular de adenocarcinoma pancreatico humana. Para cada linea celular, se incubaron monocapas de las celulas con tres
formulaciones diferentes: (1) EtBr libre, (2) gagomeros "vacios" (es decir, solamente regulador de encapsulacion)
suspendidos en una solucion de EtBr libre, y (3) Gagomeros que atrapan EtBr.
En todas las tres formulaciones, se utilizo EtBr a la misma concentracion de 25 pM. Los gagomeros en las
formulaciones (2) y (3) estaban en la misma concentracion, 0,25 mg/mL. Cada formulacion se incubo con las celulas
durante 60 minutos a temperatura ambiente, antes de la realizacion de la microscopia confocal. Los resultados se muestran en la Figura 2 para la linea celular C6 y en las Figuras 3 y 4 para la linea celular PANC-1.
Los resultados para la linea celular C6 se muestran en la Figura 2A. La seccion superior izquierda muestra los resultados de las celulas incubadas con EtBr libre. Esta claro que hay fluorescencia insignificante dentro de las celulas, como se espera para este marcador cuando esta libre en solucion. La seccion superior derecha de la figura 2A es para las celulas incubadas con EtBr libre en una solucion que tenia gagomeros vacios suspendidos en el. Aqui se observa una fluorescencia despreciable, y su similitud con EtBr libre es una indicacion clara de que las propias particulas no promueven la entrada de EtBr libre (no atrapado) en las celulas.
En contraste con estos dos controles, cuando el EtBr esta atrapado dentro de la particula, gana entrada en las celulas y en el nucleolo. Esto es claro a partir de la alta intensidad de fluorescencia de la parte inferior de la figura 2A y de su localizacion dentro de las celulas en el nucleolo (que interactua con el ADN) y tambien en el citosol (que interactua con el ARN). Estos hallazgos no se limitan a una linea celular especifica, ya que se obtuvieron resultados similares tambien con la linea PANC-1.
En la Figura 3 se representan los resultados con las formulaciones (2) y (3) solas. Las diferencias importantes entre EtBr libre y atrapado por gagomero se muestran con mayor detalle en la Figura 4. La Figura 4A muestra una unica celula incubada con EtBr libre. Solo una cantidad despreciable del marcador ha entrado en la celula y alcanzado el nucleolo. Ademas, si hay cualquier EtBr en el citosol esta por debajo del limite de deteccion. Por el contrario, como se muestra en la Figura 4B, cuando se incuba con EtBr atrapado por gagomero, cantidades sustanciales del marcador entran en la celula y se encuentran en el nucleo (unido al ADN) y en el citosol (unido al ARN).
Como todos los datos se obtuvieron usando la misma concentracion de EtBr, parece claro que el atrapamiento dentro del polimero hizo la diferencia. En principio, hay tres mecanismos principales que pueden explicar un portador que facilita la entrada de su marcador sensible al acido nucleico cargado en una celula de tal manera que le permite al marcador intracelular libre interactuar con ARN y tambien lograr la entrada en el nucleolo para interactuar con el ADN:
(1) Adsorcion y difusion. Las particulas cargadas con marcador se adhieren a la membrana celular, creando depositos locales. El marcador se difunde hacia fuera de las particulas adherentes y parte de este marcador liberado se difunde a traves de la membrana celular, dentro de la celula.
(2) Fusion. El portador cargado con marcador se une primero a la membrana celular, despues se fusiona con el y en el 5 curso de la fusion, el material atrapado se libera en el citosol.
(3) Endocitosis y liberacion. El portador cargado con marcador entra a la celula mediante una via endocitica. El portador endocitado tiene exito en la liberacion de marcador en el citosol. En los tres mecanismos, una vez que el marcador esta libre en el citosol, parte de esta combinacion del marcador ahora intracelular encuentra su camino hacia el nucleolo.
El primer mecanismo puede ser eliminado debido a los datos fisicoquimicos que muestran que el flujo de salida del 10 marcador atrapado es bastante lento. Con base en la constante de velocidad de flujo de salida (enumerada anteriormente en forma de semivida), se puede calcular que en el transcurso de los 50 minutos de incubacion antes de la microscopia, el flujo de salida seria como maximo el 2% del marcador atrapado, correspondiente a EtBr 0,5 pM que se libera. Incluso si todo esto fuera a traves de la membrana celular en la celula, el resultado habria sido aun mas despreciable que el observado con la concentracion 50 veces mayor (25 pM versus 0,5 pM) de EtBr libre (Figura 2A). 15 Por el contrario, los resultados con el marcador atrapado en el portador muestran una entrada sustancialmente mas alta, tal como la que no se podria obtener a traves del mecanismo de "adsorcion y difusion".
Independientemente de si el mecanismo de fusion o endocitico del tratamiento de las celulas cancerosas es el medio por el cual el marcador atrapado entra en la celula, esta claro que este portador permite que las moleculas impermeables entren en la celula y en el nucleolo. Esta capacidad es un buen augurio para el desempeno de los 20 gagomeros en el suministro de farmacos.
Ejemplo 7: Estudios de formulacion
Propiedades de las particulas
Calibracion de las particulas: Se calibraron las nano y microparticulas de la relacion de bajo contenido de lipidos con respecto a los glicosaminoglicanos (LLG) y la relacion de alto contenido de lipidos con respecto a los 25 glicosaminoglicanos (HLG) usando un calibrador de particulas ALV-NIBS. Los resultados, enumerados en la Tabla 6, proporcionan datos cuantitativos completos y estan de acuerdo con los datos de microscopia obtenidos previamente (EM, fluorescencia). Los dos tamanos se distinguen bien entre si, y la dispersion relativamente baja dentro de cada sistema indica una buena eficacia del proceso de separacion. Los datos tambien muestran que dentro de cada tipo de particula, hay cierta flexibilidad en el diseno del tamano de particula mediante la manipulacion de la relacion lipido/HA.
30 Tabla 6
Distribucion de tamano de los sistemas DDS tau nano y micro
Especificaciones de particula
Diametro de particula (nm)
Tipo
Relacion lipido/HA
LLG 227 ± 37
Nano
HLG 135 ± 41
LLG 1330 ±225
Micro
HLG 1150 ±178
Potenciales Zeta: Se midieron los potenciales zeta de micro y nanoparticulas, en funcion de la concentracion de particulas. El potencial zeta o electrocinetico representa el potencial a traves de la capa difusa de iones que rodean cualquier particula coloidal cargada, y es en gran parte responsable de la estabilidad coloidal. Los resultados tipicos, 35 mostrados en la Figura 9, demuestran que: (a) como se espera con base en la composicion quimica de las particulas y las caracteristicas estructurales de las particulas, los potenciales zeta son negativos; y (b) los patrones observados para la dependencia del potencial zeta en la concentracion encajan con el patron general observado en el campo para particulas cargadas negativamente.
5
10
15
20
25
30
35
40
Eficiencias de atrapamiento
Se investigaron dos formulaciones: insulina e interferon a, cada uno atrapado en formulaciones separadas en las microparticulas. Las eficiencias de atrapamiento obtenidas se muestran en la Tabla 7. Claramente, ambas proteinas nuevas son atrapadas con alta eficiencia, como se mostro anteriormente para otras macromoleculas (Tablas 4 y 5). La concentracion de insulina fue de 10 mg/mL. En este intervalo esta proteina ya esta agregada en dimeros y hexameros, lo que significa que las entidades atrapadas eran mayores de 6000 Da. No se informaron niveles de encapsulacion tan altos, a este nivel de dosis de insulina, para otros portadores en particulas.
Tabla 7
Eficiencias de encapsulacion de proteinas terapeuticas en las nuevas DDS (microparticulas)
Materia Encapsulada
Intervalo de PM (Da) Eficiencia de Encapsulacion (%)
Insulina (Recombinante humana)
6.000 86,9 ± 4,7
Interferon a (Recombinante humana)
19.000 72,5 ± 3,7
Ejemplo 8: Estudios in vitro
Ensayos de toxicidad en cultivos celulares
El ensayo de toxicidad del DDS libre se realizo de la siguiente manera: se incubaron celulas de una linea dada con concentraciones crecientes del DDS, que abarcan el intervalo de 0,01-5 mg/mL, durante 24 o 48 horas. Las celulas de control no fueron expuestas al DDS. Estos ensayos se realizaron con 8 lineas celulares diferentes, procedentes de humanos, ratas y ratones. La caracteristica comun de las ocho lineas celulares fue que tienen receptores para el acido hialuronico. Los resultados similares a los de la dosis de DDS de 1 mg/mL, como se muestra en la Figura 10, se encontraban en todo el intervalo de concentracion del DDS ensayado (es decir, 0,01-5 mg/mL). Los datos en la Figura 10 demuestran que sobre todas las dosis de DDS, periodos de incubacion y lineas celulares este DDS no es toxico para las celulas.
Transfeccion de genes
La capacidad del DDS para atrapar plasmidos con una afinidad excepcionalmente alta se reporto en las Tablas 4 y 5. El potencial de dicha formulacion para transfectar celulas con un plasmido deseado que daria como resultado la expresion de la proteina codificada se ensayo in vitro.
Las lineas celulares ensayadas fueron PANC-1 y C6, ambas lineas celulares con receptores para acido hialuronico. El gen informador era el que codificaba la proteina fluorescente verde (GFP). El DDS se comparo con dos vectores comercialmente disponibles que sirvieron como "puntos de referenda": Polyplex , un polimero cationico, y lipofectamina, un liposoma cationico. Los protocolos utilizados para los vectores comerciales fueron los recomendados por los fabricantes.
El plasmido fue atrapado en el DDS (microparticulas), y se dejo equilibrar durante 24 horas antes del uso. La concentracion de ADN fue la misma para los tres vectores, 1,5 gg/pozo. Las celulas se incubaron con las formulaciones del ADN del vector seleccionado en DMEM durante 5 horas; los pozos de control se incubaron durante el mismo periodo en DMEM solo. Al cabo de 5 horas, se anadio medio de crecimiento celular suplementado con suero a todos los pozos.
Las celulas se observaron bajo un microscopio fluorescente invertido a las 12 y 24 horas desde el inicio. Se conto el numero total de celulas y el numero de celulas fluorescentes en la muestra observada. Estos datos se usaron para calcular la eficiencia de la transfeccion, definida como el % de celulas fluorescentes de las celulas totales, en la muestra observada. El numero total de celulas en una muestra observada fue de 200-400 celulas. La viabilidad celular se probo al final del experimento, 24 horas desde el inicio.
Los resultados obtenidos se enumeran en la Tabla 8. Las dosis utilizadas para los puntos de referencia fueron 2 mg/mL (como se recomienda en sus protocolos establecidos) y para el DDS se usaron 0,2 mg/mL, una dosis diez veces menor. La concentracion de ADN fue la misma para los tres. A las 12 horas, el producto genico, GFP, se detecto con los vectores establecidos. Este hallazgo, aunque esperado, fue alentador ya que las lineas celulares ensayadas fueron las de interes terapeutico especial, pero no las lineas celulares clasicas (tales como COS 7) utilizadas en la transfeccion. Con el DDS, se requirieron 24 horas para la expresion de la proteina. Las eficiencias de transfeccion para cada uno de
5
10
15
20
25
30
35
40
los tres vectores, en ambas lineas celulares, tambien enumeradas en la tabla, muestran que el rendimiento del vector DDS funciona asi como los puntos de referencia, a una decima parte de la dosis (0,2 mg/mL versus 2 mg/mL).
Tabla 8
Transfeccion genica in vitro
Vector
Tiempo de deteccion (horas) Eficiencia de la transfeccion a las 24 horas (%) Viabilidad celular (% a partir del control no tratado)
Especies
mg/mL PANC-1 C6
Polyfect
2 12 18 20 <50
Lipofectamina
2 12 12 15 <50
DDS
0.2 24 19 19 100
Uno de los inconvenientes graves de vectores de transfeccion genica que son polimeros cationicos o lipidos cationicos es la toxicidad. Esto se observo para los dos vectores establecidos aqui, en cada linea celular, el nivel de celulas viables a las 24 horas era inferior al 50% en comparacion con el control no tratado. Por el contrario, no hubo toxicidad con el vector DDS. La viabilidad celular se mantuvo tan alta como la de las celulas de control. Los datos de toxicidad reportados en la seccion anterior sugieren que las dosis de DDS elevadas con respecto a aquellas de los vectores establecidos, 2 mg/mL, tampoco serian toxicas.
Los datos apoyan claramente la aplicacion potencial del nuevo DDS en terapia genica. Parece haber dos ventajas distintas sobre los vectores no virales competidores: (1) en dos lineas celulares diferentes era tan buena como los vectores establecidos a una concentracion 10 veces menor para lograr el mismo nivel de expresion de la proteina, lo que sugiere que para concentraciones iguales de vectores el sistema DDS puede ser significativamente superior a sus competidores; y (2) en dos lineas celulares diferentes, no se produjo toxicidad con el sistema vectorial DDS, mientras que los otros dos vectores utilizados fueron bastante toxicos.
Tratamiento de tumores MDR
En los estudios de cultivos celulares disenados para evaluar la citotoxicidad de un portador objetivo de atrapamiento de farmacos, en comparacion con la misma dosis de farmaco libre, el diseno experimental, y por lo tanto los resultados, suelen estar sesgados a favor del farmaco libre. Esto se debe a las condiciones estaticas versus dinamicas, respectivamente para las situaciones in vitro e in vivo. In vitro, el farmaco libre esta en contacto continuo con las celulas durante la duracion del experimento, usualmente 24 horas o mas. In vivo, la duracion del farmaco, administrado en forma libre, al sitio del tumor sera mucho mas corta, debido al tiempo limitado de administracion y los procesos de eliminacion naturales. El desempeno in vitro de una formulacion de farmaco/portador (incluso un portador objetivo) puede no ser muy diferente de aquel del farmaco libre, en periodos de incubacion de 24 horas o mas. Por el contrario, in vivo, si el portador se adhiere al objetivo y permanece alli como un deposito de liberacion sostenido, el suministro de farmaco al sitio del tumor puede ser mucho mas alto (dosis y duracion) que el farmaco libre, dando como resultado una citotoxicidad mejorada.
Con el fin de reducir el sesgo in vitro a favor del farmaco libre, se expusieron las celulas a las siguientes formulaciones de tratamiento: farmaco libre, farmaco atrapado en el DDS y DDS libre durante un periodo de solo 4 horas. El medio de tratamiento se reemplazo entonces con medio de cultivo celular suplementado con suero, libre de cualquier farmaco o portador, y se determino el numero de celulas viables 20 horas mas tarde (24 horas desde el inicio). Si una parte de la formulacion portadora se adhiere a las celulas, debe permanecer alli como deposito a pesar del reemplazo del medio y alimentar continuamente las celulas con farmaco, mientras que las celulas que recibieron el farmaco libre no estaran expuestas a ningun farmaco mas, una vez se remplazo el medio.
Los resultados tipicos que muestran el aumento de la muerte celular (en comparacion con el control no tratado) en funcion de la formulacion de tratamiento, se muestran en la Figura 11, para la linea celular C26. Esta es una linea inherente resistente a multiples farmacos (MDR) procedente del carcinoma de colon de raton. En la Figura 11A se muestran los resultados con el farmaco mitomicina C (MMC). Como se esperaba a partir de los estudios previos de toxicidad in vitro (Figura 2), el DDS libre (probado aqui con la dosis de 1 mg/mL) no era toxico. Dos dosis de MMC libre, 30 y 50 pg/mL no fueron eficaces, dando como resultado porcentajes de muerte celular inferiores al 15%. Esta baja respuesta a dosis bastante altas es una manifestacion de la naturaleza de MDR de estas celulas. Por el contrario,
cuando el tratamiento fue con las mismas dosis de farmaco pero atrapado en el DDS, murieron 80-100% de las celulas. Las diferencias en la respuesta para cada dosis de farmaco, mediadas por portador versus libres, son altamente significativas (p <0,001). Resultados similares se muestran en la Figura 11B para otro farmaco, doxorrubicina (DOX). El farmaco libre (cada especie de farmaco tiene un intervalo de dosis diferente) es ineficaz, mientras que las mismas dosis 5 formuladas en el portador fueron altamente efectivas, generando tambien 80 - 100% de muerte celular. Se obtuvieron resultados comparables con otras dos lineas celulares, C6 y PANC-1. Las tres lineas probadas tienen receptores HA.
Ejemplo 9 Estudios in vivo
Estudios in vivo I: Quimioterapia tumoral
Se usaron ratones BALB/c hembra que tenian 8 semanas de edad al inicio del experimento. El modelo de tumor 10 empleado fue celulas C-26 (originarias de carcinoma de colon de raton) inyectadas subcutaneamente en la pata trasera derecha. El farmaco quimioterapeutico fue mitomicina C (MMC) libre, o atrapado en DDS, LLG, en forma de nanoparticulas. La dosis de MMC fue de 2 mg/Kg de peso corporal, tanto en formulaciones libres como en DDS y la dosis de DDS fue de 1 mg/mL.
Diseno experimental para el ensayo 1
15 El experimento se realizo con 20 animales, divididos en 4 grupos, cada grupo de 5 ratones que recibieron un tratamiento especifico como se muestra en la Tabla 9, a continuacion.
Tabla 9
Grupos de animales
Grupo #
Tratamiento
1
Solucion salina
(continuacion)
Grupos de animales
Grupo #
Tratamiento
2
DDS libre
3
MMC libre
4
MMC/DDS
20 Para proporcionar el tumor, se cultivaron celulas C-26 en matraces de cultivo celular. El dia cero, se recogieron las celulas, se lavaron varias veces, se contaron e inmediatamente se inyectaron. La dosis inyectada fue de 8 x 105 celulas en 30 pl.
Los tratamientos se administraron los dias 5, 12 y 19. La administracion se realizo por inyeccion en la vena de la cola. Todos los volumenes inyectados fueron de 0,1 ml.
25 Diseno experimental para el ensayo 2
El diseno experimental fue esencialmente similar al del ensayo 1, con los siguientes cambios:
a. Se elevo la dosis de farmaco hasta 5 mg/ml.
b. La dosis de inoculacion tumoral fue de 8 x 105 celulas en 30 pl.
c. El experimento se realizo con 2 grupos, uno de los cuales recibio DDS libre y el otro MMC / DDS, con 3 y 5 ratones
30 por grupo, respectivamente.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
d. El tratamiento se administro los dias 14, 17, 20 y 23.
e. El tamano del tumor al inicio del tratamiento fue 75 mm3.
Los parametros medidos para el ensayo 1 fueron la retencion en circulacion, el inicio del tumor, el volumen tumoral, la supervivencia. Los parametros medidos para el ensayo 2 fueron supervivencia.
Los resultados para el ensayo 1: Retencion en circulacion
El sistema reticuloendotelial (RES) como parte de sus procesos fisiologicos normales, opera para eliminar rapidamente la materia en particulas foranea de la circulacion. A menos que el objetivo de un vehiculo en particulas administrado en forma intravenosa (i.v.) este dentro del RES, esta eliminacion es un problema importante para todos los vehiculos en particulas administrados en forma i.v., ya que reduce la probabilidad de que una dosis suficiente alcance su objetivo pretendido de una manera eficaz. Este problema no es especifico para el tratamiento de tumores. Es general para cualquier situacion patologica que requiera administracion i.v..
A traves de estudios extensos, de los medios para bloquear este proceso, permitiendo por lo tanto la circulacion a largo plazo de material en particulas, se resumen en la siguiente combinacion: la particula debe ser pequena y debe tener una capa hidrofilica, usualmente debido a una abundancia de residuos de hidroxilo. Los portadores de particulas del tipo esfera, elaborados a escala nanometrica (nanoesferas), estan recubiertos generalmente por polimeros tales como poloxomar o poloxamina. Liposomas pequenos usualmente portan polietilenglicol (PEG) en su superficie, y vienen bajo nombres tales como "liposomas ocultos", "liposomas PEGilados" y "liposomas estabilizados estericamente".
Tras comenzar la invencion y el desarrollo del presente DDS, se planteo la hipotesis de que debido a que el acido hialuronico es su componente principal, la superficie de la particula sera rica en residuos de hidroxilo que le proporcionaran una capacidad intrinseca de retencion prolongada en circulacion y con capacidad de direccionamiento. Estas serian ventajas distintas sobre los portadoras competitivos, ya que tanto las propiedades de direccionamiento como las "ocultas" ya estan incorporadas.
En periodos seleccionados despues de la inyeccion, los animales que recibieron las formulaciones que contenian farmacos fueron sangrados y las muestras se trataron de acuerdo con los protocolos establecidos. La concentracion de MMC se determino por ensayo de HPLC. Los resultados tipicos de la retencion en circulacion, comparando MMC libre con MMC atrapado en el portador (MMC/DDS) se muestran en la Figura 12. Los datos muestran que la MMC libre desaparece muy rapidamente de circulacion, mientras que la MMC administrada en el portador circula durante un periodo mucho mas largo de tiempo. Este hallazgo se reprodujo de una inyeccion a otra, y el farmaco se encontro en circulacion cuando se administra a traves del portador hasta 72 horas despues de la inyeccion. La rapida desaparicion del farmaco libre indica que la MMC encontrada en la circulacion de los animales que recibieron la formulacion MMC/DDS esta en el portador. Estos resultados confirman la hipotesis, discutida anteriormente, que estos DDS tienen capacidad intrinseca de "ocultamiento". Como se indico anteriormente, esto tiene implicaciones positivas mas alla de la patologia especifica probada aqui.
Los resultados para el ensayo 1: Inicio del tumor y volumen tumoral
Los resultados del aumento del volumen tumoral, para los 4 grupos, se muestran en la Figura 13, junto con el dia normal en el que se detectaron los tumores por primera vez. En todos los animales que recibieron solamente solucion salina, se detecto un tumor el dia 7 y aumento rapida y exponencialmente. El tumor se detecto el dia 7 en todos los animales que recibieron farmaco libre tambien. El aumento en el volumen tumoral, a pesar de recibir 3 dosis de un farmaco quimioterapeutico, no fue muy diferente al del grupo con solucion salina. Esto indica que la naturaleza de la MDR de esta linea celular previamente observada in vitro (Figura 3) tambien persiste in vivo. Sorprendentemente, el tratamiento con DDS libre fue mejor que la solucion salina y el farmaco libre. El dia normal de aparicion del tumor fue el dia 9 (versus 7), y la velocidad de crecimiento tumoral fue claramente mas lenta. Los tumores tambien fueron significativamente mas pequenos comparados con los grupos de solucion salina y farmaco libre.
El desempeno del DDS libre in vivo es muy diferente del observado in vitro. El acido hialuronico es uno de los componentes clave de la matriz extracelular (ECM) y se sabe que las celulas tumorales que tienen receptores para HA hacen uso de esto. A traves de la interaccion de sus receptores de HA con el HA en la ECM, las celulas tumorales pueden utilizar la ECM como plataforma en el transcurso del avance del tumor. El bloqueo de los receptores puede, por lo tanto, retrasar el avance del tumor. Esto podria ser un importante mecanismo responsable de los resultados obtenidos con DDS libre, donde el portador se une a los receptores de HA y es capaz de bloquearlos. Otros mecanismos potenciales, no mutuamente excluyentes, son el desempeno del DDS libre como un factor antiangiogenico o como un refuerzo general para los mecanismos de defensa del huesped. Se hara seguimiento a los mecanismos responsables de este efecto positivo del DDS mismo con el fin de comprender estos fenomenos y aprender a explotarlos para obtener mejores resultados terapeuticos. Independientemente de sus origenes, esta es una ventaja adicional positiva de este DDS, que no se anticipo sobre la base de los datos in vitro.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Los mejores resultados se obtuvieron con el farmaco atrapado en el portador. Como se observa en la Figura 13, el tumor se detecto por primera vez alrededor del dia 17, mucho mas tarde que en los grupos tratados con DDS libre, farmaco libre o solucion salina. La tasa de crecimiento tumoral fue mas lenta y los tumores fueron mas pequenos, de todos los grupos evaluados. Tal vez esto se debe al direccionamiento intrinseco de este DDS en donde la fraccion que alcanzo el tumor permanecio alli, actuando como deposito de farmacos y posiblemente combinando el efecto de citotoxicidad del farmaco y el efecto portador observado con el DDS libre. Los resultados in vitro que mostraron que esta formulacion, a diferencia del farmaco libre, era capaz de matar celulas MDR, se repitieron y se confirmaron tambien en el caso in vivo.
Resultados del Ensayo 1: Supervivencia
Se hizo seguimiento a la supervivencia de los animales durante mas de 90 dias hasta que murio el ultimo animal. Los resultados se muestran en la Figura 14.
Todos los animales de los grupos que recibieron solucion salina murieron entre los dias 29 y 31 y los que recibieron farmaco libre murieron entre los dias 31 y 33. Los animales que recibieron el DDS libre sobrevivieron dos veces mas que los grupos de solucion salina y farmaco libre, que murieron entre los dias 59 y 66.
Esta larga supervivencia tiene dos implicaciones criticas. La primera es que este DDS no toxicidad in vivo como se mostro previamente in vitro. El peso de la evidencia in vivo es mucho mas significativo en sus implicaciones para todas las aplicaciones de esta tecnologia. La segunda implicacion es que, al mismo tiempo que el efecto sobre el desarrollo y el tamano del tumor (Figura 13), el portador libre por si mismo tiene un efecto terapeutico beneficioso en los animales portadores de tumores.
La supervivencia mas larga, 3 veces mas larga que para los grupos con solucion salina y farmaco libre, fue observada para los animales que recibieron el tratamiento completo, el farmaco atrapado en el DDS. El ultimo animal murio el dia 94. Esta es una supervivencia excepcionalmente larga para ratones con tumores, especialmente en un caso de MDR, e indica la superioridad de esta tecnologia de suministro de farmacos en comparacion con sus competidores.
Resultados del Ensayo 2: Supervivencia
Aun se continuo haciendo seguimiento a la supervivencia de los animales el dia 91 del experimento, y los resultados se muestran en la Figura 15. Los tres animales portadores de tumores tratados con el DDS libre fueron los de mayor supervivencia, hasta 69 dias. Los cinco animales portadores de tumores tratados con la formulacion MMC/DDS obtuvieron mejores resultados, ya que a los 91 dias despues de la inoculacion del tumor todos los animales estaban vivos.
La tendencia de estos datos es similar a la obtenida en el ensayo 1, mostrando que las respuestas excepcionales al nuevo DDS son reproducibles. Hubo dos grandes diferencias entre los dos experimentos. En primer lugar, en el ensayo 2 el tratamiento se inicio despues de que el tumor se desarrollo (vease el diseno experimental anterior), lo que lo convierte en una situacion terapeutica mas desafiante en comparacion con el ensayo 1. En segundo lugar, en el ensayo 2 los animales recibieron una dosis de farmaco acumulativa mas alta. Hubo 4 inyecciones (frente a 3 en el ensayo 1) y la dosis fue 2,5 veces mayor (5 frente a 2 mg/mL).
La tendencia positiva que estas diferencias inducen indica un potencial para generar respuestas aun mejores con el nuevo DDS. Los modelos mas desafiantes, pero tambien mas realistas, en los que el tumor crece hasta el intervalo de tamano de 100-150 mm3, antes de iniciar el tratamiento pueden ser susceptibles al nuevo enfoque DDS.
Ejemplo 10: Estudios in vivo II: Suministro intranasal al cerebro
El tratamiento de enfermedades neurodegenerativas requiere la administracion de farmacos al cerebro, ya sea cruzando un BBB intacto u omitiendolo. Se llevaron a cabo dos experimentos, uno en ratas y el otro en ratones, para evaluar la capacidad del nuevo DDS de la presente invencion para administrar farmacos al cerebro, evitando el BBB a traves de administracion intranasal (IN).
El experimento 1 comprendia un experimento con ratas. Se utilizaron ratas pigmentadas sanas. El DDS fue LLG, en forma de nano particulas y el marcador fue MMC. El sistema de ensayo fue el marcador formulado en el nuevo DDS. La dosis administrada fue de 5 mg/kg de peso corporal, en formulaciones libres y DDS, 300 pL/animal. La dosis de DDS fue de 1 mg/mL.
El experimento se llevo a cabo con 4 animales, divididos en dos pares. Un par recibio el marcador libre, en forma intranasal (IN), en la fosa nasal derecha. El otro par recibio la formulacion de marcador/DDS, IN, en la fosa nasal derecha. La administracion fue lenta, durante varios minutos, utilizando una jeringa adecuada sin aguja.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
A las 6 horas despues de la administracion, se sacrificaron los animales y se retiraron los cerebros. Cada cerebro se embebio en 10 ml de PBS durante una hora, para desorber ligeramente el marcador adherido, despues de lo cual se homogenizaron los cerebros. El marcador se ensayo en el lavado y en los homogeneizados de cerebro, usando un ensayo de HPLC.
Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 16, en donde la acumulacion de marcadores se presenta como % de la dosis administrada. Aunque solo habia 2 animales por grupo de tratamiento, el acuerdo dentro de cada grupo era lo suficientemente bueno para permitir el promedio. El promedio y la desviacion estandar para cada par, en el lavado y en el homogeneizado de cerebro, se enumeran por encima de las barras pertinentes.
Centrandose en el homogeneizado cerebral, la acumulacion de marcador en el cerebro cuando se administro en forma libre fue despreciable, en el orden usualmente observado con moleculas pequenas libres, como era de esperarse. Por el contrario, cuando se administro en la forma de DDS, hubo una acumulacion sustancial del marcador en el cerebro, cercana al 10% de la dosis administrada. Este es un valor elevado por si mismo (80 veces mas alto que el farmaco libre), especialmente si esto tambien se puede lograr con farmacos de interes. Estos resultados indican el alto potencial que esta nuevo DDS tiene para las condiciones patologicas que requieren la administracion de farmacos al cerebro.
El experimento 2 comprendia un experimento con ratones. Los animales utilizados fueron ratones C57BL/6 sanos. El DDS era LLG en forma de nanoparticulas. El marcador era MMC; el sistema de ensayo era el marcador formulado en el nuevo DDS. La dosis administrada fue de 5 mg/kg de peso corporal, tanto en formulaciones libres como en DDS, 150 pL/animal. La dosis de DDS fue de 1 mg/mL.
El experimento se llevo a cabo con 4 animales, divididos en dos pares. Un par recibio el marcador libre, IN, en la fosa nasal derecha. El otro par recibio la formulacion marcador/DDS, IN, en la fosa nasal derecha. La administracion fue lenta, durante varios minutos, usando una jeringa apropiada.
A las 6 horas despues de la administracion, los animales se perfundieron a traves del corazon, despues de lo cual fueron sacrificados. Se retiraron los cerebros, se homogeneizaron y se determino la concentracion del marcador, como en el ensayo 1.
Los cerebros, despues de la perfusion, estaban limpios. Los resultados obtenidos, expresados como % de la dosis administrada, se muestran en la Figura 17. Los datos se reportan por animal debido a la variabilidad de un animal a otro. A pesar de la variabilidad, los resultados son bastante claros: se produjo una acumulacion insignificante de marcador cuando se administro en forma libre y una acumulacion significativa cuando se administro en la forma de DDS. Como en el caso de las ratas, la acumulacion encontrada cuando el marcador se administro en el portador constituye un hallazgo positivo en y por si mismo y es 600 - 2.500 veces mayor que cuando el marcador se administro en forma libre. Estos resultados muestran que el potencial de esta tecnologia de suministro de farmacos para administrar farmacos al cerebro en una forma de administracion no invasiva no se limita a una unica especie animal.
Ejemplo 11: Estudio en animales que prueba al nuevo DDS en el tratamiento de tumores resistentes a farmacos en ratones: Un modelo de metastasis tumoral
El objetivo en el presente estudio fue evaluar el nuevo DDS en un modelo de metastasis tumoral. Similar al estudio anterior usando ratones y la linea celular C-26 MDR inherente, este estudio tambien implica una linea celular MDR inherente, B16F10, de melanoma de raton. El protocolo especifico implementado se establece en el campo y esta disenado para inducir metastasis en los pulmones.
Se usaron ratones hembra C57BL/6, que tenian 12 semanas de edad al inicio del experimento. El modelo de tumor fue B16F10, celulas inyectadas en forma i.v. El farmaco quimioterapeutico empleado fue mitomicina C (MMC). El sistema DDS era LLG en forma de nanoparticulas. El sistema de ensayo se formulo con MMC en el nuevo DDS de la presente invencion, denominado MMC/dDs. La dosis de MMC inyectada fue de 5 mg/Kg de peso corporal y la dosis de DDS fue de 1 mg/mL.
El experimento se realizo con 25 animales, divididos en 5 grupos, cada grupo de 5 ratones que recibieron un tratamiento especifico como se muestra en la Tabla 10. El Grupo 1 es un grupo de control de ratones sanos que no fueron inoculados con celulas tumorales.
Tabla 10
Grupos de animales
Grupo #
1 3 4 5
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Tratamiento
Ninguno Solucion salina MMC libre DDS libre MMC/DDS
Se cultivaron celulas B16F10 en matraces de cultivo celular. El dia cero, se recogieron las celulas, se lavaron varias veces, se contaron e inmediatamente se inyectaron a los grupos 2 a 5. La dosis inyectada fue de 5 x 105 celulas en 50 pl de PBS.
Los tratamientos se administraron los dias 1, 5 y 9. La administracion se realizo mediante inyeccion en la vena de la cola. Todos los volumenes inyectados fueron de 0,1 mL. El experimento se termino 21 dias despues de la inoculacion del tumor. Los animales fueron sacrificados y los pulmones fueron extraidos, pesados y fijados en solucion de Bouin. Se calculo el aumento de peso de los pulmones usando la siguiente formula:
Aumento de peso del pulmon% = 100 x (peso del pulmon con tumor - peso del pulmon normal)/peso del pulmon normal
La metastasis superficial fue contada por un experto utilizando un microscopio de diseccion. Los codigos de muestra no eran conocidos de tal manera que el experto no conociera el tratamiento recibido por cada animal.
La evaluacion cuantitativa de metastasis en los pulmones puede realizarse mediante dos mediciones independientes: el recuento real de la metastasis en los pulmones extirpados y correctamente fijados; y/o la medicion del aumento en el peso de los pulmones debido a la metastasis en los animales inyectados con celulas tumorales. Ambas tecnicas fueron implementadas en el presente estudio.
El numero de metastasis encontrado en los grupos 1 a 5 se muestra en la Figura 18.
Como era de esperar, no hubo metastasis en los pulmones de los animales de control que no recibieron ninguna celula tumoral. Todos los demas grupos que recibieron las celulas B16F10 inyectadas en forma i.v. desarrollaron metastasis pulmonar. La situacion metastasica mas agresiva se desarrollo en los animales que recibieron solucion salina o farmaco libre. Como puede verse, no existe diferencia estadistica entre estos grupos, lo que indica que la naturaleza inherente de MDR de estas celulas se expresa tambien in vivo.
Se observa que el tratamiento con el DDS libre genera una disminucion de 6 veces en el numero de metastasis en comparacion con la solucion salina, y el tratamiento con la formulacion de ensayo genero una reduccion mucho mayor, del orden de 17 veces.
En los cuatro grupos inyectados con tumores, el peso de los pulmones aumento en comparacion con el de los animales normales (el grupo de control). Los resultados obtenidos se muestran en la Figura 19.
El mayor incremento en el peso de los pulmones, cerca del 400%, se observo en los animales que no recibieron ningun tratamiento (el grupo salino), y el grupo que recibio tratamiento con farmaco libre fue casi el mismo. El aumento en el peso del pulmon fue menor que sin tratamiento y con farmaco libre para los animales que recibieron el DDS libre, pero hubo un doble aumento en el peso de los pulmones en comparacion con el grupo de control de animales sanos. La mejor respuesta, tanto en terminos relativos (en comparacion con los otros grupos) como en terminos absolutos (en comparacion con animales sanos), se observo con la formulacion de ensayo de la MMC atrapada en el DDS. El aumento porcentual en comparacion con los animales sanos fue del orden del 10%, lo cual no es estadisticamente significativo, lo que indica el potencial de esta formulacion para abolir la metastasis pulmonar.
Debido a que las metastasis pulmonares son responsables del aumento del peso del pulmon, debe haber una correlacion razonable entre los dos parametros medidos independientemente. Este fue el caso, como se observa claramente en la Figura 20, donde los datos (promedios solamente) de las Figuras 18 y 19 fueron graficados nuevamente juntos. La Figura 20 tambien demuestra el desempeno claramente superior de la formulacion de prueba en una de las tareas mas desafiantes del tratamiento de tumores, que consiste en suprimir las metastasis de un tumor MDR.
Hasta la fecha, se ha estudiado el comportamiento del nuevo DDS como portador para farmacos quimioterapeuticos en dos modelos animales independientes. Uno es un tumor solido y el otro es metastasis pulmonar. En ambos modelos, se encontro que las celulas tumorales inyectadas en los animales, de las lineas celulares C-26 y B16F10, se manifiestan en la naturaleza de la MDR in vivo que fue previamente observada in vitro.
En ambos modelos, el tratamiento con el DDS libre mismo muestra una mejor respuesta clinica que el farmaco libre. Sin embargo, en ambos modelos la mejor respuesta clinica se observa con la formulacion de ensayo del nuevo DDS que atrapa un farmaco quimioterapeutico. Esto indica el alto potencial para este nuevo sistema en uso clinico.
Ejemplo 12: Entrada de BSA-FITC en celulas MCF-7
Se utilizo albumina de suero bovino marcada con el marcador fluorescente FITC (BSA-FITC) en forma libre y atrapada en el DDS para determinar si el DDS tambien puede inducir la entrada de macromoleculas grandes en las celulas. Se incubo la BSA-FITC atrapada en DDS y libre a 250C durante 60 minutos con monocapas confluentes de celulas MCF7 5 (originarias de carcinoma de mama humano). Se ha reportado que las celulas MCF-7 tienen dos receptores conocidos para el acido hialuronico, ICAM-1 y CD44. Los sistemas de proteina/DDS se limpiaron de la proteina libre. La proteina libre y la proteina atrapada estaban a la misma concentracion: 3,3 mg/mL. Al final de la incubacion se observaron las celulas por medio de microscopia confocal.
Los resultados mostrados en los dos paneles superiores de la Figura 21, son para proteina libre. Algunas de las 10 proteinas ganaron entrada en la celula, e incluso puede observarse unidas a la envoltura nuclear, pero no dentro del nucleo. Se sabe que la BSA se une no especificamente a las celulas y puede haber ganado entrada a traves de receptores no especificos o a traves de pinocitosis.
Los resultados en los dos paneles inferiores de la Figura 21 son para el BSA-FITC atrapado en DDS. La entrada de proteinas en las celulas es considerablemente mayor que para la proteina libre, y la proteina tambien ha ganado la 15 entrada en el nucleo. Como en el caso del EtBr atrapado (Figuras 2-4), el mecanismo exacto por el cual esto ocurrio aun no se entiende completamente. Sin embargo, la probabilidad de que el DDS con proteina sea absorbida por la endocitosis mediada por el receptor es aun mayor para la proteina grande que para el EtBr pequeno.
La descripcion anterior de las realizaciones especificas revelara tan completamente la naturaleza general de la invencion que otros pueden, mediante la aplicacion del conocimiento actual, modificar facilmente y/o adaptar para 20 diversas aplicaciones tales realizaciones especificas sin apartarse del concepto generico y, por lo tanto, tales adopciones y modificaciones deben y estan destinadas a estar comprendidas dentro del significado e intervalo de equivalentes de las realizaciones divulgadas. Debe entenderse que la fraseologia o terminologia empleada aqui tiene el proposito de descripcion y no de limitacion.
Referencias
25 Balazs y colaboradores, "Cross-linked gels of hyaluronic acid and products containing such gels", patente estadounidense No. 4.582.865, promulgada el 15 de abril de 1986.
Bangham AD, "Liposomes: the Babraham connection", Chem Phys Lipids 64(1-3): 275-285 (1993).
Benita y colaboradores, "Submicron emulsions as colloidal drug carriers for intravenous administration: comprehensive physicochemical characterization", J Pharm Sci 82(11): 1069-1079 (1993).
30 Gottesman y colaboradores, "Genetic analysis of the multidrug transporter", Annu Rev Genet 29: 607-649 (1995).
Gref y colaboradores, "Biodegradable long-circulating polymeric nanospheres", Science 263(5153): 1600-1603 (1994).
Larsen y colaboradores, "Resistance mechanisms associated with altered intracellular distribution of anticancer agents", Pharmacol Ther 85(3): 217-29 (2000).
Margalit y colaboradores, J Controlled Release 17: 285-296 (1991).
35 Nutt y colaboradores, "Differential expression of drug resistance genes and chemosensitivity in glial cell lineages correlate with differential response of oligodendrogliomas and astrocytomas to chemotherapy", Cancer Res 60(17): 4812-4818 (2000).
Van den Hoogen y colaboradores, "A microtiter plate assay for the determination of uronic acids", Anal Biochem 257(2): 107-111 (1998).
40 Wolff y colaboradores, "Chemosensitivity of glioma cells in vitro: a meta analysis", J Cancer Res Clin Oncol 125(8-9): 481-486 (1999).
Wu y colaboradores, "In vivo versus in vitro degradation of controlled release polymers for intracranial surgical therapy" J Biomed Mater Res 28(3): 387-395 (1994).

Claims (13)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    REIVINDICACIONES
    1. Portador de glicosaminoglicano lipidado en particulas en forma de una esfera con la porcion de glicosaminoglicano de la particula formando una cubierta en el exterior y la porcion lipidica del portador formando el interior, no siendo dicho portador un liposoma, comprendiendo dicho portador al producto de reaccion de al menos un glicosaminoglicano con fosfatidiletanolamina, en donde la relacion de la fosfatidiletanolamina con respecto a al menos un glicosaminoglicano esta en el intervalo de 1:1 p/p o en el intervalo de 5:1 a 20:1 p/p, y en donde el glicosaminoglicano es acido hialuronico que tiene un peso molecular de aproximadamente 1 x 105 hasta aproximadamente 1 x 107 daltons.
  2. 2. Portador de glicosaminoglicano lipidado en particulas de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el tamano de particula esta en el intervalo de aproximadamente 2-5 micrones o de aproximadamente 50-200 nanometros.
  3. 3. Portador de glicosaminoglicano lipidado en particulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde un ingrediente activo esta encapsulado dentro del portador, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en agentes antiinfecciosos, agentes quimioterapeuticos, proteinas, hormonas, enzimas, celulas y acidos nucleicos, lo mas preferiblemente un acido nucleico o un agente quimioterapeutico para tratamiento de cancer.
  4. 4. Metodo para preparar al portador de glicosaminoglicano lipidado en particulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende la reaccion de al menos un glicosaminoglicano con fosfatidiletanolamina para entrecruzar un residuo carboxilico del glicosaminoglicano con el grupo amino primario de la fosfatidiletanolamina.
  5. 5. Procedimiento para elaborar al portador de glicosaminoglicano lipidado en particulas de acuerdo con la reivindicacion 3, que comprende las etapas de: proporcionar el portador de glicosaminoglicano lipidado en particulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, liofilizar el portador de glicosaminoglicano, reconstituir el portador de glicosaminoglicano liofilizado en agua y anadir un ingrediente activo en polvo, por lo que el ingrediente activo queda atrapado dentro del portador de glicosaminoglicano lipidado.
  6. 6. Uso de un portador de glicosaminoglicano lipidado en particulas libre de farmaco de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 en la preparacion de un medicamento contra el cancer.
  7. 7. Uso de un agente bioactivo encapsulado en un portador de glicosaminoglicano lipidado en particulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 en la preparacion de un medicamento contra una condicion patologica, en donde la condicion patologica se selecciona del grupo que consiste en cancer, infecciones bacterianas, Infecciones fungicas, infecciones virales, infecciones parasitarias e infecciones por priones.
  8. 8. Uso de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7, en donde la condicion patologica es cancer y, si esta presente, dicho agente bioactivo es un farmaco contra el cancer.
  9. 9. Uso de acuerdo con la reivindicacion 7 u 8, en donde dicho cancer es un cancer del sistema nervioso central de un animal, en particular un glioma o un cancer metastasico.
  10. 10. Portador de glicosaminoglicano lipidado en particulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que encapsula un marcador utilizado en formacion de imagenes, siendo preferiblemente el marcador una molecula fluorescente o un isotopo radiactivo, elegido preferiblemente del grupo que consiste en 99Tc, 127I , y 67Gd.
  11. 11. Uso de un portador de glicosaminoglicano lipidado en particulas de acuerdo con la reivindicacion 10 para la preparacion de un agente de diagnostico adecuado para ser administrado a un paciente que requiera del mismo.
  12. 12. Uso de un portador de glicosaminoglicano lipidado en particulas de acuerdo con la reivindicacion 3, en donde los acidos nucleicos se encapsulan para la preparacion de un medicamento para suministro genico y expresion de corto plazo de acidos nucleicos.
  13. 13. Andamiaje para modificacion genetica de tejidos, que comprende al portador de glicosaminoglicano lipidado en particulas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 que encapsula celulas enteras y/o lineas celulares.
ES02761287.8T 2001-08-14 2002-08-09 Partículas lipidadas de glicosaminoglicano y su uso en el suministro de fármacos y genes para diagnóstico y terapia Expired - Lifetime ES2607802T3 (es)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US31184901P 2001-08-14 2001-08-14
US311849P 2001-08-14
US37974102P 2002-05-14 2002-05-14
US379741P 2002-05-14
PCT/US2002/025178 WO2003015755A1 (en) 2001-08-14 2002-08-09 Lipidated glycosaminoglycan particles and their use in drug and gene delivery for diagnosis and therapy

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2607802T3 true ES2607802T3 (es) 2017-04-04

Family

ID=26978107

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES02761287.8T Expired - Lifetime ES2607802T3 (es) 2001-08-14 2002-08-09 Partículas lipidadas de glicosaminoglicano y su uso en el suministro de fármacos y genes para diagnóstico y terapia

Country Status (9)

Country Link
US (4) US7544374B2 (es)
EP (1) EP1423095B1 (es)
JP (1) JP4537057B2 (es)
KR (1) KR20040037062A (es)
CN (1) CN100542612C (es)
CA (1) CA2456966A1 (es)
ES (1) ES2607802T3 (es)
IL (1) IL160205A0 (es)
WO (1) WO2003015755A1 (es)

Families Citing this family (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1776092B1 (en) 2004-07-13 2014-06-25 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. Lipidated glycoprotein particles and methods of use
AU2005277547B2 (en) 2004-08-16 2011-08-25 Immune Disease Institute, Inc. Method of delivering RNA interference and uses thereof
CA2585754C (en) 2004-11-02 2014-12-23 Tel-Aviv University Future Technology Development L.P. Formulations of water insoluble or poorly water soluble drugs in lipidated glycosaminoglycan particles and their use for diagnostics and therapy
CA2606195C (en) 2005-05-02 2015-03-31 Merck And Co., Inc. Hcv ns3 protease inhibitors
TWI387603B (zh) 2005-07-20 2013-03-01 Merck Sharp & Dohme Ｈｃｖ ｎｓ３蛋白酶抑制劑
US8278322B2 (en) 2005-08-01 2012-10-02 Merck Sharp & Dohme Corp. HCV NS3 protease inhibitors
WO2007127272A2 (en) * 2006-04-24 2007-11-08 The Cbr Institute For Biomedical Research Method of producing immunoliposomes and compositions thereof
GB0609492D0 (en) 2006-05-15 2006-06-21 Angeletti P Ist Richerche Bio Therapeutic agents
GB0612423D0 (en) 2006-06-23 2006-08-02 Angeletti P Ist Richerche Bio Therapeutic agents
CN101583372A (zh) 2006-10-24 2009-11-18 默克公司 Hcv ns3蛋白酶抑制剂
CA2667165A1 (en) 2006-10-24 2008-05-02 Merck & Co., Inc. Hcv ns3 protease inhibitors
AU2007309544B2 (en) 2006-10-24 2012-05-31 Msd Italia S.R.L. HCV NS3 protease inhibitors
JP5352464B2 (ja) 2006-10-27 2013-11-27 メルク・シャープ・アンド・ドーム・コーポレーション Ｈｃｖｎｓ３プロテアーゼ阻害剤
KR101615500B1 (ko) 2006-10-27 2016-04-27 머크 샤프 앤드 돔 코포레이션 Ｈｃｖ ｎｓ3 프로테아제 억제제
CA2672250C (en) 2006-12-20 2013-04-30 Ian Stansfield Antiviral indoles
GB0625349D0 (en) 2006-12-20 2007-01-31 Angeletti P Ist Richerche Bio Therapeutic compounds
GB0625345D0 (en) 2006-12-20 2007-01-31 Angeletti P Ist Richerche Bio Therapeutic compounds
CN101754970B (zh) 2007-07-17 2013-07-10 P.安杰莱蒂分子生物学研究所 用于治疗丙型肝炎的大环吲哚衍生物
CA2699891C (en) 2007-07-19 2013-10-22 Nigel Liverton Macrocyclic compounds as antiviral agents
EP2259775B1 (en) 2008-02-27 2015-07-22 Ramot at Tel-Aviv University Ltd. System for delivery of protein in insoluble fibrillar form
JP2011518882A (ja) 2008-04-28 2011-06-30 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション Ｈｃｖｎｓ３プロテアーゼ阻害剤
DK2310095T3 (da) 2008-07-22 2012-12-10 Merck Sharp & Dohme Makrocykliske quinoxalinforbindelser som hcv-ns3-protease-inhibitorer
US8207341B2 (en) * 2008-09-04 2012-06-26 Bristol-Myers Squibb Company Process or synthesizing substituted isoquinolines
CN102378766A (zh) 2009-03-23 2012-03-14 夸克医药公司 治疗癌症和纤维化疾病的化合物组合物和方法
GB0913442D0 (en) 2009-07-31 2009-09-16 Univ Ramot Cell-targeting nanoparticles comprising polynucleotide agents and uses thereof
KR100976850B1 (ko) * 2009-10-22 2010-08-20 (주)바이오제닉스 세라미드 히아루론산 복합체 및 이의 제조방법
CA2703532C (en) * 2010-05-10 2018-05-01 Eva Turley Topically administered, skin-penetrating glycosaminoglycan formulations suitable for use in cosmetic and pharmaceutical applications
US10758630B2 (en) 2010-08-13 2020-09-01 The Johns Hopkins University Topical compositions and methods of detection and treatment
WO2012039979A2 (en) * 2010-09-10 2012-03-29 The Johns Hopkins University Rapid diffusion of large polymeric nanoparticles in the mammalian brain
WO2012075337A2 (en) 2010-12-01 2012-06-07 Spinal Modulation, Inc. Directed delivery of agents to neural anatomy
US8455436B2 (en) 2010-12-28 2013-06-04 Depuy Mitek, Llc Compositions and methods for treating joints
US8398611B2 (en) 2010-12-28 2013-03-19 Depuy Mitek, Inc. Compositions and methods for treating joints
US8524662B2 (en) 2010-12-28 2013-09-03 Depuy Mitek, Llc Compositions and methods for treating joints
US8623839B2 (en) 2011-06-30 2014-01-07 Depuy Mitek, Llc Compositions and methods for stabilized polysaccharide formulations
WO2013018091A1 (en) * 2011-08-04 2013-02-07 Ramot At Tel-Aviv Universitiy Ltd. Particles for the treatment of neurodegenerative diseases
WO2013134777A1 (en) * 2012-03-09 2013-09-12 Northeastern University Methods for delivery to the central nervous system of nucleic acid nanoparticles to treat central nervous system disorders
JP2015514746A (ja) * 2012-04-18 2015-05-21 ラモット アット テル アビブ ユニバーシティ， リミテッド 核酸を送達するための脂質化グリコサミノグリカン粒子
EP3838293A1 (en) 2012-07-11 2021-06-23 Tissuetech, Inc. Compositions containing hc-ha/ptx3 complexes and methods of use thereof
GB201306980D0 (en) * 2013-04-17 2013-05-29 Blueberry Therapeutics Ltd Methods
CA3002989C (en) 2013-10-14 2021-03-16 Nanosphere Health Sciences, Llc Nanoparticle compositions and methods as carriers of nutraceutical factors across cell membranes and biological barriers
US10583084B2 (en) 2014-06-26 2020-03-10 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Liposomal formulations for delivery of nucleic acids
WO2016100228A2 (en) * 2014-12-15 2016-06-23 Nanosphere Health Sciences, Llc Methods of treating inflammatory disorders and global inflammation with compositions comprising phospholipid nanoparticle encapsulations of nsaids
US9682099B2 (en) 2015-01-20 2017-06-20 DePuy Synthes Products, Inc. Compositions and methods for treating joints
CA2979184C (en) 2015-03-10 2020-09-08 Nanosphere Health Sciences, Llc Lipid nanoparticle compositions and methods as carriers of cannabinoids in standardized precision-metered dosage forms
FR3039065A1 (fr) * 2015-07-20 2017-01-27 Yvon Cayre Produit pour lutter contre la proliferation de cellules cancereuses
CN117695226A (zh) 2018-12-11 2024-03-15 迪斯拉普申实验室公司 用于递送治疗剂的组合物及其使用方法和制备方法
WO2021173069A1 (en) * 2020-02-28 2021-09-02 Uppsala Therapeutics Ab Nanoparticles for use in the treatment and diagnosis of cns disorders

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4235871A (en) * 1978-02-24 1980-11-25 Papahadjopoulos Demetrios P Method of encapsulating biologically active materials in lipid vesicles
US4880635B1 (en) * 1984-08-08 1996-07-02 Liposome Company Dehydrated liposomes
US4898735A (en) * 1985-12-06 1990-02-06 Yissum Research And Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Liposome/doxorubicin composition and method
JPS63182029A (ja) * 1987-01-22 1988-07-27 Agency Of Ind Science & Technol リポソ−ム
US4927637A (en) * 1989-01-17 1990-05-22 Liposome Technology, Inc. Liposome extrusion method
CA1340994C (en) 1989-09-21 2000-05-16 Rudolf Edgar Dr. Falk Treatment of conditions and disease
US5143713A (en) * 1990-05-30 1992-09-01 Board Of Regents, The University Of Texas System 99m Tc labeled liposomes
US5733892A (en) 1990-07-24 1998-03-31 Seikagaku Corporation Metastasis inhibitor composition comprising a phospholipid-linked glycosaminoglycan and method for inhibiting metastasis employing the same
JP2997018B2 (ja) * 1990-07-24 2000-01-11 生化学工業株式会社 燐脂質又は脂質結合グリコサミノグリカン
US5824658A (en) 1990-09-18 1998-10-20 Hyal Pharmaceutical Corporation Topical composition containing hyaluronic acid and NSAIDS
US5990096A (en) 1990-09-18 1999-11-23 Hyal Pharmaceutical Corporation Formulations containing hyaluronic acid
US5639738A (en) 1992-02-20 1997-06-17 Hyal Pharmaceutical Corporation Treatment of basal cell carcinoma and actinic keratosis employing hyaluronic acid and NSAIDs
CA2061703C (en) 1992-02-20 2002-07-02 Rudolf E. Falk Formulations containing hyaluronic acid
US5910489A (en) 1990-09-18 1999-06-08 Hyal Pharmaceutical Corporation Topical composition containing hyaluronic acid and NSAIDS
JP3407072B2 (ja) * 1991-02-14 2003-05-19 バクスター、インターナショナル、インコーポレイテッド リポソームへの認識物質の結合
US5792753A (en) 1991-07-03 1998-08-11 Hyal Pharmaceutical Corporation Compositions comprising hyaluronic acid and prostaglandin-synthesis-inhibiting drugs
WO1994007505A1 (en) 1991-07-03 1994-04-14 Norpharmco Inc. Use of hyaluronic acid and forms to prevent arterial restenosis
US6103704A (en) 1991-07-03 2000-08-15 Hyal Pharmaceutical Corporation Therapeutic methods using hyaluronic acid
US5817642A (en) 1991-07-03 1998-10-06 Hyal Pharmaceutical Corporation Clearing of atherosclerosis
US5977088A (en) 1991-07-03 1999-11-02 Hyal Pharmaceutical Corporation Formulations containing hyaluronic acid
US5990095A (en) 1991-07-03 1999-11-23 Hyal Pharmaceutical Corporation Use of hyaluronic acid and forms to prevent arterial restenosis
US5972906A (en) 1991-07-03 1999-10-26 Hyal Pharmaceutical Corporation Treatment of mucous membrane disease, trauma or condition and for the relief of pain thereof
US6017900A (en) 1991-07-03 2000-01-25 Hyal Pharmaceutical Corporation Topical composition containing hyaluronic acid and nsaids
US5834444A (en) 1991-07-03 1998-11-10 Hyal Pharmaceutical Corporation Hyaluronic acid and salts thereof inhibit arterial restenosis
US6087344A (en) 1991-07-03 2000-07-11 Hyal Pharmaceutical Corporation Formulations containing hyaluronic acid
US6022866A (en) 1991-07-03 2000-02-08 Hyal Pharmaceutical Corporation Use of hyaluronic acid and forms to prevent arterial restenosis
JP3199405B2 (ja) 1991-08-30 2001-08-20 生化学工業株式会社 肝細胞球状集塊化剤及び球状集塊化肝細胞の製造方法
US5942498A (en) 1992-02-20 1999-08-24 Hyal Pharmaceutical Corporation Formulations containing hyaluronic acid
US6218373B1 (en) 1992-02-20 2001-04-17 Hyal Pharmaceutical Corporation Formulations containing hyaluronic acid
CA2061567C (en) 1992-02-20 1998-02-03 Rudolf E. Falk Use of hyaluronic acid to repair ischemia reperfusion damage
US6114314A (en) 1992-02-21 2000-09-05 Hyal Pharmaceutical Corp. Formulations containing hyaluronic acid
US5885486A (en) * 1993-03-05 1999-03-23 Pharmaciaand Upjohn Ab Solid lipid particles, particles of bioactive agents and methods for the manufacture and use thereof
US5847002A (en) 1993-04-16 1998-12-08 Hyal Pharmaceutical Corporation Compositions, for inhibition, control and regression of angiogenesis, containing hyaluronic acid and NSAID
US5783566A (en) * 1996-05-10 1998-07-21 California Institute Of Technology Method for increasing or decreasing transfection efficiency
US6960651B2 (en) * 1999-06-29 2005-11-01 Millennium Pharmaceuticals, Inc. TANGO 332 polypeptides
US6593308B2 (en) * 1999-12-03 2003-07-15 The Regents Of The University Of California Targeted drug delivery with a hyaluronan ligand
US20020061849A1 (en) * 2000-05-02 2002-05-23 Soren Nielsen Methods for treatment of diseases associated with inflammation under non-ischemic conditions

Also Published As

Publication number Publication date
CN1564678A (zh) 2005-01-12
US20160113882A1 (en) 2016-04-28
EP1423095A4 (en) 2010-03-17
CN100542612C (zh) 2009-09-23
JP2005505529A (ja) 2005-02-24
JP4537057B2 (ja) 2010-09-01
US20130095032A1 (en) 2013-04-18
US8277847B2 (en) 2012-10-02
IL160205A0 (en) 2004-07-25
EP1423095A1 (en) 2004-06-02
US9526705B2 (en) 2016-12-27
US20040241248A1 (en) 2004-12-02
US7544374B2 (en) 2009-06-09
US9259474B2 (en) 2016-02-16
WO2003015755A1 (en) 2003-02-27
KR20040037062A (ko) 2004-05-04
CA2456966A1 (en) 2003-02-27
EP1423095B1 (en) 2016-09-28
US20090155178A1 (en) 2009-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2607802T3 (es) Partículas lipidadas de glicosaminoglicano y su uso en el suministro de fármacos y genes para diagnóstico y terapia
Ibrahim et al. Polyethylene glycol (PEG): The nature, immunogenicity, and role in the hypersensitivity of PEGylated products
Wang et al. Supramolecular tubustecan hydrogel as chemotherapeutic carrier to improve tumor penetration and local treatment efficacy
ES2360538T3 (es) Composiciones para aumentar el transporte a través de moco.
US9333163B2 (en) Particles with multiple functionalized surface domains
ES2385995B2 (es) Nanocápsulas con cubierta polimérica
Tabasum et al. Glycoproteins functionalized natural and synthetic polymers for prospective biomedical applications: A review
Jin et al. Hyaluronic acid in drug delivery systems
ES2951598T3 (es) Composición farmacéutica que combina al menos dos nanopartículas distintas y un compuesto farmacéutico, preparación y usos de los mismos
US8501237B2 (en) Formulations of water insoluble or poorly water soluble drugs in lipidated glycosaminoglycan particles and their use for diagnostics and therapy
ES2403544B2 (es) Sistemas nanoparticulares elaborados a base de ésteres de sorbitán.
Sedighi et al. Nanostructured multifunctional stimuli-responsive glycopolypeptide-based copolymers for biomedical applications
Luo et al. Advances and prospects of prolamine corn protein zein as promising multifunctional drug delivery system for cancer treatment
KR20110114914A (ko) 약물 전달을 위한 ｐＨ-민감성 나노입자 및 이의 제조방법
Walvekar et al. A review of hyaluronic acid-based therapeutics for the treatment and management of arthritis
Krasnopol’skii et al. Prospective clinical applications of nanosized drugs
AU2002326564A1 (en) Lipidated glycosaminoglycan particles and their use in drug and gene delivery for diagnosis and therapy
Maghsoudnia et al. Hyaluronic acid in drug delivery
Sreeranganathan et al. Panoramic View of Biological Barricades and Their Influence on Polysaccharide Nanoparticle Transport: An Updated Status in Cancer
Raj et al. Polymers in drug delivery and targeting
Maciel Cell-responsive nanogels for anticancer drug delivery