CN113712937B - 一种血小板药物递送体系及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血小板药物递送体系及其制备方法和应用，所述血小板药物递送体系包括血小板、近红外荧光光热分子探针和药物纳米粒；所述近红外荧光光热分子探针和药物纳米粒包封于所述血小板的胞质内；本发明血小板药物递送体系利用血小板同时负载两种不同的治疗剂，可通过载体细胞的包封，避免药物的过早释放，降低药物的毒副作用，提高给药安全性；同时具有良好荧光性能的光热剂新吲哚菁绿锚点在血小板上，可实现荧光影像引导下的光控释放及肿瘤的光热‑化疗联合治疗。

Description

一种血小板药物递送体系及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种血小板药物递送体系及其制备方法和应用。
背景技术
目前恶性肿瘤已成为严重威胁着人类健康的重大疾病，其难以彻底清除及易转移的肿瘤细胞导致其高复发率，是肿瘤治疗面临的重要难题。近年来，恶性肿瘤多学科协作整合的个性化精准治疗成为肿瘤治疗的趋势。通过影像手段实时精准跟踪药物在体过程、指导给药周期及剂量，开发可视化治疗窗口。借助靶向递送体系，将治疗剂精准递送至肿瘤部位，实现肿瘤高效低毒治疗的目的。
递送系统的体内可视化跟踪是实现精准给药的又一个关键问题。结合影像学方法和治疗方法，影像引导的药物递送已被用作提供最佳治疗窗口和个性化药物的可行策略。荧光成像由于其准确性，简便性，多样性和无损性而引人注目。荧光成像引导的联合治疗可以确定目标部位的药物利用率，体内跟踪药物的定位和累积以及监测药物治疗效果的进展，实时指导治疗程序或监测治疗反应。新吲哚菁绿(IR-820)，作为临床上使用的荧光光热剂，在近红外区域(NIR)显示出强荧光，并在光热治疗中获得良好治疗效果。然而，IR-820存在快速清除，光致漂白和缺乏体内靶向性等缺陷，限制了其在肿瘤治疗和影像学中的联合应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血小板药物递送体系及其制备方法和应用，该血小板药物递送体系利用血小板同时负载两种不同的治疗剂，可通过载体细胞的包封，避免药物的过早释放，降低药物的毒副作用，提高给药安全性；同时具有良好荧光性能的光热剂新吲哚菁绿锚点在血小板上，可实现荧光影像引导下的光控释放及肿瘤的光热-化疗联合治疗。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
本发明第一方面提供一种血小板药物递送体系，所述血小板药物递送体系包括血小板、近红外荧光光热分子探针和药物纳米粒；
所述近红外荧光光热分子探针和药物纳米粒包封于所述血小板的胞质内。
优选地，所述近红外荧光光热分子探针为新吲哚箐绿活性酯。
优选地，所述药物纳米粒为药物负载的多巴胺纳米粒。
更优选地，所述药物纳米粒中的药物包括阿霉素。
本发明第二方面提供一种上述血小板药物递送体系的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(a)将血小板和近红外荧光光热分子探针混合孵育，离心，得到包载近红外荧光光热分子探针的血小板；
(b)向包载近红外荧光光热分子探针的血小板中加入药物纳米粒进行混合孵育，即得所述血小板药物递送体系。
在本发明中对血小板、新吲哚箐绿活性酯以及阿霉素负载的多巴胺纳米粒的制备不做严格限制，例如，可以采用本领域的常规制备方法制得，或者市购得到；
优选地，所述血小板可以通过如下方法制得：
选取健康成人血液并以肝素钠抗凝后，置于离心管中，100～200g室温离心20～30min；收集包含富含血小板的血浆上清液，并在100～200g再离心20～30min以去除红细胞；然后，将富含血小板的血浆以3200～3800rpm离心20～30min，收集沉淀并用PBS缓冲液洗涤2～3次，获得所述血小板。
优选地，所述新吲哚箐绿活性酯可以通过如下方法制得：
将新吲哚菁绿(IR-820)及1,6-二氨基己烷溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，氩气保护氛围下，加入三乙胺，80～90℃油浴反应3～5h；产物用乙醚沉淀，得到氨基修饰的新吲哚菁绿(IR-NH2)；然后将IR-NH2溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，加入N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯，室温搅拌反应过夜，乙醚沉淀，离心收集、真空干燥得到新吲哚菁绿活性酯。
优选地，所述阿霉素负载的多巴胺纳米粒可以通过如下方法制得：
(1)将羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，加入水合肼及N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌反应1～3h；然后将产物体系置于透析袋中，超纯水透析40～60h后收集透析袋中的液体冷冻干燥制备得到酰胺化羧甲基壳聚糖(CS-COOH/CONHNH2)；
(2)将CS-COOH/CONHNH2溶于pH 5.5的磷酸缓冲盐中，加入阿霉素搅拌反应20～30h，将产物体系置于透析袋中，超纯水透析40～60小时后收集透析袋中的液体冷冻干燥制备得到阿霉素接枝的羧甲基壳聚糖(CS-g-Dox)；
(3)将CS-g-Dox溶于pH 7.4的磷酸缓冲盐中，加入多巴胺溶液，42～50℃搅拌混合0.5～1.5h，加入氢氧化钠溶液引发多巴胺聚合过程，42～48℃继续反应4～6h，离心，收集得到阿霉素负载的多巴胺纳米粒。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)中，所述血小板与近红外荧光光热分子探针的混合比例为1×107个血小板加入1mL10～40μg/mL的近红外荧光光热分子探针溶液。
优选地，所述步骤(a)中，孵育温度为30～42℃，时间1～4h。
优选地，所述步骤(b)中，所述血小板与药物纳米粒的混合比例为1×107个血小板加入1mL 10～40μg/mL的药物纳米粒溶液。
优选地，所述步骤(a)中，孵育温度为30～42℃，时间1～4h。
本发明第三方面提供一种上述血小板药物递送体系或上述制备方法制得的血小板药物递送体系在制备恶性肿瘤靶向药物或恶性肿瘤术后防复发药物中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：
本发明血小板药物递送体系利用血小板同时负载两种不同的治疗剂，可通过载体细胞的包封，避免药物的过早释放，降低药物的毒副作用，提高给药安全性；同时具有良好荧光性能的光热剂新吲哚菁绿锚点在血小板上，可实现荧光影像引导下的光控释放及肿瘤的光热-化疗联合治疗；在本发明中，血小板自身固有的肿瘤趋向性，有利于药物在肿瘤组织靶向定位蓄积、且通过其深入肿瘤深处特性及小分子药物的定点释放，提高药物肿瘤深处渗透；血小板对肿瘤细胞的特异性识别及治疗剂的响应释放，可有效防止肿瘤复发。
本发明制备的血小板药物递送体系能进入肿瘤深处、并识别游离的癌细胞，实现影像引导下肿瘤的精准靶向联合治疗并防复发；同时本发明血小板药物递送体系制备工艺简单，不需要依赖于复杂的设备，易于工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。在所有附图中，类似的元件或部分一般由类似的附图标记标识。附图中，各元件或部分并不一定按照实际的比例绘制。
图1为本发明实施例1中新吲哚菁绿活性酯IR-NHS的合成示意图；
图2为本发明实施例1中IR-NHS的质谱图；
图3为本发明实施例1中IR-NHS的氢谱图；
图4为本发明实施例2中阿霉素接枝的羧甲基壳聚糖CS-g-Dox的合成示意图；
图5为本发明实施例2中阿霉素负载的多巴胺纳米粒PDA@Dox NPs的合成示意图；
图6为本发明实施例2制备得到的PDA@Dox NPs的粒径谱图；
图7为本发明实施例3中血小板药物递送体系的合成示意图；
图8为本发明实施例3中血小板药物递送体系IR-PLT的细胞内IR强度流式谱图；
图9为本发明实施例3中血小板药物递送体系IR-PLT细胞内摄取的光热剂IR含量柱状图；
图10为本发明实施例3中血小板药物递送体系IRDNP-PLT摄取的阿霉素Dox含量柱状图；
图11为本发明实施例3中血小板药物递送体系DNP-PLT的细胞内阿霉素Dox强度流式谱图；
图12为本发明实施例3中血小板药物递送体系DNP-PLT细胞内摄取的阿霉素Dox含量柱状图；
图13为本发明实施例4中血小板药物递送体系的体外光热转换示意图；
图14为本发明实施例4中血小板药物递送体系IRDNP-PLT的共聚焦图片；
图15为本发明实施例4中血小板药物递送体系IRDNP-PLT的对药物Dox的体外释放曲线；
图16为本发明实施例4中血小板药物递送体系的体外荧光成像照片；
图17为本发明实施例5中阿霉素Dox在血小板药物递送体系和肿瘤细胞之间的转运共聚焦图片；
图18为本发明实施例5中不同血小板递送体系对乳腺癌细胞4T1的杀伤能力；
图19为本发明实施例6中血小板递送体系的体内荧光强度；
图20为本发明实施例6中肿瘤及脏器荧光影像分布图片；
图21为本发明实施例6中血小板递送体系治疗12小时，收集的肿瘤组织冷冻切片的共聚焦荧光图像；
图22为本发明实施例6中血小板递送体系治疗12小时，收集的肿瘤组织细胞内阿霉素的荧光强度曲线；
图23为本发明实施例6中静脉注射不同血小板药物递送体系的乳腺癌4T1肿瘤生长曲线；
图24为本发明实施例6中不同血小板药物递送体系治疗后的乳腺癌4T1肿瘤的重量柱状图；
图25为本发明实施例6中4T1荷瘤小鼠在治疗期间的体重变化曲线；
图26为本发明实施例6中肿瘤切片用苏木精和伊红染色示出了治疗后肿瘤组织的组织学观察和细胞凋亡检测结果；
图27为本发明实施例6中血小板递送体系用于4T1荷瘤小鼠的术后肿瘤复发影像图片。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。
需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
目前肿瘤的临床治疗时，单种药物或者单一治疗手段能够发挥的药效有限，两种或多种治疗药物或治疗方式的联用成为有限的治疗手段。血小板包载多种治疗剂构建的多功能药物递送体系可以降低药物带来的耐药风险、避免药物的过早释放导致的毒副作用，增加给药的安全性；两种不同功能的药物的负载，实现双重治疗手段的联用，相辅相成，发挥更好的治疗效果。血小板自身固有的肿瘤趋向性，有利于药物在肿瘤组织靶向定位蓄积、且通过其深入肿瘤深处特性及小分子药物的定点释放，提高药物肿瘤深处渗透；血小板对肿瘤细胞的特异性识别及治疗剂的响应释放，可有效防止肿瘤复发。
有鉴于此，本发明实施例提供一种血小板药物递送体系，该血小板药物递送体系包括血小板、近红外荧光光热分子探针和药物纳米粒；
所述近红外荧光光热分子探针和药物纳米粒包封于所述血小板的胞质内。
血小板作为一种多功能性血液细胞，主要功能是维持血管完整性，易聚集在“伤口”部位。其具有血液中高丰度，快速补给，高载药效率以及对生物细胞的特异性结合等特性。研究表明，肿瘤细胞在生长和转移过程中会活化和诱导血小板在其周围聚集；另外肿瘤微环境中和肿瘤细胞粘附的血小板会被活化，释放血管生成因子，促进肿瘤部位血管新生，深入肿瘤内部。血小板在肿瘤部位的聚集、深入组织深处等特性，使得构建基于血小板的药物递送体系用以肿瘤的靶向递送抗肿瘤药物成为可能。
在本发明中，血小板药物递送体系利用血小板同时负载两种不同的治疗剂，可通过载体细胞的包封，避免药物的过早释放，降低药物的毒副作用，提高给药安全性；同时具有良好荧光性能的光热剂新吲哚菁绿锚点在血小板上，可实现荧光影像引导下的光控释放及肿瘤的光热-化疗联合治疗。
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细说明。
实施例1
本实施例为新吲哚菁绿活性酯的制备方法，反应过程如图1所示，该制备方法具体包括如下步骤：
将新吲哚菁绿(IR-820，170mg)及1,6-二氨基己烷(142mg)溶于10mL的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，氩气保护氛围下，加入三乙胺140μL，85度油浴反应4小时；产物用乙醚沉淀，得到氨基修饰的新吲哚菁绿(IR-NH2)；然后将93mg IR-NH2溶于3mL N,N-二甲基甲酰胺中，加入105mg N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯，室温搅拌反应过夜，乙醚沉淀，离心收集、真空干燥得到新吲哚菁绿活性酯(IR-NHS)。
利用质谱及核磁对合成的IR-NHS进行了表征；IR-NHS的质谱图如图2所示，IR-NHS的氢谱图如图3所示；
由图2可知，通过质谱数据所得IR-NH2和IR-NHS分子量分别为951.75、1077.76，与理论分子量一致。由图3可知，IR-NHS核磁共振氢谱中2.91ppm属于琥珀酰亚胺五元环上的氢质子峰，1.9ppm-1.2ppm是琥珀酰亚胺支链上脂肪族氢质子峰；以上证明成功制备出了IR-NHS。
实施例2
本实施例为阿霉素负载的聚多巴胺纳米粒PDA@Dox NPs的制备方法，其反应过程如图4、图5所示，具体制备方法如下：
(1)将1.0g羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，加入84μL 80％的水合肼及50mg N-(3-二甲基氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌反应2小时；然后将产物体系置于透析袋中，超纯水透析48小时后收集透析袋中的液体冷冻干燥制备得到酰胺化羧甲基壳聚糖(CS-COOH/CONHNH2)；
(2)将200mg CS-COOH/CONHNH2溶于pH 5.5的磷酸缓冲盐中，加入20mg阿霉素搅拌反应24小时，将产物体系置于透析袋中，超纯水透析48小时后收集透析袋中的液体冷冻干燥制备得到阿霉素接枝的羧甲基壳聚糖(CS-g-Dox)；
(3)将CS-g-Dox溶于溶于pH 7.4的磷酸缓冲盐中，配制成10mg/mL的溶液，移取1mLCS-g-Dox溶液和5mL 2mg/mL的多巴胺溶液混合，45度搅拌1小时，体系中加入84μL 0.1mol/L氢氧化钠溶液引发多巴胺聚合过程，45度继续反应5小时，离心收集得到阿霉素负载的多巴胺纳米粒。
将制备得到的阿霉素负载的多巴胺纳米粒(PDA@Dox NPs)的粒径如图6所示。
实施例3
本实施例为血小板药物递送体系的制备方法，其反应过程如图7所示，具体制备方法如下：
(a)将取自健康成人的血液以肝素钠抗凝后，置于离心管中，100g室温离心20分钟；收集包含富含血小板的血浆的上清液，并在100g再离心20分钟以进一步去除红细胞；此后，将富含血小板的血浆以3500rpm离心20分钟，收集沉淀并用10mM的pH 7.4的PBS缓冲液洗涤2次，收集底部的血小板沉淀，将其重悬在pH 7.4的PBS缓冲液中，然后利用细胞计数仪读取对血小板浓度进行计数；
(b)将步骤(a)中的血小板与新吲哚菁绿活性酯药物混合，混合比例为1×107个血小板加入1mL 10、20或40μg/mL的新吲哚菁绿活性酯药物溶液，室温孵育1，2，或4小时；产物体系离心去除上液，用pH 7.4的PBS缓冲液重复洗涤3次，收集底部的新吲哚菁绿活性酯包封的血小板(IR-PLT)，将其重悬在1X的PBS溶液中，利用流式细胞仪分析IR-PLT内部IR的荧光强度，分析结果如图8所示，然后对IR-PLT计数，超声破碎后，利用荧光分光光度计计算IR-PLT负载的新吲哚菁绿(IR)的含量，结果如图9所示；
由图8可知，随着孵育时间的延长及给药浓度的提高，血小板内部IR的荧光强度增加；
由图9可知，血小板内部的IR的含量随着时间的延长而逐步提升；
(c)将步骤(b)中制备的IR-PLT和阿霉素包裹的多巴胺纳米粒(DNPs)混合，混合比例为1×107个血小板加入1mL阿霉素浓度为10，20或40μg/mL的DNPs，室温孵育1，2，或4小时；产物体系离心去除上液，用pH 7.4的PBS缓冲液重复洗涤3次，收集底部的阿霉素包裹的多巴胺纳米粒包封的血小板(IRDNP-PLT)，将其重悬在1X的PBS溶液中，超声破碎后，利用荧光分光光度计计算IRDNP-PLT负载的阿霉素(Dox)的含量，检测结果如图10所示；
然后，将(a)中血小板和阿霉素负载的多巴胺纳米粒(DNPs)混合，混合比例为1×107个血小板加入1mL阿霉素浓度为10，20或40μg/mL的DNPs，室温孵育1，2，或4小时；产物体系离心去除上液，用pH 7.4的PBS缓冲液重复洗涤3次，收集底部的阿霉素包裹的多巴胺纳米粒包封的血小板(DNP-PLT)，将其重悬在1X的PBS溶液中，利用流式细胞仪分析DNP-PLT内部阿霉素的荧光强度，结果如图11所示；然后对DNP-PLT计数，超声破碎后，利用荧光分光光度计计算DNP-PLT负载的阿霉素(Dox)的含量，结果如图12所示。增加给药浓度及延长给药时间，有利于提高血小板内部阿霉素的荧光强度及药物负载量。
由图10～12可知，增加给药浓度及延长给药时间，有利于提高血小板内部阿霉素的荧光强度及药物负载量；
此外，新吲哚菁绿活性酯包封的血小板与正常血小板对DNPs的包封率没有显著影响。
实施例4
本实施例为实施例3中血小板药物递送体系的体外生物学评价：
血小板药物递送体系的体外光热性能评价：
将实施例3中制备得到的血小板药物递送体系，用808nm激光(功率密度1.0W cm-2)照射5分钟，温度变化用红外热像仪(E6，FLIR System Inc，美国)每分钟记录一次；结果如图13所示。
由图13可知，血小板PLT的温度随着激光照射时间的延长，几乎不变化；而多功能血小板递送体系IR-PLT及IRDNP-PLT的温度随着照射时间的延长而逐步升高，揭示了体系良好的光热转换性能。
血小板药物递送体系的负载药物分布情况：
将实施例3制备得到的多功能血小板药物递送体系重悬在PBS缓冲溶液中，将其滴加到盖玻片上，利用共聚焦显微镜观测血小板中药物分布情况，结果如图14所示。
由图14可知，光热分子IR的荧光主要分布在血小板细胞质中，而阿霉素Dox的荧光分布在血小板胞质及细胞膜上。
多功能血小板药物递送体系的药物释放行为：
将实施例3制备得到的血小板药物递送体系重悬在PBS缓冲溶液中，将上述体系转移到37度水浴中，在0，12，24，36，48小时离心收集上清液，测定上清液中阿霉素的含量；同时为了评价激光控制的药物释放行为，在12，24，及36小时，体系用808nm激光(功率密度1.0W cm-2)照射5分钟；其体外释放行为如图15所示。
由图15可知，48小时，阿霉素的释放量约为40％，激光照射提高了多功能血小板药物递送体系IRDNP-PLT对于负载的阿霉素纳米粒的释放速率，48小时药物释放量达到80％。
多功能血小板药物递送体系的体外荧光成像性能：
将实施例3制备得到的血小板药物递送体系重悬在PBS缓冲溶液中，为了评估体内成像的可行性，利用小动物活体成像系统(Maestro EX，CRI，USA)拍摄了IR-PLT、DNP-PLT、IRDNP-PLT和PLT的体外荧光影像照片；如图16所示；
由图16可知，PLT未表现出任何荧光信号，IR-PLT中可跟踪到IR的荧光信号(绿色)、DNP-PLT中可跟踪到阿霉素的荧光信号(红色))、IRDNP-PLT可以同时跟踪到IR及阿霉素的荧光信号，信号叠加为黄色。
实施例5
本实施例为细胞水平评价血小板药物递送体系：
细胞培养：从中国科学院细胞库(中国上海)获得的鼠乳腺癌细胞4T1和表达荧光素酶的鼠乳腺癌细胞(4T1-Luc)，并在含有10％FBS和100U/mL青霉素和100U/mL链霉素的RPMI 1640培养基中培养；培养条件为：二氧化碳孵育箱，37℃、5％CO2和95％湿度；
治疗剂阿霉素Dox在血小板药物递送体系和肿瘤细胞之间的转运。将4T1细胞(2×105个细胞/孔)接种到共聚焦小皿中(Nest公司)。培养24小时后，将细胞与多功能血小板药物递送体系IRDNP-PLT共孵育24小时；为了评估外部激光对药物转运过程的影响，IRDNP-PLT用808nm激光照射3分钟，再和肿瘤细胞共孵育；然后用PBS洗涤细胞三次后，立即对细胞进行共聚焦显微镜(CLSM,ZEISS LSM 710)观测，如图17所示；
由图17可知，在肿瘤细胞中明显可以观测到化疗药物阿霉素(Dox)的红色荧光，表明治疗剂从递送体系IRDNP-PLT中转运至肿瘤细胞中；而且外部激光的照射增强了肿瘤细胞中阿霉素的荧光强度，这一现象表明外部激光控制可以加速递送体系IRDNP-PLT对于负载的治疗剂Dox的释放，从而促进递送体系和肿瘤细胞之间的药物转运行为。
血小板药物递送体系对肿瘤细胞的杀伤效果：
将4T1细胞利用荧光染料羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯CFSE标记后，接种到(4×105个细胞/孔)6孔板中。培养24小时后，加入不同浓度的血小板药物递送体系IR-PLT，DNP-PLT，或IRDNP-PLT，为了调控外部激光对细胞的杀伤效果，IR-PLT或IRDNP-PLT组别用808nm激光照射0，30或60秒；共孵育24小时后，用PBS洗涤细胞两次后，胰酶解离消化，收集细胞。然后细胞中加入1.5mL PI染色液(5ug/mL)，4℃避光孵育30min。再用PBS洗两次，收集细胞，PBS重悬后用流式细胞仪FACS分析；如图18所示；
由图18可知，经过治疗的细胞明显分成两群：上群是PI阳性的凋亡4T1细胞，下群是PI阴性的活4T1细胞。与对照组相比，给药组的细胞凋亡率明显增加。单一化疗组DNP-PLT中，肿瘤细胞凋亡率和DNP-PLT的给药量呈正相关；单一光热治疗组IR-PLT中，肿瘤细胞凋亡率和激光照射时长呈正相关。与单一治疗组相比，联合治疗组IRDNP-PLT中，肿瘤细胞的凋亡率明显提高。结果表明，本发明血小板药物递送体系可实现对肿瘤细胞的光热-化疗联合治疗，且具有良好的治疗效果。
实施例6
本实施例为动物水平评价血小板药物递送体系的研究
动物饲养：雌性Balb/c小鼠(18-20g)购自Vital River实验动物技术公司(中国北京)，并在研究前在SPF条件下饲养3天，自由获取标准食物和水。所有研究均符合北京协和医学院动物护理和使用机构委员会制定的实验动物护理和使用原则。为了建立荷4T1瘤小鼠模型，在小鼠后肢部位皮下注射1×107个4T1细胞。
血小板药物递送体系的体内靶向性：
当肿瘤体积达到200mm3时，小鼠静脉注射生理盐水，IR，IR-PLT或IRDNP-PLT，IR剂量为2mg/kg。在注射后6，12，或24,小时，在动物活体成像系统上(Maestro EX,CRI,USA)采集小鼠图像。之后再注射12或24小时后，对小鼠执行安乐死。收集肿瘤和主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)，并进行离体成像。利用Maestro 3.0软件分析肿瘤部位及主要脏器的荧光强度。如图19所示；
由图19可知，在注射6小时后，IR-PLT和IRDNP-PLT在肿瘤部位表现出强荧光信号，验证了血小板递送体系的肿瘤靶向能力，其能够选择性的靶向至肿瘤部位。随着时间的延长，在12小时和24小时，与自由药物IR相比，IR-PLT和IRDNP-PLT注射的小鼠，肿瘤部位出的荧光强度升高，表明血小板药物递送体系介导的靶向能力比EPR效果更加优越。肿瘤及脏器荧光影像分布图片如图20所示，从图中可知，同IR组相比，IR-PLT和IRDNP-PLT肿瘤部位表现出更强的荧光信号，且信号强度随着时间的延长而增加。
多功能血小板药物递送体系的体内肿瘤渗透性
当肿瘤体积达到200mm3时，小鼠静脉注射生理盐水，IR，阿霉素纳米粒PDA@DoxNPs、IR-PLT、DNP-PLT及IRDNP-PLT，阿霉素剂量为2mg/kg。在注射10小时后，在肿瘤部位，外部808nm激光照射5min；注射12小时后，对小鼠执行安乐死，解剖取肿瘤组织，将一部分肿瘤组织泡在盛有OCT的胶管中，放在液氮中速冻，使用冷冻组织切片机对肿瘤进行冷冻切片，切片厚度统一为10μm；将切片粘上载玻片，滴上固定液，用激光共聚焦显微镜观察拍照。剩余部分的肿瘤组织低温研磨，利用流式细胞仪分析肿瘤细胞内药物阿霉素的荧光强度。如图21所示，在IR及纳米粒PDA@Dox NPs注射组，可以看到游离的IR和阿霉素Dox信号分布于血管周围；然而，血小板药物递送体系(IR-PLT、DNP-PLT或IRDNP-PLT)组在远离血管的地方可以观察到强烈的绿色荧光(IR)或红色荧光(Dox)，表明与游离药物或纳米颗粒相比，血小板药物递送体系可以移动至距离血管更远部位，进入肿瘤更深。此外，在激光照射下多功能血小板药物递送体系IRDNP-PLT组的所有视野都可以观察到强烈的红色荧光，表明激光照射可以加速负载纳米粒的释放，有利于它们的肿瘤细胞同化。图22表明了肿瘤组织细胞内阿霉素的荧光强度。与肿瘤冷冻切片显示的数据一致，多功能血小板药物递送体系(DNP-PLT和IRDNP-PLT)显示出比阿霉素纳米粒PDA@Dox NPs组更强的细胞内Dox荧光，激光照射可以进一步增强Dox荧光强度。总之，血小板药物递送体系和激光触发释放的负载治疗剂具有卓越的肿瘤渗透功效。鉴于血小板可以从肿瘤血管中渗出并进一步渗透到肿瘤深处，血小板药物递送体系中装载的治疗剂可以被运送到肿瘤深层组织中。此外，由外部激光触发在肿瘤部位产生小尺寸治疗颗粒的后代可能为克服对肿瘤内浸润的抵抗提供可能。
体内抗肿瘤效力测定：
当肿瘤体积达到100mm3时，对30只荷瘤小鼠称重，并随机分成6组(n＝5)。从第0天起，每7天为小鼠静脉注射PBS、Dox、PDA@Dox NPs、IR-PLT、DNP-PLT或IRDNP-PLT，其中阿霉素1mg/kg、IR-820 2mg/kg。在药物注射后的第1及第4天，PLT-IR及PLT-IR-NPs组别进行激光照射热疗，照射条件为：808nm，1.0W/cm2，5min。每两天测量一次肿瘤大小和体重。在第21天，收集肿瘤，用PBS洗涤三次并固定以便进一步切片。对于苏木精和伊红(H&E)染色，通过光学显微镜(Leica)观察肿的载玻片。对TUNEL细胞凋亡测定，根据制造商的方案，通过原位细胞死亡检测试剂盒(Roche Applied Science公司)对固定的肿瘤切片染色，并通过荧光显微镜观察。
静脉注射不同血小板药物递送体系的乳腺癌4T1肿瘤生长曲线如图23所示，第21天用不同血小板药物递送体系治疗后的乳腺癌4T1肿瘤的重量柱状图如图24所示；4T1荷瘤小鼠在治疗期间的体重变化曲线如图25所示；肿瘤切片用苏木精和伊红染色示出了治疗后肿瘤组织的组织学观察和细胞凋亡检测结果如图26所示；
由图23和24所示，与盐水对照组相比，用不同多功能血小板药物递送体系(IR-PLT、DNP-PLT或IRDNP-PLT)处理后，肿瘤的生长受到显著抑制。
由图25可知，与单一治疗组相比(IR-PLT+Laser、DNP-PLT)，联合治疗组IRDNP-PLT+Laser显示出了明显更小的肿瘤体积及肿瘤重量，这表明通过血小板递送体系与光热剂IR及治疗剂PDA@Dox NPs的组合实现了协同抗肿瘤效力。同时，接受不同药物制剂的小鼠的体重在治疗期间保持稳定。
由图26可知，通过苏木精和伊红(H&E)染色的肿瘤切片的组织学图像显示，经过血小板药物递送系统处理后，肿瘤组织中大量肿瘤细胞死亡。此外，使用原位TUNEL测定获得的荧光图像呈现出，联合治疗组IRDNP-PLT+Laser处理的小鼠收集的肿瘤具有最高水平的细胞凋亡。
血小板药物递送体系预防肿瘤复发效力：
利用荧光素酶表达的小鼠乳腺癌细胞4T1-Luc构建了荷瘤小鼠模型，当肿瘤体积达到200mm3时，通过手术切除99％的肿瘤组织，缝合伤口。将手术后的小鼠随机分成PBS、Dox、NPs和PLT-NPs四组，手术后第二天按照上述分组进行尾静脉给药，给药剂量为阿霉素1mg/kg。以第一次给药时间记为第0天，于第7天再次以相同剂量给药。并分别在在第0天、5天、10天、15天时给小鼠腹腔注射荧光素酶底物D-荧光素钾盐(15mg/mL，200μL/只)，使用生物发光活体成像系统对肿瘤的大小和荧光强度进行监测。如图27所示，PBS组中的信号继续扩散，表明肿瘤快速生长；同时，接受游离Dox和PDA@Dox NPs的小鼠没有观察到明显的抑制作用，游离Dox和PDA@Dox NPs的荧光面积分别在第5天和第10天扩大；相比之下，对于接受DNP-PLT的小鼠，在15天内显示残留的生物发光信号完全消失，表明残留肿瘤组织的肿瘤复发受到显着抑制。
总上，本发明血小板药物递送体系可用于光热剂及治疗剂的有序及肿瘤特异性靶向释放。由于血管内皮粘附，血小板递送体系可以达到肿瘤部位，然后进一步聚集与被外部激光损伤的血管部位。与此同时经过光热消融后，由于肿瘤通透性增强，局部释放的化疗剂可主动转运至肿瘤深部组织并流入肿瘤部位。此后，可以通过对pH值敏感的释放的Dox实现有效的化学光热联合治疗。在此期间，荧光成像作为可见光导航系统，可以实现对输送过程的实时跟踪和引导，打开可见光治疗窗口。以携带鼠乳腺肿瘤(4T1)的Balb/C小鼠为模型，通过荧光成像在体内验证了血小板药物递送体系的上述优点，并评估了化学光热联合治疗的有效治疗效果。利用这种仿生多功能血小板药物递送体系实现有效的抗癌治疗和预防肿瘤复发的应用前景广阔。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

Claims (6)

1.一种血小板药物递送体系，其特征在于，所述血小板药物递送体系包括血小板、近红外荧光光热分子探针和药物纳米粒；
所述近红外荧光光热分子探针和药物纳米粒包封于所述血小板的胞质内，其中，所述近红外荧光光热分子探针锚点在血小板上；
所述药物纳米粒为阿霉素负载的多巴胺纳米粒；所述阿霉素负载的多巴胺纳米粒可以通过如下方法制得：
（1）将羧甲基壳聚糖溶于去离子水中，加入水合肼及N-（3-二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温搅拌反应1~3h；然后将产物体系置于透析袋中，超纯水透析40~60h后收集透析袋中的液体冷冻干燥制备得到酰胺化羧甲基壳聚糖；
（2）将酰胺化羧甲基壳聚糖溶于pH 5.5的磷酸缓冲盐中，加入阿霉素搅拌反应20~30h，将产物体系置于透析袋中，超纯水透析40~60小时后收集透析袋中的液体冷冻干燥制备得到阿霉素接枝的羧甲基壳聚糖；
（3）将阿霉素接枝的羧甲基壳聚糖溶于pH 7.4的磷酸缓冲盐中，加入多巴胺溶液，42~50℃搅拌混合0.5~1.5h，加入氢氧化钠溶液引发多巴胺聚合过程，42~48℃继续反应4~6h，离心，收集得到阿霉素负载的多巴胺纳米粒；
所述近红外荧光光热分子探针为新吲哚箐绿活性酯；所述新吲哚菁绿活性酯通过如下方法制得：
将新吲哚菁绿及1,6-二氨基己烷溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，氩气保护氛围下，加入三乙胺，80~90℃油浴反应3~5h；产物用乙醚沉淀，得到氨基修饰的新吲哚菁绿；然后将氨基修饰的新吲哚菁绿溶于干燥的N,N-二甲基甲酰胺中，加入N,N-二琥珀酰亚胺碳酸酯，室温搅拌反应过夜，乙醚沉淀，离心收集、真空干燥得到新吲哚菁绿活性酯。
2.权利要求1所述的血小板药物递送体系的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（a）将血小板和近红外荧光光热分子探针混合孵育，离心，得到包载近红外荧光光热分子探针的血小板；
（b）向包载近红外荧光光热分子探针的血小板中加入药物纳米粒进行混合孵育，即得所述血小板药物递送体系。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（a）中，所述血小板与近红外荧光光热分子探针的混合比例为1×107个血小板加入1mL 10~40μg/mL 的近红外荧光光热分子探针溶液。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（a）中，孵育温度为30~42℃，时间1~4h。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤（b）中，所述血小板与药物纳米粒的混合比例为1×107个血小板加入1mL 10~40μg/mL 的药物纳米粒溶液。
6.权利要求1所述的血小板药物递送体系或权利要求2~5任一所述的制备方法制得的血小板药物递送体系在制备恶性肿瘤靶向药物或恶性肿瘤术后防复发药物中的应用。
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