CN105288613A - 一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂,其组成为:以人血清白蛋白、重组乙肝表面抗原和碳酸氢钠组成内核,由聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物为包封层将内核包裹,最外层包覆有壳聚糖或甘露聚糖或它们的混合物。制备方法包括:(1)将重组乙肝表面抗原、人血清白蛋白和碳酸氢钠加入到含有聚乙烯醇的磷酸盐缓冲溶液中,得到内水相;(2)将聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物溶于有机溶剂中制成油相,取步骤(1)所得内水相加入油相中,高速搅拌形成W/O初乳液;(3)将W/O初乳液加入含有聚乙烯醇的外水相溶液中,高速搅拌形成W/O/W复乳液,再低速搅拌,离心洗涤,收集纳米颗粒,真空冷冻干燥,得到含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂成品。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物制剂,特别是一种可鼻腔免疫的、具有pH值敏感性和抗原递呈细胞靶向性的、包裹乙肝表面抗原的聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物(PLGA)纳米颗粒疫苗制剂,属于生命科学技术领域。
背景技术
乙型肝炎是一种严重威胁人类健康的世界性传染疾病,它是由乙型肝炎病毒(HBV)的感染而引起的疾病。目前,接种乙肝疫苗是预防和控制HBV传播的最有效的措施之一。最常使用的乙肝疫苗是由基因重组技术获得的乙肝表面抗原(HBsAg)经纯化、灭活及加入铝佐剂吸附而成的铝佐剂乙肝疫苗。为了达到持久而有效的免疫应答效果,铝佐剂乙肝疫苗需在0,1,2个月或0,1,6个月进行三次注射的免疫程序。由于需要专业人员进行注射免疫接种,且免疫程序复杂,导致相当一部分人难以完成免疫程序,这种现象在不发达地区尤为严重。此外,铝佐剂乙肝疫苗仅选择性诱导机体产生体液免疫应答,而不能有效诱导产生细胞免疫应答,不能有效清除细胞内存在的HBV病毒;也不能产生粘膜免疫、产生粘膜抗体,防止病毒通过粘膜进行入侵。因而,临床需要研发免疫方法简便的、免疫效果更强的新型乙肝疫苗,使更广泛的人群受到有效的保护。与注射接种相比,鼻腔粘膜免疫接种方法简便,不需要侵入接种,可避免专业人员参与,自己即可进行接种;同时,也可避免注射时针刺导致的疼痛和损伤,患者依从性好,尤其对于儿童。此外,鼻腔粘膜免疫接种可减少使用污染针头导致的意外风险,增加疫苗接种的安全性,降低接种费用,适合大范围人群免疫接种。
发明内容
本发明的目的是提供一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂,克服了铝佐剂乙肝疫苗需要注射带来的诸多问题及其不能诱导粘膜免疫和细胞免疫的缺点。
本发明的另一目的是提供一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂的制备方法。
具体的,本发明的一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂的组成是这样的,以稳定性保护剂人血清白蛋白、重组乙肝表面抗原和释放促进剂碳酸氢钠组成内核,由高分子材料聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物作为包封层将内核包裹,最外层包覆有壳聚糖或甘露聚糖或它们的混合物。
本发明中,重组乙肝表面抗原为酵母乙型肝炎表面抗原或中国仓鼠卵巢细胞分泌的乙型肝炎表面抗原。
本发明中,聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物分子量为9.0×103~8.7×104,其中聚乳酸与聚羟基乙酸(PLA:PLG)的质量比为(50:50)~(85:15)。
本发明中,壳聚糖为低分子量壳聚糖,分子量低于5000 Da。
本发明中,甘露聚糖为从酿酒酵母提取的细胞壁多糖,分子量35000–60000
Da。
本发明的含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂的制备方法,包括以下步骤:
(1)将重组乙肝表面抗原、人血清白蛋白和碳酸氢钠加入到含有聚乙烯醇的磷酸盐缓冲溶液中,混合得到内水相;
(2)将聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物溶于有机溶剂中制成油相,取步骤(1)所得内水相加入油相中,高速搅拌形成W/O初乳液;
(3)将W/O初乳液加入含有聚乙烯醇的外水相溶液中,高速搅拌形成W/O/W复乳液;再低速搅拌6~8小时,离心洗涤,收集纳米颗粒,真空冷冻干燥后,即可得到含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂成品;外水相中或者添加壳聚糖和甘露聚糖。
本发明的制备方法,步骤(1),乙肝表面抗原与血清白蛋白的质量比为1∶5;内水相乳化剂聚乙烯醇浓度为5 mg/ml~20 mg/ml;内水相中碳酸氢钠的浓度为1.25 mg/ml~5 mg/ml。
本发明的制备方法,步骤(2),内水相与油相的体积比为1:(2~4)。
本发明的制备方法,步骤(2),搅拌转速为8500~20000转/分;以15000转/分为佳;搅拌时间为30~300秒;第(3)步中搅拌乳化的转速为8500~15000转/分,以12000转/分为佳;搅拌时间为10~20分钟。
本发明的制备方法,步骤(2),有机溶剂是二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合液,其中,有机溶剂是二氯甲烷和丙酮的混合液时,二氯甲烷与丙酮的体积比为75:25。
本发明的制备方法,油相中聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物的浓度为50~100 mg/ml。外水相分散介质聚乙烯醇的浓度为5
mg/ml~50 mg/ml,可加入浓度为20~50 mg/ml的无机盐,以增加抗原的包封率;外水相中壳聚糖的浓度为5~50 mg/ml,以20 mg/ml为佳;外水相中甘露聚糖的浓度为2~20 µg/ml,以10 µg/ml为佳。本发明中内水相、外水相的pH值为7.0。
本发明选择人血清白蛋白作为稳定剂保护乙肝表面抗原在纳米颗粒制备过程中的稳定性;然后使用生物可降解高分子材料聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物(PLGA)为载体材料包封稳定剂和重组乙肝表面抗原,制备得到重组乙肝表面抗原的聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物纳米颗粒,可以有效保证在纳米颗粒制备和释放过程中乙肝表面抗原的免疫原性不被破坏。
本发明提供的纳米颗粒疫苗制剂,将乙肝表面抗原包裹在具有pH值敏感性和抗原递呈细胞靶向性的PLGA纳米颗粒内,这种纳米颗粒疫苗制剂是将碳酸氢钠与抗原一起包裹在PLGA纳米颗粒内,在中性pH,纳米颗粒释放抗原速度很慢,但是,酸性pH(溶酶体中)条件下,纳米颗粒会快速释放抗原。因而,抗原的释放会受到外部环境的调节,在细胞外部,抗原释放很慢,可避免抗原在进入抗原递呈细胞前被蛋白酶降解。只有在细胞内的溶酶体中才会快速释放抗原。并且,本发明提供的纳米颗粒表明经过了甘露聚糖和壳聚糖修饰,这种修饰具有两个优点:(1)可以增强纳米颗粒靶向抗原递呈细胞的能力,增强抗原递呈细胞对纳米粒的摄取;(2)可以增加纳米颗粒在鼻腔粘膜上的滞留时间,促进抗原进入体内,增强纳米颗粒疫苗的免疫应答。本发明提供的表面经过修饰的、具有pH值敏感性和抗原递呈细胞靶向性的纳米颗粒疫苗适宜于鼻腔免疫,可诱导产生HBsAg特异性的强体液免疫应答、粘膜免疫应答和细胞免疫应答,明显优于铝佐剂乙肝疫苗,可以克服铝佐剂乙肝疫苗的缺点。
本发明通过在纳米颗粒表面包被甘露聚糖和壳聚糖,不仅可以增强纳米颗粒靶向抗原递呈细胞的能力,增加抗原递呈细胞对纳米颗粒的摄取,而且,可以增加纳米颗粒在鼻腔的滞留时间,促进纳米颗粒透过鼻粘膜,诱导抗原特异性免疫应答。更为重要的是甘露聚糖和壳聚糖修饰的pH敏感性纳米颗粒在抗原递呈细胞内释放抗原存在可调控的两种释放模式,在溶酶体中的快速释放和在细胞外部环境中的缓慢释放。
本发明取得的有益效果是:通过添加稳定性保护剂制得的纳米颗粒,颗粒规则无粘连,平均粒径在0.5-1.5 μm,载药量、包封率高。作为鼻腔接种的预防乙肝病毒传播的纳米颗粒制剂,抗原稳定性好,免疫活性高,易于形成混悬液,适合于鼻腔接种免疫健康人群,不仅可提高人群HBsAb水平,诱导粘膜免疫,预防乙肝病毒的侵入;而且可以诱导细胞免疫,用于清除感染的细胞内乙肝病毒。因此,本制剂不仅可以预防乙肝病毒的传播,又可达到治疗慢性乙肝和乙肝病毒携带者的效果。其制备过程简单,易行。
附图说明
图1为甘露聚糖和壳聚糖修饰的、PH敏感的、包裹HBsAg的聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物纳米颗粒的扫描电镜照片。
图2为巨噬细胞对不同纳米颗粒的摄取量对比。
图3为甘露聚糖和壳聚糖修饰的、PH敏感的、包裹HBsAg的聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物纳米颗粒的体外抗原释放曲线。
图4为不同纳米颗粒在鼻腔中的滞留时间对比。
图5为大鼠血清中抗HBsAg IgG抗体水平随时间的变化。
图6为大鼠脾脏中不同制剂诱导产生的IL-2和IFN-γ水平。
图7为不同制剂诱导产生的大鼠阴道和鼻腔分泌液中抗HBsAg
IgA水平。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。
纳米颗粒表面形态观察:将干燥的纳米颗粒经喷金处理后,置于日立
S-4800型扫描电子显微镜下观察并照相。
粒径和ζ 电位:纳米囊的粒径和ζ 电位是将适量纳米囊分散到水溶液中,在水溶液中加0.05%吐温20,以减少结块,用马尔文激光粒度分析仪测定纳米囊粒径与ζ 电位。
纳米颗粒的包封率和载药量:用Lowry法测定纳米颗粒制备过程中外水相中HBsAg的含量,纳米颗粒的包封率=(HBsAg总量-外水相中HBsAg量)/HBsAg总量×100%。纳米颗粒的载药量=(HBsAg总量-外水相中HBsAg量)/收集的纳米颗粒总重量(毫克)×100。
纳米颗粒体外释放: 准确称取包封乙肝表面抗原的纳米颗粒20mg,加入1mL含有0.02moL/L的pH值分别为5.0、6.0和7.4的磷酸缓冲液,置于36.5℃恒温摇床,速率150r/min,分别在设定时间离心取上清,然后,加入等量的相同磷酸盐缓冲液继续释放过程。双抗体夹心ELISA法测定上清液中释放的乙肝表面抗原的抗原活性,测定后计算累计释放百分率,绘制体外释药曲线。
双抗体夹心ELISA法测定HBsAg抗原活性:用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释兔抗HBsAg抗体,100 μl/孔,4 ℃过夜。弃包被液,使用含0.01%吐温-20的磷酸盐缓冲液作为洗涤液,洗涤3次;然后,使用1%BSA封闭;洗涤后,加入HBsAg标准样品和待测样品,100 μl/孔,37℃湿盒温育1小时。洗涤后,加1:4000稀释的酶标抗体,100μl/孔,温育1小时。洗涤后,加入TMB可溶性底物溶液100μl/孔。室温避光反应15min后,滴加100μl/孔终止液终止反应。酶标仪测定450nm和630nm下的吸光度值,OD450与OD630的差值即为样品本身吸光度。使用标准溶液建立标准曲线,计算待测样品中HBsAg抗原活性。
量子点CdSe/ZnS标记的纳米颗粒的制备:在制备纳米颗粒过程中,直接将量子点CdSe/ZnS滴加到溶解聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物的有机相中,工艺过程不变,得到的纳米颗粒即为量子点CdSe/ZnS标记的纳米颗粒。
异硫氢酸荧光素标记人血清白蛋白(FITC-HSA)的制备:取一定量的HSA,用pH9.5碳酸盐缓冲液稀释至20mg/mL。按荧光素与蛋白质比1︰100,称取异硫氰酸荧光素,用pH9.5碳酸盐缓冲液溶解。将HSA溶液置于电磁搅拌器上,轻轻搅拌,逐滴加入荧光素液(约10 min~15
min加完)。使用碳酸钠溶液调整溶液pH不低于9.0。置暗处搅拌4h即可。将标记好的HSA透析除去未标记的FITC,冷冻干燥得到FITC-HSA,避光保存 。
包封FITC-HSA纳米颗粒的制备:在制备纳米颗粒过程中,直接将FITC-HSA代替HSA溶解于内水相中,工艺过程不变,即可得到包封FITC-HSA纳米颗粒
巨噬细胞摄取纳米颗粒:将巨噬细胞接种于96孔细胞培养板(约5×105个细胞/mL)中,每孔200μL, 培养至细胞贴壁后,分别加入200 µl 包封FITC-HSA纳米颗粒混悬液,纳米颗粒的浓度设定为100
µg/ml 。一起孵育12h后,吸弃全部上清液,PBS洗两次后,每孔加入细胞裂解液(含有1%
Triton X-100和2% SDS的PBS缓冲液),冰浴30 min使巨噬细胞充分破碎,用荧光分光光度计测定525 nm的荧光强度,研究甘露聚糖和壳聚糖修饰对于巨噬细胞摄取纳米颗粒的影响。
纳米颗粒在鼻腔粘膜的滞留时间测定:雌性SD大鼠, 8〜10周龄,体重200〜250克,用于实验。鼻粘膜分别接种50 微升包封量子点CdSe/ZnS标记的包封乙肝表面抗原的纳米颗粒混悬液,在接种10分钟、30分钟、1小时、3小时后处死大鼠,取鼻粘膜加正巳烷溶剂1毫升,充分震荡萃取30分钟。用荧光分光光度计测定溶液的荧光强度。以接种纳米颗粒在625纳米处总荧光强度为100%,确定各个时间段样品的荧光强度百分数。
鼻腔和阴道分泌液样品中的抗HBsAg IgA 抗体使用ELISA测定:首先在4°C使用每孔2微克乙肝表面抗原包被96孔聚苯乙烯微孔板24小时,使用1% 牛血清白蛋白溶液37℃封闭 2 小时,然后,每孔加入100微升1:100稀释的鼻腔或者阴道分泌液样品,37℃温浴 1 小时,每孔加入100微升1:1000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgA抗体,37℃温浴 2 小时。加入发色底物四甲基联苯胺,每孔100微升,37℃温浴15分钟。然后,每孔中加入100微升终止液,终止反应。使用分光光度计测定450nm吸光度。
实施例1
以含有人血清白蛋白、HBsAg、碳酸氢钠、PVA的磷酸钠缓冲液(pH7.4)作为内水相,该混合溶液中,HBsAg浓度为1 mg/ml,人血清白蛋白浓度为5 mg/ml,碳酸氢钠浓度为2.5 mg/ml,PVA浓度为5.0 mg/ml。取5.0 ml该溶液加入到10 ml含有600 mg 分子量分别是9.0 kDa, 13 kDa、23kDa、43 kDa 和87 kDa聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物(其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量比(PLA:PLG)为75:25)的二氯甲烷溶液中将混合物在初乳转速17500转/分,高速匀质机乳化2 min,获得 稳定的W/O初乳液。然后将该初乳液缓慢注入到20ml含有20 mg/ml NaCl、25
mg/ml PVA的磷酸钠缓冲液(pH7.0)中,高速均质机在17500转/分匀质10 分钟乳化形成W/O/W乳液,向形成的W/O/W乳液中加入20 ml含有20 mg/ml NaCl的磷酸盐(pH 7.4)缓冲液,在数显恒温磁力搅拌器上500转/分搅拌5小时,使二氯甲烷挥发干净,得到固化纳米颗粒。8000rpm离心30分钟收集纳米颗粒,用去离子水洗三遍,-80℃冷冻过夜,在5.0×10−3 Pa压力下真空冷冻干燥12h得到pH敏感型缓释纳米颗粒。如表1所示,所得纳米粒包封率、载药量和颗粒粒径随着PLGA分子量增加而增高。
表1 PLGA分子量对纳米囊影响
实施例2
以含有人血清白蛋白、HBsAg、碳酸氢钠、PVA的磷酸钠缓冲液(pH7.0)作为内水相,该混合溶液中,HBsAg浓度为1 mg/ml,人血清白蛋白浓度为5 mg/ml,碳酸氢钠浓度为1.25 mg/ml,PVA浓度为20.0 mg/ml。取5.0
ml该溶液加入到20 ml含有1000
mg 2.3 kDa 聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物(其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量比(PLA:PLG)为85:15)的二氯甲烷溶液中将混合物在初乳转速17500转/分,高速匀质机乳化10
min,获得 稳定的W/O初乳液。然后将该初乳液缓慢注入到20ml含有100
mg/ml NaCl、10 mg/ml PVA的磷酸钠缓冲液(pH7.0)中,高速均质机在9500转/分匀质20 分钟乳化形成W/O/W乳液,向形成的W/O/W乳液中加入20 ml含有100 mg/ml NaCl的磷酸盐(pH 7.4)缓冲液,在数显恒温磁力搅拌器上500转/分搅拌5小时,使二氯甲烷挥发干净,得到固化纳米颗粒。8000rpm离心30分钟收集纳米颗粒,用去离子水洗三遍,-80℃冷冻过夜,在5.0×10−3 Pa压力下真空冷冻干燥12h得到pH敏感型缓释纳米颗粒。所得纳米粒包封率为20.27%,载药量为0.41%。体外释放结果显示,在pH7.4的PBS中释放48小时后,仅有8.6%的抗原释放出来,而在pH5.0的PBS中释放48小时后,抗原的累计释放量达到62.1%。
实施例3
以含有人血清白蛋白、HBsAg、碳酸氢钠、PVA的磷酸钠缓冲液(pH7.0)作为内水相,该混合溶液中,HBsAg浓度为1
mg/ml,人血清白蛋白浓度为5 mg/ml,碳酸氢钠浓度为5
mg/ml,PVA浓度为10.0
mg/ml。取2.0 ml该溶液加入到6 ml含有200 mg 2.3 kDa 聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物(其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量比(PLA:PLG)为75:25)的有机溶剂为二氯甲烷和丙酮的混合液(二氯甲烷与丙酮的体积比为75:25)中将混合物在初乳转速9500r/min,高速匀质机乳化3 min,获得稳定的W/O初乳液。然后,将该初乳液缓慢注入到20ml含有50
mg/ml NaCl、5 mg/ml PVA的磷酸钠缓冲液(pH7.0)中,高速均质机在21500转/分匀质15 分钟乳化形成W/O/W乳液,向形成的W/O/W微乳中加入20 ml含有50 mg/ml NaCl的磷酸盐(pH 7.4)缓冲液,在数显恒温磁力搅拌器上500转/分搅拌5小时,使二氯甲烷挥发干净,得到固化纳米颗粒。8000rpm离心30分钟收集纳米颗粒,用去离子水洗三遍,-80℃冷冻过夜,在5.0×10−3 Pa压力下真空冷冻干燥12h得到pH敏感型缓释纳米颗粒。所得纳米颗粒粒径为680
nm,包封率为14.96%,载药量为0.33%。体外释放结果显示,在pH7.4的PBS中释放48小时后,仅有9.5%的抗原释放出来,而在pH5.0的PBS中释放48小时后,抗原的累计释放量达到87.5%。
实施例4
以含有人血清白蛋白(HAS)、HBsAg、碳酸氢钠、PVA的磷酸钠缓冲液作为内水相,该混合溶液中,HBsAg浓度为1 mg/ml,人血清白蛋白浓度为5 mg/ml,碳酸氢钠浓度为2.5 mg/ml,PVA浓度为10.0 mg/ml。取5.0
ml该溶液加入到10 ml含有600
mg 2.3 kDa 聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物(其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量比(PLA:PLG)为75:25)的二氯甲烷溶液中将混合物在初乳转速17500转/分,高速匀质机乳化0.5
min,获得 稳定的W/O初乳液。然后将该初乳液缓慢注入到20ml含有50
mg/ml NaCl、25 mg/ml PVA的磷酸钠缓冲液(pH7.0)中,高速均质机在17500转/分匀质15 分钟乳化形成W/O/W乳液,向形成的W/O/W乳液中加入20 ml含有50 mg/ml NaCl的磷酸盐(pH 7.4)缓冲液,在数显恒温磁力搅拌器上500转/分搅拌5小时,使二氯甲烷挥发干净,得到固化纳米颗粒。8000rpm离心30分钟收集纳米颗粒,用去离子水洗三遍,-80℃冷冻过夜,在5.0×10−3 Pa压力下真空冷冻干燥12h得到pH敏感型缓释纳米颗粒。所得纳米颗粒包封率为46.21%,载药量为0.67%,突释率为10.40%。体外释放结果显示,在pH7.4的PBS中释放48小时后,仅有9.3%的抗原释放出来,而在pH5.0的PBS中释放48小时后,抗原的累计释放量达到89.2%。
实施例5
以含有人血清白蛋白(HAS)、HBsAg、碳酸氢钠、PVA的磷酸钠缓冲液作为内水相,该混合溶液中,HBsAg浓度为1
mg/ml,人血清白蛋白浓度为5 mg/ml,碳酸氢钠浓度为5
mg/ml,PVA浓度为10.0
mg/ml。取5.0 ml该溶液加入到10 ml含有600 mg 2.3 kDa 聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物(其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量比(PLA:PLG)为75:25)的二氯甲烷溶液中将混合物在初乳转速17500转/分,高速匀质机乳化3 min,获得 稳定的W/O初乳液。然后将该初乳液缓慢注入到20ml含有50 mg/ml NaCl、25
mg/ml PVA以及5、10、20和50 mg/ml壳聚糖的磷酸钠缓冲液(pH7.0)中,高速均质机在17500转/分匀质15 分钟乳化形成W/O/W乳液,向形成的W/O/W乳液中加入20 ml含有50 mg/ml NaCl的磷酸盐(pH 7.4)缓冲液,在数显恒温磁力搅拌器上500转/分搅拌5小时,使二氯甲烷挥发干净,得到固化纳米颗粒。8000rpm离心30分钟收集纳米颗粒,用去离子水洗三遍,-80℃冷冻过夜,在5.0×10−3 Pa压力下真空冷冻干燥12h得到pH敏感型缓释纳米颗粒。图1A和1B为PLGA和CS3-PLGA纳米颗粒的扫描电镜照片,外表面光滑。如表2所示,随着加入的壳聚糖浓度的增加,所得CS-PLGA纳米颗粒的包封率、载药量和粒径都随之增加,纳米颗粒的表面电位也随着壳聚糖的加入由负变正。巨噬细胞对于PLGA和CS3-PLGA纳米颗粒的摄取量分别为13.0%和31.8%(图2),巨噬细胞对于壳聚糖修饰的纳米粒的摄取量显著增加(P
<0.05)。PLGA和CS3-PLGA纳米颗粒在不同pH条件下的释放结果见图3A和图3B。两种纳米颗粒在pH5.0和6.0的PBS缓冲液中释放迅速,而在pH7.4的缓冲液中释放缓慢。鼻腔粘膜对纳米颗粒的清除结果见图4,PLGA纳米颗粒被鼻腔清除很快,10分钟后仅有24%PLGA A纳米颗粒存在于鼻腔中;而CS3-PLGA纳米颗粒被清除很慢,10分钟后超过90%的CS3-PLGA纳米颗粒还存在于鼻腔中。一个小时后,存在于鼻腔中的PLGA 纳米颗粒量低于5.0%,而存在于鼻腔中的CS3-PLGA纳米颗粒量接近30%。
表2,壳聚糖(CS)修饰纳米颗粒的制备及性质
实施例6
以含有人血清白蛋白(HAS)、HBsAg、碳酸氢钠、PVA的磷酸钠缓冲液作为内水相,该混合溶液中,HBsAg浓度为1
mg/ml,人血清白蛋白浓度为5 mg/ml,碳酸氢钠浓度为5
mg/ml,PVA浓度为10.0
mg/ml。取5.0 ml该溶液加入到10 ml含有600 mg 2.3 kDa 聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物(其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量比(PLA:PLG)为75:25)的二氯甲烷溶液中将混合物在初乳转速17500转/分,高速匀质机乳化3 min,获得 稳定的W/O初乳液。然后将该初乳液缓慢注入到20ml含有50 mg/ml NaCl、25
mg/ml PVA、10 mg/ml壳聚糖和2、5、10、20 µg/ml甘露聚糖的磷酸钠缓冲液(pH7.0)中,高速均质机在17500转/分匀质15 分钟乳化形成W/O/W乳液,向形成的W/O/W乳液中加入20 ml含有50 mg/ml NaCl的磷酸盐(pH
7.4)缓冲液,在数显恒温磁力搅拌器上500转/分搅拌5小时,使二氯甲烷挥发干净,得到固化纳米颗粒。8000rpm离心30分钟收集纳米颗粒,用去离子水洗三遍,-80℃冷冻过夜,在5.0×10−3
Pa压力下真空冷冻干燥12h得到pH敏感型纳米颗粒。图1C和1D为MN-PLGA和CS-MN3-PLGA纳米颗粒纳米颗粒的扫描电镜照片,外表面光滑。如表3所示,仅用甘露聚糖修饰时,包封率仅有39.23%,表面电位也是负值;而同时使用甘露聚糖和壳聚糖修饰纳米颗粒后,不仅包封率大幅度提高,而且表面电位由负变为正。巨噬细胞对于CS-MN3-PLGA和MN-PLGA纳米颗粒的摄取量分别为20.3%和53.2%(图2), 巨噬细胞对于壳聚糖和甘露聚糖共同修饰的纳米颗粒的摄取量显著高于没有修饰的或者单一修饰的纳米颗粒(P<0.05)。CS-MN3-PLGA和MN-PLGA纳米颗粒在不同pH条件下的释放结果分别见图3C和图3D。两种纳米颗粒在pH5.0和6.0的PBS缓冲液中释放迅速,而在pH7.4的缓冲液中释放缓慢。鼻腔粘膜清除纳米颗粒的结果见图4, MN-PLGA纳米颗粒被鼻腔清除很快,10分钟后仅有30.6%的MN-PLG纳米颗粒存在于鼻腔中;而CS-MN3-PLGA纳米颗粒被清除很慢,10分钟后超过90%的CS-MN3-PLGA纳米颗粒还存在于鼻腔中。一个小时后,存在于鼻腔中的MN-PLGA纳米颗粒量低于5.0%,而存在于鼻腔中的CS-MN3-PLGA纳米颗粒量接近30%。
表3,甘露聚糖(MN)和壳聚糖(CS)修饰纳米颗粒的制备及性质
实施例7
选用8周龄雌性SD大鼠36只,体重200g 左右,在整个实验过程中给与自由水和食物,随机地平均分成重组乙型肝炎疫苗(alum-HBsAg)组、空白PLGA纳米颗粒(不包封HBsAg)组、实施例5中PLGA纳米颗粒和CS3-PLGA纳米颗粒、实施例6中的MN-PLGA纳米颗粒和CS-MN3-PLGA纳米颗粒共六组。在给药前通过眼内眦取血0.5ml至离心管中,离心收集血清,记为阴性对照血清待测。
实验采用皮下注射,alum-HBsAg组分两次给药分别在0、21天注射,每次注射剂量为20 μg/只; PLGA纳米颗粒、CS3-PLGA纳米颗粒、MN-PLGA纳米颗粒和CS-MN3-PLGA纳米颗粒组,分别在0、21和42天鼻腔免疫接种,接种时将纳米颗粒分散在pH7.4的PBS溶液中形成混悬液,剂量按HBsAg计,20μg/只,空白PLGA纳米颗粒组分别在0、21和42天鼻腔免疫接种,接种纳米颗粒量与CS-MN3-PLGA纳米颗粒组注射重量相同。
在预定的时间通过眼内眦取血0.5ml至离心管中,将取出的血液于室温下自然凝固30分钟,3500rpm/min离心20分钟仔细收集上清,﹣20℃冷冻保存。
完成上述六组组雌性SD大鼠第16周采血后,使用200 微升含有1%BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗鼻腔,并使用50 微升含有1%BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)反复冲洗阴道,收集分泌液样品,迅速冷冻于-80℃冰箱中保存待测。
完成上述六组组雌性SD大鼠第16周采血后,给这六组大鼠注射适宜剂量的乌拉坦对其进行麻醉,麻醉后对其进行灌流手术,摘取脾脏于离心管中,迅速冷冻于-80℃冰箱中保存待测。
通过大鼠乙肝表面抗体(HBsAb)酶联免疫分析试剂盒测定血清中特异性抗HBsAg
IgG抗体水平,结果如图5所示,空白PLGA纳米颗粒几乎没有诱导对HBsAg特异性的抗体反应。四种包封HBsAg的纳米颗粒经鼻腔免疫接种之后诱导产生的抗HBsAg IgG抗体水平前12周表现为上升趋势,之后则表现出逐渐降低的趋势。而由两次注射的alum-HBsAg制剂诱导的抗HBsAg IgG抗体水平在前8周表现为上升趋势,之后则表现出逐渐降低的趋势。
由图5,可以看出,CS3-PLGA纳米颗粒组和CS-MN3-PLGA纳米颗粒组诱导的抗HBsAg
IgG抗体水平显著高于PLGA纳米颗粒组和MN-PLGA纳米颗粒组(P<0.05)。alum-HBsAg制剂在八周内诱导的抗HBsAg IgG抗体水平显著高于所有的纳米颗粒组(P<0.05)。但是,在第十二周后,CS-MN3-PLGA纳米颗粒组诱导的抗HBsAg
IgG抗体水平与alum-HBsAg制剂相当(P>0.05)。
通过大鼠白细胞介素2(IL-2)和大鼠γ-干扰素(IFN-γ)酶联免疫分析试剂盒分别测定脾脏中IL-2和IFN-γ水平进行大鼠细胞免疫反应的研究。结果如图6所示,PLGA纳米颗粒组、CS3-PLGA纳米颗粒组、MN-PLGA纳米颗粒组、CS-MN3-PLGA纳米颗粒组均诱导产生不同水平的IL-2和IFN-γ;四种纳米颗粒制剂诱导产生的IL-2和IFN-γ水平水平明显高于alum-HBsAg所诱导产生的IL-2和IFN-γ水平水平(P <0.05),且由CS-MN3-PLGA纳米颗粒制剂诱导产生的IL-2和IFN-γ水平要高于PLGA纳米颗粒组、CS3-PLGA纳米颗粒组、MN-PLGA纳米颗粒组所诱导产生的IL-2和IFN-γ水平水平(P <0.05)。
由图7,可以看出,alum-HBsAg制剂基本不诱导产生IgA抗体,也就是不诱导黏膜免疫应答;PLGA纳米颗粒组和MN-PLGA纳米颗粒组诱导了黏膜免疫应答,与铝佐剂乙肝疫苗相比,鼻腔和阴道分泌液样品中的Ig A 水平均显著升高(P<0.05);鼻腔和阴道分泌液样品中,CS3-PLGA纳米颗粒组和CS-MN3-PLGA纳米颗粒组诱导的抗HBsAg
IgA抗体水平显著高于PLGA纳米颗粒组和MN-PLGA纳米颗粒组(P<0.05)。
Claims (10)
1.一种含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂,其特征在于组成为:以稳定性保护剂人血清白蛋白、重组乙肝表面抗原和释放促进剂碳酸氢钠组成内核,由高分子材料聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物作为包封层将内核包裹其中,最外层包覆有壳聚糖或甘露聚糖或它们的混合物。
2.根据权利要求1所述的疫苗制剂,其特征在于:重组乙肝表面抗原为酵母乙型肝炎表面抗原或中国仓鼠卵巢细胞分泌的乙型肝炎表面抗原。
3.根据权利要求1所述的疫苗制剂,其特征在于:聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物分子量为9.0×103~8.7×104,其中聚乳酸与聚羟基乙酸的质量比为(50:50)~(85:15)。
4.根据权利要求1所述的疫苗制剂,其特征在于壳聚糖分子量低于5000 Da,甘露聚糖为从酿酒酵母提取的细胞壁多糖,分子量35000–60000 Da。
5.一种如权利要求1所述的含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂的制备方法,其特征在于包括以下步骤:
(1)将重组乙肝表面抗原、人血清白蛋白和碳酸氢钠加入到含有聚乙烯醇的磷酸盐缓冲溶液中,混合得到内水相;
(2)将聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物溶于有机溶剂中制成油相,取步骤(1)所得内水相加入油相中,高速搅拌形成W/O初乳液;
(3)将W/O初乳液加入含有聚乙烯醇的外水相溶液中,高速搅拌形成W/O/W复乳液,再低速搅拌6~8小时,离心洗涤,收集纳米颗粒,真空冷冻干燥,得到含重组乙肝表面抗原的纳米颗粒疫苗制剂成品。
6.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于乙肝表面抗原与血清白蛋白的质量比为1∶5,内水相乳化剂聚乙烯醇浓度为5 mg/ml~20 mg/ml,内水相中碳酸氢钠的浓度为1.25 mg/ml~5 mg/ml。
7.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:步骤(2),内水相与油相的体积比为1:(2~4)。
8.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:步骤(2),搅拌转速为15000转/分钟,搅拌时间为30~300秒,步骤(3),搅拌乳化的转速为12000转/分,搅拌时间为10~20分钟。
9.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于:有机溶剂为二氯甲烷或二氯甲烷和丙酮的混合液,有机溶剂为二氯甲烷和丙酮的混合液时,二氯甲烷与丙酮的体积比为75:25。
10.根据权利要求5所述的制备方法,其特征在于,油相中聚乳酸-聚羟基乙酸嵌段共聚物的浓度为50~100 mg/ml,外水相分散介质聚乙烯醇的浓度为5 mg/ml~50 mg/ml,外水相中壳聚糖的浓度为20 mg/ml,外水相中甘露聚糖的浓度为10 µg/ml。
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