CN103834669A - 一种无乳链球菌的口服疫苗及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，以及包含该核苷酸序列的重组载体、重组菌。本发明还公开了无乳链球菌口服疫苗。本发明乳链球菌口服疫苗，以口服方式接种免疫，对罗非鱼的保护率高，给药方便，操作简单，免疫应激反应小，安全，应用前景优良。

Description

一种无乳链球菌的口服疫苗及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种无乳链球菌的口服疫苗。
背景技术
无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）也称B组链球菌（group Bstreptococci，GBS），属于链球菌科（Streptococcaceae），链球菌属（Streptococcus），是一种兼性的革兰氏阳性球菌，按其荚膜多糖抗原性的不同，可分为10种血清型（Ia、Ib、II～VIII型），其是引起罗非鱼链球病菌的主要致病菌。
近年来在广东、海南、福建等罗非鱼主产区大规模的爆发罗非鱼链球菌病，波及范围广，病害控制难，给养殖户带来了巨大的经济损失。发病鱼表现为精神、食欲很差，体色发黑，离群打转游动，部分病鱼出现晶状体混浊，眼球突出甚至脱落的现象；疾病的发病率接近40%，死亡量与气温呈现明显的正相关性，气温在35℃以上时发病鱼的死亡率可高达100%，养殖户的损失惨重，据不完全统计，2009年该病对华南地区罗非鱼养殖造成的经济损失高达7亿人民币。据调查，罗非鱼病害往年已有发生，然而往年都能以氟苯尼考等药物很快控制，但近年来的病害来势凶猛，因耐药性等原因，药物控制效果差，养殖户损失惨重。“罗非鱼”作为海南人工养殖首要鱼种，若不能有效地预防和控制疾病的发生及蔓延，海南将面临“无鱼可养”的局面。因此，安全有效的治疗方式对于拯救海南罗非鱼养殖业显得迫在眉睫，疫苗免疫不会产生耐药性，是一种安全、有效、环保的方法。
目前，常见的无乳链球菌疫苗有灭活疫苗、减毒疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗等，其中，全菌疫苗、减毒疫苗和亚单位疫苗多用腹腔注射，DNA疫苗以肌肉注射方式接种为主。一般来说，腹腔或肌肉注射易于控制剂量，免疫应答效果较好，但是鱼体的应激反应大，伤口易发生二次感染。口服免疫的操作简单，鱼体的应激反应小，但是，将现有的无乳链球菌疫苗以口服方式免疫，免疫效果非常弱，难以起到保护作用。
发明内容
本发明提供了一种无乳链球菌口服疫苗，其由包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的减毒沙门氏菌制备而成。
本发明首先提供了SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种重组载体，它包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
优选地，所述重组载体为重组pVAX1载体。
本发明还提供了一种重组菌，它包含前述的重组载体。
优选地，所述重组菌为重组减毒沙门氏菌。进一步优选地，所述重组减毒沙门氏菌为重组减毒沙门氏菌SL7207。
本发明还提供了前述序列、重组载体或重组菌在制备无乳链球菌口服疫苗中的用途。
本发明无乳链球菌口服疫苗，它是由前述序列、重组载体或重组菌和药学上可接受的辅料或者载体制备而成。
本发明还提供了前述口服疫苗在制备预防无乳链球菌病的药物中的用途。优选地，所述的无乳链球菌病为罗非鱼无乳链球菌病。
本发明制备得到了一种可以口服接种的无乳链球菌疫苗，将其用拌料的方式免疫接种罗非鱼，获得的最高抗体效价为1:16，最高相对保护率可达63%，可以有效保护罗非鱼免受无乳链球菌感染，给药方便，操作简单，免疫应激反应小，安全，应用前景优良。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
说明书附图
图1无乳链球菌的sip基因的PCR扩增结果。M:DNA Maker（2000），1：sip基因扩增产物。
图2pVAX1-sip酶切和PCR鉴定。M:DNA Maker（10000）,1：DH5α（pVAX1-sip）菌落PCR鉴定，2：pVAX1-sip/BamH Ⅰ+Hind Ⅲ，3pVAX1-sip/BamH Ⅰ。
图3重组菌16S rDNA鉴定。M:DNA Maker（2000）,1：SL7207（pVAX1），2:SL7207(pVAX1-sip)。
图4SL7207（pVAX1）酶切鉴定。M1:DNA Maker（2000）,M2:DNAMaker（10000），1：SL7207(pVAX1)/BamH Ⅰ，2:SL7207(pVAX1)/BamH Ⅰ+Hind Ⅲ。
图5SL7207（pVAX1-sip）酶切和PCR鉴定。M1:DNA Maker（2000）,M2:DNA Maker（10000），1：SL7207（pVAX1-sip）/BamH Ⅰ，2:SL7207(pVAX1-sip)/BamH Ⅰ+Hind Ⅲ，3:SL7207(pVAX1-sip)菌落PCR鉴定。
图6重组菌生长曲线。
图7重组菌SL7027（pVAX1-sip）口服免疫罗非鱼后组织细菌计数。
图8免疫后第7天，罗非鱼肝脏、脾脏、肠道分离菌株的特异性PCR鉴定。M1：DNA Maker（2000），1：肝样，2：脾样，3：肠道样，4：sip阳性对照。
图9免疫后7天罗非鱼肝脏、脾脏、肠道分离菌抽提质粒pVAX1-sip的酶切鉴定。M1:DNA Maker（2000）,M2:DNA Maker（10000），1、2：肝样；3、4：脾样；5、6：肠样；7：sip阳性对照。
图10检测流程图
图11ELISA检测经三次灌胃免疫接种的罗非鱼血清特异性抗体每个柱形代表在血清稀释度为1:16时，OD450下的吸光度。各试验组的抗体应答水平与PBS组对比，并进行了统计学分析，SE(N=3)，**P<0.01。
图12ELISA检测经三个免疫疗程拌料免疫接种的罗非鱼血清特异性抗体每个柱形代表在血清稀释度为1:16时，OD450下的吸光度。各试验组的抗体应答水平与PBS组对比，并进行了统计学分析，SE(N=3)，**P<0.01，*P<0.05。
图13灌胃接种后罗非鱼获得的保护率。罗非鱼只进行了一次免疫。
图14灌胃接种后罗非鱼获得的保护率。罗非鱼进行了两次免疫。
图15灌胃接种后罗非鱼获得的保护率。罗非鱼进行了三次免疫。
图16拌料接种后罗非鱼获得的保护率。罗非鱼只进行了一个流程免疫。
图17拌料接种后罗非鱼获得的保护率。罗非鱼进行了两个流程免疫。
图18拌料接种后罗非鱼获得的保护率。罗非鱼进行了三个流程免疫。
具体实施方式：
实施例1本发明口服疫苗的构建
一、目标基因片段的克隆
1.1方法
将无乳链球菌用BHI肉汤培养至指数期，离心收集菌体用细菌DNA提取试剂盒收集提取无乳链球菌细菌DNA，PCR扩增分别获得大量sip基因。
Sip基因上下游引物为
sip上游引物：5'－GGATCC
Figure BDA0000483647020000031
CTGCCACTTCAATGAAA-3’（下划线为添加的BamH Ⅰ酶切位点，粗体为Kozak序列）
sip下游引物：5'-AAGCTTTTATTTGTTAAATGATACGTG-3’（下划线为添加的HindⅢ酶切位点）
PCR反应体系：上下游引物各1μl；Mix12.5μl；DNA模板1μl；ddH2O9.5μl。反应条件：95℃预变性5min，94℃50s，55℃30s，72℃1min，共30个循环，最后72℃延伸10min。取5μl反应产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统检测扩增结果。收集PCR扩增产物，胶回收，获得纯化基因片段。
将纯化的目的基因与pMD19-T载体连接，转入DH5α。通过Amp平板筛选，PCR和单双酶切鉴定后，筛选获得pMD19-T-sip重组转化细菌。
1.2结果
提取的无乳链球菌GBS基因组，根据所设计的PCR引物，经高保真DNA聚合酶扩增，得一条大小约为1000bp的目的片段，与预期结果一致（图1），经过测序，得其核苷酸序列如下：
ATGGCTGCCACTTCAATGAAAATAGAAACACCAGCAACAAATGCTGCTGGTCAAACAACAGCTA
CTGTCGATTTGAAAACCAATCAAGTTTCTGTTGCAGACCAAAAAGTTTCTCTCAATACAATTTCG
GAAGGTATGACACCAGAAGCAGCAACAACGATTGTTTCGCCAATGAAGACATATTCTTCTGCGCC
AGCTTTGAAATCAAAAGAAGTATTAGCACAAGGGCAAGCTGTTAGTCAAGCAGCAGCTAATGAA
CAGGTATCACCAGCTCCTGTGAAGTCGATTACTTCAGAAGTTCCAGCAGCTAAAGAGGAAGTTAA
ACCAACTCAGACGTCAGTCAGTCAGTCAACAACAGTATCACCAGCTTCTGTTGCCGCTGAAACA
CCAGCTCCAGTAGCTAAAGTAGCACCGGTAAGAACTGTAGCAGCCCCTAGAGTGGCAAGTGTTA
AAGTAGTCACTCCTAAAGTAGAAACTGGTGCATCACCAGAGCATGTATCAGCTCCAGCAGTTCCT
GTGACTACGACTTCAACAGCTACAGACAGTAAGTTACAAGCGACTGAAGTTAAGAGCGTTCCGG
TAGCACAAAAAGCTCCAACAGCAACACCGGTAGCACAACCAGCTTCAACAACAAATGCAGTAGC
TGCACATCCTGAAAATGCAAGGCTCCAACCTCATGTTGCAGCTTATAAAGAAAAAGTAGCGTCAA
CTTATGGAGTTAATGAATTCAGTACATACCGTGCGGGAGATCCAGGTGATCATGGTAAAGGTTTAG
CAGTTGACTTTATTGTAGGTAAAAACCAAGCACTTGGTAATGAAGTTGCACAGTACTCTACACAA
AATATGGCAGCAAATAACATTTCATATGTTATCTGGCAACAAAAGTTTTACTCAAATACAAATAGTA
TTTATGGACCTGCTAATACTTGGAATGCAATGCCAGATCGTGGTGGCGTTACTGCCAACCACTATG
ACCACGTTCACGTATCATTTAACAAATAA。
二、口服疫苗的构建
（一）真核表达质粒pVAX1-sip的构建与鉴定
1、方法
用BamH Ⅰ+HindⅢ从步骤一得到的pMD19-T-sip中，双酶切下目的基因片段，电泳胶回收纯化后与用同样酶双酶切的pVAX1载体，以T4DNA连接酶进行连接过夜，取连接产物转化DH5α感受态细胞中，并涂布Kan+的LB平板，37℃培养16h后，随机挑取菌落进行菌落PCR验证。再挑取PCR鉴定的阳性单菌落，接种于Kan+的LB液体培养。提取质粒，用BamH Ⅰ+HindⅢ进行酶切鉴定。获得的阳性重组质粒命名为pVAX1-sip。
2、结果
连接产物转化感受态DH5α细胞，涂布于Kan LB平板上有单菌落长出，挑选单个菌落进行菌落PCR鉴定，电泳结果显示可得到大小约为1000bp（图2），与目的条带大小一致。将PCR鉴定正确的菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，300r/min过夜培养后，进行质粒的小量抽提，将抽提的pVAX1-sip质粒进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，酶切产物电泳获得两条大小分别为3000bp和1000bp的条带（图2），菌落PCR和酶切结果表明pVAX1-sip重组质粒构建成功。
（二）、真核表达质粒pVAX1-sip转化减毒沙门氏菌SL7207
1、方法
制备减毒沙门氏菌感受态细胞，然后将鉴定为正确的pVAX1-sip重组质粒电转化减毒沙门氏菌SL7207。
取电转化后的减毒沙门氏菌，涂布Kan+的LB平板，37℃培养16h后，随机挑取菌落进行菌落PCR验证；再挑取PCR鉴定的阳性单菌落，接种于Kan+的LB液体培养。提取细菌基因组DNA进行16S rDNA基因扩增鉴定，同时提取质粒，用BamH Ⅰ+HindⅢ进行酶切鉴定。
获得的阳性重组质粒命名为SL7207（pVAX1-sip），按相同方法构建仅含空载体pVAX1的重组菌SL7207（pVAX1）并进行鉴定。
2、结果
PCR扩增出的16S rDNA片段经琼脂糖电泳检测表明其大小均约为1500bp（图3），将PCR扩增产物送上海生物工程技术有限公司测序。测序结果登陆NCBI，进行BLAST比对与鼠伤寒沙门氏菌的相似度最高，说明重组菌为鼠伤寒沙门氏菌SL7207。
在pVAX1电转化的平板上挑选单个菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，300r/min过夜培养后，小量提取质粒，将抽提pVAX1质粒进行BamH Ⅰ单酶切和BamH Ⅰ+HindⅢ双酶切鉴定，将单双酶切产物分别电泳获均得一条大小为3000bp的条带，与pVAX1载体大小相符（图4），酶切结果表明pVAX1表达载体已被成功电转入沙门氏菌SL7207中。将该重组菌命名为SL7207（pVAX1)。
在pVAX1-sip电转化的平板上挑选单个菌落接种于含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，300r/min过夜培养后，小量提取质粒，进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定，将酶切产物电泳获得两条大小分别约为3000bp和1000bp的条带（图5），与预期的pVAX1载体和sip基因大小相符。将该重组菌命名为SL7027（pVAX1-sip）。
实验结果说明，本发明构建得到了包含目的基因片段的阳性质粒pVAX1-sip，以及包含前述阳性质粒的重组沙门氏菌SL7027（pVAX1-sip），其中，重组沙门氏菌SL7027（pVAX1-sip）即本发明口服疫苗。
实施例2本发明口服疫苗的稳定性、安全性检测
SL7207、SL7207（pVAX1）和SL7207（pVAX1-sip），按照实施例1的方法制备。
1、检测方法
（1）重组菌的生长特性试验
用接种环将SL7207、SL7207（pVAX1）和SL7207（pVAX1-sip）分别划线接种于LB固体培养基中，37℃下培养24h后分别挑取单菌落并分别接种于LB液体培养基中，37℃，120r/min下振荡培养过夜，次日取lmL菌液加入含100mL LB培养基的烧瓶内，37℃剧烈振荡培养，每隔1h菌液测定OD600值一次，共测18h，绘制测定菌的生长曲线。
（2）SL7207（pVAX1-sip）体内稳定性试验
将40尾100g左右健康罗非鱼，随机分成2组，每组20尾，按108CFU/尾的剂量灌服接种重组菌SL7207（pVAX1-sip），对照组灌服灭菌0.01mol/LPBS。口服接种后第3、7、14、21天，每组各取5尾罗非鱼，无菌条件下取罗非鱼肝脏、脾脏、肾脏和肠道，匀浆，采用LB（Kan）抗性平板进行组织内活菌计数。计数时，随机挑取10个菌落（若平板上菌落数小于10个，则挑取全部菌落），分别进行PCR鉴定和酶切鉴定，计算出PCR阳性和酶切鉴定正确的重组菌比率，该比率乘以整个计数平板上的总菌落数作为最终稳定的重组菌的个数，并以之来计算组织内活菌数。
（3）重组菌安全性试验
将160尾体重100g左右的罗非鱼随机分成8组，每组20尾；其中7组分别灌服2×108、2×109、1×1010、2.5×1010、5×1010、1×1011、2×1011cfu/mL的减毒沙门氏菌SL7207（PVAX1-sip），1组灌服PBS（0.0lmol/L）作为对照组，每尾0.5mL。试验罗非鱼养在直径1米的玻璃缸水槽，水温30±l℃，pH值7.2左右，溶氧5mg/L以上，罗非鱼投普通配合饲料，饲养20d。试验开始后，连续观察记录试验罗非鱼有无发病、死亡等异常情况。统计20d内罗非鱼的死亡情况，以测定重组菌在30℃下对罗非鱼的半数致死量。
2、检测结果
（1）生长特性
如图6所示：重组菌SL7207（pVAX1）、SL7207（pVAX1-sip）和对照菌株SL7207均生长良好，三种菌株进入迟缓期，对数生长期和稳定期的时间及曲线走势均很相似，说明三种菌株生长规律趋于一致。重组菌SL7207（pVAX1）和SL7207（pVAX1-sip）的生长速度相近，均比对照菌株SL7207稍慢，但是差异不显著。
实验结果说明，本发明口服疫苗重组沙门氏菌SL7027（pVAX1-sip）可以正常生长。
（2）体内稳定性
罗非鱼不同组织内稳定的重组菌浓度和变化见表1、图7：
表1重组菌SL7027（pVAX1-sip）口服免疫罗非鱼后在不同组织内浓度，cfu/g
Figure BDA0000483647020000071
由表1和图7可以看出，按108CFU/尾灌服SL7207（pVAX1-sip）后第3天在肠道、脾脏和肝脏可检测到重组菌，第7天组织内的重组菌浓度达到最高，随后逐渐降低，直至第21天，除了肠道还能检测到重组菌外，脾脏和肝脏未能检测出重组菌。自免疫后，肾脏一直未检测到重组菌。PBS对照组罗非鱼脾脏、肝脏和肾脏平板均无细菌长出。
同时进行了PCR鉴定和酶切鉴定，都能获得目的条带（图8、图9），表明罗非鱼的肝、脾脏和肠道分离沙门氏菌中含有重组质粒，说明重组减毒沙门氏菌在侵入罗非鱼鱼体内过程中是稳定的。
实验结果说明，本发明口服疫苗重组沙门氏菌SL7027（pVAX1-sip）在体内可以稳定存在。
（3）安全性
重组减毒沙门氏菌SL7207（PVAX1-sip）对罗非鱼的安全性试验结果见表2：
表2重组菌SL7207（PVAX1-sip）对罗非鱼的安全性试验
Figure BDA0000483647020000081
如表2所示，罗非鱼口服不同浓度的重组减毒沙门氏菌SL7207（PVAX1-sip）20d后，灌服2×108和2×109cfu/mL的罗非鱼在整个试验期间采食、生长正常，未出现死亡和异常情况。
灌服1×1010cfu/mL及更高浓度的重组菌菌液的罗非鱼有出现死亡的现象，且随着浓度的增高，死亡率逐渐增加，半数致死量（LD50）为1.7×1011cfu/尾。
实验结果说明，本发明口服疫苗重组沙门氏菌SL7027（pVAX1-sip）安全，在使用剂量高达2×109cfu/ml时，仍然不会影响罗非鱼。
综上，本发明口服疫苗重组沙门氏菌SL7027（pVAX1-sip）稳定性好，毒性低，安全。
实施例3本发明口服疫苗的有效性检测
本章采用直接灌胃和拌料两种接种方式分别考察了疫苗对罗非鱼的口服免疫效果。灌胃接种可在实验室条件下定量考察免疫接种量对免疫效果的影响，拌料方式重在模拟生产实际使用途径，评价疫苗的免疫效果，所得结果对后期田间试验或生产推广应用更具参考价值。本章采用了特异性抗体效价和免疫保护率两种指标来评价该疫苗对罗非鱼的免疫效果。
1材料
1.1试验动物
健康罗非鱼：900尾重约100g的健康罗非鱼，购于通威罗非鱼养殖基地，暂养一周后使用。
1.2菌株
无乳链球菌（JF423941）由四川农业大学鱼病研究中心保存；重组菌SL7207（pVAX1-sip）、SL7207（pVAX1），按照实施例1的方法制备。
1.3主要试剂
卡那霉素（Kan）购自上海生工生物工程技术服务有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗兔IgG（Abgent公司）；TMB显色试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；兔抗罗非鱼IgG为实验室自制。
1.4主要仪器
超声波裂解器（宁波新芝公司）；高速冷冻离心机（Thermo Scientific）；超净工作台（苏净集团安泰公司）；JA12002型电子天平（上海分析仪器厂）；酶标仪（Bio-Rad）。
2方法
2.1疫苗的制备
将SL7207（pVAX1-sip）和SL7207（pVAX1）接种于Kan-LB液体培养基中，100r/min震荡培养至菌体OD值约0.7，离心收集菌体，以无菌PBS（0.0l mol/l）调整细菌浓度至2×107cfu/ml、2×108cfu/ml和2×109cfu/ml，4℃保存，待用于灌胃口服接种。
抗性条件下，培养重组菌菌液，经离心浓缩或采用无菌PBS稀释，制备浓度分别为108cfu/ml、109cfu/ml、1010cfu/ml的SL7207（pVAX1）和SL7207（pVAX1-sip）各200ml。将每组制备的200ml菌液各与2kg罗非鱼浮水料（四川通威公司）均匀混合，置于37℃烘箱24～48h，直至烘干并分装，制得理论浓度依次为107cfu/g、108cfu/g、109cfu/g的SL7207（pVAX1）和SL7207（pVAX1-sip）免疫饲料各2kg，用于经饲料口服接种。
2.2免疫程序及采血
灌胃组罗非鱼分为5批，每批为3组，每组30尾。前三批罗非鱼分别灌胃接种浓度为2×107cfu/ml、2×108cfu/ml和2×109cfu/ml的SL7207（pVAX1-sip），0.5ml/尾；第四批罗非鱼按2×108cfu/ml，0.5ml/尾，灌胃接种SL7207（pVAX1）作为空载体对照；第5批罗非鱼灌胃PBS作为阴性对照。每一批次罗非鱼的3组，分别以相同的剂量免疫接种1次、2次和3次，每次间隔一周（表3）。
表3灌胃组免疫分组情况
Figure BDA0000483647020000101
注：1、平均每尾鱼体重100g左右，试验水温30℃恒温
2、加强免疫间隔7d
3、首免为day1，第二次免疫为day8，第三次免疫为day15
拌料免疫组的罗非鱼同样分为5批，每批为3组，每组30尾。前三批罗非鱼分别投喂浓度为107cfu/g、108cfu/g、109cfu/g的SL7207（pVAX1-sip）免疫饲料；第四批罗非鱼投喂浓度为108cfu/g SL7207（pVAX1）的免疫饲料作为空载体对照；第5批罗非鱼投喂普通饲料作为阴性对照。每一批次罗非鱼的3组，分别以相同的剂量免疫接种1、2、3个免疫流程，每个程序连续投喂7d，间隔一周，每尾鱼每天按体重的1%投喂（约1g）（表4）。
表4拌料免疫分组情况
Figure BDA0000483647020000111
注：1、平均每尾鱼体重100g左右，试验水温30℃恒温
2、每个免疫流程为连续投喂7d，两个免疫流程之间间隔一周
3、首免为day1，第一个流程为1～7天，第二个流程为15～21天，第三个流程为29～35天
各试验组在首次接种后（不含当日）的第2、4、6、8、10周随机采血，收集血清，用于抗体效价检测。
2.3ELISA检测抗体效价
通过间接ELISA方法测定对罗非鱼体内产生的抗Sip蛋白的特异性抗体。ELISA按常规方法进行。将经PBS稀释后的无乳链球菌抗原加入96孔酶标反应板孔内，每孔100μL，4℃过夜包被，PBST（含0.02%Tween-20的PBS）洗涤3次（5min/次）后，用1%牛血清白蛋白BSA填塞，4℃封闭过夜，用PBST轻轻冲洗96孔板3次。样品血清作连续2倍稀释加入到96孔板中，每孔100μl，37℃水浴孵育1.5h，PBST洗涤3次（5min/次）后，加兔抗罗非鱼IgM抗体（1:1000），37℃孵育1h，用PBST轻轻冲洗96孔板3次后，加入100μl羊抗兔IgG-HRP酶标抗体（1:2000），37℃水浴孵育1.5h，PBST洗涤3次（5min/次），每孔加入100μlTMB底物进行显色，反应终止后的酶标板在450nm处测量每孔的OD值，以（OD免疫组/OD对照组）≥2.1可判为阳性,反之则为阴性。阳性反应的最大稀释度为待测血清的效价。
技术路线如图10所示。
2.4免疫保护力测定
在每组免疫程序结束后（不含当日）的第1周，于30℃水温下，用50LD50的无乳链球菌菌株肉汤（3.4×108cfu/尾）对各个试验组的罗非鱼进行活菌攻毒，0.2ml/尾，腹腔注射。统计30d内各组鱼的感染和死亡情况，并按照下列公式计算相对免疫保护率（Relative percent survival，RPS）：
RPS（%）=（对照组死亡率-实验组死亡率）/对照组死亡率×100%
3结果
3.1血清抗体效价
3.1.1灌胃组罗非鱼抗体效价
灌胃方式免疫的结果如表5和图11所示：
表5灌胃组ELISA结果统计
Figure BDA0000483647020000121
备注：“/”代表阴性，即免疫组与对照组吸光度比值小于2。
如表5和图11所示：
1、空载体对照和阴性对照，均无抗无乳链球菌的特异性抗体产生，接种本发明口服疫苗后，则有抗无乳链球菌的特异性抗体产生；
2、接种剂量为2×107cfu/ml～2×109cfu/ml时，随着接种剂量的增加，抗无乳链球菌的特异性抗体出现的时间更早，效价更高。
实验结果说明，以灌胃的方式接种本发明口服疫苗后，机体可以产生抗无乳链球菌的特异性抗体。
3.1.2拌料组罗非鱼抗体效价
拌料方式免疫结果如表6和图12所示：
表6拌料组ELISA结果统计
Figure BDA0000483647020000131
备注：“/”代表阴性，即免疫组与对照组吸光度比值小于2。
如表6和图12所示：
1、空载体对照和阴性对照，均无抗无乳链球菌的特异性抗体产生，接种本发明口服疫苗后，则有抗无乳链球菌的特异性抗体产生；
2、接种剂量为1×107cfu/ml～1×109cfu/ml时，随着接种剂量的增加，抗无乳链球菌的特异性抗体出现的时间更早，效价更高。
实验结果说明，以拌料的方式接种本发明口服疫苗后，机体可以产生抗无乳链球菌的特异性抗体。
3.2免疫保护率
3.2.1灌胃组免疫保护率
攻毒前，各组罗非鱼均未出现死亡等异常现象；
攻毒后的死亡率图13～图15所示：在攻毒后20天内，空载体组和PBS组罗非鱼均全部死亡，死亡率为100%；攻毒后30天时，按107、108、109cfu/尾/次的剂量分别免疫接种本发明口服疫苗组，免疫1次时，死亡率分别为80%、73%、67%（只免疫1次）；免疫2次时，死亡率分别为70%、60%、53%（免疫两次）；免疫2次时，死亡率分别为53%、47%、43%（免疫三次）。
实验结果表明，本发明疫苗后，按107、108、109cfu/尾/次的剂量分别免疫接种本发明口服疫苗后，罗非鱼获得的抗无乳链球菌感染的相对保护率分别为20%、27%、33%（只免疫1次）；30%、40%、47%（免疫两次）和47%、53%、57%（免疫三次）。
实验结果说明，以灌胃的方式接种本发明口服疫苗后，可以有效保护机体免受感染，提高存活率，保护效果随着免疫剂量和免疫次数的增加而增加。
3.2.2拌料组免疫保护率
整个试验期间，攻毒前，各组罗非鱼均未出现死亡等异常现象。罗非鱼按日口服约体重1%的免疫饲料量（约1g），分别免疫接种浓度为107、108、109cfu/g的免疫饲料，并进行了单个及多个免疫流程对比。
攻毒后的死亡率图16～图18所示：在攻毒后20天内，空载体组和PBS组罗非鱼均全部死亡，死亡率为100%；攻毒后30天时，按107、108、109cfu/尾/次的剂量分别免疫接种本发明口服疫苗组，免疫一个流程时，死亡率分别为77%、70%、67%；免疫两个流程时，死亡率分别为70%、57%、50%；免疫三个流程时，死亡率分别为63%、40%、37%。
实验结果表明，本发明疫苗后，按107、108、109cfu/尾/次的剂量分别免疫接种本发明口服疫苗后，罗非鱼获得的抗无乳链球菌感染的相对保护率分别为23%、30%、33%（只进行了一个免疫流程）；30%、43%、50%（进行了两个免疫流程）和37%、60%、63%（进行了三个免疫流程）。
实验结果说明，以拌料的方式接种本发明口服疫苗后，可以有效保护机体免受感染，提高存活率，保护效果随着免疫剂量和免疫次数的增加而增加。
因此，本发明口服疫苗可以诱导机体产生抗无乳链球菌的特异性抗体，对机体的保护率高，最高可以达到63%。
综上，本发明口服疫苗最的保护率高，最高可达63%，可以有效保护罗非鱼免受无乳链球菌感染，给药方便，操作简单，免疫应激反应小，安全，应用前景优良。
Figure IDA0000483647110000011
Figure IDA0000483647110000021

Claims (10)

1.SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
2.一种重组载体，其特征在于：它包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组pVAX1载体。
4.一种重组菌，其特征在于：它包含权利要求2或3所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为重组减毒沙门氏菌。
6.根据权利要求5所述的重组菌，其特征在于：所述重组减毒沙门氏菌为重组减毒沙门氏菌SL7207。
7.权利要求4～6所述重组菌在制备无乳链球菌口服疫苗中的用途。
8.一种无乳链球菌口服疫苗，其特征在于：它是由权利要求4～6任意一项所述重组菌和药学上可接受的辅料或者载体制备而成。
9.权利要求8所述的口服疫苗在制备预防无乳链球菌病的药物中的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于：所述的无乳链球菌病为罗非鱼无乳链球菌病。
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