CN107523531A - 一种含有pMG36e‑pgsA‑gp85重组质粒的基因工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含有pMG36e‑pgsA‑gp85重组质粒的基因工程菌，通过将gp85基因与pgsA基因插入大肠杆菌‑乳酸菌穿梭型表达载体pMG36e中获得重组载体pMG36e‑pgsA‑gp85，之后将其电转进植物乳杆菌工程菌株中构建了能表达pgsA‑gp85融合蛋白的植物乳杆菌工程菌株，菌株可表达获得对应的pgsA‑gp85融合蛋白，该融合蛋白可广泛应用于口服免疫中，能大大提高鸡只各期平均日增重，且能提高鸡体抵抗ALV‑J感染的能力，从而有利于增加养殖效益，降低ALV‑J感染鸡体的风险。

Description

一种含有pMG36e-pgsA-gp85重组质粒的基因工程菌

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体提供了一种含有pMG36e-pgsA-gp85重组质粒的基因工程菌。

背景技术

J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus subgroup J,ALV-J)是1988年首次从肉用型鸡中分离得到，主要引发鸡的髓细胞组织增生和肾瘤。该病已经迅速蔓延到许多国家，给世界养禽业造成巨大的损失。

目前还没有商品化的疫苗用于防治ALV-J感染，国外主要通过净化种鸡群的办法来防控ALV-J。但是由于养殖的大环境已经污染，所以只依靠净化来完全控制ALV-J感染是不可能的。最近几年，许多专家学者也都尝试研制ALV-J灭活苗和弱毒苗，但是由于灭活病毒的同时也破坏了其诱导产生抗体的能力，而且该病毒的抗原结构复杂，要想得到理想的弱毒苗十分困难。因此，研制新型有效的ALV-J疫苗势在必行。

从抵抗微生物病原感染的角度看，研制黏膜疫苗已成为热点方向。保护机体免于病原体侵犯的第一道屏障是黏膜系统，80％以上的细菌、病毒和寄生虫感染动物机体都起始于黏膜表面。机体的黏膜系统是由泌尿生殖系统、呼吸系统和消化系统组成的，另还包括眼结膜、内耳膜、外分泌腺等，所以对抗外来物入侵就只需要刺激引起黏膜免疫一个点即可刺激全身的黏膜免疫系统来完成。黏膜免疫应答可诱导保护性抗体的产生如IgM、sIgA和IgG等，也可诱导黏膜细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocytes,CTL)发生反应，分泌产生CD4+T细胞和IFN-γ，机体预防和清除外来病原体入侵的防御能力被大大加强(Holmgren et.al.,2005)；因此说明，刺激黏膜免疫应答可相继刺激整个机体系统发生免疫应答反应，从而全身的机体被动员来对抗外来病原微生物的入侵和伤害。

具有益生特性的植物乳杆菌也是良好的外源蛋白运输载体系统，通过该菌表达的口服药用蛋白可在一定程度上有效地发挥防治疾病的作用。口服重组植物乳杆菌引起的黏膜免疫应答不仅仅局限于肠道固有层，受该菌及其相关抗原刺激的淋巴细胞从消化道Peyer氏结感应位点向鼻相关淋巴组织反应位点迁移，从而使口服该重组菌的机体对非消化道病原产生免疫保护效应。正是由于黏膜免疫系统的相通性，重组植物乳杆菌才有机会介导全身黏膜免疫保护作用。

Sorving等将构建好的Psip质粒导入植物乳杆菌内，成功地进行了外源蛋白的表达。Shi等将构建好的Psip409质粒导入植物乳杆菌内，成功地表达出H9N2病毒的血凝素基因，该重组菌口服免疫小鼠后发现其特异性抗H9N2病毒的sIgA、IgG、HI抗体效价都显著性上升并发生CD8+T细胞的免疫应答。郭红敏等将构建好的Psip-409-Ompc-DC导入植物乳杆菌内，成功地表达出Ompc-DC蛋白，该重组菌口服免疫雏鸡后对鸡白痢产生良好的免疫效果。除此，重组植物乳杆菌也成功地进行了多种酶的表达。

另外，从植物乳杆菌作为一种肠道优势菌群的角度而言，该菌株可通过其分泌的乳酸、细菌素等物质对其他菌产生作用，从而调整或维持菌群内部关系来形成稳固的生物学屏障，从而保证肠道微生态平衡。从机体感染肠道致病菌时，植物乳杆菌通过对病原菌必需生长物质的掠夺及黏附作用的排斥来抑制其侵入和定植。此外，相关研究还表明植物乳杆菌在医疗保健方面(消化道疾病、过敏性疾病和心脑血管疾病等)也发挥着重要的防治作用。

口服植物乳杆菌疫苗为常规疫苗发展开辟了一条新颖的并极具可行性的途径，为未来疫病的防治提供宝贵的思路。

pMG36e来源于pWV01载体，是经过人工改造的pWV01衍生载体，质粒大小约为3.6kb，便于为宿主所携带转运，能够把外源蛋白在多种细菌中进行表达；目前已成功在乳杆菌属、乳球菌属和链球菌属中进行其他外源蛋白基因的表达。它是由以乳酸乳球菌乳脂亚种蛋白酶基因的转录和翻译信号为基础构建而成。质粒pMG36e是由下述的主要六个部分构成：强启动子p32、多克隆位点、pWV01复制子、下游的部分开放阅读框、来自于乳酸乳菌乳脂亚种的蛋白酶基因的转录终止子和来自于质粒pE194的红毒素抗性基因Emr。

1993年，Roy等将大肠杆菌MnSOD克隆到表达载体pMG36e中，并分别电转化到携带SOD的乳酸乳球菌中和缺乏SOD的加氏乳杆菌中。1996年，Franke等借助于pMG36e表达了lcnD基因，与β-半乳糖苷酶融合的细菌素转运和成熟密切相关，为乳球菌素的运输机制的深入研究提供了基础。2000年，Xing等还利用pMG36e克隆表达了人类谷胱甘肽基因hGSTA1；2007年，张安勇等成功利用pMG36e构建成pMG36e-P30重组载体，并电转到乳酸乳球菌，免疫小鼠，结果证实该重组口服疫苗能诱发小鼠特异性体液免疫，促进发生细胞免疫应答。目前，已用pMG36e质粒来进行多种外源目的基因的表达，丰富了有关乳酸菌基因工程及分子生物学的研究的理论依据，其应用涉及多个重要领域(如食品、保健、医药等)，同时也作为重要的分子克隆工具为其他相关学科的深入研究打下了基础。

研究发现ALV-J基因组主要含有3个基因：gag、pol和env。病毒的env基因编码病毒的包膜，其亚群特异性是由env-gp85基因编码的表面囊膜蛋白所决定。其中gp85负责识别靶细胞膜上的特异性病毒受体，属于病毒的外膜蛋白，是病毒表面的球状结构，它决定了ALSV的亚群特异性，并带有病毒受体决定簇，在侵染易感细胞时起到粘附作用，并可以诱导机体产生特异性的抗体；我国近年来不断地对ALV-J的env的gp85蛋白加以研究，2013年，Dou等人表达ALV-J重组gp85囊膜蛋白，利用CpG佐剂和弗氏佐剂与重组蛋白结合免疫鸡群，检测鸡只体内的母源抗体水平，产生较好的免疫效果；2014年，Zhang等人报道，将ALV-J重组gp85囊膜糖蛋白利用脂质体进行包被后进行免疫，检测鸡体抗体水平，产生较好的免疫效果；2016年Cheng等利用二氧化硅纳米颗粒作为疫苗佐剂与ALV-J重组gp85囊膜糖蛋白结合免疫鸡群，取得了一定的效果。上述相关工作都为后续研制ALV-J亚单位疫苗提供了丰富的理论依据。

聚-γ-谷氨酸合成酶A(Poly-γ-Glutamic A,pgsA)来自于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtlis)，pgsA的N端第26-42氨基酸残基处有一个跨膜区，该跨膜区的存在为其成为细菌表面展示元件创造了条件，它可将外源蛋白锚定在宿主菌表面。例子Nanta等首次成功地应用pgsA锚定基因序列与来源不同的酶结合并成功展示到大肠杆菌表面，因该系统表面展示效率较高，相关学者又将pgsA锚定基因应用于革兰氏阳性菌的膜蛋白表面展示研究。Lee等以菌株表面展示元件pgsA蛋白将非典型肺炎病毒(Severe Acute RespiratorySyndrome,SARS)相关糖蛋白表达于干酪乳杆菌(Lb.casei)表面，后续研究表明该重组菌可有效地诱导机体产生黏膜免疫，充分规避了传统疫苗的常见缺点。Poo等以菌株表面展示元件pgsA蛋白将人的乳头瘤状病毒16型E7蛋白成功地锚定于干酪乳杆菌表面，将该重组菌口服免疫C57/BL6小鼠，成功地诱导机体产生黏膜免疫。

鉴于pgsA蛋白的特性，它已应用于多种原核蛋白的表面展示，特别是其在乳酸菌等革兰氏阳性受体菌株中都有成功应用的范例，这为我们研究如何将外源药用蛋白锚定在植物乳杆菌细胞壁表面提供了理论基础。

而如何利用上述现有技术获得植物乳杆菌工程菌株进而获得可以提高鸡体抵抗ALV-J感染的能力的口服疫苗成为本领域亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的空白，本发明提供了一种含有pMG36e-pgsA-gp85重组质粒的基因工程菌，通过将gp85基因与pgsA基因插入大肠杆菌-乳酸菌穿梭型表达载体pMG36e中获得重组载体pMG36e-pgsA-gp85，之后将其电转进植物乳杆菌工程菌株中构建了能表达pgsA-gp85融合蛋白的植物乳杆菌工程菌株，菌株可表达获得对应的pgsA-gp85融合蛋白，该融合蛋白可广泛应用于口服免疫中，能大大提高鸡只各期平均日增重，且能提高鸡体抵抗ALV-J感染的能力，从而有利于增加养殖效益，降低ALV-J感染鸡体的风险。

本发明所采用的技术方案是：

一种含有pMG36e-pgsA-gp85重组质粒的基因工程菌，其保藏编号为CGMCCNo.14209，该基因工程菌为植物乳杆菌；

其中所含有的pMG36e-pgsA-gp85重组质粒，其获得方法如下：

分别设计了两对针对gp85和pgsA基因的引物，从J亚群禽白血病病毒env基因中扩增出gp85囊膜糖蛋白基因；从枯草芽孢杆菌全基因中的pgsA,pgsB and pgsC基因中扩增出pgsA锚定蛋白基因；其中gp85基因片段其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；pgsA基因片段其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

将上述两个蛋白基因分别克隆至大肠-乳酸杆菌穿梭表达载体pMG36e中。将鉴定出的阳性质粒gp85和pgsA和表达载体pMG36e分别用Sac I、Xba I和Hind III单酶切回收后，连接获得阳性重组质粒pMG36e-pgsA-gp85，并测序鉴定；

在获得上述重组载体质粒pMG36e-pgsA-gp85后，以电转化法将其转入植物乳杆菌中，获得含有pMG36e-pgsA-gp85重组质粒的基因工程菌，并对其进行生物保藏；利用Western-blot鉴定蛋白的免疫原性，再利用流式细胞技术检测蛋白在细菌表面的表达情况；

将含重组质粒的植物乳杆菌口服免疫SPF海兰褐蛋公鸡雏鸡，免疫接种后检测不同时间段抗体水平；同时在免疫7周后，对试验鸡进行攻毒保护性试验。

结果证明口服免疫雏鸡后，能增强鸡体产生特异性抗ALV-J的免疫应答反应；攻毒后表现出良好的免疫保护效果。

更进一步的，本申请的具体技术方案如下：

pMG36e-pgsA-gp85重组质粒的获得：

(1)设计特异性引物：

目的片段pgsA的PCR扩增中使用PCR引物5′-CGAGCTCGCGAACTGAGCTTTCATGAAAAG-3′，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；5′-CTAGTCTAGACTATGATCAATATCAAACGTCA-3′，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

目的片段gp85的PCR扩增中使用PCR引物5′-TCATCTAGAGGGAGTTCATCTGTTG-3′，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和5′-TCCAAGCTTATTAGCGCCTGCTAC-3′，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示；

利用上述引物从J亚群禽白血病病毒env基因中扩增出gp85囊膜糖蛋白基因；从枯草芽孢杆菌全基因中的pgsA,pgsB and pgsC基因中扩增出pgsA锚定蛋白基因；

(2)将步骤(1)获得的gp85与pgsA基因的PCR产物分别连接到两个单独的pMD18-T载体上；

(3)将食品级穿梭表达载体pMG36e与步骤(2)获得的含gp85与pgsA基因的T载体用限制性内切酶(Sac I、Xba I、Hind III)分别酶切后通过T4连接酶进行分步连接；

(4)将步骤(3)获得的连接产物转化进大肠杆菌，最后通过PCR、酶切鉴定方法验证阳性克隆菌；

(5)将重组载体电转化进入植物乳杆菌，然后通过SDS-PAGE、Western-blot、流式细胞技术验证表达；

其中步骤(3)中采用Xba I与Hind III酶对pMG36e载体与步骤(2)获得的含gp85基因的T载体分别酶切，后通过T4连接酶进行连接，再采用Sac I与Xba I酶将此连接产物pMG36e-gp85与步骤(2)获得的含pgsA基因的T载体分别酶切，后通过T4连接酶进行连接,获得重组质粒pMG36e-pgsA-gp85；

本发明所获得的重组载体pMG36e-pgsA-gp85电转进植物乳杆菌工程菌株后发现pMG36e-pgsA-gp85重组植物乳杆菌能对gp85蛋白进行表达并能将其稳定地锚定在细菌表面上。口服免疫SPF雏鸡后发现，pMG36e-pgsA-gp85重组植物乳杆菌可以引起较高水平的特异性抗ALV-J的IgG与IgA抗体水平，通过对病毒血症的检测观察可以发现，pMG36e-pgsA-gp85重组植物乳杆菌对ALV-J病毒表现出良好的免疫保护效果。为J亚群禽白血病重组乳酸菌口服疫苗的研制提供了可靠的实验数据和科学依据，同时也为其他囊膜病毒病的防治提供了新的研究思路与理论参考。

针对上述的植物乳杆菌工程菌株，发明人进行了生物保藏，保藏信息如下：保藏信息

保藏时间：2017年06月01日

保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC

保藏编号：CGMCC No.14209

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所

分类命名:植物乳杆菌lactobacillus plantarum

附图说明

图1为重组质粒构造示意图；

图2为PCR扩增产物电泳示意图，

图中M为Super DNA Maker；图2A中1和2泳道为gp85PCR产物，936bp,图2B中1和2泳道为pgsA PCR产物，1155bp,与预期结果大小一致；

图3为重组质粒pMG36e-gp85的双酶切鉴定示意图，

图中M为DL 5000DNA marker；1泳道为重组质粒pMG36e-gp85经Xba Ⅰ and HindⅢ双酶切后结果，3592bp的pMG36e片段和930bp的gp85基因片段；

图4为重组质粒pMG36e-pgsA-gp85的双酶切鉴定示意图，

图中M为Super DNA marker；1泳道为重组质粒pMG36e-pgsA-gp85经SacⅠ and XbaⅠ双酶切后结果，约4500bp的pMG36e-gp85片段和1143bp的pgsA基因片段；

图5为重组质粒pMG36e-pgsA-gp85的PCR验证结果，

图5A中M为1kb Ladder；1泳道为gp85PCR产物；图5B中M为Super DNA marker；1泳道为pgsA PCR产物；

图6为重组融合蛋白pgsA-gp85(未纯化)的SDS-PAGE结果示意图，

图中M为预染蛋白质Marker；1为重组融合蛋白pgsA-gp85，其为69KD；

图7为重组蛋白的Western blot结果，

图中M为预染蛋白质Marker；1为重组融合蛋白pgsA-gp85，其为69KD；

图8为流式细胞仪检测直方图，

其中分别用单抗JE9作为一抗，FITC标记的鼠源IgG作为二抗检测A、B、D，鼠源IgG作为二抗检测C，图中A为植物乳杆菌；B为pMG36e-gp85重组植物乳杆菌；C和D为pMG36e-pgsA-gp85重组植物乳杆菌，图中的P1部分表示选中的菌群，P3部分表示表面蛋白的荧光强度；

图9为图8中P3部分表面蛋白的荧光数量柱状示意图；

图10为口服免疫鸡血清中特异性IgG水平；

图11为口服免疫鸡胆汁、十二指肠洗液和血清中sIgA水平；A：胆汁中sIgA水平B:十二指肠洗液中sIgA水平C:血清中sIgA水平；

图12为免疫后各组鸡体重检测结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞购自TaKaRa生物技术公司、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)HQ542228菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心；pMD18-T Vector Cloning Kit；pMG36e vector试剂盒购自TaKaRa生物技术公司；限制性内切酶Sac I、Xba I和Hind III，T4DNA Ligase和Taq DNA聚合酶都购自Takara生物技术有限公司。

实施例1 gp85基因与pgsA基因的扩增

(1)设计特异性引物：

目的片段pgsA的PCR扩增中使用PCR引物5′-CGAGCTCGCGAACTGAGCTTTCATGAAAAG-3′，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；5′-CTAGTCTAGACTATGATCAATATCAAACGTCA-3′，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

目的片段gp85的PCR扩增中使用PCR引物5′-TCATCTAGAGGGAGTTCATCTGTTG-3′，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示和5′-TCCAAGCTTATTAGCGCCTGCTAC-3′，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示；

利用上述引物从J亚群禽白血病病毒env基因中扩增出gp85囊膜糖蛋白基因；从枯草芽孢杆菌全基因中的pgsA,pgsB and pgsC基因中扩增出pgsA锚定蛋白基因；结果如图2所示；

gp85的PCR扩增体系与条件：以pMD18T-env(Limei Zhang,Dongjie Cai,XiaonaZhao,et al.Lipsomes containing recombinant gp85protein vaccine against ALV-Jin chickens[J].Vaccine,2014,32:2452-2456.)为模板，用gp85引物进行PCR扩增：

采用20μl的反应体系:10×PCR Buffer 2.4μl；dNTP 2μl(2.5mM)；上、下游引物各lμl(25umol/L)；重组质粒模板1μl；Taq DNA聚合酶0.6μl(1U/μl)；补充去离子水至11.4μl。PCR的循环参数为:94℃预变性5min；94℃变性30s；58℃60s退火；72℃延伸l min，共30个循环，最后72℃延伸10min。

所获得的gp85片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

pgsA的PCR扩增体系与条件：以pgsA，pgsB和pgsC(Chun-Hua Wei,Jian-Kui Liu,Xi-Lin Hou,et al.Immunogenicity and protective efficacy of orally orintranasally administered recombinant Lactobacillus casei expressing ETEC K99[J].Vaccine.2010,28:4113-4118.)为模板，用pgsA引物进行PCR扩增：

采用20μl的反应体系：质粒模板1μl；上、下游引物各lμl(25umol/L)；Taq DNA聚合酶0.6μl(1U/μl)；dNTP 2μl(2.5mM)；10×PCR Buffer 2.4μl；去离子水补充至11.4μl。PCR的循环参数设置为：94℃5min预变性；94℃30s变性；58℃60s退火；72℃l min 12s延伸，共30个循环，最后72℃延伸10min。

所获得的pgsA片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

实施例2

将步骤(1)获得的gp85与pgsA基因的PCR产物分别连接到两个单独的pMD18-T载体上；

将pMD18-T载体与纯化回收的两个目的基因片段分别进行连接，连接体系为pMD18-T载体0.5μl，SolutionⅠ5.0μl,纯化PCR产物4.5μl。将连接产物混匀，稍作离心去除气泡，放置于16℃连接8-10h,然后放于4℃保存备用。

实施例3重组质粒pMG36e-pgsA-gp85的获得

表达载体pMG36e与gp85目的基因片段的双酶切回收

表达载体pMG36e和目的基因gp85片段分别经Hind Ⅲ和Xba Ⅰ双酶切。采用50μl的酶切体系：10×M Buffer，6μl；Xba Ⅰ和HindⅢ各3μl；gp85/pMG36e15μl；补充ddH₂O 23μl。把反应物按照以上体系混匀，37℃水浴3h。用胶回收试剂盒纯化回收pMG36e载体片段和目的片段gp85。产物回收纯化后用1％琼脂糖凝胶电泳观察回收情况。

目的基因gp85与表达载体pMG36e的连接转化

a.连接：将胶回收的酶切载体片段与酶切目的片段进行连接。采用20μl连接体系：pMG36e 8μl；gp85片段8μl；T4DNA Ligase 2μl；10×T4ligase Buffer 2μl。将以上物质混合后，16℃连接仪中连接过夜。

b.转化：从-70℃超低温冰箱中取出冻存的DH5感受态细胞，在冰水混合物中，迅速冻融，在无菌条件下，将10μl连接产物与感受态细胞混匀，冰浴30min然后放入42℃恒温水浴锅热休克90s，后立即取出冰浴2min，之后迅速加入1mL LB液体培养基，在37℃摇床上150r震荡温育培养45min，取出后将培养物5000r/min离心5min，弃去上清，只留下约100μl菌液，吹打混匀后将其涂于LB平板(含Emr+300μg/mL)，放置37℃培养箱中倒置过夜培养。

重组质粒pMG36e-gp85的提取

使用TIANGEN DP103质粒小提试剂盒提取质粒

从转化板上，挑取生长状态良好单个菌落，无菌接种至5mL含300ug/mL Emr+LB液体培养基中，37℃振荡培养12h后，收集菌液提取质粒，操作步骤具体如下：

a.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

b.收集已培养12-16h的菌液，吸取1.5mL菌液于无菌l.5mL离心管中，12000r/min离心1min，弃去上清，如此重复2-3次，收集菌体；

c.向离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用漩涡振荡器或移液器彻底悬浮细菌沉淀；

d.向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

e.向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，12000r/min离心10min；

f将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

g.向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中；

h.向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

i.重复步骤8；

j.将吸附柱CP3放入收集管中，12000r/min离心2min，目的是将吸附柱中的残留漂洗液去除；

k.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000r/min离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

1％琼脂糖核酸凝胶电泳，观察鉴定后，可直接用于后续实验或置于-20℃冰箱中保存。

重组质粒pMG36e-gp85的鉴定

a.重组质粒的pMG36e-gp85PCR鉴定

无菌操作下，挑取单菌落，接种于10mL LB液体培养基(含300ug/mL Emr+)中，37℃培养14h后提取质粒，把1％琼脂糖核酸凝胶电泳鉴定为阳性的pMG36e-gp85重组质粒作为模板，进行PCR鉴定。选用20μl的PCR反应体系：重组质粒DNA 0.5μl；gp85上下游引物各1μl；dNTP 2μl；Taq DNA聚合酶0.6μl；10×PCR Buffer 2.4μl；补充ddH₂O 11.9μl。

设置好的PCR反应循环参数如下：预变性94℃5min；变性94℃30s；退火58℃60s；延伸72℃l min，共30个循环，最后延伸72℃10min。1％琼脂糖核酸凝胶电泳观察鉴定PCR产物,如图5A泳道1所示：约930bp gp85PCR产物。

b.重组质粒pMG36e-gp85的双酶切鉴定

将PCR鉴定后的重组质粒pMG36e-gp85经Hind Ⅲ和Xba Ⅰ进行双酶切，鉴定采用10μl反应体系：重组质粒DNA 6μl Hind Ⅲ和Xba Ⅰ各0.25μl；10×M Buffer 1μl；ddH2O 2.5μl。把反应物按上述体系混匀，37℃作用3h后，1％琼脂糖核酸凝胶电泳观察鉴定,结果如图3所示:3592bp的pMG36e片段和930bp的gp85基因片段。

表达载体pMG36e-gp85与目的基因pgsA片段的双酶切回收

表达载体pMG36e-gp85和目的基因pgsA片段分别经Sac Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切。采用60μl的酶切体系：pMG36e-gp85/pgsA各15μl；Sac Ⅰ和Xba Ⅰ各3μl；10×M Buffer，6μl；补充ddH₂O 33μl。把反应物按照以上体系混匀，37℃水浴3h。胶回收试剂盒回收纯化pMG36e-gp85载体片段和目的片段pgsA。用1％琼脂糖核酸凝胶电泳观察纯化后产物的回收情况。

目的基因pgsA与表达载体pMG36e-gp85的连接转化

a.连接：将酶切后回收的载体片段与目的基因片段进行连接。采用10μl连接体系：pMG36e-gp85 4μl；pgsA片段4μl；T4DNA Ligase 1μl；10×T4l igase Buffer 1μl。将以上物质按上述比例混合后，16℃连接仪连接过夜。

b.转化：从-70℃超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态，在冰水混合物中，迅速冻融，在无菌条件下，将10μl连接产物与感受态细胞混匀，冰浴30min然后放入42℃恒温水浴锅热休克90s，后立即取出冰浴2min，之后迅速加入1mL LB液体培养基，在37℃摇床上150r震荡温育培养45min，取出后将培养物5000r/min离心5min，弃去上清，只留下约100μl菌液，吹打混匀后将其涂于LB平板(含Emr+300ug/ml)，放置37℃培养箱中倒置过夜培养。

重组质粒pMG36e-pgsA-gp85的提取

使用TIANGEN DP103质粒小提试剂盒提取质粒

从转化板上，挑取生长状态良好单个菌落，无菌接种至5mL含300ug/mL Emr+LB液体培养基中，37℃振荡培养12h后，收集菌液提取质粒，操作步骤具体如下：

a.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

b.收集已培养12-16h的菌液，吸取1.5mL菌液于无菌l.5mL离心管中，12000r/min离心1min，弃去上清，如此重复2-3次，收集菌体；

c.向离心管中加入250μl溶液P1(请先检查是否已加入RNaseA)，使用漩涡振荡器或移液器彻底悬浮细菌沉淀；

d.向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解。

e.向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀，12000r/min离心10min；

f.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3(吸附柱放入收集管中)，注意尽量不要吸出沉淀，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

g.向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中；

h.向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW(请先检查是否已加入无水乙醇)，12000r/min离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

i.重复步骤8；

j.将吸附柱CP3放入收集管中，12000r/min离心2min，目的是将吸附柱中的残留漂洗液去除；

k.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2min，12000r/min离心2min将质粒溶液收集到离心管中。

1％琼脂糖核酸凝胶电泳，观察鉴定后，可直接用于后续实验或置于-20℃冰箱中保存。

重组质粒pMG36e-pgsA-gp85的鉴定

a.重组质粒的pMG36e-pgsA-gp85PCR鉴定

无菌操作下，挑取单菌落，接种于10mL LB液体培养基(含300ug/mL Emr+)中，37℃培养14h后提取质粒，把凝胶电泳鉴定为阳性的pMG36e-pgsA-gp85重组质粒作为模板,进行PCR鉴定。采用20μl的反应体系：重组质粒DNA 0.5μl；pgsA上下游游引物各1μl；Taq DNA聚合酶0.6μl；dNTP 2μl；10×PCR Buffer2.4μl；补充ddH2O 11.9μl。

设置好的PCR反应循环参数如下：预变性94℃5min；变性94℃30s；退火58℃60s；延伸72℃l min 12s，共30个循环，最后延伸72℃10min。用1％琼脂糖凝胶电泳观察鉴定PCR产物,如图5B泳道1所示：约1143bp pgsA PCR产物。

b.重组质粒pMG36e-pgsA-gp85的酶切鉴定

将PCR鉴定后的重组质粒经Sac Ⅰ和Xba Ⅰ进行双酶切，鉴定采用10μl反应体系：重组质粒DNA 6μl Sac Ⅰ和Xba Ⅰ各0.25μl；10×M Buffer 1μl；ddH2O 2.5μl。把反应物按以上体系混匀，37℃作用3h后，1％琼脂糖核酸凝胶电泳观察鉴定,结果如图4所示：约4500bp的pMG36e-gp85片段和1143bp的pgsA基因片段。

实施例4pMG36e-pgsA-gp85重组植物乳杆菌的构建

植物乳杆菌感受态细胞的制备

a.从-70℃冰箱取出植物乳杆菌HQ542228，于无抗性的MRS固体培养基上划线接种，37℃厌氧培养12h；

b.在划线过夜后的MRS平板上，挑取单菌落，接种于5mL MRS液体培养基中37℃静止培养过夜；

c.将培养得到产物次日按2％的比例，接种于50mL MRS液体培养基中，37℃静止培养；

d.当培养物OD600达0.5～0.6时，将培养物置冰上10～15min，分装2mL离心管，4000r/min离心10min收集菌体；

e.用预冷的洗液(0.15mmol/L氯化镁和5mmol/L)磷酸钠)轻轻地将沉淀悬浮，4000r/min离心10min，如此重复洗涤3次；

f.用50μl预冷的悬液(0.15mmol/L氯化镁、5mmol/L磷酸钠和0.3mmol/L蔗糖)轻轻将沉淀悬浮，-70℃保存备用或直接用于电转。

重组质粒电转化进植物乳杆菌

a.取重组质粒pMG36e-pgsA-gp85 3μl加入植物乳杆菌感受态细胞中，冰上静置15min；

b.将混有质粒的植物乳杆菌感受态细胞全部加入干燥的2mm电击杯(事先浸泡在75％乙醇)中，冰上静置10min；

c.把电击杯用滤纸擦干，放入到电转化仪中，按2.0KV电压、25uF电容、400Ω电阻等参数快速电脉冲，脉冲时间为4ms；

d.电脉冲后，立即向电击杯中加入含0.5％甘氨酸MRS液体培养基1mL，混合后，全部转入Eppendorf管中，37℃静止培养1h；

e.取50μl培养物均匀涂布于含5ug/mL红霉素MRS固体培养基中，37℃静止厌氧培养12-24h即可看到单菌落，对其进行生物保藏，其保藏编号为CGMCC No.14209。

实施例5 pMG36e-pgsA-gp85重组植物乳杆菌质粒的蛋白表达及Western-blot结果

把鉴定好的pMG36e-pgsA-gp85重组植物乳杆菌按2％接种于1mL MRS液体培养基中，37℃静止培养过夜。次日按2％将活化的菌液接种于10mL MRS培养基内。37℃静止培养6h左右，当菌液OD600约为1.0时开始取样。取2mL样品，7000r/min离心1min收集菌体，加入l0mg/mL溶菌酶400μl，37℃水浴30min，7000r/min离心1min收集菌体，加入4×上样缓冲液(含DTT)，用漩涡震荡器混匀，沸水浴中煮沸10min，l0000r/min离心5min，取15μl上清，以10％分离胶10mL，5％浓缩胶3mL进行配胶进行SDS聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。

将未经破碎的表达蛋白菌体直接上样，进行SDS-PAGE后，按照半干式转移电泳槽的使用说明，进行转膜。把鼠源单克隆抗体(MAb JE9)作为第一抗体，HRP标记的羊抗鼠IgG(1：6000)作为第二抗体，进行常规Westen-blot检测。操作步骤具体如下：

a.剪6块3mm厚的滤纸和1块PVDF膜，其大小与待转凝胶一致。用甲醇浸泡PVDF膜，激活处理15s后再与剪好的滤纸一同放入转移缓冲液中浸泡30min；

b.在转印槽的板上依次放置：一层海绵、两层滤纸、蛋白胶、PVDF膜、两层滤纸，每一层都要排尽气泡(用玻璃棒)，且要注意PVDF膜和蛋白胶要大于滤纸防止短路，盖上阴极盖，200v、110mA，转膜90min，凝胶中的蛋白质即可转移至PVDF膜上；

c.转膜完成后，将转移好的膜放入TBST洗涤液中，漂洗3次，1次7min，取出后浸入5％脱脂奶粉中，于水平摇床上缓慢摇动，4℃封闭90min或过夜；

d.次日，用TBST溶液洗膜，洗3次，1次7min，将膜分别浸入l:500稀释鼠源阳性血清中，室温缓慢摇动2h；

e.用TBST溶液洗膜，洗3次，1次7min，后将膜分别浸入l：2000稀释HRP标记的羊抗鼠IgG阳性血清中，室温缓慢摇动2h；

f.用TBST溶液洗膜，洗3次，1次7min，最后将膜用DAB显色试剂盒进行操作并观察结果，并照相记录实验结果。

将重组表达载体pMG36e-pgsA-gp85转化至植物乳杆菌中，静置培养表达后将菌体直接上样进行SDS-PAGE分析，证明菌体得到正确表达，表达蛋白约为69KD大小，结果见图6泳道1。

转膜完成后的PVDF膜，分别与一抗鼠源单克隆抗体(MAb JE9)，二抗HRP标记的羊抗鼠IgG(1:6000)作用后，按DAB显色试剂盒中的操作说明显色，可观察到，重组菌在预期位置出现了约69KD的条带，与预计大小一致，结果见图7泳道1。

实施例6流式细胞术对外源蛋白在植物乳杆菌表面的定位检测结果

利用流式细胞术分别检测植物乳杆菌、pMG36e-gp85/Lb.plantarum重组植物乳杆菌和pMG36e-pgsA-gp85/Lb.plantarum重组植物乳杆菌细菌表面蛋白的荧光强度和数量。

将pMG36e-pgsA-gp85重组植物乳杆菌、pMG36e-gp85重组植物乳杆菌和植物乳杆菌分别培养6h，采用流式细胞术鉴定表达的外源蛋白是否定位在植物乳杆菌细胞表面，以下为具体的操作步骤：

a.取植物乳杆菌、pMG36e-gp85重组植物乳杆菌和pMG36e-pgsA-gp85重组植物乳杆菌菌液各l mL，离心收集菌体，PBS洗涤三次，用200目筛网过滤；

b.用PBS调整细胞浓度为3×10⁴个/mL，离心弃上清，加入5％脱脂乳4℃封闭过夜；

c.离心弃去上清，PBS洗涤三次，加入单抗JE9，4℃作用5h；

d.PBS洗涤三次，加入FITC标记羊抗鼠的IgG荧光二抗(l:100稀释)，4℃避光作用5h；

e.PBS洗涤三次后上样，流式细胞仪检测(FITC用氛离子激发荧光，发射光波波长为525nm，激发光波波长为488nm，产生绿色荧光)，保存图片，分析结果。

结果如图8和图9中的P3部分所示，pMG36e-pgsA-gp85/Lb.plantarum重组植物乳杆菌(D)表面蛋白的荧光强度和数量均明显高于植物乳杆菌(A)、pMG36e-gp85/Lb.plantarum重组植物乳杆菌(B)和未加FITC标记的鼠源二抗IgG处理过的pMG36e-pgsA-gp85/Lb.plantarum重组植物乳杆菌(C)，而A、B、C三者相比，表面蛋白的荧光强度和数量均无明显差异。上述结果说明pgsA锚定蛋白基因成功地把ALV-J gp85抗原蛋白表达在细菌表面上。

实施例7血清中ALV-J gp85特异性IgG的效价

如表1所示，以鉴定好的阳性重组pMG36e-pgsA-gp85植物乳杆菌为实验组，采用植物乳杆菌为阴性对照组，PBS为空白对照组进行口服免疫对其抗ALV-J的免疫效果进行评价，测定重组植物乳杆菌疫苗免疫雏鸡的血清抗体IgG效价，胆汁、十二指肠洗液及血清中的sIgA效价，体重的变化及攻毒后病毒血症的阳性检测率，来比较口服重组植物乳杆菌疫苗对ALV-J的免疫保护效果。

表1动物分组及免疫剂量

结果如下：

初次免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d、56d、63d、70d、77d、84d，各组分别翅静脉采血，检测血清中特异性ALV-J gp85IgG抗体效价。实验结果表明(图10)：实验组ALV-Jgp85IgG抗体水平明显高于对照组，且在首免后实验组ALV-J gp85IgG抗体水平出现显著性升高(p＜0.05)，而且在第三次免疫后，ALV-J gp85IgG抗体效价达到最高。而对照组抗体水平变化不大；

初次免疫后7d、14d、21d、28d、35d、42d、49d，各组分别采取胆汁、十二指肠洗液及血清进行ALV-J特异性IgA抗体的定性检测。试验结果表明：各阶段检测中，实验组胆汁、十二指肠洗液及血清样品的ALV-J特异性IgA抗体的检测结果均呈阳性，而对照组胆汁、十二指肠洗液及血清样品的ALV-J特异性IgA抗体的检测结果均呈阴性。具体如表2所示：

表2各组鸡胆汁、十二指肠洗液及血清样品的ALV-IgA抗体阳性率

将进行过ALV-J特异性IgA的定性检测后的鸡胆汁、十二指肠洗液及血清样品进行sIgA抗体的定量检测。试验结果表明(图11)：实验组胆汁、十二指肠洗液及血清样品中sIgA抗体效价均高于对照组，且实验组在首免后sIgA抗体水平明显升高(p＜0.05)，而且在第三次免疫后抗体效价达到高峰。对照组OD值变化不大；

各组分别于初次免疫后每周称量体重，直到第12周称重结束。从每组的体重结果可以看出(图12)：口服重组植物乳杆菌组，口服植物乳杆菌组体重水平一直高于空白对照组，而且相对于空白对照组，口服植物乳杆菌组的体重在第35d，42d和56d出现显著性增长，而口服重组植物乳杆菌组的体重在第35d，42d，56d，70d，77d以及84d出现显著性增长。对照组的体重水平一直低于口服重组植物乳杆菌组与口服植物乳杆菌组；

口服植物乳杆菌组、口服重组植物乳杆菌组和攻毒对照组分别于末免后攻毒并连续4周进行病毒血症检测，然后统计出阳性率；在攻毒后第3周对照组有鸡只死亡，根据剖检变化，确诊为禽白血病。口服重组植物乳杆菌组的保护率均大于口服植物乳杆菌组和攻毒对照组，并出现显著性差异(p＜0.05)，具体如表3所示：

表3攻毒后各组病毒血症阳性率

以上结果表明，重组植物乳杆菌作为疫苗免疫雏鸡，能显著提高血清中抗ALV-J的IgG抗体效价及胆汁、十二指肠洗液和血清中抗ALV-J的IgA抗体效价，促进体重增长及攻毒后表现出良好的免疫保护效果。

序列表

<110> 山东农业大学

<120> 一种含有pMG36e-pgsA-gp85重组质粒的基因工程菌

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

cgagctcgcg aactgagctt tcatgaaaag 30

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ctagtctaga ctatgatcaa tatcaaacgt ca 32

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

tcatctagag ggagttcatc tgttg 25

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

tccaagctta ttagcgcctg ctac 24

<210> 5

<211> 936

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tctagaggag ttcatctgtt gcaacaacca ggaaacgtgt gggtcacctg ggcgaatatg 60

acgggccgaa cagatttttg ccttagtcta cagtcagcga cctcaccatt ccgcacctgc 120

ttgataggca ttccacagta tcctctgaac acctttgagg gatatgtcac taatgttact 180

gcttgcgaaa acaacgccga tttagccaac caaacagcat gcttgataaa ggctctaaac 240

acaaccctcc cttgggaccc ccaagaattg gatattttag ggtctcagat gatcaagaac 300

ggaacaacac gtacgtgtgt tacctttggt tcgatgtgct ataaagagaa caatcacagc 360

agagtctgcc acaattttga tgggaatttt aatgggactg gtggggtgga agcagaattg 420

cgtgacctca tagcaaaatg gggcaaaggt gaccctcgta taagacccta tgtcaaccaa 480

tcatggacga tggtaagtcc aataaacaca gagagttttt caataagtag tagatattgt 540

ggattcacca gtaacgagac tcgttactat gaagggaact tttctaattg gtgcagttca 600

aaaggggggg aatggtcagt ggggtacagc aacgggacag attgttccag caacacgacg 660

gattgcggtg gtaattgtac agcggaatgg aattattatg catatgggtt taccttcggg 720

ggtaagccag agatattgtg gaataatggg actgctaagg cactcccacc aggtattttc 780

ttgatttgtg gggacagggc ttggcaaggc atcccgcgta acgccttggg agggccctgt 840

tatctaggac aattgactat gctctctcct aactttacca cctggataac atatgggccg 900

aacattacgg gtcaccgccg tagcaggcgc aagctt 936

<210> 6

<211> 1155

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

gagctcatga aaaaagaact gagctttcat gaaaagctgc taaagctgac aaaacagcaa 60

aaaaagaaaa ccaataagca cgtatttatt gccattccga tcgtttttgt ccttatgttc 120

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gtgcagtcac actggggcca agagtatgac aatgatccaa acgaccgcca gcgccagctt 780

gcaagagcca tgtctgatgc gggagctgac atcatcgtcg gccatcatcc gcacgtctta 840

gaaccgattg aagtatataa cggaaccgtc attttctaca gcctcggcaa ctttgtcttt 900

gaccaaggct ggacgagaac aagagacagt gcactggttc agtatcacct gaagaaaaat 960

ggaacaggcc gctttgaagt gacaccgatc gatatccatg aagcgacacc tgcacctgtg 1020

aaaaaagaca gccttaaaca gaaaaccatt attcgcgaac tgacgaaaga ctctaatttc 1080

gcttggaaag tagaagacgg aaaactgacg tttgatattg atcatagtga caaactaaaa 1140

tctaaataat ctaga 1155

Claims (3)

1.一种含有pMG36e-pgsA-gp85重组质粒的基因工程菌，其保藏编号为CGMCCNo.14209。

2.根据权利要求1所述含有pMG36e-pgsA-gp85重组质粒的基因工程菌，其特征在于：其所含有pMG36e-pgsA-gp85重组质粒，中含有gp85和pgsA基因片段，其中gp85基因片段其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；pgsA5基因片段其核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.含有pMG36e-pgsA-gp85重组质粒的基因工程菌在制备ALV-J口服疫苗中的应用。