CN103194471A - 猪传染性胃肠炎s/n蛋白融合基因及重组乳酸乳球菌和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪传染性胃肠炎S/N蛋白融合基因及重组乳酸乳球菌和应用。本发明提供了由猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中A、D抗原位点和N蛋白中的N₃₂₁抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列连接一起后得到的融合基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。本发明进一步提供了含有该融合基因的表达载体及含有该重组表达载体的重组乳酸乳球菌菌株。将重组乳酸乳球菌菌株用乳链杆菌肽Nisin进行诱导，融合基因可在细菌细胞壁表面进行表达。免疫印迹实验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性，可将其制备成防治猪传染性胃肠炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。

Description

猪传染性胃肠炎S/N蛋白融合基因及重组乳酸乳球菌和应用

技术领域

本发明涉及抗原融合基因以及含有该抗原融合基因的重组菌株，尤其涉及猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白融合基因以及含有该融合基因的表达载体，本发明进一步涉及含有该表达载体的重组乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）菌株以及它们在制备防治猪传染性胃肠炎疫苗中的用途，属于猪传染性胃肠炎的防治领域。 

背景技术

猪传染性胃肠炎是由传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritisvirus of swine，TGEV）所引起的以严重腹泻、呕吐、脱水和高死亡率为主要特征的高度接触性传染病。TGEV主要存在于空肠和十二指肠，各种日龄的猪均易感。由于仔猪自身抵抗力比较差，易受外界各种刺激因素的影响和病原微生物的侵袭，常会因严重脱水而发生死亡，并以2周龄以内的仔猪死亡率最高，可达100％。随日龄的增大，虽然死亡率逐渐下降，但感染该病的猪生产性能下降，饲料报酬率低，给世界范围内的养猪业都带来严重的经济损失。猪传染性胃肠炎病毒主要通过肠道感染猪，具有明显的肠道组织嗜性的特点，在抗TGEV感染免疫过程中除体液免疫和细胞免疫外，局部肠粘膜免疫系统发挥着不可替代的作用。 

常规的灭活疫苗和弱毒疫苗在防治这两种疾病中起到了积极作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些问题，如灭活疫苗免疫原性差，不能有效诱导slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接种后的动物机体排散病毒、病毒毒力可能返强等，另外必须通过注射途径免疫。针对本病的特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径，但是如何避免胃肠道对抗原的破坏并有效诱导免疫应答成为技术的关键。TGEV有三种主要结构蛋白，分别为磷酸化的 核衣壳蛋白N、膜蛋白M和糖基化的纤突蛋白S，其中S糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定族，并且可以介导细胞的吸附、中和抗体的产生等过程，可以提供有效的免疫保护作用。 

TGEV感染具有明显的嗜肠性，病毒粒子表面的纤突蛋白（S蛋白）与存在于肠上皮细胞顶膜的氨基肽酶（APN）的结合是感染发生的首要条件，粘膜免疫是本病特异性免疫应答的主要特征，肠道粘膜表面SIgA含量的高低直接决定临床疾病的发生和疾病严重程度。 

针对猪传染性胃肠炎发病的几个特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径。口服免疫突出的优点是可有效地刺激肠道局部免疫细胞产生分泌型IgA，这尤其适应于肠道粘膜传染病，但口服免疫需要克服免疫原在到达小肠粘膜之前被降解或灭活的可能。使用细菌病毒等活载体来传递完整无损的抗原成分解决了这个问题，目前有使用减毒细菌作为疫苗抗原的载体的报道，如沙门氏菌、弱毒李斯特菌等，但沙门氏菌作为载体传递DNA疫苗可能存在毒力返强的危险，质粒DNA也可能会整合到宿主细胞基因组，引起调控细胞生长的基因紊乱、原癌基因和抑癌基因的表达失控、体细胞癌变、细胞转型等一系列问题。 

发明内容

本发明的目的之一是提供一种猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白抗原融合基因及其编码的蛋白； 

本发明的目的之二是提供含有上述猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白抗原位点的融合基因的表达载体； 

本发明的目的之三提供含有上述表达载体的重组宿主菌株。 

为了实现上述目的，本发明一方面提供了一种由猪传染性胃肠炎病毒S蛋白中A、D抗原位点和N蛋白中的N₃₂₁抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列（CWA_M6）连接得到的抗原融合基因，其多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。 

本发明将TGEV S蛋白中A、D抗原位点（Sad）和N蛋白中的N₃₂₁抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列（CWA_M6）（以化脓链球菌M6蛋白的最后140个氨基酸为细胞壁锚定序列）连接起来，考虑到乳酸乳球菌使用密码子的偏嗜情况，为了提高异源基因在宿主菌中的表达，并保证翻译后的氨基酸不变的情况下，对稀有密码子丝氨酸（TCG）、苏氨酸（ACG）、脯氨酸（CCC）、精氨酸（CGG）、苯丙氨酸（TTC）等进行改变，但不改变其所编码的氨基酸。对A抗原位点上的3个甲基化位点（AAC—AAT，ATC—ATT，ACA—ACT）进行点突变，但不改变其所编码的氨基酸。通过两个柔性的Linker((GGGGS)₃)将TGEV的A、D抗原位点基因和N₃₂₁抗原位点基因连接起来（顺序为D-Linker-N₃₂₁-Linker-A），并把该序列命名为MLSN（SEQ IDNo.1）；此外，在MLSN的上游和下游分别引入NcoI酶切位点和SacI酶切位点。 

本发明的另一方面是提供由SEQ ID No.1所示抗原融合基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。。 

本发明的又一方面是提供含有所述抗原融合基因的表达载体，譬如，将本发明的SEQ ID No.1所示的抗原融合基因与表达载体pNZ8149进行连接，得到可以在乳酸乳球菌的外表面或细胞壁表达抗原融合基因的分泌表达载体。 

由此，本发明的再一方面是提供一株表达猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白的重组乳酸乳球菌菌株，能够用其制备成防治猪传染性胃肠炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。 

本发明将SEQ ID No.1所示融合基因与分泌表达载体pNZ8149进行双酶切、连接并经电击转化转入乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）NZ3900细胞，获得含有重组质粒的乳酸乳球菌命名为NZ3900-pNZ8149-MLSN；其微生物保藏号是：CCTCC No:M2011444；分类命名是：乳酸乳球菌NZ3900-pNZ8149-MLSN（Lactococcus lactis NZ3900-pNZ8149-MLSN）；保 藏时间是2011年12月5日；保藏单位是：中国典型培养物保藏中心；保藏地址是：中国武汉武汉大学。 

进一步的，本发明将重组乳酸乳球菌菌NZ3900-pNZ8149-MLSN用乳链杆菌肽Nisin进行诱导，使目的基因在菌体表面进行表达；免疫印迹实验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性，能够用于制备成防治猪传染性胃肠炎的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。 

本发明构建了NZ3900-pNZ8149-MLSN表达载体系统，表达了含有TGEV蛋白A/D位点和N蛋白N₃₂₁位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列CWAM6连接序列MLSN（目的蛋白约28kDa）；免疫印迹试验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性。间接免疫荧光也证实表达蛋白存在于菌体上，诱导表达后的活菌体免疫荧光试验表明，所表达的重组蛋白初步定位于菌体的表面，存在菌体表面的目的蛋白为抗原物质有效刺激免疫系统，提高抗体水平奠定了重要的物质基础。 

本发明针对TGEV发生和免疫的几个特点，在实验设计上以阻断肠道传染病疾病病原感染的第一道防线为目的，利用安全无毒的乳酸菌表达系统在肠道黏膜上粘附、定植和表达及传递抗原物质，因而抗原物质对黏膜的免疫刺激作用更接近于病毒的自然感染途径，因此所产生的黏膜免疫保护效果将更为理想。同时，乳酸菌本身具有佐剂效应，会明显加强抗原的免疫原性，机体对乳酸菌载体系统本身不产生强的抗体应答反应，乳酸菌还可合成一些生物活性物质，如乳酸菌素、细菌素、多种有机酸等，这些物质本身就具有抑菌抗菌、抗腹泻作用。 

为了检验本发明所构建的重组乳酸乳球菌或该重组乳酸乳球菌所表达的融合蛋白MLSN作为防治猪传染性胃肠炎口服疫苗的可行性，本发明将重组乳酸乳球菌NZ3900-pNZ8149-MLSN口服免疫小鼠，不同时间点测定肠道粪便中特异性抗体sIgA的水平。测定结果表明，重组乳酸乳球菌 NZ3900-pNZ8149-MLSN在连续3次免疫后诱导小鼠产生了明显的抗TGEV-S蛋白的分泌性sIgA抗体反应。重组菌组后期采样抗体一直上升，各时间点采样抗体水平均明显高于免疫之初及对照菌（免疫空载体转化菌NZ3900-pNZ8149）和PBS组（p<0.05），重组菌组38d时抗体水平达到顶峰（p<0.05）之后下降，至60d时重组菌组抗体水平仍明显高于对照组（p<0.05）。试验结果表明，本发明重组乳酸乳球菌或其所表达的融合蛋白MLSN能够有效的刺激动物肠道免疫系统产生特异性免疫应答，能够将其制备成防治猪传染性胃肠炎的口服疫苗。 

本发明所涉及到的术语定义 

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。 

术语“重组宿主菌株”或“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。 

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定 的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985);和Cassol等人,(1992);Rossolini等人,MolCell.Probes 8:91-98(1994)）。 

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白（即抗原），其中氨基酸残基经由共价肽键连接。 

附图说明

图1PCR产物电泳结果。 

图2PCR产物电泳结果；M：蛋白质分子量标准；1、pNZ8149-MLSN的NcoI、SacI酶切结果；4、MLSN的PCR鉴定。 

图3表达产物的SDS-PAGE及Western-blot分析；M：蛋白质分子量标准；1：重组乳酸乳球菌NZ3900-pNZ8149诱导后的蛋白质；2-3、重组NZ3900-pNZ8149-MLSN诱导后的蛋白质；4：重组乳酸乳球菌NZ3900-pNZ8149-MLSN诱导后的蛋白质的免疫印迹。 

图4表达产物的间接免疫荧光检测（×40）；A：NZ3900-pNZ8149-MLSN重组菌的IFA试验结果，菌体细胞散发了强烈的黄绿色荧光；B：NZ3900-pNZ8149重组菌的IFA试验结果，没有荧光，菌体呈红色。 

图5重组乳酸乳球菌NZ3900-pNZ8149-MLSN免疫小鼠后各时间点粪便采样特异性sIgA测定结果。 

图6重组乳酸乳球菌NZ3900-pNZ8149-MLSN免疫小鼠各时间点粪便 采样特异性sIgA测定结果。 

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。 

实施例1MLSN基因乳酸乳球菌分泌表达载体的构建及鉴定 

1多抗原表位序列MLSN的设计与合成 

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白含有A、B、C、D共4个抗原位点，其中A（536—593残基区）和D（376—392残基区）抗原位点在诱导产生中和抗体中起重要作用，并且A抗原位点是一个主要的B细胞抗原表位。猪传染性胃肠炎病毒含有4个主要的T细胞表位，其中N蛋白上的N₃₂₁（321-335残基区）抗原位点能够诱导最强烈的T细胞反应，而且能诱导T细胞在体内协助合成中和抗体即抗S蛋白的特异性抗体。 

通过两个柔性的Linker((GGGGS)₃)将TGEV的A、D抗原位点基因和N₃₂₁抗原位点基因连接起来（顺序为D-Linker-N₃₂₁-Linker-A），并把该序列命名为ADN。对稀有密码子丝氨酸（TCG）、苏氨酸（ACG）、脯氨酸（CCC）、精氨酸（CGG）、苯丙氨酸（TTC）等进行改变，但不改变其所编码的氨基酸。对A抗原位点上的3个甲基化位点（AAC—AAT，ATC—ATT，ACA—ACT）进行点突变，但不改变其所编码的氨基酸。在MLSN（SEQ ID No.1）所示的上游和下游分别引入NcoI酶切位点和SacI酶切位点。将设计好的MLSN序列进行人工合成，构建了重组质粒pMD18-MLSN。 

pMDl8-T Simple Vector购自TaKaRa(大连)公司，pMD18-MLSN的具体构建过程如下： 

PCR扩增目的基因 在PCR反应管中加入下列试剂和溶液： 

表1MLSN的PCR反应体系 

P1：5'-GA AGA TCT ATGTCTGTAAGTGATTCAAGCT 3' 

P2：5'-ACAT GCA TGC GTTTTCTTCTTTGCGTTTTAC 3' 

混匀并离心后放置于PCR仪中，94℃预变性5min后，进行如下循环：94℃，30s；54℃，30s；72℃，30s。30个循环后72℃延伸10min。PCR扩增完成后，取5μL产物用l％琼脂糖凝胶电泳观察。并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收酶切产物，参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收PCR反应产物，操作步骤如下： 

将100μL PCR产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外线灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，加入3个凝胶体积的DE-A溶液（为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂），混合均匀后于75℃加热融化。加0.5个DE-A体积的DE-B溶液（为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂），混合均匀。取以上混合液，转移至DNA制备管中离心弃滤液。将制备管置回离心管，加0.5ml W1溶液（为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂），12000rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液（为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂），12000rpm离心30s，弃滤液，重复此步骤一次。将制备管置回离心管中，12000rpm 离心1min。将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜正中央加适量（20μL）水或洗脱液室温静置1min，12000rpm离心1min洗脱DNA。取回收产物1μL 1％琼脂糖凝胶中进行电泳，检测回收结果。并于-20℃保存备用。 

PCR产物与克隆载体的连接及转化 

按pMDl8-T Simple Vector说明书将回收的PCR产物与pMDl8-T Vector连接。连接体系见表2： 

表2连接反应体系 

混匀后离心，置于16℃水浴连接4h，4℃过夜。连接后，含有MLSN序列的质粒命名为pMD18-MLSN。 

2重组表达载体的构建 

将pMD18-2DNA质粒和分泌表达的载体质粒pNZ8149（质粒pNZ8149购于MoBiTec公司）分别用NcoI+SacI双酶切后回收，用T₄ DNA ligase连接起来构建成重组质粒pNZ8149-MLSN。 

2.1MLSN序列的酶切与回收 

酶切反应体系见表3。 

表3NcoI、SacI双酶切反应体系 

将100μL酶切产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收酶切产物，参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收PCR反应产物，操作步骤如下： 

将100μL PCR产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，在紫外线灯下切下含有目的DNA的琼脂糖凝胶，加入3个凝胶体积的DE-A溶液（为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂），混合均匀后于75℃加热融化。加0.5个DE-A体积的DE-B溶液（为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂），混合均匀。取以上混合液，转移至DNA制备管中离心弃滤液。将制备管置回离心管，加0.5ml W1溶液（为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂），12000rpm离心30s，弃滤液。将制备管置回离心管，加0.7ml W2溶液（为DNA凝胶回收试剂盒中的试剂），12000rpm离心30s，弃滤液，重复此步骤一次。将制备管置回离心管中，12000rpm离心1min。将制备管置于洁净的1.5ml离心管中，在制备膜正中央加适量（20μL）水或洗脱液室温静置1min，12000rpm离心1min洗脱DNA。取回收产物1μL 1％琼脂糖凝胶中进行电泳，检测回收结果，核苷酸片段大小与预期结果相符约850bp（图1）。 

2.2乳酸乳球菌分泌表达的载体pNZ8149的酶切与回收 

将乳酸乳球菌分泌表达的载体pNZ8149的大量酶切，酶切反应体系见表4。 

表4NcoI、SacI双酶切反应体系 

将100μL酶切产物于1%的琼脂糖凝胶中电泳，并参照DNA凝胶回收试剂盒说明书回收酶切产物，具体步骤参考以上，取回收产物1μL 1％琼脂糖凝胶中进行电泳，检测回收结果。并于-20℃保存备用。 

2.3MLSN基因乳酸乳球菌分泌表达载体的构建 

将以上步骤制备的酶切纯化产物进行连接，连接体系见表5。 

表5MLSN基因分泌表达的载体pNZ8149连接反应体系 

16℃水浴连接4h后，4℃过夜。 

连接产物的纯化：将连接产物转移至1.5ml离心管中，加入2.0μL的3mol/L醋酸钠（pH5.2）和50μL的无水乙醇轻轻混匀，置于-20℃、1h后，4℃、12000rpm离心30min，小心移去上清，加入500μL的70％乙醇，4℃、12000rpm离心5min，小心移去上清，风干至无乙醇气味，加入4μL灭菌去离子水溶解沉淀，-20℃保存备用。 

2.4pNZ8149-MLSN质粒的双酶切、PCR鉴定 

（1）将上述所回收的质粒，用NcoI、SacI双酶切，酶切反应体系如下： 

表6pNZ8149-MLSN质粒的双酶切反应体系 

轻轻混匀以上组分，37℃水浴4h，取5μL酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳观察。能切出目的片段和pNZ8149载体大小一致的质粒鉴定为阳性。 

（2）将上述所提取的质粒用灭菌蒸馏水稀释100倍，取2μL作为模板，进行PCR鉴定，取PCR产物1μL 1%琼脂糖凝胶中进行电泳，检测回收结果，得到核苷酸片段大小约为2600bp和850bp（图2），表明MLSN基因己插入到表达载体pNZ8149的酶切位点NcoI、SacI之间，将获得的阳性重组质粒命名为pNZ8149-MLSN；将获得的阳性重组菌株命名为NZ3900-pNZ8149-MLSN菌株。 

实施例2MLSN基因乳酸乳球菌的表达与鉴定结果 

1MLSN基因乳酸乳球菌的构建及电转化 

将连接产物与电转化感受态细胞NZ9000（乳酸乳球菌NZ9000购于MoBiTec公司）混匀后，冰上放置5min；将其转入2mm的预冷电转化杯中；以Transformation Apparatus 165-2101电击，电击参数为电压2kV，时间为4.5ms；电击后加入900μL冰预冷的SGM17MC（GM17液体培养基，加入0.5mol/L蔗糖，,0.02mol/L氯化镁，0.002mol/L氯化钙）恢复培养基， 混匀；将菌液转移至1.5mL离心管中，冰上放置10min；30℃厌氧培养2h；取适量菌液涂布于含有5μg/mL氯霉素的GM17琼脂培养基上，30℃厌氧培养2-3d。于平板上挑取单个菌落，分别接种于含有5μg/mL Cm的GM17液体培养基中，30℃厌氧培养过夜后，从乳酸乳球菌中提取质粒。对重组质粒进行酶切鉴定、PCR鉴定及序列测定分析，将转化获得重组质粒乳酸乳球菌命名为NZ3900-pNZ8149-MLSN。 

2重组乳酸乳球菌的诱导表达及鉴定 

pNZ8112-Sa/NZ9000及pNZ8112/NZ9000对照菌,接种于GM17液体培养基中,30℃厌氧培养过夜后,取过夜培养物以1：25比例接种于20mL培养基中，30℃培养至OD₆₀₀为0.4左右，取10mL细菌培养液用1ng/mL的乳链杆菌肽Nisin诱导2-3h。终止培养后分别取出1mL样品以12000r/mi n离心3min，弃上清；用200μL PBS溶液悬浮，12000r/min离心3min，弃上清；加入100μL 10mg/mL的溶菌酶，37℃水浴放置30min，沸水浴5min，灭活溶菌酶，12000r/min离心3min，弃上清；加入1×PBS(OD₆₀₀×50μL)及等量2×SDS凝胶加样缓冲液（含DTT），充分混匀，煮沸10min,12000r/min离心3min，取上清10μL上样，以蛋白质标准分子量为参考，10%SDS-PAGE进行电泳分析。 

3表达产物的免疫印记（western-blot）分析 

将上述电泳结束后的凝胶经转印装置将蛋白转移到经转印缓冲液平衡的硝酸纤维素膜上，接通电源，0.5-1mA/cm²转印1h。转印结束后，兔抗TGEV血清作为第一抗体,以辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG作为第二抗体，4-氯-1-萘酚底物显色溶液中显色20min，检测表达产物的抗原活性。 

检测结果表明，重组乳酸乳球菌NZ3900-pNZ8149-MLSN在约28kDa处有表达带，目的基因在工程菌中得到了有效的表达（如箭头所示），随着诱 导时间的增加，上清液中目的蛋白的含量也逐步增加，而阳性对照菌上清液中不含目的蛋白（图3）。通过Western-blot检测表明重组蛋白具有与TGEV全病毒制备的抗血清发生反应的能力，并具有良好的特异性，即反应原性。 

4间接免疫荧光 

取12h培养的阳性重组菌和空载体对照菌液体培养物0.5mL离心去上清后，分别用PBS低速离心洗3次，加入兔源抗TGEV抗血清，悬浮混合后37℃作用30min，离心去上清，PBS离心洗菌体3次，加入稀释的含有伊文思蓝的抗兔荧光标记二抗，悬浮混合后37℃作用30min，离心去上清，PBS离心洗菌体3次，菌体沉淀物悬浮在200μL PBS，取适量涂片，自然干燥，冷丙酮固定30min，干燥后荧光显微镜观察。 

以NZ3900-pNZ8149-MLSN重组菌和NZ3900-pNZ8149对照菌所进行的间接免疫荧光实验结果表明，重组菌NZ3900-pNZ8149-MLSN荧光显微镜检查可见明显的黄绿色荧光，由此也表明，重组菌所表达的外源蛋白是存在于菌体的表面位置；NZ3900-pNZ8149未发现绿色荧光，菌体被染成红色（图4）。 

试验例1重组乳酸乳球菌（NZ3900-pNZ8149-MLSN）的免疫保护效力试验 

1试验材料及方法 

1.1供试菌株 

实施例1所获得的阳性重组菌株NZ3900-pNZ8149-MLSN； 

1.2试验动物分组及免疫 

实验动物：体重18-20g、6-8周龄清洁级BALB/c小鼠30只，购自湖北省实验动物研究中心。 

免疫组别：将实验动物随机分成3组，每组10只，即 NZ3900-pNZ8149-MLSN重组菌组、NZ3900-pNZ8149对照菌组和PBS对照组，重组菌组和对照菌组每只小鼠以2×10¹⁰个/mL细菌口服接种0.1mL，PBS对照组口服同体积的PBS液。 

免疫程序：免疫3次，每隔2周免疫一次，每次连续免疫3d，每天1次。 

1.3样品采集与处理 

分别于18d、32d、38d、46d、60d收集免疫小鼠新鲜粪便样品。－70℃冻存备用。 

粪便样品处理：检测前，每0.1g粪便加入1mL粪便提取液，置于振荡器上，振荡30min，4℃浸润过夜。10000r/min离心5min，收集上清用作检测样品。 

1.4免疫小鼠粪便特异性sIgA测定 

采用间接ELISA方法进行。以TGEV全病毒抗原包被96孔聚苯乙烯微量板37℃反应2h，0.01mol/L PBST液洗3次。用含有0.5%聚乙烯醇的0.01mol/L PBS液37℃封闭4h，0.01mol/L PBST液洗3次。分别加入处理好的粪便上清，37℃反应1h，0.01mol/L PBST洗3次。加入1：2000稀释的HRP标记羊抗鼠IgA（购自华美生物工程有限公司），37℃反应1h，0.01mol/LPBST液洗3次。加OPD-H₂O₂底物显色液避光显色15min。加终止液后，自动酶标测定仪在波长492nm处测定每孔的光吸收（OD₄₉₂）值。 

2试验结果 

试验结果见图5、图6和表7。重组乳酸乳球菌NZ3900-pNZ8149-MLSN在连续3次免疫后诱导小鼠产生了明显的抗TGEV-S蛋白的分泌性sIgA抗体反应。重组菌组后期采样抗体一直上升，各时间点采样抗体水平均明显高于免疫之初及对照菌（免疫空载体转化菌NZ3900-pNZ8149）和PBS组（p<0.05），重组菌组（NZ3900-pNZ8149-MLSN）38d时抗体水平达到顶峰（p<0.05）之后下降，至60d时抗体水平仍明显高于对照组（p<0.05）。 免疫空载体转化菌NZ3900-pNZ8149的小鼠和阴性对照组小鼠在免疫前后分泌性sIgA抗体水平未出现明显差别。 

试验结果表明，本发明重组乳酸乳球菌能够有效的刺激小鼠肠道免疫系统产生特异性免疫应答，证明了本发明重组的乳酸乳球菌作为防治猪传染性胃肠炎口服疫苗具有可行性。 

表7重组乳酸乳球菌免疫小鼠特异性sIgA测定结果 

注：*表示重组菌组后期采样与0天采样比较（P<0.05）；#表示重组菌组与对照菌及PBS组比较（P<0.05）。 

<110>  武汉华扬动物药业有限责任公司

 

<120>  猪传染性胃肠炎S/N蛋白融合基因及重组乳酸乳球菌和应用

 

<130>  DQXL-0016

 

<160>  2    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  843

<212>  DNA

<213>  Artifical sequence

 

 

<220>

<221>  CDS

<222>  (1)..(843)

 

<400>  1

aug tct gta agt gat tca agc ttt ttt agt tac ggt gaa att ccg ttc         48

Met Ser Val Ser Asp Ser Ser Phe Phe Ser Tyr Gly Glu Ile Pro Phe          

1               5                   10                  15               

 

ggc gta act gat gga cca cgt tac tgt tac ggt ggc ggt ggc tct ggc         96

Gly Val Thr Asp Gly Pro Arg Tyr Cys Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly          

            20                  25                  30                   

 

gga ggt ggg agc ggc ggt ggt ggc agc caa ttt ctt cag cag att aat        144

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Phe Leu Gln Gln Ile Asn          

        35                  40                  45                       

 

gcc tat gct cgt cca tca gaa gta gca aaa gaa cag aga aaa aga aaa        192

Ala Tyr Ala Arg Pro Ser Glu Val Ala Lys Glu Gln Arg Lys Arg Lys          

    50                  55                  60                           

 

tct cgt ggt ggt ggc ggt tct ggc gga ggt ggc agc ggc ggt ggc ggt        240

Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly          

65                  70                  75                  80           

 

tct ggt atg aag cgt agt ggt tat ggt caa cct ata gcc tca aca tta        288

Ser Gly Met Lys Arg Ser Gly Tyr Gly Gln Pro Ile Ala Ser Thr Leu          

                85                  90                  95               

 

agt aat att act cta cca atg cag gat cac aac acc aca gat gta tac        336

Ser Asn Ile Thr Leu Pro Met Gln Asp His Asn Thr Thr Asp Val Tyr          

            100                 105                 110                  

 

tgt att cgt tct gac caa ttt tca gtt tat gtt cat tct act tgc aaa        384

Cys Ile Arg Ser Asp Gln Phe Ser Val Tyr Val His Ser Thr Cys Lys          

        115                 120                 125                       

 

agt gct tta tgg gac aat att ttt aag cga aac tgc acg aaa gct tta        432

Ser Ala Leu Trp Asp Asn Ile Phe Lys Arg Asn Cys Thr Lys Ala Leu          

    130                 135                 140                          

 

gaa gaa gca aac agc aaa tta gct gct ctt gaa aaa ctt aac aaa gag        480

Glu Glu Ala Asn Ser Lys Leu Ala Ala Leu Glu Lys Leu Asn Lys Glu          

145                 150                 155                 160          

 

ctt gaa gaa agc aag aaa tta aca gaa aaa gaa aaa gct gag cta caa        528

Leu Glu Glu Ser Lys Lys Leu Thr Glu Lys Glu Lys Ala Glu Leu Gln          

                165                 170                 175              

 

gca aaa ctt gaa gca gaa gca aaa gca ctc aaa gaa caa tta gcg aaa        576

Ala Lys Leu Glu Ala Glu Ala Lys Ala Leu Lys Glu Gln Leu Ala Lys          

            180                 185                 190                  

 

caa gct gaa gaa ctt gca aaa cta aga gct gga aaa gca tca gac tca        624

Gln Ala Glu Glu Leu Ala Lys Leu Arg Ala Gly Lys Ala Ser Asp Ser          

        195                 200                 205                      

 

caa acc cct gat gca aaa cca gga aac aaa gtt gtt cca ggt aaa ggt        672

Gln Thr Pro Asp Ala Lys Pro Gly Asn Lys Val Val Pro Gly Lys Gly          

    210                 215                 220                          

 

caa gca cca caa gca ggt aca aaa cct aac caa aac aaa gca cca atg        720

Gln Ala Pro Gln Ala Gly Thr Lys Pro Asn Gln Asn Lys Ala Pro Met          

225                 230                 235                 240          

 

aag gaa act aag aga cag tta cca tca aca ggt gaa aca gct aac cca        768

Lys Glu Thr Lys Arg Gln Leu Pro Ser Thr Gly Glu Thr Ala Asn Pro          

                245                 250                 255              

 

ttc ttc aca gcg gca gcc ctt act gtt atg gca aca gct gga gta gca        816

Phe Phe Thr Ala Ala Ala Leu Thr Val Met Ala Thr Ala Gly Val Ala          

            260                 265                 270                  

 

gca gtt gta aaa cgc aaa gaa gaa aac                                    843

Ala Val Val Lys Arg Lys Glu Glu Asn                                      

        275                 280                                          

 

 

<210>  2

<211>  281

<212>  PRT

<213>  Artifical sequence

<400>  2

 

Met Ser Val Ser Asp Ser Ser Phe Phe Ser Tyr Gly Glu Ile Pro Phe

1               5                   10                  15     

 

 

Gly Val Thr Asp Gly Pro Arg Tyr Cys Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Gly

            20                  25                  30         

 

 

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Phe Leu Gln Gln Ile Asn

        35                  40                  45             

 

 

Ala Tyr Ala Arg Pro Ser Glu Val Ala Lys Glu Gln Arg Lys Arg Lys

    50                  55                  60                 

 

 

Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

65                  70                  75                  80 

 

 

Ser Gly Met Lys Arg Ser Gly Tyr Gly Gln Pro Ile Ala Ser Thr Leu

                85                  90                  95     

 

 

Ser Asn Ile Thr Leu Pro Met Gln Asp His Asn Thr Thr Asp Val Tyr

            100                 105                 110        

 

 

Cys Ile Arg Ser Asp Gln Phe Ser Val Tyr Val His Ser Thr Cys Lys

        115                 120                 125            

 

 

Ser Ala Leu Trp Asp Asn Ile Phe Lys Arg Asn Cys Thr Lys Ala Leu

    130                 135                 140                

 

 

Glu Glu Ala Asn Ser Lys Leu Ala Ala Leu Glu Lys Leu Asn Lys Glu

145                 150                 155                 160

 

 

Leu Glu Glu Ser Lys Lys Leu Thr Glu Lys Glu Lys Ala Glu Leu Gln

                165                 170                 175    

 

 

Ala Lys Leu Glu Ala Glu Ala Lys Ala Leu Lys Glu Gln Leu Ala Lys

            180                 185                 190        

 

 

Gln Ala Glu Glu Leu Ala Lys Leu Arg Ala Gly Lys Ala Ser Asp Ser

        195                 200                 205            

 

 

Gln Thr Pro Asp Ala Lys Pro Gly Asn Lys Val Val Pro Gly Lys Gly

    210                 215                 220                

 

 

Gln Ala Pro Gln Ala Gly Thr Lys Pro Asn Gln Asn Lys Ala Pro Met

225                 230                 235                 240

 

 

Lys Glu Thr Lys Arg Gln Leu Pro Ser Thr Gly Glu Thr Ala Asn Pro

                245                 250                 255    

 

 

Phe Phe Thr Ala Ala Ala Leu Thr Val Met Ala Thr Ala Gly Val Ala

            260                 265                 270        

 

 Ala Val Val Lys Arg Lys Glu Glu Asn

        275                 280

Claims (10)

1.猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus of swine）S/N蛋白抗原融合基因，其特征在于：其多核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.由权利要求1所述融合基因编码的蛋白序列，其特征在于：其氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

3.含有权利要求1所述猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白抗原融合基因的重组表达载体。

4.含有权利要求3所述重组表达载体的重组宿主细胞株。

5.按照权利要求4所述的重组宿主株，其特征在于：所述的重组宿主细胞株是重组乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）菌株，其微生物保藏号是：CCTCC No:M2011444。

6.权利要求1所述的猪传染性胃肠炎病毒S/N蛋白抗原融合基因在制备防治猪传染性胃肠炎疫苗中的用途。

7.权利要求2所述的蛋白在制备防治猪传染性胃肠炎疫苗中的用途。

8.权利要求3所述的重组表达载体在制备防治猪传染性胃肠炎疫苗中的用途。

9.权利要求4或5所述的重组宿主细胞株在制备防治猪传染性胃肠炎疫苗中的用途。

10.按照权利要求6-9任何一项所述的用途，其特征在于：所述的疫苗是粘膜免疫活菌疫苗。

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