CN101525589A - 表达传染性胰腺坏死病毒vp3蛋白的重组干酪乳杆菌及制法 - Google Patents

Abstract

本发明提供的是一种表达传染性胰腺坏死病毒(Infectious pancreas necrosis virus，IPNV)VP3蛋白的重组干酪乳杆菌及制法。根据传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点，设计一对引物，进行PCR，获得含有IPNV VP3基因主要抗原位点的618bp目的片段，将扩增得到的IPNVVP3基因与表面表达的载体质粒pPG1进行连接，通过电转化进入宿主菌干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393细胞内，含阳性重组质粒pPG1－IPNV VP3的干酪乳杆菌命名为pPG1－IPNV VP3/L.casei 393。将重组pPG1－IPNV VP3/L.casei 393在乳糖的诱导下进行表达。本发明中构建了传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白干酪乳杆菌表达载体系统，表达了含有IPNV VP3蛋白主要抗原位点的约31KDa的目的蛋白，免疫印迹实验和间接免疫荧光试验均表明，所表达的外源蛋白能够与IPNV免疫血清发生反应，表明重组VP3蛋白与IPNV天然抗原一样具有相同的抗原性。

Description

表达传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的重组干酪乳杆菌及制法

(一)技术领域

本发明涉及的是生物制品，本发明还涉及这种生物制品的制备方法。具体地说是表达传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的重组干酪乳杆菌及制法。

(二)技术背景

传染性胰腺坏死是由传染性胰腺坏死病病毒(Infectious pancreas necrosis virus，IPNV)引起鲑科鱼类的一种高度传染性和急性病毒性疾病，典型症状为游动异常，病鱼体色深暗，腹部膨胀，眼球突出，皮下、肝胰腺等内脏实质器官出血坏死，高致病力毒株对两月龄的幼鱼致死率高达90％，感染后幸存的鱼终生带毒，通过粪便和精卵排出病原，成为潜在的传染源。因该病流行范围广，发病和致死率高，给我国和世界各国鲑鳟养殖业带来重大的经济损失。疫苗免疫接种是预防本病的主要措施。IPNV主要经皮肤、消化道和鳃感染鲑科鱼类，局部的黏膜免疫是传染性胰腺坏死特异性免疫应答的主要特征，鱼肠道、鳃黏膜表面Ig含量的高低直接决定IPN的发生与否和疾病表现的严重程度。而针对本病黏膜免疫特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径。因此选择安全无毒，能够在肠道中存活并能表达和传递抗原物质的载体系统，有效的刺激黏膜免疫系统所产生的黏膜免疫应答对本病的防治具有重要意义。

IPNV有两种主要结构蛋白，分别为外衣壳蛋白VP2和内衣壳蛋白VP3。已证明VP2蛋白是产生免疫保护的重要抗原，最新研究也表明，针对IPNV VP3蛋白的血清抗体，能够在细胞水平上中和病毒的细胞病变效应，与VP2比较其免疫原性更强。表明VP3蛋白亦含有重要的中和抗原表位。一般认为VP3蛋白是作为IPNV的内衣壳蛋白参与病毒粒子的组成，但Tarrab等利用抗VP3单克隆抗体检测到IPNV病毒粒子表面存在部分VP3蛋白，Park等的试验表明，VP3蛋白含有重要的中和表位。因此，由VP3基因编码的蛋白和VP2蛋白一样具有重要的免疫学功能，因此，由VP3基因编码的蛋白和VP2蛋白一样具有重要的免疫学功能。目前报道的用于IPNV VP3蛋白的表达主要宿主菌是大肠杆菌和酵母。大肠杆菌是一类应用最为广泛的表达异源蛋白的宿主菌，因为大肠杆菌生长速度快，并且具有良好代表性的遗传学特征，目前仍然广泛被应用来表达异源蛋白，但是在大肠杆菌中表达的融合蛋白以不溶的包涵体形式存在，不具有生物活性，并且大肠杆菌含有有毒的细胞致热源，因此其表达产物需要做广泛的检测后才能被使用。酵母普遍被认为是食品级安全的表达宿主具有大肠杆菌所没有的优点，但是融合蛋白产量又很低，并且酵母菌表达的目的蛋白需将酵母细胞壁破碎后才能口服免疫鱼，均不能作为活的载体系统来传递完整无损的抗原成分。

(三)发明内容

本发明的目的在于提供一种能够用于防治传染性胰腺坏死的安全、有效的黏膜免疫活菌疫苗，即表达传染性胰腺坏死病毒(Infectious pancreas necrosis virus，IPNV)VP3蛋白的重组干酪乳杆菌及其制法。

(一)要解决的技术问题

本发明的目的是这样实现的：

它是保藏在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO：M 209004，命名为pPG1-IPNVVP3/Lactobacillus casei 393的重组干酪乳杆菌，保藏日期2009年1月6日。

根据传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点，设计一对引物，进行PCR，获得含有IPNV VP3基因主要抗原位点的618bp目的片段(图1)，将扩增得到的IPNV VP3基因克隆到质粒pMD18-T中(图2)，并转化于大肠杆菌JM109菌株中，得到pMD18-T-IPNV VP3/JM109，将pMD18-T-IPNV VP3双酶切回收的VP3与表面表达的载体质粒pPG1进行连接，通过电转化进入宿主菌干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393细胞内，含阳性重组质粒pPG1-IPNV VP3的干酪乳杆菌命名为pPG1-IPNV VP3/L.casei393。将重组pPG1-IPNV VP3/L.casei 393在乳糖的诱导下进行表达。

扩增获得IPNV VP3基因cDNA序列为：

上、下游引物序列分别：

P1 5′AGC GGATCC T GCATCCGGGATGGACGAG 3′

P2 5′AGC CTCGAG TCGTCGTTTCATCTGTC 3′。

(二)技术方案

采用本发明的方法获得的产物经检验结果为：

1.干酪乳杆菌表达载体的酶切鉴定结果

从pMD18-T-IPNV VP3/JM109中提取质粒pMD18-T-IPNV VP3，与载体质粒同时用相应的限制内切酶进行双酶切并以胶回收试剂盒进行回收纯化后进行16℃过夜连接，连接产物电转化入宿主菌干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393，重组质粒pPG1-IPNV VP3单酶切后得到大小约为4300bp的基因片段，用BamH I、Xhol I双酶切后得到大小为618bp和3700bp基因片段。以P1、P2为引物进行PCR扩增，得到约为618bp基因片段，与预计大小相符合(见图3)。表明IPNV VP3基因片段已插入到表达载体pPG1中。序列测定结果分析表明IPNV VP3基因已插入到表达载体质粒中。获得的阳性重组菌命名为重组pPG1-IPNV VP3/L.casei393菌株。

2.IPNV VP3蛋白在干酪乳杆菌中的诱导表达及蛋白检测

对重组的pPG1-IPNV VP3/L.casei 393菌株和pPG1/L.casei 393空质粒的菌诱导结果表明，重组蛋白获得了表达，蛋白大小约在31Kda左右。通过Western-blot检测表明重组蛋白具有与IPNV制备的抗血清发生反应的能力，并具有良好的特异性，即反应原性(见图4)。

3.IPNV VP3蛋白在干酪乳杆菌中的诱导表达间接免疫荧光检测结果

pPG1-IPNV VP3/L.casei 393重组菌和pPG1/L.casei 393对照菌所进行的间接免疫荧光实验结果表明，重组菌pPG1-IPNV VP3/L.casei 393荧光显微镜检查可见明显的黄绿色荧光(见图5A)，由此也表明，重组菌所表达的外源蛋白是存在于菌体的表面位置；pPG1/L.casei 393未发现绿色荧光，菌体被染成红色(见图5B)。

基于IPNV的肠道致病特点和黏膜免疫特点，本发明以IPNV起主要免疫保护作用的VP3基因含有主要抗原位点片段插入到乳酸菌表达载体，构建了表达IPNV VP3蛋白的重组乳酸菌表达系统，以期获得IPNV口服活菌疫苗，依靠乳酸菌天然的抗菌作用和VP3蛋白刺激的特异性黏膜免疫作用，达到预防本病的目的。

IPNV主要经皮肤、消化道和鳃感染鲑科鱼类，局部的黏膜免疫是传染性胰腺坏死特异性免疫应答的主要特征，鱼肠道、鳃黏膜表面Ig含量的高低直接决定IPN的发生与否和疾病表现的严重程度。而针对本病黏膜免疫特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径。口服免疫突出的优点是可有效地刺激黏膜免疫细胞产生抗体并引起全身免疫，但口服免疫需要克服免疫保护性抗原在到达肠道粘膜之前在胃和肠道中被降解或灭活的可能，满足这一要求的必须是活的载体系统来传递完整无损的抗原成分。乳酸菌作为表达和传递异质性抗原的活载体系统具有许多优点，如载体对动物本身是安全的，而大肠杆菌，沙门氏菌作为活载体系统就不能称为安全的生物制剂；某些乳酸菌又可合成一些生物活性物质和多种有机酸类，这些物质本身具有抑菌抗菌。

本发明针对IPN发生和免疫的几个特点，在实验设计上以阻断肠道传染性疾病的第一道防线为目的，利用安全无毒的乳酸菌表达系统在肠道粘膜上的粘附，定植和表达及传递抗原物质，因而抗原物质，对粘膜的免疫刺激作用更接近于病毒的自然感染途径，因此所产生的粘膜免疫保护效果将更为理想。本发明中构建了传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白干酪乳杆菌表达载体系统，表达了含有IPNV VP3蛋白主要抗原位点的约31KDa的目的蛋白，免疫印迹实验和间接免疫荧光试验均表明，所表达的外源蛋白能够与IPNV免疫血清发生反应，表明重组VP3蛋白与IPNV天然抗原一样具有相同的抗原性。

目前普遍认为，在宿主细胞表面表达外源抗原的活载体疫苗向粘膜免疫系统提呈抗原的最佳方式。本发明所使用的使用的pPG1表达载体，具有ssUSP分泌信号肽，同时具有锚定结构，属表面表达型载体，表达的目的蛋白能够锚定于干酪乳杆菌的表面。经诱导表达后，对其培养物上清液10倍浓缩后进行目的蛋白的检查，结果未检测到表达的VP3蛋白，菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可见在预期的分子量大小有目的蛋白的表达，Western-bolt检测也证实表达蛋白存在于菌体上，诱导后的活菌体免疫荧光试验表明，所表达的蛋白初步定位于菌体的表面，存在菌体表面的目的蛋白，为抗原物质有效刺激免疫系统，提高抗体水平奠定了重要的物质基础。

(四)附图说明

图1传染性胰腺坏死病毒VP3基因的RT-PCR扩增结果凝胶电泳图

1.DNA MarkerDL2000；2.VP3基因PCR扩增产物(618bp)

图2重组质粒pMD18-T-VP3酶切、PCR鉴定结果

1.DNA Marker DL15000；2.BamHI单酶切；3.PCR阴性对照；4、5.BamH I和XhoI双酶切；6.DNAMarkerDL2000；7、8.PCR鉴定结果

图3重组质粒pPG1-IPNV VP3酶切、PCR鉴定结果

1.DNA Marker DL15000；2、3.BamH I和XhoI双酶切；4、5.BamHI、XhoI单酶切；6.DNA MarkerDL2000；

7.PCR鉴定结果

图4重组干酪乳杆菌pPG1-IPNV VP3/L.casei393表达VP3蛋白SDS-PAGE及Western-blotting鉴定结果

a：重组菌pPG1-IPNV VP3/L.casei393诱导表达的SDS-PAGE鉴定结果.1.protein marker(116kD～18.4kD)；2.pPG1-IPNV VP3/L.casei393未经乳糖诱导；3.pPG1-IPNV VP3/L.casei393经1％乳糖Lactose诱导；

b：目的蛋白Western-blot鉴定结果.将蛋白转印NC膜，先后与兔抗IPNV VP3血清和HRP标记羊抗兔IgG作用，显色后观察结果：1.protein marker(116kD～18.4kD)；2.经乳糖诱导的pPG1-IPNVVP3/L.casei393，Western blot鉴定出现预期大小的免疫反应带；3.未经乳糖诱导的重组菌，Western blot结果未出现预期的反应带。

图5重组干酪乳杆菌pPG1-IPNV VP3/L.casei393免疫荧光结果

a：pPG1-IPNV VP3/L.casei393经诱导表达后，间接免疫荧光检测菌体表面出现黄绿色荧光；b：未经诱导的pPG1-IPNV VP3/L.casei393菌体表面未出现荧光反应，菌体被伊文思蓝染成红色。

(五)具体实施方式

下面结合附图举例对本发明做更详细的描述：

1.IPNV VP3基因干酪乳杆菌表达载体的构建

用质粒DNA小量提取试剂盒从大肠杆菌pMD18-T-IPNV VP3/JM109和含质粒pPG1干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393中提取重组质粒pMD18-T-IPNV VP3及质粒pPG1。将pPG1和pMD18-T- IPNV VP3分别进行双酶切后分别对目的片段进行回收纯化。将回收的pPG1和VP3的纯化产物进行连接，将连接产物电转化于感受态细胞Lactobacillus casei 393，含阳性重组质粒pPG1-IPNV VP3的干酪乳杆菌命名为pPG1-IPNV VP3/L.casei 393。

2.IPNV VP3蛋白干酪乳杆菌中的诱导表达

将pPG1-IPNV VP3/L.casei 393单个菌落接种5mL MRS液体培养基中过夜培养使菌种活化，活化菌种按1∶20比例接种于10mL含1％乳糖的MRS培养基中，30℃诱导16h。诱导前和诱导后样品各1mL以12000r/min离心5min，菌体用100μL 10mg/mL的溶菌酶，37℃水浴作用60min，12000r/min离心5min，弃上清，加入1×PBS和等量的2×SDS-PAGE样品缓冲液(含DTT)，混匀，沸水浴5min，12000r/min离心5min，以蛋白质标准分子量为参考，分别取出1ml样品经溶菌酶处理后进行SDS-PAGE及Western-blot分析。

3.间接免疫荧光检测

取经诱导的重组干酪乳杆菌和含空质粒的干酪乳杆菌各0.5mL离心去上清后，分别用PBS洗菌体3次；加入兔源抗IPNV VP3蛋白高免血清，混匀，37℃作用60min，4000r/min离心5min去上清，PBS离心洗菌体3次；加入稀释的羊抗兔IgG/FITC荧光抗体，悬浮混合后37℃作用60min，4000r/min离心5min去上清，PBS离心洗菌体3次；菌体沉淀物悬浮于200μL PBS缓冲液中，取适量涂片，自然干燥后，预冷丙酮固定30min后，荧光显微镜观察。

Claims (3)

1.一种表达传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的重组干酪乳杆菌，其特征是：它是保藏在中国典型培养物保藏中心保藏编号为CCTCC M 209004的重组干酪乳杆菌。

2.一种表达传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的重组干酪乳杆菌的方法，其特征是：根据传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的全基因序列及表达载体质粒的基因融合特点，设计一对引物，进行PCR，获得含有IPNVVP3基因主要抗原位点的618bp目的片段，将扩增得到的IPNV VP3基因与表面表达的载体质粒pPG1进行连接，通过电转化进入宿主菌干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393细胞内，含阳性重组质粒pPG1-IPNV VP3的干酪乳杆菌命名为pPG1-IPNV VP3/L.casei 393。将重组pPG1-IPNV VP3/L.casei 393在乳糖的诱导下进行表达。

根据权利要求1所述的表达传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的重组干酪乳杆菌的方法，其特征是：所述的引物序列为：

P15′AGC GGATCC T GCATCCGGGATGGACGAG 3′

P25′AGC CTCGAG TCGTCGTTTCATCTGTC 3′。

3.根据权利要求2所述的表达传染性胰腺坏死病毒VP3蛋白的重组干酪乳杆菌的制法，其特征是：

(1)IPNV VP3基因干酪乳杆菌表达载体的构建

用质粒DNA小量提取试剂盒从大肠杆菌pMD18-T-IPNV VP3/JM109和含质粒pPG1干酪乳杆菌Lactobacillus casei 393中提取重组质粒pMD18-T-IPNV VP3及质粒pPG1。将pPG1和pMD18-T-IPNV VP3分别进行双酶切后分别对目的片段进行回收纯化。将回收的pPG1和VP3的纯化产物进行连接，将连接产物电转化于感受态细胞Lactobacillus casei 393，含阳性重组质粒pPG1-IPNV VP3的干酪乳杆菌命名为pPG1-IPNV VP3/L.casei 393。

(2)IPNV VP3蛋白干酪乳杆菌中的诱导表达

将pPG1-IPNV VP3/L.casei 393单个菌落接种5mL MRS液体培养基中过夜培养使菌种活化，活化菌种按1∶20比例接种于10mL含1％乳糖的MRS培养基中，30℃诱导16h。诱导前和诱导后样品各1mL以12000r/min离心5min，菌体用100μL 10mg/mL的溶菌酶，37℃水浴作用60min，12000r/min离心5min，弃上清，加入1×PBS和等量的2×SDS-PAGE样品缓冲液(含DTT)，混匀，沸水浴5min，12000r/min离心5min，以蛋白质标准分子量为参考，分别取出1ml样品经溶菌酶处理后进行SDS-PAGE及Western-blot分析。

(3)间接免疫荧光检测

取经诱导的重组干酪乳杆菌和含空质粒的干酪乳杆菌各0.5mL离心去上清后，分别用PBS洗菌体3次；加入兔源抗IPNV VP3蛋白高免血清，混匀，37℃作用60min，4000r/min离心5min去上清，PBS离心洗菌体3次；加入稀释的羊抗兔IgG/FITC荧光抗体，悬浮混合后37℃作用60min，4000r/min离心5min去上清，PBS离心洗菌体3次；菌体沉淀物悬浮于200μL PBS缓冲液中，取适量涂片，自然干燥后，预冷丙酮固定30min后，荧光显微镜观察。

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