CN108251382A - 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用 - Google Patents

一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株，该猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株TK基因的99～103位发生5个碱基的缺失。本发明的自然致弱毒株制备的疫苗组合物能够对猪体产生完全保护，其生物安全性好，不存在毒力返强的风险。

Description

一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合 物和应用
技术领域
本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、致弱的病毒株及利用该毒株制备的疫苗组合物，属于兽用生物制品领域。
背景技术
伪狂犬病，又称Aujeszky氏病，是由疱疹病毒科(Herpesviridae)α亚科中的猪疱疹病毒Ⅰ型(Suid herpesvirus 1strain)所引起的猪、牛、羊等多种家畜、家禽和野生动物的一种以发热、奇痒(除猪外)及脑脊髓炎为主症的急性传染病。猪的伪狂犬病在我国广泛存在，危害严重，是制约规模化猪场生产的主要疫病之一。它能引起妊娠母猪流产、死胎或木乃伊胎和仔猪出现神经症状、麻痹，死亡率高。PRV具有较强的泛嗜性、神经嗜性及潜伏感染特性，在外周神经系统可以长期潜伏感染，当潜伏病毒被激活变成有感染力的病毒，被潜伏感染的宿主就会发病。
最近的研究报道称猪伪狂犬病发生了新的特点，突出表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状。现有技术的疫苗免疫猪只后不能完全抵抗野毒攻击，依然会出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝等症状，感染率超过80％，发病率超过30％，死亡率在10％～20％之间(参见猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析.彭金美等.中国预防兽医学报，2013，35(1)：1-4；免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定.童武等.中国动物传染病学报，2013,21(3):1-7；PathogenicPseudorabies Virus,China,2012.Yu et al.,Emerging infectious Diseases.2014,20(1):102-104；Pseudorabies virus variant in Bartha-K61-vaccinated pigs,China,Anet al.,Emerging infectious Diseases.2013.19(11)：1749-1755，临床上需要针对猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病的疫苗。
预防和控制猪伪狂犬变异株引起的伪狂犬病有效的方法是疫苗接种，开发商品化的疫苗可以是灭活疫苗，也可以是弱毒株制备的活疫苗。然而，灭活疫苗成本较高，活疫苗一般是通过基因工程手段人工缺失毒力基因致弱毒株来制备的，存在生物安全风险。因此，临床上存在提供安全性高的弱毒疫苗株以预防猪伪狂犬变异株感染蔓延的需要。
发明内容
为解决上述问题，本发明通过细胞传代、结合诱变剂诱变的方式，自然致弱毒株，使其在自然进化过程中发生变异，达到完全适应自然环境条件，以保证该致弱株的稳定性，不存在生物安全方面的风险。
本发明的一个方面在于提供一种猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株TK基因的99～103位发生5个碱基的缺失。本发明的弱毒株为自然致弱，生物安全性好，不存在毒力返强的风险。
本发明的一个方面在于提供一种猪伪狂犬病病毒的致弱方法，所述方法包括：(1)培养胸腺激酶缺陷传代细胞，同步加入5-溴-2’-脱氧尿苷(BUdR)，形成良好单层；(2)将猪伪狂犬病病毒接种生长良好的上述传代细胞单层，同步加入BUdR，继续传代培养至所述猪伪狂犬病病毒传代5代以上，得到所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株。
本发明的一个方面在于提供一种疫苗组合物，所述疫苗组合物含有免疫量的所述猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株或其培养物，以及药学上可以接受的载体。
本发明的一个方面在于提供一种制备所述疫苗组合物的方法，所述方法包括：(1)将所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株或其培养物扩增培养，获得扩增的所述猪伪狂犬病病毒弱毒株；(2)在所述步骤(1)中获得的所述扩增的猪伪狂犬病病毒弱毒株中加入载体。
本发明的一个方面在于提供所述的疫苗组合物在制备预防与治疗猪伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。
具体实施方式
以下，对本发明的实施方式进行说明。
本发明涉及一种猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株，其中，以猪伪狂犬病病毒HN1201株的TK基因为基准，所述猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株TK基因99～103位发生5个碱基的缺失。
本发明的猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株其TK基因，以猪伪狂犬病病毒HN1201株的TK基因为基准，在99～103位发生5个碱基的缺失，能使TK基因完全、不可逆地失活，保证了自然致弱毒株的弱毒性。
本领域技术人员可以预料，本发明的不同的猪伪狂犬病病毒TK具体的缺失片段在TK基因的全长上具体位置会有差异，然而，其缺失的具体位置可以使用本领域公知的软件以猪伪狂犬病病毒HN1201株的TK基因为基准进行确定。这些公知的软件包括但不限于，BLAST软件(在美国国立生物技术信息中心NCBI的网址上可获得：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi，或者见，例如，Altschul S.F.et al，J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)；Stephen F.et al，Nucleic Acids Res.，25：3389-3402(1997))，ClustalW2软件(在欧洲生物信息研究所网址上可获得：http://www.eji.ac.uk/Toolsa/clustalw2/，另见，例如，Higgins D.G.et al，Methods in Enzymology，266：383-402(1996)；Larkin M.A.et al，Bioinformatics(Oxford，England)，23(21)：2947-8(2007))；和TCoffee软件等(在瑞典生物信息学研究所的网站上可以获得：http://tcoffee.vital-it.ch/cgi-bin/Tcoffee/tcoffee_cgi/index.cgi，另见，例如，Poirot O.et al，NucleicAcids Res.，31(13)：3503-6(2003)；Notredame C.et al，J.Mol.Boil.，302(1)：205-17(2000))。使用软件进行序列比对时，可以使用软件提供的默认参数，或者也可以根据实际情况对软件提供的参数进行调整，这些都在本领域技术人员的知识范围内。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株中，所述猪伪狂犬病病毒为猪伪狂犬病病毒变异株，所述猪伪狂犬病病毒变异株包括HN1201株、HN1202株、HN1201-R株；所述猪伪狂犬病病毒HN1201株的自然致弱毒株为HN1201-TK[99-103nt]-株，所述猪伪狂犬病病毒HN1202株的自然致弱毒株为HN1202-TK[99-103nt]-株，所述猪伪狂犬病病毒HN1201-R株的自然致弱毒株为HN1201-R1株(又称为HN1201-R-TK[99-103nt]-株)。
术语“伪狂犬变异株”也称为高致病性猪伪狂犬毒株，是指：表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状。
优选地，所述的伪狂犬变异株为经分离的所述猪伪狂犬病病毒变异株，当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中基因缺失伪狂犬弱毒疫苗后依然会造成猪出现高热，精神沉郁，食欲下降或废绝症状的毒株。
优选地，所述的伪狂犬变异株为当重现所述猪伪狂犬病毒变异株感染时，免疫了现有技术中缺失gE、TK和gI基因中的一个及一个以上基因的伪狂犬弱毒疫苗后，所述猪依然感染猪伪狂犬病，并且所述猪伪狂犬病毒变异株具备具有使9-10日龄仔猪精神沉郁和食欲下降的毒株。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株中，所述猪伪狂犬病病毒包括猪伪狂犬病病毒JS-2012株、猪伪狂犬HeN1株、NVDC-PRV-BJ株、NVDC-PRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株、PRV TJ株、猪伪狂犬病病毒PRV-ZJ01、猪伪狂犬病病毒HN1201株、猪伪狂犬病病毒HN1202株、猪伪狂犬病病毒HN1201-R株。
猪伪狂犬病病毒株JS-2012株公开于免疫后发病仔猪中伪狂犬病毒的分离和鉴定[J].童武，张青占，郑浩等，中国动物传染病学报2013,21(3):1-7)；猪伪狂犬HeN1株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCCNO.6656，公开于中国专利申请CN102994458A；NVDC-PRV-BJ株、NVDCPRV-HEB株和NVDC-PRV-SD株公开于Pathogenic PseudorabiesVirus,Xiuling Yu,Zhi Zhou,Dongmei Hu,et al.China,2012EmergingInfectious Diseases，www.cdc.gov/eid ol.20,No.1,January 2014；PRVTJ strain(PRV TJ)株，公开于ChinaChun-Hua Wang Jin Yuan1,Hua-Yang Qin1，et al，Anovel gE-deleted pseudorabies virus(PRV)provides rapid andcomplete protectionfrom lethal challenge with the PRV variantemerging in Bartha-K61-vaccinatedswine population in China Vaccine 32(2014)3379–3385中；猪伪狂犬病毒变异株PRV-ZJ01，其保藏号为CGMCCNo.8170，公开于中国专利申请CN103627678A；猪伪狂犬病毒HN1201株(Pseudorabies virus,strain HN1201)保藏号为CCTCC NO.V201311，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年5月20日，公开于中国专利申请CN104004774A；猪伪狂犬病毒HN1202株(Pseudorabies virus,strain HN1202)保藏号为CCTCC NO.V201335，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2013年8月26日，公开于中国专利申请CN104328090A；猪伪狂犬病病毒HN1201-R株(Pseudorabies virus,strain HN1201-R)保藏号为CCTCC NO.V201516，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉·武汉大学，保藏日期为2015年3月17日，公开于中国专利申请CN105087506A。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株中，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株基因从TK基因的99～103位发生5个碱基的缺失。
优选地，所述猪伪狂犬病病毒株为伪狂犬变异株，包括猪伪狂犬病病毒HN1201株、猪伪狂犬病病毒HN1202株、猪伪狂犬病病毒HN1201-R株。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株为猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株为猪伪狂犬病病毒HN1201-TK[99-103nt]-株。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株为猪伪狂犬病病毒HN1202-TK[99-103nt]-株。
作为本发明的一种优选实施方式，猪伪狂犬病病毒HN1201-R株通过本发明致弱方式得到猪伪狂犬病病毒弱毒株，命名为猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株，与猪伪狂犬病病毒HN1201-R株相比，病毒基因从TK基因的99～103位发生5个碱基的缺失。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株培养1代至118代之间，对小鼠致病力显著降低。小鼠在接种后观察14天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本毒株猪伪狂犬病病毒HN1201-R株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株。通过对猪接种后观察28天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。
免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株培养至118代，仍具有良好的免疫原性。猪在接种21天后，可抵御强毒猪伪狂犬病病毒HN1201株的攻击。同时，未接种HN1201-R1株培养物的猪，则不能抵御猪伪狂犬病病毒HN1201株的攻击，全部发病。
毒力返强试验表明，培养1代至118代之间的病毒接种猪群，接种后在猪群中连续接触传代多次，不发生返强；而后将在猪群中多次传代后的病毒再次接种鼠群，对小鼠依然无致病力。因此，病毒接种猪群后，不会重新演变为强毒而引发病，安全性有保证。
作为本发明的一种优选实施方式，猪伪狂犬病病毒HN1201株通过本发明致弱方式得到猪伪狂犬病病毒弱毒株，命名为猪伪狂犬病病毒HN1201-TK[99-103nt]-株，与猪伪狂犬病病毒HN1201株相比，病毒基因从TK基因的99～103位发生5个碱基的缺失，与猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株缺失基因的位置、大小完全一致。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-TK[99-103nt]-株培养1代至118代之间，对小鼠致病力显著降低。小鼠在接种后观察14天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本毒株猪伪狂犬病病毒HN1201株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株。
作为本发明的一种优选实施方式，猪伪狂犬病病毒HN1202株通过本发明致弱方式得到猪伪狂犬病病毒弱毒株，命名为猪伪狂犬病病毒HN1202-TK[99-103nt]-株，与猪伪狂犬病病毒HN1202株相比，病毒基因从TK基因的99～103位发生5个碱基的缺失，与猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株缺失基因的位置、大小完全一致。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1202-TK[99-103nt]-株培养1代至118代之间，对小鼠致病力显著降低。小鼠在接种后观察14天，不出现临床症状，剖检组织器官无变化。因此，该病毒与亲本毒株猪伪狂犬病病毒HN1202株相比，致病力显著降低，是致弱的病毒株。
本发明还涉及一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的所述HN1201-R1株或其培养物，和药学上可接受的载体。
本发明的HN1201-R1株其由猪伪狂犬病病毒HN1201株的gI/gE/11K/28K基因经传代致弱失活的HN1201-R株，进一步使其TK基因的99-103位发生5个碱基的缺失后失活，其保留了原亲本株HN1201株良好的免疫原性，而其致病力显著降低，是自然致弱的疫苗株，其作为活疫苗免疫猪后，能对猪提供100％的保护。
作为本发明的一个优选的实施方式，在本发明所述的疫苗组合物中，所述HN1201-R1株的培养物为传代1～118代的培养物。
本发明的另一方面在于提供制备的疫苗组合物，其中，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株含量≥106.0TCID50/头份。
作为本发明的一个优选的实施方式，本发明制备的疫苗组合物中，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株含量为106.0TCID50/头份～107.0TCID50/头份。
作为本发明的一个实施方式，本发明制备的疫苗组合物中，所述HN1201-R1株含量为≥106.0TCID50/头份。
作为本发明的一个优选的实施方式，本发明制备的疫苗组合物中，所述HN1201-R1株含量为106.0TCID50/头份～107.0TCID50/头份。
作为本发明的一个实施方式，本发明制备的疫苗组合物中，所述药学上可接受的载体包括稳定剂，所述稳定剂包括SPGA、糖类、蛋白质，含有蛋白质的物质，或缓冲液；糖类包括山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖，蛋白质包括白蛋白或者酪蛋白，所述含有蛋白质的物质包括牛血清或脱脂乳，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
特别当将这种稳定剂加入疫苗时，疫苗非常适于冷冻干燥。因此，在该实施方案的更优选的形式中，活的减毒疫苗是冷冻干燥的形式。
作为本发明的一个实施方式，本发明制备的疫苗组合物中，所述疫苗组合物进一步包括免疫量的其他抗原，所述其他抗原包括猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪细小病毒抗原、猪乙型脑炎病毒抗原。
此外，本发明的猪伪狂犬疫苗可与其他失活病原体或抗原组合使用以制备抵抗包括猪伪狂犬病的各种疾病的联合疫苗或复合疫苗。
本发明所用的术语“联合疫苗”用于指从本发明的猪伪狂犬病病毒与至少一种不同病毒的病毒混合物制备的疫苗。
本发明所用术语“复合疫苗”指的是从病毒和细菌制备的疫苗。例如，本发明的猪伪狂犬病毒可与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒和/或副猪嗜血杆菌、支原体混合或组合。
作为本发明的一种实施方式，所述疫苗进一步含有失活病原体或抗原组分。
作为本发明的一个优选实施方式，本发明制备的疫苗组合物中，所述其他抗原包括猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪圆环病毒抗原和/或副猪嗜血杆菌抗原或猪肺炎支原体抗原。
本发明的组合物的成分或组分的量优选地是治疗有效量。所述治疗有效量是指在组合物施用的宿主中发挥它们的免疫学作用而不导致过度副作用所必需量。所用的成分和待施用的组合物的精确的量将根据因素如治疗的疾病的类型，待治疗的动物的类型和年龄，施用的方式，以及组合物中的其它成分而变化。
作为本发明的一个优选实施方式，本发明制备的疫苗组合物中，所述疫苗组合物进一步包括佐剂，所述佐剂包括弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs、皂苷、矿物油、植物油或Carbopol。
任选地，可以向疫苗中加入具有佐剂活性的一种或多种化合物。根据本发明的活的减毒的猪伪狂犬病毒不一定需要这种佐剂来实现功效，但是特别对应包含根据本发明的活的减毒的猪伪狂犬病毒和来自另一致病病毒或微生物的抗原性物质的组合疫苗，将值得加入佐剂。佐剂是免疫系统的非特异性刺激剂，它们增强宿主对疫苗的免疫应答。本领域中已知的佐剂的实例是弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs(免疫刺激复合体)、皂苷、矿物油、植物油和Carbopol。
因此，在该实施方案的优选形式中，根据本发明的活的减毒疫苗包含佐剂。
本发明还涉及所述猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株的制备方法，其中，所述方法包括：
步骤(1)，培养单层143TK-细胞，用胰酶消化143TK-细胞，将所述消化后的143TK-细胞接种于细胞瓶内，添加含有90％～97％体积比的DMEM培养液、3％～10％体积比的胎牛血清和100μg/ml 5-溴-2’-脱氧尿苷的细胞培养液，所述细胞培养液pH为7.0～8.0，在36℃～38℃，5％CO2条件下培养，形成单层143TK-细胞；
步骤(2)，接种猪伪狂犬病病毒到所述步骤(1)培养的单层143TK-细胞，用含有100μg/ml 5-溴-2’-脱氧尿苷及95％～99％体积比的DMEM培养液和1％～5％体积比的胎牛血清的细胞维持液，所述细胞维持液pH为7.1～7.5，在36℃～38℃，5％CO2条件下继续培养，在40-48h，当细胞80％以上发生病变时，收获感染病毒的细胞及上清液，-80℃反复冻融3次后，收获病毒；以及
步骤(3)，按照所述步骤(2)的方法再传≥4代，然后将收获的病毒接种于143TK-细胞，用含100μg/ml 5-溴-2’-脱氧尿苷的低熔点琼脂糖平皿培养，所述低熔点琼脂糖平皿由含4％胎牛血清的2×DMEM与2％琼脂糖按照体积比1:1混合而成，待出现蚀斑后，挑取单个蚀斑接种到DMEM培养液中培养。
本发明提供一种猪伪狂犬病病毒的致弱方法，所述方法包括：(1)培养胸腺激酶缺陷传代细胞，同步加入BUdR，加入BUdR的量为100μg/ml细胞生长液，形成良好单层；(2)将猪伪狂犬病病毒接种生长良好的上述传代细胞单层，同步加入BUdR，加入BUdR的量为100μg/ml细胞维持液，40h～48h后，当细胞80％以上发生病变时，收获细胞培养病毒液作为继续传代用毒种；继续传代培养至所述猪伪狂犬病病毒传代5代以上，得到所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法中，所述胸腺激酶缺陷传代细胞包括人胸腺激酶缺陷细胞、鼠胸腺激酶缺陷细胞。
优选地，所述人胸腺激酶缺陷细胞为143TK-。
作为本发明的一种优选实施方式，所述猪伪狂犬病病毒株为HN1201株、HN1202株、HN1201-R株。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法中，所述步骤(1)包括如下步骤：
(1a)接毒用细胞的传代与培养：所述传代细胞经胰酶细胞分散消化，用细胞生长液继续培养，同步加入BUdR，加入BUdR的量为100μg/ml细胞生长液，形成传代细胞单层。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法中，所述步骤(2)包括如下步骤：
(2a)病毒的繁殖：将所述猪伪狂犬病病毒接种至所述步骤(1a)中得到的传代细胞单层，同步加入BUdR，加入BUdR的量为100μg/ml细胞维持液，用细胞维持液继续培养；40h～48h后，当细胞80％以上发生病变时，收获细胞培养病毒液作为继续传代用毒种，进行下一步的传代，所述传代传至5代以上，得到所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株。
优选地，步骤(2a)猪伪狂犬病病毒进行传代的代数为8～50代。
优选的，步骤(1a)、(2a)中的细胞培养所用的温度为36℃～38℃。
优选的，步骤(2a)中猪伪狂犬病病毒接种时的接种量为1％～2％体积百分比的猪伪狂犬病病毒的维持液。
优选的，步骤(1a)中的细胞生长液含90％～97％体积百分比的细胞培养液和3％～10％体积比的牛血清，所述细胞生长液的pH值为7.0～8.0。
优选的，步骤(2a)中的细胞维持液含95％～99％体积百分比的细胞培养液和1％～5％体积比的牛血清，所述细胞维持液的pH值为7.1～7.5。
其中所述的适合培养易增殖猪伪狂犬病病毒的传代细胞的细胞培养液包括但不限于选自MEM培养液、DMEM培养液、EMEM培养液、199培养液、1640培养液和α-MEM培养液中的任意一种，所述的牛血清包括但不限于胎牛血清、新生牛血清或小牛血清。
优选的，所述的细胞培养液为DMEM培养液，所述的牛血清为胎牛血清。
本发明提供所述的猪伪狂犬病病毒的致弱方法致弱的猪伪狂犬病病毒弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒弱毒株TK基因失活。
优选地，步骤(2)得到猪伪狂犬病病毒弱毒株与亲本毒株相比，TK基因失活。
优选地，步骤(2)得到猪伪狂犬病病毒弱毒株与亲本毒株相比，TK基因缺失部分片段。
本发明的另一方面在于提供一种制备疫苗组合物的方法，所述方法包括：(1)将所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株或其培养物扩增培养，获得扩增的所述的猪伪狂犬病病毒弱毒株；以及(2)在所述步骤(1)中获得的所述扩增的猪伪狂犬病病毒弱毒株中加入载体。
作为本发明的一个优选的实施方式，所述制备所述疫苗组合物的方法中，所述的方法包括：(1)培养猪伪狂犬病病毒弱毒株；以及(2)在所述培养的猪伪狂犬病病毒弱毒株中加入冻干保护剂。
本发明的另一方面在于提供所述的疫苗组合物在制备预防与治疗猪伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用。
作为本发明的一种实施方式，所述的猪伪狂犬感染相关疾病是由猪伪狂犬病病毒变异株导致的猪伪狂犬病。
本文所用的术语“猪伪狂犬病病毒感染相关疾病”可以指表现为任何年龄的猪都会感染，可在猪群水平传播，潜伏期短(1～2天)，发病率在10％～100％之间，发病猪死亡率在10％～100％之间(仔猪死亡率可高达100％)，感染后可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死，并可引起种公猪精液质量下降，怀孕母猪流产(高达35％)，早产，死胎，弱仔(弱仔14日龄前全部死亡)等繁殖障碍症状，但不限于此。上述症状与现有技术中感染了普通猪伪狂犬病病毒后产生的症状差异在于：感染了后会造成感染后成年猪(体重在50kg以上猪)可引起猪只高热(40～42℃，持续3日以上)，呼吸困难，腹泻，喘，咳嗽，打喷嚏，后肢麻痹，犬坐，突然倒地，抽搐，侧卧不起，角弓反张，泳状划水，最后衰竭而死；新生及4周龄以内的仔猪突然发病，发生大批死亡，死亡率达90％以上；发病仔猪主要表现为体温上升达41℃以上，食欲废绝，伴有明显的神经症状和腹泻；断奶前后仔猪主要为呼吸系统症状，表现呼吸困难、咳嗽、流鼻涕等。
本文所用的术语“预防”指通过给予根据本发明的疫苗组合物抑制猪伪狂犬病病毒感染或推迟疾病发作的所有行为。术语“治疗”指通过给予根据本发明的疫苗组合物使猪伪狂犬病病毒感染引起的症状减轻或转好的所有行为。
本发明具有以下突出的优点：
(1)本发明的毒株是通过自然传代的方式天然缺失毒性基因的，能更好的适应自然，无毒力返强风险，生物安全性好。
(2)本发明野毒致弱方法结果稳定性好，可操作，可重复，提供了一种不同的强毒致弱的方式。
(3)本发明的毒株，毒性小，能够获得较好的免疫保护，能够诱导较早产生抗体。
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明的实施例中以猪伪狂犬病病毒HN1201株、HN1202株、HN1201-R株为例说明本发明。
本发明中所述的“TCID50”(50％tissue culture infective dose)是指半数细胞培养物感染量，是表示病毒感染力的一种表示方式。
本发明的DMEM培养基用购自美国Gibco公司的DMEM干粉培养基按照其说明书配制。
本发明中所述的“PBS”是指磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer Saline)的英文缩写，本发明中使用的是0.01mM的pH7.4的PBS，按《分子克隆》第三版所述配制。
胎牛血清购自PAA公司。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1猪伪狂犬病病毒TK基因缺失株的获得
1.取生长良好的143TK-细胞，用胰酶消化，接种于细胞瓶内，以含有90％～97％体积比的DMEM培养液、3％～10％体积比的胎牛血清和100μg/ml BUdR(5-溴-2’-脱氧尿苷)的细胞培养液(pH调整为7.0～8.0)于36℃～38℃，5％CO2条件下继续培养，形成良好单层，用于接种病毒。
2.将猪伪狂犬病病毒HN1201株接种生长良好的上述传代细胞单层，用含有100μg/ml BUdR及95％～99％体积比的DMEM培养液和1％～5％体积比的胎牛血清的细胞维持液(pH调整为7.1～7.5)于36℃～38℃，5％CO2条件下继续培养，于40h～48h后，当细胞80％以上发生病变时，收获感染病毒的细胞及上清液，-80℃反复冻融3次后，按照上述方法再传4代，然后将收获的病毒接种于143TK-细胞，用含100μg/ml BUdR的低熔点琼脂糖(含4％胎牛血清的2×DMEM与2％琼脂糖按照体积比1:1混合而成)培养，待出现蚀斑后，挑取单个蚀斑到DMEM培养液中。
含有噬斑的培养液用GenAid DNA extraction Kit提取病毒基因组DNA，用针对TK基因的引物进行PCR扩增，将PCR产物克隆后送测序，鉴定TK基因序列变化。通过6轮筛选，获得TK基因突变株。测序结果表明，TK基因的99～103位发生5个碱基的缺失，命名为HN1201-TK[99-103nt]-。HN1201株TK基因突变前后的序列见SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，比较两者可见，在突变后原来99～103位的5个碱基发生了缺失。
实施例2猪伪狂犬病病毒TK基因缺失株HN1201-TK[99-103nt]-株的致病性试验
7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪15头随机分成3组，第1组接种HN1201-TK[99-103nt]-株，第2组接种HN1201株，第3组为对照组，每组5头，分组和攻毒情况见表1。
表1 TK基因缺失株HN1201-TK[99-103nt]-株的致病性试验分组
组别 接种用毒株 接种剂量
1 HN1201-TK[99-103nt]-株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
2 HN1201株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
3 DMEM培养基 滴鼻接种1ml/头
病毒接种后，每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体见表2。
表2 TK基因缺失株HN1201-TK[99-103nt]-株的致病性试验结果
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1201株可以导致7日龄仔猪100％死亡(5/5)，而TK基因缺失株HN1201-TK[99-103nt]-株毒性大幅度减低，神经症状消失，仅两头猪死亡。TK基因缺失株HN1201-TK[99-103nt]-株毒性对7日龄仔猪还有普遍的体温升高、精神沉郁等临床症状，证明仍有毒力。
6周龄BALB/c小鼠15只随机分成3组，第4组接种HN1201-TK[99-103nt]-株，第5组接种HN1201株，第6组为对照组，每组5头，分组和攻毒情况见表3。
表3 TK基因缺失株HN1201-TK[99-103nt]-株对小鼠的致病性试验分组
组别 接种用毒株 接种剂量
4 HN1201-TK[99-103nt]-株 滴鼻接种50μl(105.0TCID50/只)
5 HN1201株 滴鼻接种50μl(105.0TCID50/只)
6 DMEM培养基 滴鼻接种50μl/只
病毒接种后，观察临床症状和死亡情况，具体见表4。
表4 TK基因缺失株HN1201-TK[99-103nt]-株对小鼠的致病性试验结果
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1201株可以导致小鼠100％死亡(5/5)，而TK基因缺失株HN1201-TK[99-103nt]-株对小鼠完全无致病力。
实施例3猪伪狂犬病病毒HN1202-TK[99-103nt]-株的获得
参照实施例1的方法，利用猪伪狂犬病病毒HN1202株筛选TK基因缺失株，通过6轮筛选，获得TK基因突变株。比较HN1202株突变前后的TK基因序列，测序结果表明，TK基因的99～103位发生5个碱基的缺失，命名为HN1202-TK[99-103nt]-株。这与HN1201株的突变结果一致，都是在TK基因的相同位置缺失了相同的片段。
实施例4猪伪狂犬病病毒HN1202-TK[99-103nt]-株的致病性试验
7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪15头随机分成3组，第7组接种HN1202-TK[99-103nt]-株，第8组接种HN1202株，第9组为对照组，每组5头，分组和攻毒情况见表5。
表5 HN1202-TK[99-103nt]-株的致病性试验分组
组别 接种用毒株 接种剂量
7 HN1202-TK[99-103nt]-株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
8 HN1202株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
9 DMEM培养基 滴鼻接种1ml/头
病毒接种后，每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体见表6。
表6 HN1202-TK[99-103nt]-株的致病性试验结果
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1202株可以导致7日龄仔猪100％死亡(5/5)，而TK基因缺失株HN1202-TK[99-103nt]-株毒性大幅度减低，神经症状消失，仅两头猪死亡。TK基因缺失株HN1202-TK[99-103nt]-株毒性对7日龄仔猪还有普遍的体温升高、精神沉郁等临床症状，证明仍有毒力。
6周龄BALB/c小鼠15只随机分成3组，第10组接种HN1202-TK[99-103nt]-株，第11组接种HN1202株，第12组为对照组，每组5头，分组和攻毒情况见表7。
表7 HN1202-TK[99-103nt]-株对小鼠的致病性试验分组
组别 接种用毒株 接种剂量
10 HN1202-TK[99-103nt]-株 滴鼻接种50μl(105.0TCID50/只)
11 HN1202株 滴鼻接种50μl(105.0TCID50/只)
12 DMEM培养基 滴鼻接种50μl/只
病毒接种后，观察临床症状和死亡情况，具体见表8。
表8 HN1202-TK[99-103nt]-株对小鼠的致病性试验结果
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1202株可以导致小鼠100％死亡(5/5)，而TK基因缺失株HN1202-TK[99-103nt]-株对小鼠完全无致病力。
实施例5猪伪狂犬病病毒gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株HN1201-R1株的获得
参照实施例1的方法，利用猪伪狂犬病病毒HN1201-R株筛选gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株，通过6轮筛选，获得TK基因突变株。比较HN1201-R株突变前后的TK基因序列，测序结果表明，TK基因的99～103位发生5个碱基的缺失，命名为HN1201-R1株。这与HN1201株、HN1202株的突变结果一致，都是在TK基因的相同位置缺失了相同的片段。
实施例6猪伪狂犬病病毒gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株HN1201-R1株的致病性试验
7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪15头随机分成3组，第13组接种HN1201-R1株，第14组接种HN1201-R株，第15组为对照组，每组5头，分组和攻毒情况见表9。
表9 gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株HN1201-R1株的致病性试验分组
组别 接种用毒株 接种剂量
13 HN1201-R1株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
14 HN1201-R株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
15 DMEM培养基 滴鼻接种1ml/头
病毒接种后，每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况，具体见表10。
表10 gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株HN1201-R1株的致病性试验结果
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1201-R株接种7日龄仔猪无死亡情况发生，但依然有2头体温升高；gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株HN1201-R1株已完全没有毒性。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株HN1201-R1株与亲本gI/gE/11K/28K基因缺失株猪伪狂犬病病毒HN1201-R株相比，致病力降低，是安全致弱的病毒株。
6周龄BALB/c小鼠15只随机分成3组，第16组接种HN1201-R1株，第17组接种HN1201-R株，第18组为对照组，每组5头，分组和攻毒情况见表11。
表11 gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株HN1201-R1株对小鼠的致病性试验分组
组别 接种用毒株 接种剂量
16 HN1201-R1株 滴鼻接种50μl(105.0TCID50/只)
17 HN1201-R株 滴鼻接种50μl(105.0TCID50/只)
18 DMEM培养基 滴鼻接种50μl/只
病毒接种后，观察临床症状和死亡情况，具体见表12。
表12 gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株HN1201-R1株对小鼠的致病性试验结果
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1201-R株可以导致小鼠100％死亡(5/5)，而TK基因缺失株HN1201-R1株对小鼠完全无致病力。
实施例7本发明猪伪狂犬病病毒TK基因缺失株的致病力稳定性试验
为验证猪伪狂犬病病毒不同的TK基因缺失株不同代次对猪致病力的稳定性，分别用HN1201-TK[99-103nt]-株、HN1202-TK[99-103nt]-株、HN1201-R1株第1代、30代、60代、90代、118代培养物，各接种1组7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪(5头)，滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头，5头猪作为对照组。每日测定仔猪体温，观察、记录临床症状和死亡情况。
结果显示，第1代、30代、60代、90代、118代的猪伪狂犬病病毒HN1201-TK[99-103nt]-株培养物，接种后观察，猪伪狂犬病病毒HN1201-TK[99-103nt]-株毒性大幅度降低，体温升高3～4天，均有精神沉郁、食欲下降及喜卧等临床症状，但最终3头存活，各代次接种组结果一致；第1代、30代、60代、90代、118代的猪伪狂犬病病毒HN1202-TK[99-103nt]-株培养物，接种后观察，猪伪狂犬病病毒HN1202-TK[99-103nt]-株毒性大幅度降低，体温升高3～4天，均有精神沉郁、食欲下降及喜卧等临床症状，但最终3头存活，各代次接种组结果一致；第1代、30代、60代、90代、118代的猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株培养物，接种后观察，猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株毒性大幅度降低，体温正常，无其他临床症状，皆存活，各代次接种组结果一致。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-TK[99-103nt]-株、HN1202-TK[99-103nt]-株、HN1201-R1株不同代次培养物对猪致病力稳定。
为验证猪伪狂犬病病毒不同的TK基因缺失株不同代次对小鼠致病力的稳定性，分别用HN1201-TK[99-103nt]-株、HN1202-TK[99-103nt]-株、HN1201-R1株第1代、30代、60代、90代、118代培养物，各接种1组6周龄的BALB/c小鼠(5只)，滴鼻接种50μl(105.0TCID50/只)，5只小鼠作为对照组。每日观察临床症状和死亡情况。
结果显示，第1代、30代、60代、90代、118代的猪伪狂犬病病毒HN1201-TK[99-103nt]-株培养物，接种后观察，猪伪狂犬病病毒HN1201-TK[99-103nt]-株毒性大幅度降低，对小鼠完全无致病力，无临床症状，皆存活，各代次接种组结果一致；第1代、30代、60代、90代、118代的猪伪狂犬病病毒HN1202-TK[99-103nt]-株培养物，接种后观察，猪伪狂犬病病毒HN1202-TK[99-103nt]-株毒性大幅度降低，对小鼠完全无致病力，无临床症状，皆存活，各代次接种组结果一致；第1代、30代、60代、90代、118代的猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株培养物，接种后观察，猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株毒性大幅度降低，对小鼠完全无致病力，无临床症状，皆存活，各代次接种组结果一致。
致病性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-TK[99-103nt]-株、HN1202-TK[99-103nt]-株、HN1201-R1株不同代次培养物对小鼠致病力稳定。
实施例8猪伪狂犬病病毒gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株HN1201-R1株的病毒返强安全性试验
7日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪30头随机分成5组，每组6头，将猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株(1代)培养物，滴鼻接种第一组6头阴性猪(107.0TCID50/头)。第14天将其与第二组6头阴性猪同栏饲养14天后，将第一组6头猪取出，将第三组6头阴性猪与第二组再同栏饲养14天，以此类推，连续传4代。所有取出的猪处死，观察有无病变。同时，取传4代的病毒再次接种鼠群，观察临床症及死亡情况。
同上述方法验证猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株第30代、60代、90代、118代培养物病毒返强试验。
结果表明，同居感染试验至第4代，30头实验猪临床观察和大体剖检均未见异常，表明该弱毒株无毒力返强现象；且在猪群中多次传代后的病毒再次接种鼠群，对小鼠依然无致病力。因此，病毒接种猪群后，不会重新演变为强毒而引发病，安全性有保证。
实施例9猪伪狂犬病病毒gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株HN1201-R1株的免疫原性试验
9日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪10头随机分成2组，第19组接种HN1201-R1株，第20组为对照组，每组5头，分组情况见表13。
表13 gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株HN1201-R1株的免疫原性试验分组
组别 接种用毒株 接种剂量
19 HN1201-R1株 滴鼻接种1ml(107.0TCID50/ml)/头
20 DMEM培养基 滴鼻接种1ml/头
在免疫后21天，对猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株接种的仔猪5头，以及对照组5头仔猪，均用猪伪狂犬病病毒HN1201株以107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。结果见表14。
表14 gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株HN1201-R1株的免疫原性试验结果
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡。
免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒HN1201株产生良好的保护作用。
同时，为验证猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株不同代次免疫原性的稳定性，对分别免疫第1代、30代、60代、90代、118代的猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株培养物后第21天，各免疫组连同对照组均用猪伪狂犬，病病毒HN1201株以107.0TCID50/头剂量攻毒，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。
结果显示，第1代、30代、60代、90代、118代的猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株培养物接种过的仔猪全部健活，对照组仔猪全部死亡。
不同代次免疫原性试验表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株不同代次培养物均具有良好的免疫原性，能对猪伪狂犬病病毒HN1201株产生良好的保护作用。
实施例10猪伪狂犬病病毒gI/gE/11K/28K/TK基因缺失株HN1201-R1株的基因序列分析
将猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株第1代至第118代的培养物，用RT-PCR方法，进行基因组扩增(不同代次培养物分别扩增)。将获得的基因扩增产物回收、纯化，连接到测序质粒载体中，测定病毒基因的核苷酸序列，并用计算机软件转化成病毒的氨基酸序列。用序列分析软件，将获得的氨基酸序列与其亲本强毒株HN1201-R株氨基酸序列进行比较，描述病毒氨基酸序列特征。
结果显示，猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株第1代至第118代的培养物，TK基因的99～103位发生5个碱基的缺失，缺失5个碱基后的TK基因序列如SEQ ID NO.2所示。表明，猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株不同代次培养物病毒TK基因出现的共性的特征性变化是其毒力进一步降低的原因。
实施例11猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株弱毒活疫苗的制备
1.病毒的增殖
将实施例5制备的猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株毒种5×104倍稀释后接种已长成单层的ST细胞，吸附1h后，加入1000ml含2％胎牛血清的DMEM培养液，置37℃温室中转瓶培养，转速为6转/小时。待80％细胞病变后，反复冻融2次，收获病毒，测定病毒滴度，置低温保存。
2.保护剂的配制
每100ml去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置高压蒸气灭菌(121℃30min)。
3.疫苗的制备
将上述制备并保存的病毒液与保护剂按1:1(体积比)混合，冻干。疫苗含量具体配比见表15。
表15 HN1201-R1株弱毒活疫苗含量配比
疫苗1(TCID50) 疫苗2(TCID50)
HN1201-R1株抗原 106.0 107.0
保护剂(V/V) 50％ 50％
实施例12猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株弱毒活疫苗的免疫原性试验
9日龄的猪伪狂犬抗原抗体阴性仔猪15头随机分成3组，5头/组，免疫实施例11制备的猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株弱毒活疫苗。第21组免疫疫苗1，第22组免疫疫苗2，第23组为对照组。免疫21日后攻毒，攻毒剂量为猪伪狂犬病病毒HN1201株107.0TCID50/头，攻毒后每日测定仔猪体温，观察临床症状和死亡情况。具体结果见表16。
表16 HN1201-R1株弱毒活疫苗的免疫原性试验结果
结果显示，采用实施例11制备的猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株弱毒活疫苗免疫仔猪后，可阻断病毒感染(出现临床症状)，能为仔猪提供100％(5/5)保护，而对照组仔猪攻毒后4日全部死亡。
证明了两个试验组猪伪狂犬病病毒HN1201-R1株弱毒活疫苗具有很好的保护力，显示出很好的免疫保护和安全性。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
SEQUENCE LISTING
<110> 普莱柯生物工程股份有限公司
<120> 一种猪伪狂犬病病毒致弱方法、及其致弱的病毒株、疫苗组合物和应用
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 963
<212> DNA
<213> 猪伪狂犬病病毒
<400> 1
atgcgcatcc tccggatcta cctcgacggc gcctacggca ccggcaagag caccacggcc 60
cgggtgatgg cgctcggcgg ggcgctgtac gtgcccgagc cgatggcgta ctggcgcact 120
ctgttcgaca cggacacggt ggccggtatt tacgatgcgc agacccggaa gcagaacggc 180
agcctgagcg aggaggacgc ggccctcgtc acggcgcagc accaggccgc cttcgcgacg 240
ccgtacctgc tgctgcacac gcgcctggtc ccgctcttcg ggcccgcggt cgagggcccg 300
cccgagatga cggtcgtctt tgaccgccac ccggtggccg cgacggtgtg cttcccgctg 360
gcgcgcttca tcgtcgggga catcagcgcg gcggccttcg tgggcctggc ggccacgctg 420
cccggggagc cccccggcgg caacctggtg gtggcctcgc tggacccgga cgagcacctg 480
cggcgcctgc gcgcccgcgc gcgcgccggg gagcacgtgg acgcgcgcct gctcacggcc 540
ctgcgcaacg tctacgccat gctggtcaac acgtcgcgct acctgagctc ggggcgccgc 600
tggcgcgacg actgggggcg cgcgccgcgc ttcgaccaga ccgtgcgcga ctgcctcgcg 660
ctcaacgagc tctgccgccc gcgcgacgac cccgagctcc aggacaccct cttcggcgcg 720
tacaaggcgc ccgagctctg cgaccggcgc gggcgcccgc tcgaggtgca cgcgtgggcg 780
atggacgcgc tcgtggccaa gctgctgccg ctgcgcgtct ccaccgtcga cctggggccc 840
tcgccgcgcg tctgcgccgc ggccgtggcg gcgcaggcgc gcggcatgga ggtgacggag 900
tccgcgtacg gcgaccacat ccggcagtgc gtgtgcgcct tcacgtcgga gatgggggtg 960
tga 963
<210> 2
<211> 958
<212> DNA
<213> 猪伪狂犬病病毒
<400> 2
atgcgcatcc tccggatcta cctcgacggc gcctacggca ccggcaagag caccacggcc 60
cgggtgatgg cgctcggcgg ggcgctgtac gtgcccgatg gcgtactggc gcactctgtt 120
cgacacggac acggtggccg gtatttacga tgcgcagacc cggaagcaga acggcagcct 180
gagcgaggag gacgcggccc tcgtcacggc gcagcaccag gccgccttcg cgacgccgta 240
cctgctgctg cacacgcgcc tggtcccgct cttcgggccc gcggtcgagg gcccgcccga 300
gatgacggtc gtctttgacc gccacccggt ggccgcgacg gtgtgcttcc cgctggcgcg 360
cttcatcgtc ggggacatca gcgcggcggc cttcgtgggc ctggcggcca cgctgcccgg 420
ggagcccccc ggcggcaacc tggtggtggc ctcgctggac ccggacgagc acctgcggcg 480
cctgcgcgcc cgcgcgcgcg ccggggagca cgtggacgcg cgcctgctca cggccctgcg 540
caacgtctac gccatgctgg tcaacacgtc gcgctacctg agctcggggc gccgctggcg 600
cgacgactgg gggcgcgcgc cgcgcttcga ccagaccgtg cgcgactgcc tcgcgctcaa 660
cgagctctgc cgcccgcgcg acgaccccga gctccaggac accctcttcg gcgcgtacaa 720
ggcgcccgag ctctgcgacc ggcgcgggcg cccgctcgag gtgcacgcgt gggcgatgga 780
cgcgctcgtg gccaagctgc tgccgctgcg cgtctccacc gtcgacctgg ggccctcgcc 840
gcgcgtctgc gccgcggccg tggcggcgca ggcgcgcggc atggaggtga cggagtccgc 900
gtacggcgac cacatccggc agtgcgtgtg cgccttcacg tcggagatgg gggtgtga 958

Claims (10)

1.一种猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株，其中，以猪伪狂犬病病毒HN1201株的TK基因为基准，所述猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株TK基因99～103位发生5个碱基的缺失。
2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株，其中，所述猪伪狂犬病病毒为猪伪狂犬病病毒变异株；所述猪伪狂犬病病毒变异株包括HN1201株、HN1202株、HN1201-R株；所述猪伪狂犬病病毒HN1201株的自然致弱毒株为HN1201-TK[99-103nt]-株，所述猪伪狂犬病病毒HN1202株的自然致弱毒株为HN1202-TK[99-103nt]-株，所述猪伪狂犬病病毒HN1201-R株的自然致弱毒株为HN1201-R1株。
3.一种疫苗组合物，所述疫苗组合物包括免疫量的所述HN1201-R1株或其培养物，和药学上可接受的载体。
4.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述HN1201-R1株的培养物为传代1～118代的培养物。
5.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述HN1201-R1株含量为≥106.0TCID50/头份；优选地，所述HN1201-R1株含量为106.0TCID50/头份～107.0TCID50/头份。
6.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述药学上可接受的载体包括稳定剂，所述稳定剂包括SPGA、糖类、蛋白质，含有蛋白质的物质，或缓冲液；糖类包括山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖，蛋白质包括白蛋白或者酪蛋白，所述含有蛋白质的物质包括牛血清或脱脂乳，所述缓冲液包括磷酸盐缓冲液。
7.根据权利要求3所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物进一步包括免疫量的其他抗原，所述其他抗原包括猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪圆环病毒抗原、副猪嗜血杆菌抗原、猪肺炎支原体抗原、猪细小病毒抗原、猪乙型脑炎病毒抗原；优选地，所述其他抗原包括猪瘟病毒抗原、猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原、猪圆环病毒抗原和/或副猪嗜血杆菌抗原或猪肺炎支原体抗原。
8.根据权利要求7所述的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物进一步包括佐剂，所述佐剂包括弗氏完全和不完全佐剂、维生素E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、ISCOMs、皂苷、矿物油、植物油或Carbopol。
9.权利要求1所述猪伪狂犬病病毒的自然致弱毒株的制备方法，其中，所述方法包括：
步骤(1)，培养单层143TK-细胞，用胰酶消化143TK-细胞，将所述消化后的143TK-细胞接种于细胞瓶内，添加含有90％～97％体积比的DMEM培养液、3％～10％体积比的胎牛血清和100μg/ml 5-溴-2’-脱氧尿苷的细胞培养液，所述细胞培养液pH为7.0～8.0，在36℃～38℃，5％CO2条件下培养，形成单层143TK-细胞；
步骤(2)，接种猪伪狂犬病病毒到所述步骤(1)培养的单层143TK-细胞，用含有100μg/ml5-溴-2’-脱氧尿苷及95％～99％体积比的DMEM培养液和1％～5％体积比的胎牛血清的细胞维持液，所述细胞维持液pH为7.1～7.5，在36℃～38℃，5％CO2条件下继续培养，在40-48h，当细胞80％以上发生病变时，收获感染病毒的细胞及上清液，-80℃反复冻融3次后，收获病毒；以及步骤(3)，按照所述步骤(2)的方法再传≥4代，然后将收获的病毒接种于143TK-细胞，用含100μg/ml 5-溴-2’-脱氧尿苷的低熔点琼脂糖平皿培养，所述低熔点琼脂糖平皿由含4％胎牛血清的2×DMEM与2％琼脂糖按照体积比1:1混合而成，待出现蚀斑后，挑取单个蚀斑接种到DMEM培养液中培养。
10.权利要求3～8所述的疫苗组合物在制备预防和治疗猪伪狂犬病病毒感染相关疾病的药物中的应用；优选地，所述的猪伪狂犬感染相关疾病是由猪伪狂犬病病毒变异株导致的猪伪狂犬病。
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