CN107988130A

CN107988130A - 稳定表达猪轮状病毒vp4蛋白的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株及其制备方法

Info

Publication number: CN107988130A
Application number: CN201711395821.XA
Authority: CN
Inventors: 李经; 李一经; 徐义刚; 王丽; 唐丽杰; 尹纪元; 施雯
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2017-12-21
Filing date: 2017-12-21
Publication date: 2018-05-04

Abstract

本发明公开了一种稳定表达猪轮状病毒VP4蛋白的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株及其制备方法。所述疫苗株是在尿嘧啶磷酸核糖转移酶(uracil phosphoribosyl transferase,UPP)基因缺失的干酪乳杆菌的基础上，通过同源重组将猪轮状病毒VP4基因插入干酪乳杆菌的丙酮酸水合酶基因的终止密码子和终止子之间后得到，所述疫苗株不带有抗生素选择标记。实验证明，本发明构建的稳定表达猪轮状病毒VP4蛋白的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株，经口服途径免疫动物既能诱导局部黏膜免疫应答，产生黏膜抗体IgA，又能够诱导机体产生体液免疫应答，产生血清抗体IgG，显示了良好的免疫原性，且本发明所构建的非抗生素抗性标记的基因工程乳酸菌疫苗株符合兽用疫苗绿色、环保的发展理念。

Description

稳定表达猪轮状病毒VP4蛋白的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种以乳酸菌为载体的基因工程亚单位疫苗及其制备方法，特别涉及一种基因组整合猪轮状病毒VP4基因的乳酸菌基因工程亚单位疫苗及其制备方法。本发明属于医药技术领域。

背景技术

猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PRV)属于呼肠病毒科轮状病毒属，是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原体之一，主要感染1-4周龄仔猪，具有发病率高、分布广泛的特点。猪轮状病毒病是典型的经粪--口途径传播的一类传染病。目前预防猪轮状病毒感染的主要方法是疫苗接种，常见疫苗有强毒灭活苗和弱毒活疫苗。

轮状病毒灭活疫苗，是灭活的轮状病毒强毒，通过肌肉注射妊娠母猪使其产生母源抗体，在哺乳期使仔猪获得被动免疫。轮状病毒强毒灭活疫苗安全可靠，但也有一定局限性。首先，由于不能够有效的诱导产生黏膜抗体，因此不能有效控制轮状病毒经黏膜感染。其次，灭活疫苗免疫保护持续的时间较短，需要经过反复免疫刺激才能使动物产生足够的免疫应答反应。再次，轮状病毒感染多呈现地区流行性，灭活疫苗的分离株对不同地区的保护效果不完全相同。

轮状病毒减毒口服活疫苗是通过在组织或细胞上或异种动物上连续传代培养致弱获得引起无感染症状的弱毒株。可以口服免疫妊娠母猪或仔猪。减毒活疫苗能够诱导产生黏膜免疫，中和具有中和活性的血清抗体，并能够诱导动物产生细胞免疫应答；还具有免疫剂量小、免疫持续时间长等优点。但是轮状病毒减毒活疫苗也存在致弱的病毒毒力返强的风险；另外，免疫毒株主要诱导机体产生同型免疫，对于不同型的轮状病毒的保护效果不完全相同。虽然这两种疫苗都在猪轮状病毒防控中发挥了重要作用，但是在使用过程中都存在一些不足，对猪轮状病毒感染的发生和流行控制并不理想。

局部黏膜免疫是动物体抵抗病原体入侵的第一道防线。通过口服免疫可有效刺激消化道产生局部粘膜免疫、并能够引起全身免疫应答，从而有效的预防病毒感染。乳酸菌是一类人和动物消化道共生菌，除了安全无毒以外还被证实具有提高免疫力的作用，是作为口服免疫的理想载体。乔薪瑗等(表达猪轮状病毒VP4基因重组乳酸球菌表达载体构建及免疫原性分析，SCIENTIAAGRICULTURA SINICA，2009,42(10))将编码猪轮状病毒主要保护性抗原VP4蛋白的基因连接到乳酸菌表达载体中，重组乳酸菌可以通过口服免疫途径有效刺激小鼠产生抗猪轮状病毒VP4蛋白黏膜抗体IgA和血清抗体IgG。但利用质粒系统进行外源抗原的表达存在很多缺陷，如乳酸菌质粒表达系统对外源抗原的表达量明显低于大肠杆菌表达系统；质粒表达存在不稳定性；质粒在细菌增殖过程中可发生丢失现象；质粒在细菌间的传递尤其是质粒中存在抗生素抗性基因使乳酸菌作为人和动物疫苗存在着重大生物安全隐患。

因此针对猪轮状病毒感染的特点，探索新的免疫防治策略十分必要。

发明内容

本发明的目的在于根据猪轮状病毒病经粪-口途径传播的特点，从黏膜免疫角度设计疫苗以预防猪轮状病毒感染，为有效预防和控制轮状病毒感染提供有效的技术手段。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

为获得不带有抗生素选择标记、基因组组成型稳定表达猪轮状病毒VP4蛋白的基因工程乳酸菌株，本发明通过基因组微阵列技术分析了干酪乳杆菌全基因在不同碳源中的表达情况，筛选出丙酮酸水合酶基因是干酪乳杆菌组成型高表达基因，确定了猪轮状病毒VP4基因插入位点。利用携带有upp基因和氯霉素耐药性基因的温敏型复制子的重组质粒，以upp基因缺失的干酪乳杆菌作为宿主，构建了基于upp基因的无选择标记重组系统。利用干酪乳杆菌丙酮酸水合酶基因调控序列及基因同源重组技术构建出一株无抗生素选择标记、基因组组成型表达猪轮状病毒VP4蛋白的重组干酪乳杆菌。

具体的，本发明的一种稳定表达猪轮状病毒VP4蛋白的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株，所述疫苗株是在尿嘧啶磷酸核糖转移酶(uracil phosphoribosyl transferase,upp)基因缺失的干酪乳杆菌的基础上，通过同源重组将猪轮状病毒VP4基因插入干酪乳杆菌的丙酮酸水合酶基因的终止密码子和终止子之间后得到，所述疫苗株不带有抗生素选择标记。

其中，优选的，所述的upp基因缺失的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌Δupp-L.casei393，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.5842，保藏日期为2012年3月2日。该乳酸菌Δupp L.casei 393已记载在公开号为CN102732502A，发明名称为“无选择标记残留的乳酸菌基因组基因操作系统及其应用”的专利申请中，由东北农业大学保存提供。

其中，优选的，所述的猪轮状病毒VP4基因的5’端还包括含有信号肽序列的核糖体结合序列。

其中，优选的，所述的含有信号肽序列的核糖体结合序列(SD序列)如SEQ ID NO.1所示。

一种制备所述的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株的方法，包括以下步骤：

(1)猪轮状病毒VP4基因的克隆

以猪轮状病毒VP4基因的cDNA为模板，通过PCR扩增获得猪轮状病毒VP4基因片段，将基因连接到pMD18-T载体上；

(2)上、下游重组同源臂的亚克隆

以干酪乳杆菌基因组为模板，通过PCR扩增获得用于基因重组的上、下游同源臂片段EA、EB，将EA、EB片段连接到pMD18-T载体上，得到pMD18-T-EA、pMD18-T-EB；

(3)重组同源臂和表达盒的拼接

分别将猪轮状病毒VP4基因、含有信号肽序列的核糖体结合序列(SD)以及上下游同源臂EA、EB基因利用限制性内切酶进行拼接，拼接顺序为EA-SD-VP4-EB，将该重组基因连接到pUC57载体中，获得pUC57-EA-SD-VP4-EB重组质粒，简称为pUC57-EV；

(4)构建pGBHC-32upp-EV质粒

将重组载体pGBHC-32upp和pUC57-EV经过双酶切并经过胶回收纯化的产物，利用T4连接酶，在16℃条件下连接过夜后，转化到大肠杆菌克隆感受态TG1中，得到含有EA-SD-VP4-EB片段的pGBHC-32upp重组质粒，命名为pGBHC-32upp-EV；

(5)将重组质粒pGBHC-32upp-EV电转化Δupp L.casei 393感受态细胞，涂布在含有氯霉素的MRS肉汤固体培养基上，30℃静置培养72小时，挑取单克隆菌落，并接种在含有氯霉素的MRS肉汤液体培养基中，30℃静置培养48小时，提取质粒PCR鉴定质粒中的上/下游同源臂、猪轮状病毒VP4基因；制备含100μg/mL的5-FU(5-氟尿嘧啶)的SDM培养基，将培养的菌液按1:1000到1:100000的比例涂布5-FU-SDM培养基，37℃培养48到72小时，获取在5-FU(5-氟尿嘧啶)的SDM培养基上生长的单克隆，挑取单克隆，用无抗MRS培养基培养过夜，得到基因组组成型高效表达猪轮状病毒VP4蛋白的重组干酪乳杆菌，命名为L.casei-EVP4。

所述的方法中，优选的，用于扩增猪轮状病毒VP4基因的引物如SEQ ID NO.5以及6所示，扩增得到的猪轮状病毒VP4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的方法中，优选的，用于扩增上、下游同源臂片段EA、EB的引物如SEQ IDNO.7-10所示，扩增得到的上、下游同源臂片段EA、EB的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3以及4所示。

进一步的，本发明还提出了所述的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株在制备预防猪轮状病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。

更进一步的，本发明还提出了一种预防猪轮状病毒基因工程亚单位疫苗，其含有本发明所述的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株。优选的，所述的疫苗为口服疫苗。

实验证明，本发明构建的稳定表达猪轮状病毒VP4蛋白的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株，经口服途径免疫动物既能诱导局部黏膜免疫应答，产生黏膜抗体IgA，又能够诱导机体产生体液免疫应答，产生血清抗体IgG，显示了良好的免疫原性。本发明所构建的非抗生素抗性标记的基因工程乳酸菌疫苗株符合兽用疫苗绿色、环保的发展理念。

附图说明

图1肽聚糖水解酶核糖体结合位点和信号肽序列PCR扩增结果；

图2pMD18-T-VP4的PCR鉴定结果；

M:DNA Marker；1：阳性克隆1；2：阳性克隆2；

图3pMD18-T-EA、pMD18-T-EB单双酶切鉴定结果；

A.pMD18-T-EA酶切鉴定结果；B.pMD18-T-EB酶切鉴定结果；

1、2.单酶切鉴定；3.双酶切鉴定；

图4质粒pUC57-EV的酶切鉴定结果

1和2：分别为Puc57-EV经Asc I和Pac I单酶切结果；3：Puc57-EV经Asc I和Pac I双酶切鉴定结果；4：Puc57-EV经Pac I和Bam H I双酶切鉴定结果；M：DNA Marker；

图5质粒pGBHCupp-EV的PCR鉴定结果；

1和2：分别为重组上/下游同源臂EA、EB的PCR鉴定结果；3：猪轮状病毒VP4基因的鉴定结果；M：dM8000；

图6.重组干酪乳杆菌革兰氏染色后的形态观察；

A.L.casei-EVP4株；B.Δupp L.casei 393株；

图7氯霉素和5’-FU敏感性实验；

A：含有氯霉素的MRS固体培养基；B：含有5’-FU的固体培养基；C：不含有氯霉素和5’-FU的MRS培养基：D：培养基中不同菌种分布位置，其中WT代表Δupp L.casei393，TT代表pGBHCupp-EVP4/L.casei，PT代表L.casei-EVP4；

图8重组干酪乳杆菌基因组的稳定性PCR检测结果；

M：DNA Marker；W：野生型未重组L.casei393；1-16：将重组乳酸菌L.casei-EVP4连续传代80代，每5代提取基因组，基因组中插入基因的PCR扩增结果；

图9猪轮状病毒VP4蛋白表达的Western blot检测结果；

1.重组菌L.casei-EVP4菌体蛋白的Western blot结果；2.Δupp L.casei 393菌体蛋白的Western blot结果；M：蛋白Marker；

图10实时荧光定量PCR检测VP4基因转录水平；

A.VP4基因的扩增曲线；B.VP4基因的溶解曲线；C.16sRNA基因的扩增曲线；D.16sRNA基因的溶解曲线；

图11口服免疫重组菌特异性IgA和IgG抗体水平的测定；

图12免疫小鼠脾细胞的增殖反应检测结果；

图13脾细胞诱导后上清中IL-4(图13A)和IFN-γ(图13B)检测结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1猪轮状病毒VP4基因插入位点的选择

将干酪乳杆菌分别接种在含有1％不同碳源(葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、乳糖、海藻糖、棉子糖、多聚果糖)的MRS液体培养基中，提取菌体总RNA进行干酪乳杆菌全基因组微阵列分析，并对微阵列检测结果进行层级聚类分析，寻找在不同碳源培养基中都能够高效稳定表达的基因。经检测丙酮酸水合酶基因RNA在不同碳源中都能够稳定地高水平转录。为了获得基因组组成型高效表达猪轮状病毒VP4蛋白的重组干酪乳杆菌，本发明以丙酮酸水合酶基因位点作为VP4基因的重组位点，将丙酮酸水合酶RNA转录调控基因的终止密码子和终止子之间作为VP4基因的插入位点，利用丙酮酸水合酶RNA转录相关蛋白的启动子和转录调控序列启动VP4基因的转录。

实施例2含有信号肽序列的SD序列的确定

利用生物信息学软件SignalP-4.0预测得到肽聚糖水解酶信号肽序列以及核糖体结合位点。以干酪乳杆菌基因组为模板扩增肽聚糖水解酶的含有信号肽序列的SD序列，结果见图1所示，获得大小约100bp的片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，并将片段连接到克隆载体pUC-57上。

实施例3基因组组成型高效表达猪轮状病毒VP4蛋白的重组干酪乳杆菌的制备

1、基因打靶质粒骨架的构建

(1)猪轮状病毒VP4基因的克隆

以猪轮状病毒VP4基因的cDNA为模板，以VP4-F/VP4-R为引物，通过PCR扩增获得猪轮状病毒VP4基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，并在VP4基因的两端加入限制性酶切位点Pst I和Spe I，将基因连接到pMD18-T载体上，引物序列如表1所示，PCR鉴定结果见图2所示。

表1引物序列

(2)上、下游重组同源臂的亚克隆

以干酪乳杆菌基因组为模板，分别以EB-F/EB-R、EA-F/EA-R为引物，通过PCR扩增获得用于基因重组的上、下游同源臂片段EA、EB，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3以及4所示在EA的两端加入限制性酶切位点Asc I和Bam H I，在EB的两端加入限制性酶切位点PstI和Pac I，将EA、EB片段连接到pMD18-T载体上，得到pMD18-T-EA、pMD18-T-EB，将pMD18-T-EA、pMD18-T-EB分别转化阳性克隆子提取质粒，进行PCR酶切鉴定，结果见图3所示。

(3)重组同源臂和表达盒的拼接

分别将猪轮状病毒VP4基因、SD基因与上下游同源臂EA、EB基因利用限制性内切酶进行拼接，拼接顺序为EA-SD-VP4-EB，将该重组基因连接到pUC57载体中，获得pUC57-EA-SD-VP4-EB重组质粒，简称为pUC57-EV，经酶切鉴定结果见图4所示。

(4)构建pGBHC-32upp-EV质粒

将重组载体pGBHC-32upp(本实验室前期构建完成，该载体的具体制备方法已记载在公开号为CN102732502A，发明名称为“无选择标记残留的乳酸菌基因组基因操作系统及其应用”的专利申请中。)和pUC57-EV经过Asc I和Pac I双酶切并经过胶回收纯化的产物，利用T4连接酶，在16℃条件下连接过夜后，转化到大肠杆菌克隆感受态TG1中，筛选阳性克隆子，阳性质粒命名为pGBHC-32upp-EV。

2、电转化Δupp L.casei393

将重组质粒pGBHC-32upp-EV电转化缺失了630bp碱基的尿嘧啶磷酸核糖基转移酶基因的开放阅读框的乳酸菌Δupp L.casei 393感受态细胞(该乳酸菌Δupp L.casei 393记载在公开号为CN102732502A，发明名称为“无选择标记残留的乳酸菌基因组基因操作系统及其应用”的专利申请中，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCCNO.5842，保藏日期为2012年3月2日。)，涂布在含有氯霉素(5μg/ml)的MRS肉汤固体培养基上，30℃静置培养约72小时，挑取单克隆菌落，并接种在含有氯霉素的MRS肉汤液体培养基中，30℃静置培养约48小时，提取质粒PCR鉴定质粒中的上/下游同源臂、猪轮状病毒VP4基因。结果见图5所示，同源臂和VP4基因在目的位置均出现特意性扩增条带，表明质粒pGBHC-32upp-EV已经转化到Δupp L.casei 393中。

3、无选择标记重组

制备含100μg/mL的5-FU(5-氟尿嘧啶)的SDM培养基，将培养的菌液按1:1000到1:100000的比例涂布5-FU-SDM培养基，37℃培养48到72小时，获取在5-FU(5-氟尿嘧啶)的SDM培养基上生长的单克隆，挑取单克隆，用无抗MRS培养基培养过夜，得到基因组组成型高效表达猪轮状病毒VP4蛋白的重组干酪乳杆菌，命名为L.casei-EVP4。

4.基因重组菌株L.casei-EVP4鉴定

4.1L.casei-EVP4插入基因测序分析

将重组菌L.casei-EVP4涂布在含有5’FU的SDM固体培养基上，挑取单克隆子进行菌落PCR鉴定，并将PCR产物进行测序，结果显示目的基因正确插入丙酮酸水合酶基因的终止密码子之后。

4.2基因重组菌株L.casei-EVP4特性分析

将处于对数生长期的L.casei-EVP4株和Δupp L.casei进行革兰氏染色，在油镜下观察菌体形态及革兰氏染色结果。结果见图6所示，L.casei-EVP4株和Δupp L.casei菌体形态一致，呈革兰氏阳性，短杆状，表明重组菌L.casei-EVP4的形态未发生改变。

4.3L.casei-EVP4抗生素敏感性分析

将浓度为10⁹CFU/mL的重组菌L.casei-EVP4分别在含有5μg/mL氯霉素的MRS固体培养基上划线，同时设置无抗MRS肉汤固体培养基作为对照。37℃静置48h后，观察重组菌L.casei-EVP4在不同培养基中的生长情况。结果见图7所示，重组菌L.casei-EVP4对氯霉素不具有耐受性，不含氯霉素抗性基因，表明重组质粒pGBHC-Pupp-EV在L.casei-EVP4中没有残留，成功将外源目的基因重组入干酪乳杆菌基因组。

4.4L.casei-EVP4遗传稳定性分析

将L.casei-EVP4连续传代培养，共培养至80代，每5代提取重组干酪乳杆菌基因组，采用PCR结合测序的方法检测插入目的基因的遗传稳定性，PCR扩增结果见图8。PCR产物的测序结果表明，经过反复传代后，插入目的基因的碱基没有发生缺失、插入、突变，显示了良好的遗传稳定性。

5、L.casei-EVP4的表达检测

5.1Western blot检测VP4表达

分别在不含Cm抗生素的MRS肉汤液体培养基中接种重组菌L.casei-EVP4和ΔuppL.casei，37℃条件下静置培养15h，收集菌体，获得菌体蛋白，以鼠抗猪轮状病毒VP4蛋白多克隆抗体作为检测抗体，以HRP标记的山羊抗鼠IgG作为二抗，进行Western blot分析。检测结果见图9所示，L.casei-EVP4菌体蛋白经Western blot检测在预期大小位置处出现特异性条带，而对照组Δupp L.casei未出现特异性条带，结果表明猪轮状病毒VP4蛋白在重组干酪乳杆菌中获得基因组组成型表达，且该蛋白可被抗VP4抗体识别。

5.2实时荧光定量PCR检测VP4基因转录

提取处于对数生长期的重组菌L.casei-EVP4的RNA并进行反转录，以获得的cDNA作为模板，以干酪乳杆菌16S RNA基因作为看家基因，以Δupp L.casei 393作为阴性对照，对VP4基因的转录水平进行检测。VP4基因和16S RNA的实时荧光定量PCR溶解曲线和扩增曲线结果见图10所示，溶解曲线均为单一峰，扩增曲线都在10～20个扩增循环，阴性对照没有VP4基因扩增。

实施例4重组菌L.casei-EVP4免疫原性测定

1、动物免疫

分别将L.casei-EVP4和Δupp L.casei 393在37℃静置培养10h，调整菌体浓度至1.0×10¹⁰/mL左右。将6-8周龄BALB/c小鼠随机分组，每组20只，实验组小鼠通过口服免疫重组菌L.casei-EVP4，同时设置PBS组和Δupp L.casei393组(简称Δupp L.casei组)作为对照。每组小鼠连续免疫3天，每天免疫一次，间隔14d后进行加强免疫。具体信息见表2所示。

表2实验小鼠的分组免疫情况

2、免疫鼠黏膜抗体IgA及血清抗体IgG的测定

分别于免疫后第3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36、39、42d采集免疫鼠粪便、鼻腔冲洗液和阴道冲洗液样本，以及免疫后第6、12、18、24、30、36、42d采集血清样本，采用ELISA方法，以纯化的VP4重组蛋白作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgA/IgG作为酶标抗体，检测免疫后诱导小鼠产生的特异性黏膜抗体IgA及血清抗体IgG的水平。检测结果见图11所示，实验组从第3天开始黏膜抗体IgA水平开始升高，与对照组相比差异极显著(P<0.01)；加强免疫后，诱导小鼠机体产生了显著性水平的特异性IgA抗体(P<0.05)；采用两种免疫剂量免疫小鼠，诱导小鼠机体产生的黏膜抗体IgA水平差异并不显著(P≥0.05)。实验组小鼠血清抗体IgG水平从免疫后第6天开始上升，与对照组相比差异极显著(P<0.01)；加强免疫后，诱导小鼠机体产生了显著水平的特异性血清抗体IgG(P<0.05)；而两种免疫剂量免疫小鼠，诱导产生的特异性血清抗体水平差异不显著(P≥0.05)。

3、免疫小鼠脾淋巴增殖检测结果

无菌取免疫后小鼠脾细胞，分别以纯化的不同浓度的猪轮状病毒VP4蛋白刺激脾细胞，以RPMI1640作为阴性对照，以ConA作为阳性对照，检测免疫小鼠脾淋巴细胞的增殖反应。脾淋巴细胞增殖反应能力用增殖系数IS表示(IS＝OD570试验组/OD570阴性对照组)，检测结果见图12所示，不同剂量抗原均能够刺激重组菌L.casei-EVP4免疫组小鼠的脾细胞产生增殖，与Δupp L.casei组和PBS组相比较差异极显著(P<0.01)，而不同剂量重组菌L.casei-EVP4免疫组之间的差异不显著(P≥0.05)。

4、细胞因子检测结果

取免疫后小鼠脾细胞，分别以纯化的猪轮状病毒VP4蛋白刺激脾细胞，取培养上清通过ELISA检测细胞因子IFN-γ和IL-4水平。结果见图13A-B所示，与Δupp L.casei 393组和PBS组相比较，不同剂量重组菌L.casei-EVP4免疫组IFN-γ(图13B)和IL-4(图13A)水平都显著增加(P<0.01)，表明重组菌L.casei-EVP4既能刺激小鼠产生体液免疫反应，又能刺激小鼠产生细胞免疫反应。不同剂量重组菌L.casei-EVP4免疫组之间，差异不显著(P≥0.05)。

综上所述，本发明构建的基因组组成型表达猪轮状病毒VP4蛋白的重组干酪乳杆菌L.casei-EVP4，经口服途径免疫动物既能诱导局部黏膜免疫应答，产生黏膜抗体IgA，又能够诱导机体产生体液免疫应答，产生血清抗体IgG，显示了良好的免疫原性。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 一种整合猪轮状病毒VP4蛋白的乳酸菌基因工程亚单位疫苗及其制备方法

<130> KLPI171045

<160> 10

<170> PatentIn 3.5

<210> 1

<211> 97

<212> DNA

<213> SD

<400> 1

atgaaattaa agcaattagt tacaggcttt atcacagttg caacattggc tggggttggg 60

gtttcagggg tggctgccac aacagttaaa gctgatg 97

<210> 2

<211> 757

<212> DNA

<213> vp4

<400> 2

ggctataaaa tggcttcgct catttataga caactactta ctaattcata cacagtcaat 60

ctttctgacg aaattcaaga gattggatcg gctaagtcac aggatgttac tataaatcct 120

ggtccattcg cacaaacagg ttatgcacca gttaattggg gagcaggtga gactaatgac 180

tccacaactg tcgagccgtt attagatggt ccataccaac caaccacttt caatccacca 240

acaagctatt gggtactact tgcgccaact gtagagggcg taattgttca aggaacaaac 300

aataccgata gatggttggc cactatacta attgaaccaa acgtacaaac aactaacaga 360

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ttgttctcta caccaaaatt atacgctgta atgaaattca gtggtagaat atatacatat 540

aatggaacca caccaaacgc aacaacagga tactattcaa ctattaatta tgacacagta 600

aatatgacat cattttgtga tttttatatt ataccaagaa atcaagaaga aaaatgtact 660

gagtatatca atcatggatt acctcctata caaaatacaa ggaatgttgt gccagtatct 720

ttatcggcta gagagatagt gcacacaaga gctctag 757

<210> 3

<211> 1259

<212> DNA

<213> EA

<400> 3

atcgatggca cctactgttg agttgattgt acactgaaga cggcggcttt ggccgtgcgt 60

tggtaccatc aggtgcttca accggtgaac acgaagccgt tgaacttcgt gatggtgaca 120

aggatcgttt tggcggcaag ggtgttttga aggccgttgg tcatgtgaac aacgaaatcg 180

ctaaggcggt tattggccat gacgtgactg aacaacgcct gattgaccaa accatgattg 240

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tggctgcagc ccgtgctgct gctgatgaag ttggcctgcc attgtatcaa tatcttggcg 360

gcccgaatgc ccacgttctg ccaacgccaa tgatgaacgt cctcaatggt ggtgcacact 420

caactaacac cgttgacttc caggaattca tgatcatgcc tgttggcgct aagagcgttc 480

gtgaagctgt tcggatgggt tcagaaacct tccatgcttt acaggcactg ttgaagagta 540

aaggcgacat caccgctgtt ggtgatgaag gcggctttgc cccgaacttg aaggataacg 600

aagaagcctt cgaacttctt gttgaagcaa tcaagaaagc tggctacaag ccaggcgacg 660

acattgcttt ggcctttgac gttgctgctt cagaaatgta cgatgccgag agcaagacat 720

acacaaccaa gtggtctaac cctgacaaga agtacaccac tgaagaatgg accgacatga 780

ttgatggtta cattaacaag tacccaatcg tttctgttga agatcctatc gacgaaaacg 840

actgggaagg ctggcagaca ttcaccaaga agatgggcga caaagtccaa atcgttggtg 900

atgatctgtt tgttaccaac accgactacc tgaagaaggg tatcgatatg ggtgttgcta 960

actccatcct gatcaagctg aaccagatcg gtacattgac cgaaaccttc gaagccatcg 1020

aaatggctaa agaagctggt tacacagctg ttgtttcaca tcgttccggt gaaactgaag 1080

atacaacgat tgctgacttg gttgttgcaa ccaacgctgg ccagatcaag actggttcaa 1140

tgagccggac agatcgtatc gctaagtaca accagttaat gcggatcgaa gatcaactgg 1200

gtgcacaatc cttgtacaag ggccgcaagt ccttctacaa tgtgaaagca atcgactaa 1259

<210> 4

<211> 1353

<212> DNA

<213> EB

<400> 4

tttgcttaat tagttggcag cttggaaagc acgtttccgt taaggagcgt gctttttttg 60

tggagcgtga gctggcgcgg ttagaaacca gagtgtgtaa gttcaaggtc cttacatgca 120

ggtttctgcg ccagcgagcg cgtttaattg tgcgcgaaca ggagcgctta gaagccagaa 180

aataagtggc ttcgaccaaa tggcgtggtt ttagcgaggt cgcttgggtt gaaagaatca 240

gtgtttttta atcggtgaga ctgaatcgcg gttgtcgggt gcacctttct gtatactagg 300

gataagcaca aatgaaagga cagttttcta tgcaaacgac gccacctcat tggcaacgga 360

acattgctat ctttttgctt ggtcaatttc tttctggcat taccagtatg acggttcagt 420

atgcgatcat ttggtactta acggctaaaa ctggctctgc aacgattctc agcattgcta 480

ctttattagg tatgttgccg acgattctgc tgagtccttt tgtcgggcct tatattgatc 540

gcttgaacaa gaaaatgttg ttgattgtac cggatattgt cgccgctatg gtggcactta 600

ttttgagtgc cgttggcgag tttggtggtt tttttcctgt ttggctgatc tttgtgtcgt 660

tgctggtgcg ggcgttggca caaacattcc agatgccgac gattcaggct attttgccaa 720

ccatggtacc tggtgatcag ttgacgcgcg tgaacggtca actcggtgtg gtgaattcgg 780

cgaacatgat tattgcgccg gcactcggag ctgtcctttt tggcctgatg ccgatgccgc 840

ttttgatttt gttagatgtt ttaggtgcga ttctaggagt cagcttgctg ttgttcgtta 900

gtattccaga aaatcgcttg gtcgggacaa ccgtccatgt tgcgcaggat gccaaggtcg 960

ggtggcaatt gttgcgaggc aatcgtggcc tgtggtatat gactttaatt ggcatgttga 1020

cgacgtttgc cttcatgcca gccgctagta tgtatccttt aatgaccatg cgttattttc 1080

atggcactgt cggtcaagct gggttgattg aagttgttta ttttgctggc tcgttgcttg 1140

gcggcctgct cattagtact tttggtcatt ttcgtgatcg tattcatccg attgtctggg 1200

ggatggtggt cattggcgtg acgtttggat taagtggtgt tttgccacga actgaaaatg 1260

gctttttatg gtttcttatc ttgaatggcg ttgctggctt agcttggccg tttttcaaca 1320

cgcctttgat cgcgatgtat cagcaaagct agt 1353

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 5

ggctataaaa tggcttcgc 19

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 6

ctagagctct tgtgtgcact a 21

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 7

tttgcttaat tagttggcag cttgg 25

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 8

tagctttgct gatacatcgc gat 23

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 9

atcgatggca cctactgttg agttg 25

<210> 10

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial sequence

<400> 10

ttagtcgatt gctttcacat tgtagaagg 29

Claims

1.一种稳定表达猪轮状病毒VP4蛋白的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株，其特征在于，所述疫苗株是在尿嘧啶磷酸核糖转移酶(uracil phosphoribosyl transferase,upp)基因缺失的干酪乳杆菌的基础上，通过同源重组将猪轮状病毒VP4基因插入干酪乳杆菌的丙酮酸水合酶基因的终止密码子和终止子之间后得到，所述疫苗株不带有抗生素选择标记。

2.如权利要求1所述的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株，其特征在于，所述的upp基因缺失的干酪乳杆菌为干酪乳杆菌Δupp-L.casei 393，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，其菌种保藏编号为：CGMCC NO.5842，保藏日期为2012年3月2日。

3.如权利要求1所述的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株，其特征在于，所述的猪轮状病毒VP4基因的5’端还包括含有信号肽序列的核糖体结合序列。

4.如权利要求1所述的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株，其特征在于，所述的含有信号肽序列的核糖体结合序列如SEQ ID NO.1所示。

5.一种制备权利要求1所述的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)猪轮状病毒VP4基因的克隆

(2)上、下游重组同源臂的亚克隆

(3)重组同源臂和表达盒的拼接

(4)构建pGBHC-32upp-EV质粒

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，用于扩增猪轮状病毒VP4基因的引物如SEQID NO.5以及6所示，扩增得到的猪轮状病毒VP4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，用于扩增上、下游同源臂片段EA、EB的引物如SEQ ID NO.7-10所示，扩增得到的上、下游同源臂片段EA、EB的核苷酸序列分别如SEQ IDNO.3以及4所示。

8.权利要求1-4任一项所述的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株在制备预防猪轮状病毒基因工程亚单位疫苗中的应用。

9.一种预防猪轮状病毒基因工程亚单位疫苗，其特征在于，含有权利要求1-4任一项所述的乳酸菌基因工程亚单位疫苗株。

10.如权利要求9所述的基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗为口服疫苗。