CN103421728A - 一种重组支气管败血波氏杆菌菌株、疫苗及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物细菌学和基因工程疫苗制备技术领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段的重组支气管败血波氏杆菌菌株、含有该重组菌的疫苗，其制备方法与应用。本发明得到一株不含抗性标记的表达猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段重组支气管败血波氏杆菌QH0814ΔaroA/toxA-N，该菌株缺失了支气管败血波氏杆菌的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶aroA基因，该菌株含有猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段。本发明还公开了该重组菌的制备方法及疫苗的应用。本发明的基因工程疫苗可以刺激猪产生抵抗猪产毒多杀性巴氏杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌野毒株的保护性免疫反应，能有效防止猪产毒多杀性巴氏杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌的双重感染。

Description

一种重组支气管败血波氏杆菌菌株、疫苗及应用

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段重组支气管败血波氏杆菌活疫苗菌株的构建、含有该菌株的疫苗，其制备方法与应用。

背景技术

支气管败血波氏杆菌（Bordetella Bronchiseptica，Bb）是一种革兰氏阴性菌，其宿主范围广泛，大多数哺乳动物和鸟类都可以被感染。该菌是引起猪萎缩性鼻炎（Atroptic Rhinitis,AR）的主要病原菌之一，单独的Bb常常引起猪只的隐性感染，发病猪临床表现为生长缓慢，育肥延迟，极大地降低了饲料报酬和生产效率；而Bb和产毒素多杀性巴氏杆菌（Pasteurellamultocida,Pm）共同作用引起的猪萎缩性鼻炎，在临床上以出现鼻炎、鼻甲骨萎缩和生长性能下降为特征。Bb可通过飞沫传播，并经动物的呼吸运动而侵入机体，该菌侵入机体后，能够破坏局部的纤毛或上皮，同时Bb分泌的各种毒素可引起机体呼吸道粘膜上皮细胞发炎、增生和纤毛脱落。如果机体的鼻粘膜出现急性炎症的继续发展，则常有部分粘膜上皮受损脱落，进而鼻粘膜的屏障作用遭到破坏，大量细菌及其毒素就会趁机迅速进入粘膜下组织，造成骨组织明显损伤，引起猪鼻甲骨病变。同时，Bb粘膜上皮细胞受损脱落后可为其它呼吸道病原菌的侵入提供了条件，造成其它多种病原的继发感染，对鼻腔和整个呼吸道造成更严重的损伤（斯特劳等．猪病学[M].赵德明等译．第8版．北京：中国农业大学出版社，2008,369-406.）。从而增加猪群呼吸道疾病的发病率和严重程度，造成严重经济损失(Straw etal.,2000;Karen,2000;Borckmeier,2003)。以AR为代表的猪波氏菌病现已遍布养猪业发达国家，已成为猪的重要呼吸道传染病之一(Straw et al.,2000;Dugal et al.,1992;Vecht et al.,1992;Brockmeier,2004;Brockmeier et al.,2000)。由于Bb属猪鼻腔中的一种常在细菌，因此从机体中根除该菌的可能性不大，但是Bb对猪群的危害又不容忽视，所以防制工作就显得尤为重要，目前主要采取综合防控措施控制该菌，其中对猪群进行免疫接种是主要手段。现今市场上已有针对Bb的相关灭活疫苗，但其使用效果并不明显，效力也普遍较低，这可能与Bb灭活疫苗不能有效引起局部粘膜免疫，不能产生足够的保护性抗体IgA有关(Bercovich et al.,1977;Giles et al.,1982)。另外，有研究报道有部分Bb弱毒疫苗和亚单位苗在研制中，但尚未被大规模临床推广应用(Kruger et al.,1992;Kang et al.,2007)。

A型或D型产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxaigenic Pasteurella multocida,T⁺Pm)是引起猪进行性萎缩性鼻炎(progressive atrophic rhinitis,PAR)的主要病原菌(Chanter et al.,1989)。这些致病菌可分泌一种约146kDa的皮肤坏死毒素(Pasteurella multocida toxain,PMT)，PMT由toxA基因编码，可直接引起猪鼻炎、鼻梁变形、鼻甲骨萎缩甚至消失，全身代谢障碍，生产性能下降，同时可诱发其它病原微生物感染，甚至导致死亡。目前，PAR被誉为世界规模化养猪五大传染病之一，并被国际兽疫局(OIE)定为须上报疫情的动物传染病。另外，T⁺Pm感染猪后，损害呼吸系统的正常结构和功能，至使机体抵抗力降低，极易诱发其它病原微生物感染，诸如支原体、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等，引起猪呼吸系统综合征，增加猪的死亡率，加大疾病的危害，使之成为危害养猪业最严重的疾病之一。可见，作为一种呼吸道传染病，PAR给世界养猪业的发展带来了巨大的经济损失，严重危害世界养猪业的健康发展。

大量的实验表明，PMT是T⁺Pm的主要的毒力因子，它能与哺乳动物细胞上的受体结合进入细胞，单独启动DNA的合成，加之又是一种活性很强的促有丝分裂原，最终导致细胞生长和分裂(Mullan et al.,1996)。PMT通过激活造骨细胞有丝分裂，致使造骨细胞的异常的形态变化和生长，从而使骨细胞遭受破骨细胞的裂解(斯特劳等，2000)。此外，PMT还有很强的致病性，小鼠对该毒素及其敏感，LD₅₀为0.2μg/只；猪对该毒素的LD₅₀为40μg/kg，且注射少量人工表达rPMT或提纯的天然PMT就可以复制出典型PAR临床症状。本申请人所在的农业微生物学国家重点实验室汤细彪等人在2008年将toxA基因分成五段筛选PMT毒素的主要免疫原性片段，最终获得PMT的主要活性位点及用于疫苗的可行性片段有N-端1518bp和C端2115bp，将上述两个片段制成亚单位疫苗免疫小鼠，二免14天后对小鼠进行攻毒，结果显示N1518免疫组的小鼠的保护率为90%，C2115免疫组的小鼠保护率为50%，因此toxA基因N端片段1518bp的免疫原性更好，为研究新型PAR疫苗的开发提供了思路和研究基础。此外，Jayoung Seo等人在2009年将toxA基因分四段进行表达并制成亚单位疫苗免疫小鼠，结果显示toxA基因N端片段组的免疫原性最好，且用T⁺Pm活菌攻毒的小鼠的保护力也是最好的，能达62.5%；用该组免疫仔猪后，用T⁺Pm活菌攻毒和T⁺Pm溶菌产物攻毒，免疫猪鼻甲骨没有发生萎缩或轻微萎缩（Jayoung Seo,2009）。目前主要采取接种灭活苗的方法控制该病，但更多的研究表明灭活疫苗只具有部分保护作用，其原因最可能的解释是由于这种全菌灭活疫苗缺少PMT毒素，或一些抗原的存在降低了疫苗中毒素的保护效率，因此亚单位疫苗及活载体疫苗等将是研制PAR疫苗的主要方向。

随着人们对流行病学、病原菌致病机理的深入了解，以及免疫学、分子生物学和基因工程技术的发展，学术界已形成了有关免疫调节和疫苗递呈系统的新概念，为新型疫苗的设计提供了新思路。其中，以细菌为活载体的疫苗被认为是最有发展前景的研究领域之一，该类疫苗是将致病菌的特异性抗原基因插入减毒的细菌载体中，以递呈表达所编码的异源抗原，以期达到预防一种或多种疾病的作用。研究表明许多传染性疾病是由于病原菌在粘膜表面（如呼吸道、胃肠道）的定居或者侵入引起的，因此，刺激机体的粘膜免疫在保护机体免受病原菌的侵扰和毒素作用方面则显得尤为重要。细菌载体活疫苗能将特异的免疫抗原递呈到粘膜表面，使其有效接触，基于其共同的粘膜免疫系统，所产生的免疫应答不仅发生在接触抗原的诱导部位，而且也发生在较远的粘膜部位，进而诱导强有力的全身免疫。细菌与病毒都可作为重组疫苗载体，与病毒载体不同，细菌疫苗载体有许多显著的优点，例如细菌疫苗载体基因组容量大，可以携带许多不同的外源基因片段，易于构建多价基因工程疫苗；具有免疫佐剂的作用,提高了外源蛋白的免疫活性，可刺激机体产生持久的系统和粘膜免疫反应，具有良好的免疫效果；诱导作用位点比较明确，更安全可靠。另外，细菌载体疫苗生产成本相对低廉，可以通过口服或者鼻腔喷雾接种，方法简便易行，适合大范围免疫预防。因此，减毒细菌作为疫苗载体已成为医学、兽医学和公共卫生学领域的研究热点。目前有关细菌载体的研究越来越多，减毒沙门氏菌是最早用作疫苗载体的病原菌，也是目前研究最深入的细菌载体。重组卡介苗(rBCG)是牛分支杆菌的减毒疫苗，它是世界上应用最广泛的疫苗，自1948年以来全球已有30亿人接种重组卡介苗，其安全性已被证实，而且BCG是WHO推荐的两种婴儿出生时接种的活疫苗之一。可见，粘膜免疫与多价基因工程疫苗是未来有效预防控制人、畜传染病的主要研究方向；同时，这些细菌载体疫苗在控制相关动物疫病方面具有无可比拟的优点。

支气管败血波氏杆菌与大多数细菌呼吸道病原体不同，该菌能有效、快速的定殖于猪的呼吸道粘膜，持久刺激机体的粘膜免疫反应。因此，若在试验中用安全性高、减毒的Bb作为疫苗或活菌疫苗载体具有很多优点，通过鼻腔接种，使其直接进入猪的呼吸系统，激发机体产生有效的粘膜免疫和全身体液免疫及细胞免疫抗体。另外，Bb基因组相对高等，目前已经对其全基因组进行了测序并有了较为全面深入的功能基因组学研究，操作起来相对简单，有相对比较好的动物模型来评价候选疫苗菌株。而且Bb具备所有已知的细菌蛋白分泌系统，因此可用作细菌载体以递呈其它呼吸道致病菌的免疫基因，达到一次接种就能持久预防多种疫病的目的，使猪群获得更好的保护。

目前，国际上构建细菌突变株所缺失的靶基因主要有两类，一类是缺失相关毒力基因，如毒素和粘附素；另一类是缺失细菌代谢途径或适应环境调节中的“看家”基因。由于Bb含有多个毒力因子，不同的毒株之间，存在明显的毒力和致病差异，且目前还未见哪一个或一类毒力相关基因在致病与免疫相关功能上起着决定性的作用，因此，选择缺失一个或几个靶基因，有一定的盲目性。而代谢途径或环境调节中的看家“基因”是每一个细菌都含有的，通过分子遗传学方法缺失该类基因，进而达到使野毒株致弱，具有更好的普适性；并且已有学者应用这种减毒策略在鼠伤寒沙门氏菌中获得满意结果。芳香族（aro）生物合成途径是革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌共有的代谢途径。aroA基因编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，缺失该基因可影响芳香族氨基酸、氨基苯甲酸及其它芳香族化合物的合成，使细菌在宿主内有限繁殖，进而使其毒力减弱；同时，该类基因缺失突变株可能具有其它优点，如可有效表达Bb的各种免疫原性基因；在宿主体内定殖的数周内，既可激发机体强大的免疫应答，又能及时被宿主清除，具有更好的安全性和免疫效力；通过鼻腔粘膜免疫途径，可局部逃避肌注或口服抗生素所带来抑制作用。

尽管波氏杆菌疫苗作为载体有诸多的无可比拟的优点，但各种问题也很多，如外源抗原的表达量低而不能激发免疫反应，外源抗原高水平的表达可能对波氏杆菌载体有毒性，外源基因表达不稳定，免疫原性低等，这些原因均可导致免疫效果差。如果疫苗的免疫原性很弱，可以使用稳定的高拷贝的质粒以增加重组抗原的产量，提高免疫原性，从而产生更强的免疫应答（Galen and Levine,2001）。除了外源抗原在波氏杆菌中表达量低以外，常常遇到的另一个问题是外源基因表达不稳定，特别是在体内。研究者们研究了各种方法来解决遗传不稳定问题，较为有效的方法之一是将编码外源基因的DNA通过同源重组整合到波氏杆菌载体染色体上。

目前国外已有学者开始对支气管败血波氏杆菌弱毒活疫苗作为载体进行研究，但迄今为止还没有一个较为成熟的产品问世。目前报道的研究成果大都采用携带抗性基因的表达质粒，因存在生物安全性问题而不被人们所接受。因此，通过同源重组构建不含抗性标记的，缺失支气管败血波氏杆菌的营养代谢基因的弱毒菌株，既可以用来作为预防波氏菌病的疫苗，也可以用来作为载体表达外源基因，有着较好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，获得一种免疫原性更好和安全性更强的猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段重组支气管败血波氏杆菌菌株。

本发明以我国地方流行的支气管败血波氏杆菌菌株QH0814为起始材料，利用负向筛选技术构建不含抗性标记的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失突变株，在此基础上，进一步构建了能表达猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段的重组突变株，并对其遗传稳定性、生长特性、对小鼠的致病性和免疫保护效力等生物学特性进行研究。证明该菌株不携带任何外源基因、抗生素抗性基因或者基因转移原件，对动物和环境是安全的，将重组突变菌株制备疫苗免疫动物具有较好的免疫效果。

本发明的第二个目的是利用表达猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段重组支气管败血波氏杆菌QH0814ΔaroA/toxA-N制备猪产毒多杀性巴氏杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌二价基因工程疫苗。

本发明的第三个目的是表达猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段重组支气管败血波氏杆菌QH0814ΔaroA/toxA-N在制备猪产毒多杀性巴氏杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌二价基因工程疫苗中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

利用基因工程技术将支气管败血波氏杆菌QH0814（野生菌）（裴洁．猪支气管败血波氏杆菌分离鉴定及疫苗菌株的生物学特性研究．[硕士学位论文]．中国知网http://www.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=cmfd&dbname=cmfd2007&filename=2006190701.nh&uid=WEEvREcwSlJHSldTTGJhYkhRZU9XNDZIcTJjYVlNZ3g3WmJTek1KeUlvTE9kWUNycHZzZS9DdXc3WmRncTIrdg==&p=.）的一个主要芳香烃氨基酸代谢基因aroA基因部分缺失后，使整个芳香基团的生化代谢途径被阻断。将aroA基因的上游、下游各1380bp左右的序列通过分子克隆技术克隆至pBluescriptIISK(+)载体上，通过酶切位点拼接在一起，构成重组所必需的上下游同源臂，并将toxA基因N端片段的933bp的序列插入到上下同源臂之间。将含有插入基因toxA基因N端片段的aroA基因上下游同源臂片段转移至自杀性载体pRE112（徐引弟等，猪霍乱沙门氏菌C500株crp-/gfp+缺失株的构建及鉴定，农业生物技术学报，2008,16(2):196-201）。然后将有上下游同源臂自杀性载体通过结合转移至支气管败血波氏杆菌野生菌株QH0814中，通过自杀性载体pRE112上的氯霉素抗性基因和针对aroA基因的PCR方法来筛选同源臂和同源基因的第一次同源重组（单交换）。筛选所得单交换克隆通过对氯霉素抗性的消除和PCR验证来筛选aroA基因缺失的重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N。本发明的发明人将筛选所得的表达猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段重组支气管败血波氏杆菌菌株，于2012年06月07日送交中国.湖北.武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2012206，分类命名：支气管败血波氏杆菌QH0814ΔaroA/toxA-N。本发明所述的该菌株缺失了支气管败血波氏杆菌对芳香族氨基酸代谢所必须的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶aroA基因（其核苷酸序列见序列表3所示），并含有能在该菌株基因组中稳定表达的猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段的免疫原性蛋白（其核苷酸序列见序列表1所示），该菌株具有针对猪产毒多杀性巴氏杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌的免疫保护力。本发明还包含应用所述一种表达猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段重组支气管败血波氏杆菌制备基因工程疫苗。本发明还包含所述的重组支气管败血波氏杆菌菌株QH0814ΔaroA/toxA-N在制备猪产毒多杀性巴氏杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌病疫苗中的应用。

本发明通过大量的生物学实验数据证明本发明制备的重组菌株可用于制备针对猪产毒多杀性巴氏杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌的二价疫苗。

本发明的主要优点是：

1、本发明制备的基因工程菌株表达的猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段为猪产毒多杀性巴氏杆菌的免疫原性基因片段，具有良好的免疫保护性。使用滴鼻方式进行免疫操作方便，能刺激机体产生粘膜应答。因此，用本发明的基因工程菌株制成的疫苗具有广阔的市场应用前景。

2、本发明所用的起始材料为支气管败血波氏杆菌菌株QH0814，该菌株具有全部的毒力因子和其他免疫原性良好的抗原。因此，芳香烃氨基酸代谢途径中的重要基因aroA基因缺失后，获得的aroA基因缺失株毒力大大降低而其免疫原性未发生改变，可以保护多种异源支气管败血波氏杆菌野毒菌株的攻击。

3、本发明制备的基因工程菌株可以同时提供针对猪产毒多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌两种病原的双重保护。

4、本发明制备的基因工程菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

附图说明

序列表1：是外源基因toxA基因片段核苷酸序列，Genbank登录号为AY864768，全长933bp。

序列表2：是外源基因toxA基因片段的蛋白质的序列，编码311个氨基酸。

序列表3：是缺失基因aroA基因片段核苷酸序列，Genbank登录号为AF182427，位于BbRB50基因组序列231769bp-230816bp，全长954bp。

序列表4：是缺失基因aroA基因片段蛋白质的序列，编码318个氨基酸。

图1：是本发明所用的克隆载体pGEM-T easy限制性图谱。

图2：是本发明所用的转移载体pBluscriptII SK（+）限制性图谱。

图3：是本发明所用的自杀性载体pRE112限制性图谱。

图4：是本发明制备的转移质粒pREΔaroA/toxA-N构建的流程图。

图5：是本发明制备的转移质粒pREΔaroA/toxA-N的酶切鉴定结果。图中：M1:DNAmarker(DL 15,000)；M2：DNAmarker(DL2,000)；1-3：pREΔaroA/toxA-N（Kpn I和Sac I）。

图6：是本发明中的转移质粒整合至基因组后用引物A5/A6进行的PCR鉴定。图中M1：DNALadder(DL 2,000)；1-4：单交换子；5：野生菌QH0814；6：ddH₂O对照。

图7：是本发明中的转移质粒整合至基因组后用引物Cm1/Cm2进行的PCR鉴定。图中M：DNA Ladder(DL 2,000)；1：ddH₂O对照；2-4：单交换子；5-6：质粒pREΔaroA/toxA-N。

图8：用引物A5/A6对本发明中的重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N进行的PCR鉴定。图中M：DNA Ladder(DL 2,000)；1：ddH₂O对照；2-3：重组菌；4：野生菌QH0814；5：质粒pREΔaroA/toxA-N；6：单交换子。

图9：用引物T1/T2对本发明中的重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N进行的PCR鉴定。图中M：DNA Ladder(DL 2,000)；1：ddH₂O对照；2-3：QH0814ΔaroA/toxA-N；4：Pm基因组；5：质粒pREΔaroA/toxA-N。

图10：用引物Cm1/Cm2对本发明中的重组菌QH0814ΔaroA/toxA-N进行的PCR鉴定。图中M：DNALadder(DL 15,000)；1：重组菌；2：质粒pRE112；3：质粒pREΔaroA/toxA-N。

图11：用引物A5/A6对本发明中的重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N遗传稳定性进行PCR鉴定。图中M:DNALadder(DL 2,000)；1-7：分别为重组菌株的第1代、5代、10代、15代、20代、25代、30代；8：野生菌株QH0814；9：质粒pREΔaroA/toxA-N；10：ddH₂O对照。

图12：用引物T1/T2对本发明中的重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N遗传稳定性的PCR鉴定。图中M：DNA Ladder(DL 2,000)；1-7：分别为重组菌株的第1代、5代、10代、15代、20代、25代、30代；8：Pm基因组；9：ddH₂O对照。

图13：是本发明中的重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N分泌表达toxA基因片段蛋白的western-blot鉴定。图中1：重组菌株QH0814△aroA/toxA-N；2：野生菌株QH0814。

具体实施方式

以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1

1、引物设计和PCR扩增

根据已报道的支气管败血波氏杆菌RB50株（Parkhill J.,2003,Nature）全基因组序列（参照Genbank登录号为AF315119的基因序列）设计两对引物（所有引物由南京金斯瑞生物科技公司合成）分别扩aroA基因的上游同源臂和下游同源臂，扩增片段大小分别为1388bp和1383bp，上游臂两端分别设计KpnI和SalI酶切位点，下游臂两端分别设计Hind III和Sac I酶切位点。根据已报道的猪产毒多杀性巴氏杆菌菌株HN-13（唐先春．猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究．[硕士学位论文]，中国知网http://www.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx?dbcode=cmfd&dbname=cmfd2005&filename=2004138308.nh&uid=WEEvREcwSlJHSldTTGJhYkg4MXIyTFA0VHBid3o5NXhqOUx0aGtNb2xYTXBpZ25aa29aZXUyQzBnaXkyVVgwVg==&p=.）toxA基因序列设计一对引物扩增toxA基因N端片段，扩增片段大小为933bp，两端分别设计SalI和Hind III酶切位点。所述引物序列如下：

表1本实验所用的PCR引物

表1中引物序列的下划线为酶切位点。

2、支气管败血波氏杆菌aroA基因上下游同源臂和猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因N端片段的克隆

将猪源支气管败血波氏杆菌菌株QH0814在改良的TSA（即胰蛋白大豆琼脂培养基，购自美国BD公司，以该培养基为基本成分，添加体积为10%的小牛血清）平板上培养24h，挑取单菌落接种于改良TSB（即胰蛋白大豆培养基，购自美国BD公司，以该培养基为基本成分，添加体积为10%的小牛血清）培养基中，37℃200r/min培养12h，按细菌基因组提取试剂盒说明书提取基因组为PCR模板。扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系如下：模板DNA2μL，10×PCR缓冲液5μL，10μmol/L上游引物A1、下游引物A2各1μL，2mmol/L dNTPs 5μL，Ex Taq 0.5μL，DMSO 4μL，ddH₂O 30.5μL。扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃1min，56℃1min，72℃，1min 30s。30个循环后，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增aroA基因上下游同源臂的2个片段大小分别为1388bp和1383bp，与预期大小相当。

以猪产毒多杀性巴氏杆菌菌株HN-13全基因组为PCR模板扩增toxA基因N端片段，扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系如下：模板DNA 2μL，10×PCR缓冲液5μL，10μmol/L上游引物T1、下游引物T2各1μL，2mmol/L dNTPs 5μL，Ex Taq 0.5μL，ddH₂O34.5μL。扩增条件为：95℃变性5min后进入循环；循环参数为94℃1min，50℃1min，72℃，1min，30个循环后；72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增的片段大小为933bp，与预期大小相当。

将得到的目的基因克隆到pEGM-T Easy载体（购自宝生物工程（大连）有限公司，见图1），将酶切鉴定正确的重组质粒pEGM-toxA-N送宝生物工程（大连）有限公司进行外源基因序列的测定。

3、重组转移质粒pREΔaroA/toxA-N的构建

用Kpn I和SalI（购自宝生物工程（大连）有限公司）双酶切pEGM-aroA1，回收大小为1388bp的aroA基因上游同源臂PCR扩增产物,同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pBluscriptSK（购自宝生物工程（大连）有限公司，见图2）。将酶切的aroA上游同源臂和质粒片段用T4DNA ligase（购自宝生物工程（大连）有限公司）连接（重组质粒命名为pSKaroA1），16℃水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37℃培养，挑菌，然后将转化子转接扩大培养，将培养获得菌液用于小量制备质粒。用Hind III和Sac I双酶切pMDT-aroA2，回收大小为1383bp的aroA基因下游同源臂PCR扩增产物，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pSKaroA2。将酶切的下游同源臂和质粒片段用T4DNA ligase连接（重组质粒命名为pSKΔaroA），16℃水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37℃培养，挑菌，然后将转化子转接扩大培养，将培养获得菌液用于小量制备质粒。用Sal I和Hind III双酶切pEGM-toxA-N，回收大小为933bp的toxA基因N端片段PCR扩增产物，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pSKΔaroA。将酶切的toxA基因N端片段和质粒pSKΔaroA用T4DNA ligase连接，得到的重组质粒命名为pSKΔaroA/toxA-N，16℃水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37℃培养，挑菌，然后将转化子转接扩大培养，将培养获得菌液用于小量制备质粒。

同时分别用Kpn I和Sac I酶切载体pRE112（由美国华盛顿大学Dr.Roy CurtissⅢ教授惠赠，质粒图见图3）和重组质粒pSKΔaroA/toxA-N，回收酶切过的上下游同源臂基因和载体pRE112，然后用T4DNA ligase连接，16℃水浴过夜，转化大肠杆菌X7213（由美国华盛顿大学Dr.Roy CurtissⅢ教授惠赠）感受态细菌，37℃培养，挑菌，然后将转化子转接扩大培养，将培养获得菌液用于小量制备质粒pREΔaroA/toxA-N，转移质粒pREΔaroA/toxA-N构建流程如图4所示。转移质粒用Kpn I和Sac I双酶切鉴定，鉴定结果证实构建的转移质粒pREΔaroA/toxA-N是正确的（见图5）。

4、重组菌株的构建与鉴定

以转化了重组质粒pREΔaroA/toxA-N的大肠杆菌X7213为供体，支气管败血波氏杆菌QH0814为受体进行接合转移。供体菌和受体菌分别在适合的琼脂平板上培养过夜，然后用胰蛋白胨大豆肉汤TSB（购自Sigma公司）洗两遍，调整菌液浓度至OD₆₀₀为0.8，各取100μL菌悬液混合，将无菌硝酸纤维滤膜贴于含2’6－二氨基庚二酸（DAP，购自Sigma公司）的胰蛋白胨大豆琼脂TSA（购自Sigma公司）培养基上，并于37℃预温，然后将混合菌液滴于滤膜上，使之慢慢吸收。37℃接合5小时，同时做供体和受体对照。然后用TSB洗下滤膜上的支气管败血波氏杆菌，重悬细菌后再用TSB洗两遍，涂布在含氯霉素（Cm，购自Sigma公司）的TSA培养基上，37℃培养过夜24小时。Cm抗性菌落进一步用PCR鉴定。PCR反应1(用引物A5/A6扩增)用来确定发生了第一次交换，质粒整合到染色体上后，aroA的前后臂将有两个拷贝，一个是缺失型，一个是野生型，因此用aroA全长引物可以扩增出两个片段，野生型是1329bp，缺失型是1241bp（见图6）。PCR反应2（用引物Cm1/Cm2扩增）来确定pRE112中的Cm表达盒的存在（见图7），从而说明转移质粒已经整合到支气管败血波氏杆菌的染色体上了。

将单交换子在无NaCl的LB液体培养基（添加二羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，所添加的试剂均购自Sigma公司，使这五种营养因子终浓度均为40μg/mL）中传代培养，将每一代培养物倍比稀释后，选择合适的稀释度涂布于TSA平板，培养24h后，用牙签挑取单菌落分别影印到含有Cm抗性和不含Cm抗性的平板上。筛选出Cm敏感的克隆，然后用反应1、反应2和反应3（用引物T1/T2扩增）进行PCR鉴定，以确定发生了第二次交换。发生第二次同源重组，可以产生两种结果，一种是得到aroA基因缺失株，一种是回复野生型。正确的aroA基因缺失菌株用A5/A6只能扩增出1241bp的片段（见图8），用T1/T2能扩增出toxA基因N端片段的933bp(见图9)，并用Cm1和Cm2无法扩增出Cm基因盒(见图10)。将A5/A6扩增得到的片段送上海生工生物技术有限公司测序，测序结果证明本发明构建的缺失菌株缺失了目的片段aroA基因（序列表SEQ ID NO：2），并将toxA-N基因片段（序列表SEQ ID NO：1）插入到了基因组中。

将筛选得到的支气管败血波氏杆菌QH0814ΔaroA/toxA-N，于2012年06月07日送交中国.湖北.武汉中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2012206。

5、表达toxA基因片段的重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N的生物学特性试验

（1）重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N的培养特性分析

分别挑取重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N和野生菌株QH0814的单菌落划线接种脱纤绵羊血平板（胰蛋白胨大豆琼脂中加入10%脱纤绵羊血），然后分别转接枸橼酸盐、硝酸盐、尿素、触酶、氧化酶、MR、VP、乳糖、葡萄糖、吲哚及H₂S等生化鉴定管进行生化反应。结果表明将重组菌株划线接种脱纤绵羊血平板后能产生明显的β溶血。生化反应鉴定结果显示，QH0814ΔaroA/toxA-N的生化特性与野生菌株QH0814相同，没有发生改变，两者都不能利用乳糖和葡萄糖，硝酸盐、枸橼酸盐、尿素、触酶、氧化酶反应呈阳性，甲基红、吲哚反应呈阴性。

（2）重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N的遗传稳定性分析

将得到的重组菌株在TSA培养基上连续传代30代，每隔5代取单菌落分别用引物A5/A6和引物C1/C2进行PCR验证。结果显示缺失株传代后用引物A5/A6都能扩增1241bp的片段(见图11)，用引物T1/T2都能扩增933bp的片段(见图12)，表明重组菌株能稳定遗传。

（3）重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N的生长特性分析

分别挑取重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N和野生菌株QH0814的单菌落，接种于TSB培养基中37℃震荡培养20h。第二天以体积比为1:1000的稀释度转接至TSB培养基中。37℃摇床200r/min震荡培养28h，每隔2小时取样测OD₆₀₀值并活菌计数，绘制其生长曲线。结果显示本发明构建的QH0814ΔaroA/toxA-N菌株的生长速度明显慢于野生株QH0814，野生菌株6～20h左右进入对数生长期，本发明的重组菌株8～24h左右进入对数生长期。

（4）重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N的表达特性分析

挑取重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N的单菌落在TSB液体培养基中，37℃、200r/min培养12h，按体积比1:100转接TSB培养基再培养至OD值为0.5，取1ml菌液8000r/min离心5min收集菌体。将菌体加适量去离子水重悬后，取50μL加等体积的2×SDS-PAGE凝胶加样缓冲液，100℃煮沸裂解10min，冰中放置10min，进行聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE，黄培堂等译.萨姆布鲁克J,拉塞尔D W著.分子克隆实验指南（第三版）.北京：科学出版社,2002）。电泳结束后转膜，以猪产毒素多杀性巴氏杆菌toxA-N制备的小鼠单抗为一抗，以羊抗鼠HRP-IgG（购自sigma公司）为二抗，进行Western-blot分析（黄培堂等译.萨姆布鲁克J，拉塞尔D W著.分子克隆实验指南（第三版）.北京：科学出版社,2002）。结果表明QH0814ΔaroA/toxA-N能分泌表达大小为34kDa的蛋白（见图13）。

6、QH0814ΔaroA/toxA-N重组疫苗的制备

将获得的重组菌株QH0814ΔaroA/toxA-N进行鉴定，每代接种于改良的TSB培养基（添加二羟基苯甲酸、对氨基苯甲酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，使这五种营养因子终浓度均为40μg/mL），利用引物A5/A6和引物T1/T2进行PCR检测鉴定重组细菌的遗传稳定性，经30次传代后发现仍然能扩增出大小为1241bp左右和933bp的片段，其遗传性能稳定。通过Western-blotting检测发现，toxA基因片段蛋白可以在重组菌株中稳定表达，并具有良好的免疫学反应原性。将该重组菌株先在aromix改良的TSA固体培养基上培养，然后挑取单菌落于改良的TSB液体培养基上培养，直到活细菌浓度达到2×10¹⁰CFU/mL，将重组菌株的菌液与明胶保护剂按体积比为7:1的比例加入明胶保护剂（该明胶保护剂的配制方法是：每100mL去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置121℃下灭菌30min后保存备用），于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置-50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，复苏后确定没有杂菌污染，置-20℃保存备用，作为研制重组疫苗的疫苗菌株。

7、重组菌株对小鼠的致病力及LD₅₀测定

为评价重组菌株对小鼠的致病力，将重组菌QH0814ΔaroA/toxA-N、野生菌QH0814分别接种于含10%脱纤绵羊血改良BG绵羊血培养基上，在潮湿空气中培养48h后，用无菌磷酸盐缓冲液即PBS（PBS配方：取0.2mol/L的Na₂HPO₄溶液40.5mL与0.2mol/L的NaH₂PO₄溶液9.5mL混合，加入8.2g氯化钠，用蒸馏水定容至1,000mL，即为0.01mol/LpH7.4的PBS）洗脱，调整至合适菌液浓度分别为2.7×10⁸CFU和2.7×10⁷CFU，将菌液3倍一级稀释，每个稀释度采用滴鼻方式接种用乙醚麻醉的4周龄Balb/C雌鼠（购自湖北省疾病预防控制中心），连续观察14天，记录小鼠死亡情况。死亡小鼠肺脏无菌接种TSA平板回收细菌分离鉴定，用鉴定支气管波氏杆菌的特异性引物F1/F2扩增鉴定，均能够扩增出预期237bp的特异性条带，表明小鼠是因感染Bb而死亡的。根据寇氏(Korbor)法计算小鼠半数致死剂量（LD₅₀），计算的公式为:logLD₅₀=X_m–d（∑P-0.5）公式中：X_m为最大剂量对数，d为相邻剂量比值对数，p为各组的死亡率（死亡率以小数表示），∑P为各组死亡率的组合。评价重组菌株与野生菌株相比毒力是否减弱以及对小鼠是否安全。结果表明本发明构建的重组菌QH0814ΔaroA/toxA-N比QH0814毒力降低了约7倍，说明重组菌的毒力明显降低（见表2）。

表2：不同Bb菌株对小鼠的毒力试验

8、本发明的重组菌株对小鼠的免疫效力试验

将24只4周龄Balb/c雌小鼠随机分为2组，每组12只。第一组用50μL含有1×10⁵CFU的重组菌株进行滴鼻免疫，第二组为PBS空白对照组。间隔14d加强免疫，分别于第14d、28d、35d由尾静脉采血，用间接ELISA法检测免疫组小鼠的抗体水平。

挑取波氏杆菌单菌落培养过夜，以体积比为1:100转接培养8h，离心收集菌体，PBS洗2次，以1:100倍浓缩菌液重悬于PBS，置于冰上超声破碎处理至清亮，12000r/min离心10min，弃去细胞碎片。上清用分光光度计测定蛋白浓度，每管500μL分装，-20℃冻存备用，用来作为间接ELISA的抗原。用包被液（1.59g NaCO₃，2.93g NaHCO₃，加ddH₂O至1,000mL）将波氏杆菌抗原按800ng/孔的包被浓度包被酶联板(100μL/孔)，于37℃温育1h后放置于4℃过夜，取出酶联板用洗涤液（8.0g NaCl，0.2g KCl，2.9g Na₂HPO₄·12H₂O，0.2g KH₂PO₄，0.5mL Tween-20，加ddH₂O至1,000mL。）洗涤3次，每次3min，然后每孔加入100μL封闭液（5g脱脂牛奶，洗涤液定容至100mL），37℃封闭1h。然后将待检血清按确定的稀释倍数稀释后加入酶联板，100μL/孔于37℃反应30min，洗涤3次，加入体积比为l:5000羊抗猪IgG-HRP(购自sigma公司)，用封闭液稀释IgG-HRP100μL/孔，37℃反应30min，经洗涤后加入TMB底物（3,3',5,5'-tetramethylbenzidine）100μL，反应10min，最后加入50μL终止液终止反应，用酶标仪在630nm波长下测定OD₆₃₀值，检测免疫小鼠血清中抗Bb抗体水平。用上述同样的方法检测免疫小鼠血清中抗toxA基因N端片段蛋白抗体水平。

结果表明重组菌株QH0814△aroA/toxA-N免疫组的小鼠能产生抗Bb抗体和抗猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA-N蛋白的抗体（见表3）。

表3：本发明制备的重组菌株疫苗免疫小鼠血清中抗体检测（ELISA法）

Claims (5)

1.一种对猪产毒多杀性巴氏杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌具有双重免疫保护力的，表达猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段重组的支气管败血波氏杆菌QH0814ΔaroA/toxA-N，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012206。

2.如权利要求1所述的支气管败血波氏杆菌，其特征在于：该菌缺失支气管败血波氏杆菌对芳香族氨基酸代谢所必须的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶aroA基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示，并含有能在该菌基因组中稳定表达猪产毒多杀性巴氏杆菌toxA基因片段的蛋白，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

3.包含权利要求1或2所述的支气管败血波氏杆菌基因工程疫苗。

4.权利要求1或2所述的支气管败血波氏杆菌在制备猪产毒多杀性巴氏杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌病疫苗中的应用。

5.权利要求3所述的基因工程疫苗在防治猪产毒多杀性巴氏杆菌和猪源支气管败血波氏杆菌病中的应用。

Images