CN106589080A - 一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其中抗原的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。本发明通过对兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株主要保护性抗原蛋白基因PPP的PCR扩增，利用PET32a(+)表达性载体构建了能表达兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原蛋白PPP的基因工程重组大肠杆菌BL21宿主菌。经SDS‑PAGE分析，表达出了46.2kDa重组融合目的蛋白。将融合蛋白纯化并复性后制备成基因工程亚单位氢氧化铝胶疫苗。将该亚单位苗按照1.0ml/只剂量皮下注射免疫体重1.5kg左右的家兔，免后14日，用兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株按照100LD50进行攻毒，保护率为10/10。

Description

一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域，具体涉及一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗。
背景技术
兔支气管败血波氏杆菌病在秋冬季节和早春多发。主要通过空气传播，经呼吸道而感染。幼兔发病率高，并且有死亡病例。成年兔发病较少。此菌在群养兔污染为64.4％，散养兔为20％。在自然条件下，多种哺乳动物上呼吸道中都有本菌寄生，常引起慢性呼吸道病的相互感染。尤其在天气突变，兔的抵抗力下降，兔舍卫生不好，空气污浊等情况下，均可引起本病发生。本病的潜伏期7～10d。成年兔表现鼻炎和支气管炎。有多量的浆液性、黏液性鼻液流出。鼻炎长期不愈，鼻腔流出黏液性或脓性分泌物，打喷嚏，呼吸困难，不食，消瘦等。仔兔多呈急性经过，初期刚见鼻炎病状后，即表现呼吸困难，迅速死亡，病程2～3d。本病的主要病变为鼻炎、化脓性鼻气管炎、化脓性支气管肺炎，个别的出现败血病变化。鼻腔、气管黏膜充血、水肿。鼻腔内有浆液性、黏液性或黏液脓性分泌物。在肺门支气管周围到肺的边缘见有支气管肺炎病灶。病变多见于心叶、尖叶，严重的病例，波及全肺叶。病变部隆起、坚硬，呈暗红色，褐色，进而为灰黄色。有些病例肺上有大小不等的脓疮。严重的占肺部的90％以上。有的肝脏表面有黄豆至蚕豆大的脓疮。脓疮破后可见黏稠的奶油状乳白色的脓汁。还见有心包炎、胸膜炎、胸腔积脓及肌肉脓肿等。
兔支气管败血波氏杆菌病主要采用生物安全措施和疫苗预防接种。其中生物安全措施主要包括：加强饲养管理，改善饲养环境，做好防疫工作；兔场最好坚持自繁自养；对新引进的兔，必须隔离观察1个月以上，经细菌学与血清学检查为阴性者方可入群。本病常与巴氏杆菌混合感染，兔群一旦发病，必须查明原因，消除外界刺激因素，隔离感染兔，以控制病原传播。兔支气管败血波氏杆菌病较难治愈，需要加强规模化兔场的免疫，目前主要用分离到的支气管败血波氏杆菌制成灭活菌苗，进行预防接种，每只兔皮下注射1mL，每年2次；也有用兔巴氏杆菌—波氏杆菌二联苗或巴氏杆菌—波氏杆菌—兔病毒性出血症三联苗预防接种(杜雅楠等,2006；黄艳艳等,2006)。但兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗容易出现细菌毒素残留问题，常导致免疫兔发病，因此，目前迫切需要一种能够防控该病的安全性、效力好的疫苗，从而弥补现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的是提供一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，即通过原核表达载体构建出能表达兔支气管败血波氏杆菌PPP蛋白的大肠杆菌BL21重组基因工程菌，从而制备出兔支气管败血波氏杆菌基因工程重组亚单位疫苗，弥补现有技术的不足。
本发明首先提供一种新型的兔支气管败血波氏杆菌抗原蛋白PPP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2；
编码上述抗原蛋白的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
本发明再一个方面提供一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其中抗原为兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原蛋白PPP，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；
上述的基因工程亚单位疫苗，优选为氢氧化铝胶苗；
本发明所提供的兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗中，主要保护性抗原蛋白PPP的含量优选不少于160μg/ml；
本发明的兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其制备方法包含如下的步骤：
1)将兔支气管败血波氏杆菌接种于TSB培养基37℃培养过夜，次日，5000r/min离心5min，吸尽上清弃掉，提取细菌总DNA作为模板；
2)通过PCR方法扩增出兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原PPP基因，回收PPP基因目的片段；
3)将PPP基因的目的片段按正确阅读框架插入表达载体pET32a(+)中，构建成表达重组质粒；
4)将构建的表达重组质粒通过转化BL21宿主菌,构建了能表达兔支气管败血波氏杆菌的基因工程重组大肠杆菌；用该重组基因工程菌表达出兔支气管败血波氏杆菌PPP蛋白；
5)对融合蛋白进行纯化、复性后，加入氢氧化铝胶相制成疫苗。
本发明利用pET32a(+)表达性载体构建了能表达兔支气管败血波氏杆菌主要抗原蛋白基因(PPP)的基因工程重组大肠杆菌BL21宿主菌。经SDS-PAGE分析，表达出了46.2kDa重组融合目的蛋白。将融合蛋白纯化并复性后制备成基因工程亚单位氢氧化铝胶疫苗，免疫体重1.5kg左右的家兔，免后14日，用兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株(LD50为4.8×105CFU)按照100LD50进行攻毒,保护率100％。
附图说明
图1：本发明的兔支气管败血波氏杆菌的分离及培养图；
图2：玻片凝集试验图；其中左(阳性菌)、中(样品菌)和右(生理盐水)
图3：兔支气管败血波氏杆菌PPP基因PCR扩增的核酸电泳图；其中左(PPP基因)、中(阴性对照)和右(DL5000Marker)。
图4：兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原蛋白PPP SDS-PAGE图；其中左(Protein Marker)、中(阴性菌蛋白对照)和右(阳性菌PPP蛋白)。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述
实施例1抗原蛋白PPP的筛选及序列分析
从山东省潍坊某兔场购进一批1.5～3.0kg兔子做猪瘟脾淋苗试验，出现以发病急、死亡快，口鼻出血，肺脏出血、淤血为特征的疾病，根据发病死亡兔的临床表现、剖检病变，初步怀疑兔巴氏杆菌或兔支气管败血波氏杆菌感染，于是取肺脏组织进行了细菌的分离和培养，进行玻片凝集试验进行验证；对培养单菌落进行16s和巴氏杆菌(Pm)基因或波氏杆菌(Bb)基因的PCR扩增，并克隆、测序，确诊该批兔是由兔支气管败血波氏杆菌感染引起的死亡。
1.1发病情况从山东潍坊购进一批1.5～3.0kg兔子做猪瘟脾淋苗测温试验，该批兔子只免疫过兔瘟疫苗，其它疫苗均未免疫，整体状态良好。
1.2临床及剖检症状一只体重大概2kg左右试验兔子，突然死亡，口鼻喷血，死前一天精神状态、采食和饮水良好，无任何疾病症状，无打斗外伤，发病兔口鼻出血，肺脏出血、淤血，肝脏有一叶成黄白色。
1.3实验室诊断
1.3.1细菌分离和培养
初步怀疑兔巴氏杆菌或兔支气管败血波氏杆菌感染，于是无菌取发病兔肺部组织病料均匀接种于巧克力琼脂平板培养基上，培养24小时形成中等菌落，呈灰白色，表面湿润、光滑，边缘整齐。详见图1。
1.3.2细菌鉴定
1.3.2.1革兰氏、美兰染色鉴定经革兰氏染色并在显微镜下观察确定，革兰氏染色为红色小球杆菌，表明该菌为革兰氏阴性菌；用美蓝染色，镜检，可见多形态、两极染色的小杆菌。
1.3.2.2玻片凝集试验鉴定采用兔支气管败血波氏杆菌阳性血清鉴定该分离样品菌，并用兔支气管败血波氏杆菌阳性菌和生理盐水分别做阳性和阴性对照，具体结果见图2。
1.3.3.3 PCR鉴定利用检测原核生物用16S通用引物和巴氏杆菌(Pm)特定引物及设计的波氏杆菌(Bb)特定引物(上、下游引物序列详见表1)对单个菌落进行PCR扩增，并于1％琼脂糖凝胶中电泳，详见图3。
表1引物序列表
1.3.3.4目的基因序列测定将16S和Bb目的基因分别送上海生工测序，测序结果分析表明，该菌为兔支气管败血波氏杆菌，命名为QDBb01株。兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株(Rabbit Bordetella bronchiseptica QDBb01)，于2016年11月01日保藏在中国武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016607。
1.3.3.5兔支气管败血波氏杆菌(QDBb01株)灭活疫苗的制备
将菌种接种于鲍姜氏培养基，37℃摇床内培养48h。用灭菌生理盐水离心洗涤2次，再用生理盐水稀释至含菌数为200亿个/ml，按总体积0.4％加入甲醛，混匀，37℃灭活48小时，每隔6h混匀一次。经检验灭活合格者作为制苗用抗原。与氢氧化铝胶佐剂按体积比＝1：4进行配苗，制备成兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗，相当于成品含40亿个灭活菌/ml。免疫结果表明，本发明筛选的QDBb01株制备的疫苗对兔支气管败血波氏杆菌具有良好的免疫效果。并且，用目前市场上出售的兔支气管败血波氏杆菌疫苗进行免疫，再用本发明筛选的QDBb01株进行攻毒实验；结果表明目前市场上出售的疫苗的免疫效果远低于本发明QDBb01株制成的灭活疫苗的效果。推测是由于QDBb01株基因发生变异导致目前疫苗的免疫效果不好。
从QDBb01株中提取具有免疫原性的蛋白，具体就是将兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株的菌体破碎后，离心去除未破碎掉的细菌菌体和较重的细菌细胞内细胞器；将上清液高速离心后获得沉淀；用缓冲液溶解沉淀后，室温孵育后；再进行高速离心；沉淀溶解以后，用能够截留蛋白分子量在40kDa以上的半透膜透析掉小分子蛋白。用上述的提取的粗蛋白(包含有多种抗原蛋白)作为抗原来制备的亚单位疫苗，该疫苗也具有很好的免疫效果。但由于存在很多的杂蛋白，使的免疫后的兔子在一段时间内出现进食减少等副作用。
为了获得纯度更高的抗原蛋白，申请人对兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株的基因组进行分析，结果发现主要保护性抗原蛋白PPP的基因序列与已经报道的序列同源性在93％以下。进一步研究表明正是该蛋白的差异导致目前疫苗对QDBb01株的免疫效果不好。QDBb01株的抗原蛋白PPP的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；其一种核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
实施例2表达兔支气管败血波氏杆菌PPP基因重组质粒pET32a-PPP的构建
根据兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株细菌基因组中PPP抗原蛋白基因序列与表达性载体PET32a(+)的多克隆酶切位点，利用DNAStar软件设计PPP基因的特异性引物：PPP-F:5-TATGGATCCGCAAAAAGACTCTGCTCGCT-3加入了BamHⅠ酶切位点；PPP-R:5-ATAGCGGCCGCTTAGAAGCGGTGACGGATAC-3加入了Not Ⅰ酶切位点。以兔支气管败血波氏杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，并用DNA纯化回收试剂盒回收目的基因，其核苷酸序列为SEQID NO:2,编码的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。利用pET32a(+)质粒获得pET32a-PPP重组质粒，将该重组质粒转入表达性大肠杆菌BL21宿主菌,挑取单个克隆，酶切法鉴定阳性克隆，摇菌，测序。
实施例3重组融合蛋白的表达、纯化、复性及SDS-PAGE鉴定
将测序结果正确的单个克隆重组质粒pET32a-PPP转化表达性BL21宿主菌构建出重组基因工程菌，命名为pET32a-PPP/BL21。将该重组基因工程菌接种于5ml含有氨苄青霉素(100mg/L)的LB细菌培养基,37℃振摇(200r/min)培养过夜，次日取出1ml培养物接种于120ml的LB培养基中，37℃振摇(200r/min)培养2.5h后，菌液摇至半透明半浑浊状态，吸光光度法测得OD600＝0.6～0.8,在诱导前先取10ml作为诱导前对照，并将振摇温度变为30℃加α-乳糖(终浓度为1.0mmol/L)诱导，分别诱导1h、2h、3h、4h、5h、6h收集10ml菌液，以诱导未转化pET32a(+)载体的菌液作为空白对照，以诱导转化pET32a(+)载体的菌液作为空载体对照。按照以下步骤进行纯化、复性：(1)将诱导表达的菌液取出分装至50ml离心管中，4000r/min离心10min，弃上清；(2)用1ml TE1(Tris-cl 10mM/L,EDTA二钠1mM/L,PH＝8.0)重悬沉淀并转移至1.5ml离心管中，按照以下条件：超声30s、间隔30s、工作20次、480V电压下超声波裂解破碎工程菌，7000r/min 4℃离心20min，弃上清；(3)将沉淀中加入1ml TE2(TritonX-100/TE1＝1/100配置)震荡混匀，7000r/min 4℃离心20min，弃上清；(4)在沉淀中加入1ml TE3(用TE1配置2M/L尿素)，7000r/min 4℃离心20min，弃上清；(5)将沉淀收集加入150ml变性液(8M/L尿素、10mM/L Tris-cl、10mM/L DTT)搅拌溶解，8000r/min 4℃离心30min，取上清；(6)将上清液加入半透膜袋中，4℃透析复性48h。取半透膜袋中的蛋白液按1:1加2×上样Buffer煮沸10min，离心取上清，上清用12％SDS-PAGE电泳鉴定分析获得46.2kDa目的蛋白。
实施例4纯化融合蛋白定量与兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗制备
将纯化好的兔支气管败血波氏杆菌PPP目的蛋白用分光光度法按照以下步骤进行绝对定量：(1)加测蛋白用的PBS 0.15ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液2.85ml于比色皿中作为对照，进行调零；(2)加测蛋白用PBS 0.14ml、加待测蛋白溶液0.01ml和蛋白定量用考马斯亮蓝染液2.85ml于比色皿中测出吸光度值y为0.211，通过公式y＝0.142x+0.0731得出蛋白浓度x＝0.971mg/ml，即为971μg/ml，以上所用测蛋白用试剂购自TIANGEN公司。将此纯化的蛋白溶液稀释成800ug/ml，与氢氧化铝胶佐剂按体积比＝1：4进行配苗，制备成兔支气管败血波氏杆菌亚单位疫苗，成品相当于每毫升氢氧化铝胶苗中含有蛋白160μg/ml。
实施例5兔支气管败血波氏杆菌灭活苗和亚单位疫苗效力检验方法
5.1攻毒用菌液的制备将分离鉴定保存的兔支气管败血波氏杆菌(QDBb01株)复苏挑取单菌落接种150ml 3％小牛血清鲍姜氏培养基，37℃过夜摇床培养兔支气管败血波氏杆菌，次日早上取出，进行菌落计数：将菌液进行10-7倍稀释，取0.1ml进行涂板，然后计算菌落数为48个。结果，菌数为4.8×109cfu/ml。
5.2攻毒菌液最小致死剂量(LD50)的确定选择25只兔子，随机分成5组，每组5只，将上述菌液按照10-1依次稀释成4.8×107cfu/ml、4.8×106cfu/ml、4.8×105cfu/ml、4.8×104cfu/ml四个梯度，以1.0ml/只的剂量进行攻菌，留1组作为空白对照。连续观察、记录兔子发病死亡情况，解剖观察病变情况，最终确定4.8×105CFU为最小致死剂量。
5.3兔支气管败血波氏杆菌灭活疫苗、亚单位疫苗的攻毒保护试验将制备出的此灭活疫苗和亚单位疫苗成品分别按照1.0ml/只剂量皮下注射免疫体重1.5kg左右的家兔各10只，留10只作为未免疫对照组。免后14日，用兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株(LD50为4.8×105CFU)按照100LD50进行攻毒，攻毒后观察7日，统计家兔的攻毒保护率，以此来判定该疫苗的保护效果。结果，对照组10只全部发病，解剖上呼吸道病变均为支气管败血波氏杆菌典型症状；而亚单位疫苗和灭活苗免疫组攻毒后均健活，均未见发病，保护率均为10/10。但解剖两种疫苗的注射的部位发现，灭活苗吸收不完全，而制备的亚单位疫苗吸收完全，因此，制备的兔支气管败血波氏杆菌(QDBb01株)亚单位疫苗较灭活苗具有更好的安全性。而且，与QDBb01株制备的灭活疫苗效果相当，本发明制备的亚单位疫苗对QDBb01株的免疫效果也在统计学意义上明显好于市场上的类似疫苗。

Claims (10)

1.一种新型的兔支气管败血波氏杆菌抗原蛋白，其特征在于，所述的蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
2.一种编码基因，其特征在于，所述的编码基因用于编码权利要求1所述的抗原蛋白。
3.如权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。
4.一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原为权利要求1所述的抗原蛋白。
5.一种兔支气管败血波氏杆菌基因工程亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗的抗原包含有权利要求1所述的抗原蛋白。
6.如权利要求4或5所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗为氢氧化铝胶苗。
7.如权利要求4或5所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述的疫苗中抗原蛋白的含量不少于160μg/ml。
8.权利要求4或5所述的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括如下的步骤：
1)将兔支气管败血波氏杆菌接种于TSB培养基37℃培养过夜，次日，5000r/min离心5min，吸尽上清弃掉，提取细菌总DNA作为模板；
2)通过PCR方法扩增出兔支气管败血波氏杆菌主要保护性抗原PPP基因，回收PPP基因目的片段；
3)将PPP基因的目的片段按正确阅读框架插入表达载体pET32a(+)中，构建成表达重组质粒；
4)将构建的表达重组质粒通过转化BL21宿主菌,构建了能表达兔支气管败血波氏杆菌的基因工程重组大肠杆菌；用该重组基因工程菌表达出兔支气管败血波氏杆菌PPP蛋白；
5)对融合蛋白进行纯化、复性后，加入氢氧化铝胶相制成疫苗。
9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述的兔支气管败血波氏杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M 2016607。
10.如权利要求8所述的制备方法制备对的亚单位疫苗，按照1ml/只剂量皮下注射免疫体重1.5kg左右的家兔，免后14日，用兔支气管败血波氏杆菌QDBb01株(LD50为4.8×105CFU)按照100LD50进行攻毒，保护率为10/10。
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