CN102199571B - 一种表达猪2型圆环病毒orf2基因片段的重组支气管败血波氏杆菌株、疫苗及应用 - Google Patents

Abstract

一种不含抗性标记的表达猪2型圆环病毒ORF2基因片段的重组支气管败血波氏杆菌株的构建、疫苗的制备与应用，属基因工程领域。得到一株不含抗性标记的表达猪2型圆环病毒ORF2基因片段的重组支气管败血波氏杆菌株QH0814ΔaroA/ORF2。该菌株缺失了支气管败血波氏杆菌的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶(aroA)基因，含有猪2型圆环病毒ORF2基因片段。公开了该重组株及疫苗的制备以及在制备猪2型圆环病毒和猪源支气管败血波氏杆菌疫苗中的应用。本发明的基因工程疫苗可以刺激猪产生抵抗猪2型圆环病毒和猪源支气管败血波氏杆菌野毒株的保护性免疫反应，能有效防止猪2型圆环病毒和猪源支气管败血波氏杆菌的感染。

Description

一种表达猪2型圆环病毒ORF2基因片段的重组支气管败血波氏杆菌株、疫苗及应用

技术领域

本发明属于动物细菌基因工程技术领域，具体涉及一种不含抗性标记的表达猪2型圆环病毒ORF2基因片段的重组支气管败血波氏杆菌活疫苗菌株的构建、疫苗制备及应用。

背景技术

支气管败血波氏杆菌(Bordetella Bronchiseptica，Bb)是一种革兰氏阴性菌，其宿主范围广泛，大多数哺乳动物和鸟类都可以被感染。该菌是引起猪萎缩性鼻炎(Atroptic Rhinitis，AR)的主要病原菌之一，单独的Bb常常引起猪只的隐性感染，发病猪临床表现为生长缓慢，育肥延迟，极大地降低了饲料报酬和生产效率；而Bb和产毒素多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)共同作用引起的猪萎缩性鼻炎，在临床上以出现鼻炎、鼻甲骨萎缩和生长性能下降为特征。Bb可通过飞沫传播，并经动物的呼吸运动而侵入机体，该菌侵入机体后，能够破坏局部的纤毛或上皮，同时Bb分泌的各种毒素可引起机体呼吸道粘膜上皮细胞发炎、增生和纤毛脱落。如果机体的鼻粘膜出现急性炎症的继续发展，则常有部分粘膜上皮受损脱落，进而鼻粘膜的屏障作用遭到破坏，大量细菌及其毒素就会趁机迅速进入粘膜下组织，造成骨组织明显损伤，引起猪鼻甲骨病变。同时，Bb粘膜上皮细胞受损脱落后可为其它呼吸道病原菌的侵入提供了条件，造成其它多种病原的继发感染，对鼻腔和整个呼吸道造成更严重的损伤(斯特劳，2000)。从而增加猪群呼吸道疾病的发病率和严重程度，造成严重经济损失(Straw et al.，2000；Karen，2000；Borckmeier，2003)。以AR为代表的猪波氏菌病现已遍布养猪业发达国家，已成为猪的重要呼吸道传染病之一(Straw et al.，2000；Dugal et al.，1992；Vecht et al.，1992；Brockmeier，2004；Brockmeier et al.，2000)。由于Bb属猪鼻腔中的一种常在细菌，因此从机体中根除该菌的可能性不大，但是Bb对猪群的危害又不容忽视，所以防制工作就显得尤为重要，目前主要采取综合防控措施控制该菌，其中对猪群进行免疫接种是主要手段。现今市场上已有针对Bb的相关灭活疫苗，但其使用效果并不明显，效力也普遍较低，这可能与Bb灭活苗不能有效引起局部粘膜免疫，不能产生足够的保护性抗体IgA有关(Bercovich et al.，1977；Giles et al.，1982)。另外，有研究报道有部分Bb弱毒疫苗和亚单位苗在研制中，但尚未被大规模临床推广应用(Kruger et al.，1992；Kang et al.，2007)。

猪2型圆环病毒(Porcine circovirus type 2，PCV2)是当前严重危害世界养猪业的重要病原之一。该病毒与猪的多种疾病综合征有关，特别是断奶仔猪多系统衰竭综合征，其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热、苍白及黄疸等。PCV2基因组全长为1767或1768bp，共编码11个开放阅读框架(Open reading frames，ORFs)，阅读框之间相互重叠，使病毒可以充分利用有限的遗传物质传递大量的遗传信息。ORF2编码病毒的核衣壳(Cap)蛋白，是病毒唯一的结构蛋白，含有234个氨基酸，分子量大小为27.8kDa。由基因组的互补链合成。Cap蛋白转录起始位点在1238位核苷酸，转录产物内含有由119个核苷酸(1238nt-1120nt)组成的非编码前导序列，Cap启动子精确定位于1353nt-1168nt核苷酸区域，与Rep基因有重叠(Mankertz et al.，1998)。Cap蛋白在圆环病毒感染细胞后6-12小时即可表达，在12-24小时定位于细胞核中(Meertset al.，2005)。ORF2基因在圆环病毒中变异比较大，同源性约为70％。Cap蛋白端的41个氨基酸序列高度保守，富含碱性氨基酸(如精氨酸)，编码病毒的核定位信号，与病毒在细胞核内的定位有关，其中第12-18位和第34-41位氨基酸残基对ORF2的定位起着至关重要的作用。Cap蛋白间不存在交叉反应，具有良好的免疫原性，产生的抗体在血清中维持时间长，因此ORF2基因是进行病毒控制和构建重组疫苗的首选基因。PCV2在猪群中的感染率非常高，但多为隐性感染，且主要侵害机体的免疫系统，导致免疫抑制，造成继发感染，给全球养猪业造成巨大的经济损失。目前主要采取疫苗接种的方法控制该病，但PCV2在体外细胞上增殖滴度不高，用全病毒来制备灭活疫苗或弱毒疫苗操作繁琐，成本高，因此DNA疫苗、亚单位疫苗及活载体疫苗等将是研制PCV2疫苗的主要方向。

随着人们对流行病学、病原菌致病机理的深入了解，以及免疫学、分子生物学和基因工程技术的发展，学术界已形成了有关免疫调节和疫苗递呈系统的新概念，为新型疫苗的设计提供了新思路。其中，以细菌为活载体的疫苗被认为是最有发展前景的研究领域之一，该类疫苗是将致病菌的特异性抗原基因插入减毒的细菌载体中，以递呈表达所编码的异源抗原，以期达到预防一种或多种疾病的作用。研究表明许多传染性疾病是由于病原菌在粘膜表面(如呼吸道、胃肠道)的定居或者侵入引起的，因此，刺激机体的粘膜免疫在保护机体免受病原菌的侵扰和毒素作用方面则显得尤为重要。细菌载体活疫苗能将特异的免疫抗原递呈到粘膜表面，使其有效接触，基于其共同的粘膜免疫系统，所产生的免疫应答不仅发生在接触抗原的诱导部位，而且也发生在较远的粘膜部位，进而诱导强有力的全身免疫。细菌与病毒都可作为重组疫苗载体，与病毒载体不同，细菌疫苗载体有许多显著的优点，例如细菌疫苗载体基因组容量大，可以携带许多不同的外源基因片段，易于构建多价基因工程疫苗；具有免疫佐剂的作用，提高了外源蛋白的免疫活性，可刺激机体产生持久的系统和粘膜免疫反应，具有良好的免疫效果；诱导作用位点比较明确，更安全可靠。另外，细菌载体疫苗生产成本相对低廉，可以通过口服或者鼻腔喷雾接种，方法简便易行，适合大范围免疫预防。因此，减毒细菌作为疫苗载体已成为医学、兽医学和公共卫生学领域的研究热点。目前有关细菌载体的研究越来越多，减毒沙门氏菌是最早用作疫苗载体的病原菌，也是目前研究最深入的细菌载体。重组卡介苗(rBCG)是牛分支杆菌的减毒疫苗，它是世界上应用最广泛的疫苗，自1948年以来全球已有30亿人接种重组卡介苗，其安全性已被证实，而且BCG是WHO推荐的两种婴儿出生时接种的活疫苗之一。可见，粘膜免疫与多价基因工程疫苗是未来有效预防控制人、畜传染病的主要研究方向；同时，这些细菌载体疫苗在控制相关动物疫病方面具有无可比拟的优点。

支气管败血波氏杆菌与大多数细菌呼吸道病原体不同，该菌能有效、快速的定殖于猪的呼吸道粘膜，持久刺激机体的粘膜免疫反应。因此，若在试验中用安全性高、减毒的Bb作为疫苗或活菌疫苗载体具有很多优点，通过鼻腔接种，使其直接进入猪的呼吸系统，激发机体产生有效的粘膜免疫和全身体液免疫及细胞免疫抗体。另外，Bb基因组相对高等，目前已经对其全基因组进行了测序并有了较为全面深入的功能基因组学研究，操作起来相对简单，有相对比较好的动物模型来评价候选疫苗菌株。而且Bb具备所有已知的细菌蛋白分泌系统，因此可用作细菌载体以递呈其它呼吸道致病菌的免疫基因，达到一次接种就能持久预防多种疫病的目的，使猪群获得更好的保护。

目前，国际上构建细菌突变株所缺失的靶基因主要有两类，一类是缺失相关毒力基因，如毒素和粘附素；另一类是缺失细菌代谢途径或适应环境调节中的“看家”基因。由于Bb含有多个毒力因子，不同的毒株之间，存在明显的毒力和致病差异，且目前还未见哪一个或一类毒力相关基因在致病与免疫相关功能上起着决定性的作用，因此，选择缺失某一个或几个靶基因，有一定的盲目性。而代谢途径或环境调节中的看家“基因”是每一个细菌都含有的，通过分子遗传学方法缺失该类基因，进而达到使野毒株致弱，具有更好的普适性；并且已有学者应用这种减毒策略在鼠伤寒沙门氏菌中获得满意结果。芳香族(aro)生物合成途径是革兰氏阴性菌和阳性菌共有的代谢途径。aroA编码5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶，缺失该基因可影响芳香族氨基酸、氨基苯甲酸及其它芳香族化合物的合成，使细菌在宿主内有限繁殖，进而使其毒力减弱；同时，该类基因缺失突变株可能具有其它优点，如可有效表达Bb的各种免疫原性基因；在宿主体内定殖的数周内，既可激发机体强大的免疫应答，又能及时被宿主清除，具有更好的安全性和免疫效力；通过鼻腔粘膜免疫途径，可局部逃避肌注或口服抗生素所带来抑制作用。

尽管波氏杆菌疫苗作为载体有诸多的无可比拟的优点，但各种问题也很多，如外源抗原的表达量低而不能激发免疫反应，外源抗原高水平的表达可能对波氏杆菌载体有毒性，外源基因表达不稳定，免疫原性低等，这些原因均可导致免疫效果差。如果疫苗的免疫原性很弱，可以使用稳定的高拷贝的质粒以增加重组抗原的产量，提高免疫原性，从而产生更强的免疫应答(Galen andLevine，2001)。除了外源抗原在波氏杆菌中表达量低以外，常常遇到的另一个问题是外源基因表达不稳定，特别是在体内。研究者们研究了各种方法来解决遗传不稳定问题，较为有效的方法之一是将编码外源基因的DNA通过同源重组整合到波氏杆菌载体染色体上。

目前国外已有学者开始对支气管败血波氏杆菌弱毒活疫苗作为载体进行研究，但迄今为止还没有一个较为成熟的产品问世。目前报道的研究大都普遍采用携带抗性基因的表达质粒，因存在生物安全问题而不被人们所接受。因此，通过同源重组构建不含抗性标记的，缺失支气管败血波氏杆菌的营养代谢基因的弱毒菌株，既可以用来作为预防波氏菌病的疫苗，也可以用来作为载体表达外源基因，有着较好的应用前景。本实验室用此方法已经成功构建了支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失株，此基因缺失株不含任何抗性基因，有着较好的免疫原性，能够提供针对波氏杆菌野毒株攻击的保护。参见中国发明专利《一种支气管败血波氏杆菌基因缺失疫苗及应用》，授权公告号：CN101575586B和农业转基因生物安全性评价在湖北省的环境释放试验(农基安办字2009第015号)。

发明内容

本发明以我国地方流行Bb菌株(QH0814)为材料，利用负向筛选技术构建不含抗性标记的支气管败血波氏杆菌aroA基因缺失突变株，将猪2型圆环病毒ORF2基因在其基因组中进行表达，并对其遗传稳定性、生长特性、对小鼠的致病性和免疫保护效力等生物学特性进行研究。该疫苗菌株不携带任何外源基因、抗生素抗性基因或者基因转移原件，所以菌株对动物、环境和人均是安全的，且具有很好的免疫效果。鉴于此前提，本发明的目的在于克服现有技术存在的缺陷，获得一种免疫原性更好和安全性更强的表达猪2型圆环病毒ORF2基因片段的重组支气管败血波氏杆菌株；

本发明的第二个目的是利用表达猪2型圆环病毒ORF2基因片段的重组支气管败血波氏杆菌株制备猪2型圆环病毒和猪源支气管败血波氏杆菌二价基因工程疫苗；

本发明的第三个目的是表达猪2型圆环病毒ORF2基因片段的重组支气管败血波氏杆菌株在制备猪2型圆环病毒和猪源支气管败血波氏杆菌二价基因工程疫苗中的应用。

本发明通过以下技术方案实现：

利用基因工程技术将支气管败血波氏杆菌野生菌株QH0814的一个主要芳香烃氨基酸代谢基因aroA部分缺失后，使整个芳香基团的生化代谢途径被阻断。将aroA基因的上游、下游各1380bp的序列通过分子克隆技术克隆至pBluescriptIISK(+)载体上，通过酶切位点拼接在一起，构成重组所必需的上下游同源臂，并将ORF2基因的582bp的序列插入到上下同源臂之间。将含有插入基因ORF2基因的上下游同源臂片段转移至自杀性载体pRE112(徐引弟，郭爱珍，陈焕春.猪霍乱沙门氏菌C500株crp-/gfp+缺失株的构建及鉴定，农业生物技术学报，2008，16(2)：196-201)上。然后将有上下游同源臂自杀性载体通过结合转移至支气管败血波氏杆菌野生菌株QH0814中，通过自杀性载体pRE112上的氯霉素抗性基因和针对aroA基因的PCR方法来筛选同源臂和同源基因的第一次同源重组(单交换)。筛选所得单交换克隆通过对氯霉素抗性的消除和PCR验证来筛选aroA缺失的重组菌株(QH0814ΔaroA/ORF2)。本发明设计人将筛选所得的表达猪2型圆环病毒ORF2基因片段的重组菌株，于2011年3月24日已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2011093，保藏命名：支气管败血波氏杆菌Bordetella bronchisepticaQH0814ΔaroA/ORF2。本发明所述的该菌株缺失了支气管败血波氏杆菌对芳香族氨基酸代谢所必须的5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶aroA基因，并含有能在该菌株基因组中稳定表达的猪2型圆环病毒ORF2基因，该菌株具有针对猪2型圆环病毒和猪源支气管败血波氏杆菌的免疫保护力。本发明还包含应用所述一种表达猪2型圆环病毒ORF2基因片段的重组支气管败血波氏杆菌制备基因工程疫苗。本发明还包含所述的重组支气管败血波氏杆菌株QH0814ΔaroA/ORF2在制备猪2型圆环病毒和猪源支气管败血波氏杆菌病疫苗中的应用。

本发明通过大量的生物学实验数据证明本发明制备的重组菌株可用于制备针对猪2型圆环病毒和猪源支气管败血波氏杆菌的二价疫苗。

本发明的主要优点是：

1、本发明制备的基因工程菌株表达的猪2型圆环病毒ORF2基因片段为猪圆环病毒2型的免疫原性基因片段，具有良好的免疫保护性。使用滴鼻途径进行免疫操作方便，能刺激机体产生粘膜应答。因此，用本发明的基因工程菌株制成的疫苗具有广阔的市场应用前景。

2、本发明所用的材料为支气管败血波氏杆菌野生致病菌株QH0814，具有全部的毒力因子和其他免疫原性良好的抗原。因此，芳香烃氨基酸代谢途径中的重要基因aroA缺失后，获得的aroA缺失株毒力大大降低而其免疫原性未发生改变，可以保护多种异源波氏杆菌野毒菌株的攻击。

3、本发明制备的基因工程菌株可以同时提供针对猪2型圆环病毒和支气管败血波氏杆菌两种病原的保护。

4、本发明制备的基因工程菌株不含抗性标记，完全符合疫苗生物安全性要求。

附图说明

图1：是本发明制备的转移质粒pREΔaroA/0RF2的物理图谱。

图2：是本发明制备的转移质粒pREΔaroA/0RF2的酶切鉴定结果。图中M1：DNA marker(DL 2,000)；M2：DNA marker(DL 15,000)1-3：pREΔaroA/0RF2(KpnI和SacI)。

图3：是本发明制备的转移质粒pREΔaroA/0RF2构建的流程图。

图4：是本发明中的转移质粒整合至基因组后用引物A5/A6进行的PCR鉴定。

图中M：DNA Ladder(DL 2,000)；1-3：单交换子；4：亲本菌株QH0814；5：ddH₂O对照。

图5：是本发明中的转移质粒整合至基因组后用引物Cm1/Cm2进行的PCR鉴定。图中M：DNA Ladder(DL 8,000)；1-5：单交换子；6：质粒pRE112；7：ddH₂O对照。

图6：用引物A5/A6对本发明中的重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2进行的PCR鉴定。图中M：DNA Ladder(DL 2,000)；1-2：重组菌株；3：亲本菌株QH0814；4：质粒pREΔaroA/0RF2；5：单交换子；6：ddH₂O对照。

图7：用引物C1/C2对本发明中的重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2进行的PCR鉴定。图中M：DNALadder(DL 2,000)；1-2：重组菌株；3：PMD-PCV2基因组；4：质粒pREΔaroA/0RF2；5：ddH₂O对照。

图8：用引物Cm1/Cm2对本发明中的重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2进行的PCR鉴定。图中M：DNA Ladder(DL 2,000)；1-2：重组菌株；3：质粒pRE112；4：质粒pREΔaroA/0RF2；5：ddH₂O对照。

图9：用引物A5/A6对本发明中的重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2遗传稳定性进行PCR鉴定。图中M：DNA Ladder(DL 2,000)；1-7：分别为重组菌株的第1代、5代、10代、15代、20代、25代、30代；8：亲本菌株QH0814；9：ddH₂O对照；10：质粒pREΔaroA/0RF2。

图10：用引物C1/C2对本发明中的重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2遗传稳定性的PCR鉴定。图中M：DNA Ladder(DL 2,000)；1-7：分别为重组菌株的第1代、5代、10代、15代、20代、25代、30代；8：PMD-PCV2基因组；9：ddH₂O对照。

图11：是本发明中的重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2分泌表达ORF2基因的western-blot鉴定。图中M：蛋白Ladder；1-2：重组菌株；3：亲本菌株QH0814对照。

具体实施方式

以下结合说明书附图和实施例对本发明作进一步的说明，但不是限制本发明。

实施例1

1、引物设计和PCR扩增

根据已报道的支气管败血波氏杆菌RB50株全基因组序列(参照GenBank登录号为AF315119的基因序列)设计两对引物(所有引物由上海生工生物工程技术有限公司合成)分别扩aroA基因的上游同源臂和下游同源臂，扩增片段大小分别为1388bp和1383bp，上游臂两端分别设计KpnI和SalI酶切位点，下游臂两端分别设计HindIII和SacI酶切位点。根据已报道的猪圆环病毒2型WH株全基因组序列(参照GenBank登录号为FJ598044的基因序列)设计一对引物扩增ORF2基因，扩增片段大小为582bp，两端分别设计SalI和HindIII酶切位点。所述引物序列如下：

表1：PCR引物

2、支气管败血波氏杆菌aroA基因上下游同源臂和猪2型圆环病毒ORF2基因的克隆

将猪源支气管败血波氏杆菌QH0814株在改良的TSA(即胰蛋白大豆琼脂培养基，购自美国BD公司，以该培养基为基本成分，添加体积为10％的小牛血清)平板上培养24h，挑取单菌落接种于改良TSB(即胰蛋白大豆培养基，购自美国BD公司，以该培养基为基本成分，添加体积为10％的小牛血清)培养基中，37℃200r/min培养12h，按细菌基因组提取试剂盒说明书提取基因组为PCR模板。扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系如下：模板DNA2μL，10×PCR缓冲液5μL，10μmol/L上、下游引物各2μL，2mmol/L dNTPs 5μL，Ex Taq 0.5μL，DMSO 4μL，ddH₂O 29.5μL。扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃1min，58℃1min，72℃，1min30s。30个循环后，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增aroA基因上下游同源臂的2个片段大小分别为1388bp和1383bp，与预期大小相当。

以含PCV2WH株全基因组的重质粒pMD-PCV2(本实验室保存)为PCR模板扩增ORF2基因，扩增反应在50μL的体系中进行，反应体系如下：模板DNA 2μL，10×PCR缓冲液5μL，10μmol/L上、下游引物各2μL，2mmol/L dNTPs5μL，Ex Taq 0.5μL，ddH₂O 33.5μL。扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃1min，59℃1min，72℃，1min。30个循环后，72℃延伸10min。扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，扩增的片段大小为582bp，与预期大小相当。

将得到的目的基因克隆到pMD-18T载体(购自宝生物工程(大连)有限公司)，将重组质粒送宝生物工程(大连)有限公司进行外源基因序列的测定。

3、重组转移质粒pREΔaroA/ORF2的构建

用KpnI和Sal I(购自宝生物工程(大连)有限公司)双酶切pMD-aroA1，回收大小为1388bp的aroA上游同源臂PCR扩增产物，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pBluscriptSK(购自宝生物工程(大连)有限公司)。将酶切的aroA上游同源臂和质粒片段用T4DNA ligase(购自宝生物工程(大连)有限公司)连接(重组质粒命名为pSKaroA1)，16℃水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37℃培养，挑菌，然后将转化子转接扩大培养，将培养获得菌液用于小量制备质粒。用HindIII和SacI双酶切pMD-aroA2，回收大小为1383bp的aroA下游同源臂PCR扩增产物，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pSKaroA1。将酶切的下游同源臂和质粒片段用T4DNA ligase连接(重组质粒命名为pSKΔaroA)，16℃水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37℃培养，挑菌，然后将转化子转接扩大培养，将培养获得菌液用于小量制备质粒。用Sal I和HindIII双酶切pMD-ORF2，回收大小为582bp的ORF2基因PCR扩增产物，同时用相同的限制性内切酶酶切质粒pSKΔaroA。将酶切的ORF2基因片段和质粒片段用T4DNAligase连接(重组质粒命名为pSKΔaroA/ORF2)，16℃水浴过夜，转化DH5α感受态细菌，37℃培养，挑菌，然后将转化子转接扩大培养，将培养获得菌液用于小量制备质粒。

同时分别用KpnI和SacI酶切载体pRE112和重组质粒pSKΔaroA/ORF2。回收酶切过的上下游同源臂基因和载体pRE112，然后用T4DNAligase连接，16℃水浴过夜，转化想X7213感受态细菌，37℃培养，挑菌，然后将转化子转接扩大培养，将培养获得菌液用于小量制备质粒和KpnI和SacI双酶切鉴定。重组转移质粒pREΔaroA/ORF2的物理图谱见图1。鉴定结果证实构建的转移质粒pSKΔaroA/ORF2是正确的(见图2)，转移质粒pREΔaroA/ORF2构建流程如图3所示。

4、重组菌株的构建与鉴定

以转化了重组质粒pREΔaroA/ORF2的大肠杆菌X7213为供体，支气管败血波氏杆菌QH0814为受体进行接合转移。供体菌和受体菌分别在适合的琼脂平皿上培养过夜，然后用TSB洗两遍，调整菌浓度至OD600为0.8。各取100μL菌悬液混合，将无菌硝酸纤维滤膜贴于含2’6-二氨基庚二酸(DAP，购自Sigma公司)的TSA培养基上，并于37℃预温，然后将混合菌液滴于滤膜上，使之慢慢吸收。37℃接合4小时，同时做供体和受体对照。然后用TSB洗下滤膜上的支气管败血波氏杆菌，重悬后再用TSB洗两遍，涂布在含氯霉素(Cm，购自Sigma公司)的TSA培养基上，37℃培养过夜24小时。Cm抗性菌落进一步用PCR鉴定。PCR反应1(用引物A5/A6扩增)用来确定发生了第一次交换(见图4)，PCR反应2(用引物Cm1/Cm2扩增)来确定pRE112中的Cm表达盒的存在(见图5)，从而说明转移质粒已经整合到支气管败血波氏杆菌的染色体上了。质粒整合到染色体上后，aroA的前后臂将有两个拷贝，一个是缺失型，一个是野生型，因此用aroA全长引物可以扩增出两个片段，野生型是1329bp，缺失型是957bp(见图4)。

将单交换子在无NaCl的LB液体培养基(添加二羟基苯甲酸(DHB)、对氨基苯甲酸(PABA)、苯丙氨酸(Phe)、酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)，使终浓度均为40μg/mL)中传代培养，将每一代培养物倍比稀释后，选择合适的稀释度涂布于TSA平板，培养24h后，用牙签挑取单菌落分别影印到含有Cm抗性和不含Cm抗性的平板上。筛选出Cm敏感的克隆，然后用反应1、反应2和反应3(用引物C1/C2扩增)进行PCR鉴定，以确定发生了第二次交换。发生第二次同源重组，可以产生两种结果，一种是得到aroA缺失株，一种是回复野生型。正确的aroA缺失株用A5/A6只能扩增出957bp的片段(见图6)，用C1/C2能扩增出ORF2基因的582bp(见图7)，并用Cm1和Cm2无法扩增出Cm基因盒(见图8)。将A5/A6扩增得到的片段送上海生工测序，测序证明缺失菌株缺失了目的片段aroA基因，并将ORF2基因插入到了基因组中。

5、表达ORF2基因片段的重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2的生物学特性及鉴定

(1)重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2的表达特性分析

挑取重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2的单菌落在TSB液体培养基中，37℃、200r/min培养12h，按1∶100转接TSB培养基再培养至OD值为0.5，取1ml菌液8000r/min离心5min收集菌体。将菌体加适量去离子水重悬后，取50μL加等体积的2×SDS-PAGE凝胶加样缓冲液，100℃煮沸裂解10min，冰浴5min，进行聚丙稀酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，黄培堂等译.萨姆布鲁克J，拉塞尔D W著.分子克隆实验指南(第三版).北京：科学出版社，2002)。电泳结束后转膜，以猪2型圆环病毒ORF2制备的小鼠单抗为一抗，以羊抗鼠HRP-IgG为二抗，进行Western-blot分析(黄培堂等译.萨姆布鲁克J，拉塞尔D W著.分子克隆实验指南(第三版).北京：科学出版社，2002)。结果表明QH0814ΔaroA/ORF2能分泌表达大小为26kDa的蛋白(见图11)。

(2)重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2的培养特性分析

分别挑取重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2和野生菌株QH0814的单菌落划线接种改良BG绵羊血平板，然后分别转接枸橼酸盐、硝酸盐、尿素、触酶、氧化酶、MR、VP、乳糖、葡萄糖、吲哚及H₂S等生化鉴定管进行生化反应。结果表明将重组菌株划线接种改良BG绵羊血平板后能产生明显的β溶血。生化反应鉴定结果显示，QH0814ΔaroA/ORF2的生化特性与亲本菌株QH0814相同，没有发生改变，两者都不能利用乳糖和葡萄糖，硝酸盐、枸橼酸盐、尿素、触酶、氧化酶反应呈阳性，甲基红、吲哚反应呈阴性。

(3)重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2的遗传稳定性分析

将得到的重组菌株在TSA培养基上连续传代30代，每隔5代取单菌落分别用引物A5/A6和C1/C2进行PCR验证。结果显示缺失株传代后用引物A5/A6都能扩增957bp的片段(见图9)，用引物C1/C2都能扩增582bp的片段(见图10)，表明重组菌株能稳定遗传。

(4)重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2的生长特性分析

分别挑取重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2和野生菌株QH0814的单菌落，接种于TSB培养基中37℃震荡培养20h。第二天以1∶1000的稀释度转接至TSB培养基中。37℃摇床200r/min震荡培养28h，每隔2小时取样测OD600值并活菌计数，绘制其生长曲线。结果显示QH0814ΔaroA/ORF2的生长速度明显慢于亲本株QH0814，亲本菌6～20h左右进入对数生长期，重组菌株8～24h左右进入对数生长期。

6、QH0814ΔaroA/ORF2重组疫苗的制备

将获得的重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2进行鉴定，每代接种于aromix改良的TSB培养基上，利用引物A5/A6和C1/C2进行PCR检测鉴定重组细菌的遗传稳定性，经30次传代后发现仍然能扩增出大小为957bp左右和582bp的片段，其遗传性能稳定。通过Western-blotting检测发现，cap蛋白可以在重组菌株中稳定表达，并具有良好的免疫学反应原性。将该重组菌株先在aromix改良的TSA固体培养基上培养，然后挑取单菌落于aromix改良的TSB液体培养基上培养，直到活细菌浓度达到2×10¹⁰CFU/mL，将重组菌株的菌液与明胶保护剂按体积比为7∶1的比例加入明胶保护剂(该明胶保护剂的配制方法是：每100mL去离子水中加蔗糖40g，明胶8g，充分融化后，置121℃下灭菌30min后保存备用)，于灭菌冻干瓶中按2.0mL/瓶分装，置-50℃冷冻干燥机中冻干，冻干36-40h后压盖，复苏后确定没有杂菌污染，置-20℃保存备用，作为研制重组疫苗的疫苗菌株。

7、重组菌株对小鼠的致病力及LD₅₀测定

为评价重组菌株对小鼠的致病力，分别将重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2、亲本菌株QH0814接种于含10％脱纤绵羊血改良BG绵羊血培养基，在潮湿空气中培养48h后，用无菌PBS洗脱，调整至合适菌液浓度，将菌液3倍稀释，每个稀释度采用滴鼻方式接种用乙醚麻醉的4周龄Balb/C雌鼠，连续观察14天，记录小鼠死亡情况。死亡小鼠肺脏无菌接种TSA平板回收细菌分离鉴定，用鉴定支气管波氏杆菌的特异性引物扩增鉴定，均能够扩增出预期237bp的特异性条带，表明小鼠是因感染Bb而死亡的。根据寇氏(Korbor)法计算小鼠半数致死剂量(LD₅₀)，计算的公式为：logLD₅₀＝X_m-d(∑P-0.5)公式中：X_m为最大剂量对数，d为相邻剂量比值对数，p为各组的死亡率(死亡率以小数表示)，∑P为各组死亡率的组合。评价重组菌株与亲本菌株相比毒力是否减弱以及对小鼠是否安全。结果表明QH0814ΔaroA/ORF2比QH0814毒力降低了约8倍，说明重组菌株的毒力明显降低(见表2)。

表2：不同Bb菌株对小鼠的毒力试验

8、重组菌株对小鼠的免疫效力试验

将20只4周龄Balb/c雌小鼠随机分为2组，每组10只。第一组用50μL含有1×10⁵CFU的重组菌株进行滴鼻免疫，第二组为PBS空白对照组。间隔14d加强免疫，分别于第14d、28d、35d由尾静脉采血，用间接ELISA法检测免疫组小鼠的抗体水平。

挑取波氏杆菌单菌落培养过夜，以1∶100转接培养8h，离心收集菌体，1×PBS洗2次，以1∶100倍浓缩重悬于1×PBS，置于冰上超声破碎处理至清亮，12000r/min离心10min，弃去细胞碎片。上清用分光光度计测定蛋白浓度，每管500μL分装，-20℃冻存备用，用来作为波氏杆菌ELISA抗原。将波氏杆菌抗原按100ng/孔的包被浓度包被酶联板(100μL/孔)，于37℃温育1h后放置于4℃过夜，取出用洗涤液洗涤3次，每次3min，然后每孔加入100μl封闭液，37℃封闭1h。然后将待检血清按确定的稀释倍数稀释后加入酶联板，100μl/孔于37℃反应30min，洗涤3次，加入1∶5，000羊抗猪IgG-HRP(用封闭液稀释)100μL/孔，37℃反应30min，经洗涤后加入TMB底物100μL，反应10min，最后加入50μL 0.25％HF终止反应，用酶标仪在630nm波长下测定OD值，检测免疫小鼠血清中抗Bb抗体水平。

免疫小鼠血清中抗cap蛋白抗体水平使用武汉科前动物生物制品有限责任公司生产的猪圆环病毒2型ELISA抗体检测试剂盒进行检测。(阴阳性临界值为OD630＜0.4为阴性，OD630＞0.4为阳性)

结果表明重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2免疫组的小鼠能产生抗Bb抗体和抗猪2型圆环病毒cap蛋白抗体(见表3)。

表3：本发明制备的重组菌疫苗免疫小鼠血清中抗体检测(ELISA法)

9、重组菌株在小鼠的呼吸道定殖能力试验

为评价重组菌株与野生株在小鼠呼吸道的定殖能力，将63只4周龄Balb/C小鼠随机分为3组，每组21只。第1组滴鼻感染50uL含有1×10⁶CFU的重组菌株，第2组和第3组滴鼻感染相同剂量的QH0814ΔaroA单缺失株(本菌株由本实验室构建，已经申请专利，申请号为200910062245.6，发明创造名称为一种支气管败血波氏杆菌基因缺失疫苗及应用)和QH0814，分别在感染后的第0、3、7、14、21、28和35天，每组解剖3只小鼠，分别取鼻腔、气管、肺脏进行匀浆后，选取合适稀释倍数，均匀涂布于含有链霉素(20ug/mL)的TSA平板上，进行计数，比较重组菌株与单缺失菌株QH0814ΔaroA和亲本菌株QH0814在小鼠呼吸道不同器官的定殖效力，检测外源基因ORF2基因的插入对菌株的定殖能力是否产生影响。

结果显示：重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2与单缺失菌株QH0814ΔaroA在鼻腔、气管和肺脏中的定殖持续时间分别为28天、21天和14天；而亲本株QH0814在肺脏定殖时间持续到第28天，到第35天其鼻腔和气管还有细菌定殖。表明重组菌株和单缺失菌株在小鼠呼吸道的定殖能力与亲本株相比大大降低，并且外源基因的插入对菌株的定殖能力没有产生影响，机体清除细菌的速度在下呼吸道(肺脏)比在上呼吸道(气管、鼻腔)要快(见表4、表5、表6)。

表4：不同菌株在小鼠肺脏的定殖能力

表5：不同菌株在小鼠气管的定殖能力

表6：不同菌株在小鼠鼻腔的定殖能力

Claims (3)

1.一种表达猪2型圆环病毒ORF2基因片段的重组支气管败血波氏杆菌株，其特征在于：该菌株于2011年3月24日已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号：CCTCC NO：M2011093，保藏命名：支气管败血波氏杆菌（Bordetella bronchiseptica）QH0814ΔaroA/ORF2。 

2.权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO：M2011093的重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2制备的针对猪2型圆环病毒和猪源支气管败血波氏杆菌的疫苗。 

3.权利要求1所述的保藏号为CCTCC NO：M2011093的重组菌株QH0814ΔaroA/ORF2在制备针对猪2型圆环病毒和猪源支气管败血波氏杆菌的疫苗中的用途。 

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