CN114751978A - 一种猪轮状病毒特异性阳性血清及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明针对兽用生物制品标准物质短缺问题，提供了一种猪轮状病毒特异性阳性血清及其制备方法，通过该方法制备的阳性血清中和效价高，能解决目前兽用生物制品外源病毒检验时猪轮状病毒活疫苗中和不完全的问题；且纯净性好，不含有其他猪常见病原；特异性好，不含有除猪轮状病毒抗体外的其他猪常见病原抗体，能够解决长期困扰猪轮状病毒活疫苗单苗以及联苗的质量控制的瓶颈问题。此外，猪轮状病毒阳性血清是目前主要应用于鉴别、检验、诊断的蛋白类物质，在清除细菌和病毒中起着重要的作用，对于兽用生物制品行业的健康发展具有重要意义。

Description

一种猪轮状病毒特异性阳性血清及其制备方法
技术领域
本发明属于兽医生物技术和动物病毒学领域，具体涉及一种猪轮状病毒特异性阳性血清及其制备方法。
背景技术
猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)为无囊膜的双链RNA病毒，属于呼肠孤病毒科 (Reoviridae)轮状病毒属(Rotavirus)。猪轮状病毒感染引起的仔猪病毒性腹泻主要症状为仔猪呕吐、厌食、脱水、腹泻和死亡等。由猪轮状病毒所引起的感染无论是单独感染或者混合感染在猪群中均普遍存在，由此造成仔猪的发病甚至死亡给猪养殖业造成了巨大的经济损失。尤其近两年来，全国各地规模化猪场轮状病毒检出率直线上升，与猪流行腹泻病毒混合感染，给国内的养猪业带来了巨大的经济损失。
目前没有特效的药物用来治疗由猪轮状病毒感染引起的疾病，因此做好对猪轮状病毒感染的预防尤为重要，接种疫苗能够对于猪轮状病毒的防控具有十分重要的意义。目前，猪轮状病毒活疫苗以联苗的形式应用广泛，在兽用生物制品制造的过程中，需要采用多种生物性原材料，如血清、胰酶和细胞等，这些材料很容易受到外源因子的污染，且这些外源因子的不确定性也给检验带来了极大的困难。目前按照现行《中国兽药典》的规定，猪轮状病毒活疫苗单苗以及联苗均需要进行外源病毒检验。检验时需采用特异性血清对疫苗毒进行中和，检验过程中低效价的猪轮状病毒血清不能完全中和疫苗毒以及种毒，严重影响产品的质量检验。
目前还未有猪轮状病毒相关阳性血清制备方法的相关报道。现有技术仅公布了一种猪繁殖与呼吸综合征病毒阳性血清及其制备方法(申请号为202011029500.X)。
发明内容
本发明针对兽用生物制品标准物质短缺问题，提供了一种猪轮状病毒特异性阳性血清的制备方法，通过该方法制备的阳性血清中和效价高，能解决目前兽用生物制品外源病毒检验时猪轮状病毒活疫苗中和不完全的问题；且纯净性好，不含有其他猪常见病原；特异性好，不含有除猪轮状病毒抗体外的其他猪常见病原抗体，能够解决长期困扰猪轮状病毒活疫苗单苗以及联苗的质量控制的瓶颈问题。此外，猪轮状病毒阳性血清是目前主要应用于鉴别、检验、诊断的蛋白类物质，在清除细菌和病毒中起着重要的作用，对于兽用生物制品行业的健康发展具有重要意义。
本发明的技术方案是：一种猪轮状病毒特异性阳性血清的制备方法，包括以下步骤：
(1)选用满足条件的兔：体重2.25-3.5kg，符合国家规定的清洁级实验动物，且其不带有病原体及其抗体，病原体包括杂菌、支原体、牛病毒性腹泻病毒、猪流行腹泻病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒中的任一种或多种的组合；
(2)免疫原制备：制备猪轮状病毒的病毒液，取上清液经无菌检验、无支原体检验、鉴别检验和外源病毒检验合格，且病毒含量不低于107.5TCID50/mL作为活免疫原；
将活免疫抗原，作为灭活免疫原；
(3)免疫接种：分别对每只兔进行5次免疫接种：
第一次免疫接种：对每只兔颈部肌肉注射按1：1混合的2ml的活免疫原和弗氏完全佐剂；
中间4次免疫接种：第一次免疫接种后每隔14天分别对每只兔进行颈部肌肉注射按1： 1混合的2ml的灭活免疫原和弗氏不完全佐剂；
(4)采集兔血清:最后一次免疫接种后7-10天采集兔血清检测血清中猪轮状病毒的中和抗体效价和猪轮状病毒抗原，确认兔血清为猪轮状病毒抗体阳性且细胞中和抗体效价在1：256 以上，即得猪轮状病毒特异性阳性血清。
优选地，猪轮状病毒的病毒液的制备步骤为：将猪轮状病毒按0.05～0.1MOI的剂量接种长满单层的MA104细胞，37℃、5％CO2培养箱中培养48小时，当CPE达80％或以上时收获病毒液，经冻融三次后，离心去除细胞碎片。
优选地，将活免疫抗原灭活包括：在活免疫原中加入BEI，混合均匀后，37℃灭活，加入Na2S2O3溶液过滤除菌，置2-8℃保存。
进一步地，所述将活免疫抗原灭活包括：在活免疫抗原中加入浓度为0.5mol/L的BEI 至浓度为0.005mol/L，混合均匀后，37℃灭活30小时，灭活终止后，加入浓度为1.0mol/L 的Na2S2O3溶液至终浓度为0.005mol/L，进行过滤除菌，置2-8℃保存，作为灭活免疫原。
由上述方法制备的一种猪轮状病毒特异性阳性血清的效价在1：320以上。
进一步地，所述猪轮状病毒为保藏编号为CCTCC NO：V202222的猪轮状病毒PoRVKQ06 株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2022年3月20日，该KQ06株的VP4基因序列如SEQ ID NO：4所示，KQ06 株的VP7基因序列如SEQ ID NO：3所示。
进一步地，所述猪轮状病毒为保藏编号为CCTCC NO：V202221，的猪轮状病毒PoRVHN01 株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2022年3月20日，该HN01株的VP4基因序列如SEQ ID NO：6所示，HN01 株的VP7基因序列如SEQ ID NO：5所示。
进一步地，所述猪轮状病毒为保藏编号为CCTCC NO：V202191，的猪轮状病毒PoRVCH09 株，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期：2021年12月15日，该CH09株的VP4基因序列如SEQ ID NO：2所示，CH09 株的VP7基因序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的有益效果：
1.本发明所制备的猪轮状病毒阳性血清中和效价高，能解决目前兽用生物制品外源病毒检验时猪轮状病毒活疫苗中和不完全的问题。
2.本发明所制备的猪轮状病毒阳性血清纯净性好，不含有其他猪常见病原。
3.本发明所制备的猪轮状病毒阳性血清特异性好，不含有除猪轮状病毒抗体外的其他猪常见病原抗体，能够解决长期困扰猪轮状病毒活疫苗单苗以及联苗的质量控制的瓶颈问题。
4.本发明采取实验兔进行阳性血清的制备，减小了用猪制备阳性血清因同源动物而引起的同源其他外源病毒污染的风险。
本发明提供了一种针对猪轮状病毒高效价、成分单一、纯净性良好的特异性阳性血清的制备工艺，该工艺制备的阳性血清充分满足了外源病毒检验对检验试剂的要求，能够解决猪轮状病毒活疫苗质量控制的瓶颈问题。此外，猪轮状病毒阳性血清是目前主要应用于鉴别、检验、诊断的蛋白类物质，对于兽用生物制品行业的健康发展具有重要意义。
附图说明
图1为本发明制备的猪轮状病毒特异性阳性血清加入猪轮状病毒液后的CPE检测结果；
图2为本发明制备的猪轮状病毒特异性阳性血清和不同毒种中和后的荧光检测结果；
图3为本发明制备的猪轮状病毒特异性阳性血清和不同毒种中和后的荧光检测结果；
图4为本发明使用不同灭活剂灭活猪轮状病毒后的电镜对比图；
图5为三株分离毒株VP7基因核苷酸进化树分析结果图；
图6为三株分离毒株VP4基因核苷酸进化树分析结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。
首先对本发明所设计的术语解释如下：
“弗氏不完全佐剂”是油剂(液体石蜡或植物油)与乳化剂(羊毛脂或叶吐温80)混合而成油包水乳浊液，组分比为1～5:1,可根据需要而定，通常为2:1。用于初次免疫刺激。为了减少副作用，不含结核分枝杆菌(如死卡苗)成分的弗氏不完全佐剂用于加强免疫。
“弗氏完全佐剂”是一种油包水的乳浊液，含结核分枝杆菌的细胞壁成分。不完全佐剂中加卡介苗(最终浓度为2～20mg/ml)或死的结核分枝杆菌，即为完全弗氏佐剂(FCA)。佐剂活性来自于油滴中免疫原的持续释放，并刺激局部免疫反应。一般首次注射时用1/2体积FCA。第二次或第三次注射时用不完全佐剂或不用佐剂。如不加佐剂，则抗原量增大10～20倍。
实施例1
(一)猪轮状病毒抗原灭活工艺的研究
选取甲醛和BEI两种灭活剂对猪轮状病毒CH09株(猪轮状病毒疫苗生产毒株，保藏在 CCTCC-中国典型培养物保藏中心，中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：V202191，名称猪轮状病毒PoRV CH09株)进行灭活试验。G9型CH09株的VP4基因序列如SEQ ID NO：2所示，CH09株的VP7基因序列如SEQ ID NO：1所示，CH09株处于G9基因型分支，CH09株与P[23]基因型参考毒株处于同一分支，属于P[23]基因型。通过3个不同终浓度的甲醛对病毒液进行 4个不同时间的灭活来筛选合适的灭活条件。将40％的甲醛溶液缓慢加入到活病毒液中，使甲醛溶液终浓度分别为0.1％、0.3％和0.4％，充分混匀，置37℃分别于灭活后12、18、24 和30小时结束灭活并分别取样，经无菌检验合格后灭活检验，检验结果如表1所示。此外，通过3个不同终浓度的BEI对病毒液进行4个不同时间的灭活来筛选合适的灭活条件。取 1mol/L的BEA和1.0mol/L的NaOH等体积混合，置37℃下水浴，每隔10分钟振摇1次， 1小时后终止环化，即为0.5mol/L的BEI(二乙烯亚胺)。向纯化抗原中加入浓度为0.5mol/L 的BEI至终浓度为0.00125mol/L、0.0025mol/L和0.005mol/L，混合均匀置37℃，分别于灭活后18、24、30、36小时后加入过滤除菌的1.0mol/LNa2S2O3溶液终止灭活(终浓度为 5mmol/L)，并分别取样，经无菌检验合格后进行灭活检验，检验结果如表2所示。终浓度为0.1％甲醛溶液37℃灭活30小时、0.3％甲醛溶液37℃灭活24小时或终浓度为0.4％甲醛溶液37℃灭活18小时，终浓度为0.0025mol/L BEI 37℃灭活36小时或终浓度为0.005mol/L BEI 37℃灭活24小时，均可将PoRV G9-WH01株纯化抗原液完全灭活。
表1 不同浓度不同时间甲醛灭活猪轮状病毒CH09株抗原检验结果
Figure RE-GDA0003697047580000031
表2 不同浓度不同时间BEI灭活猪轮状病毒CH09株纯化抗原检验结果
Figure RE-GDA0003697047580000041
采用蔗糖密度梯度离心的方法对终浓度为0.4％甲醛溶液37℃灭活18小时的抗原和终浓度为0.005mol/L BEI 37℃灭活24小时的抗原，分别进行超速离心纯化，负染后进行电镜观察。结果见图4。
对于轮状病毒来说，BEI灭活的抗原病毒粒子的完整性更好，其四周呈放射状排列的棒状突起脱落较少或不明显；甲醛溶液灭活的抗原多数病毒粒子不完整，棒状突起脱落较多。故选用BEI进行灭活。
为保证猪轮状病毒CH09株的灭活效果和免疫原性，确定猪轮状病毒G9-WH01株抗原的灭活工艺为：纯化抗原中加入0.5mol/L的BEI溶液，使其终浓度为0.005mol/L，混合均匀置37℃灭活24小时，后加入过滤除菌的1.0mol/LNa2S2O3溶液(终浓度0.005mol/L)终止灭活，充分混合均匀后置2～8℃保存。
(二)、阳性血清的制备
1.免疫原的制备
将猪轮状病毒(猪轮状病毒疫苗生产毒株，保藏在CCTCC-中国典型培养物保藏中心，中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：V202191，名称猪轮状病毒PoRV CH09株；或经过严格鉴定猪轮状病毒分离毒株均可以作为阳性血清制备毒株)按照0.05-0.1MOI的剂量接种长满单层的MA104细胞(MA104细胞已证实对猪轮状病毒敏感且纯净无污染)，置于37℃、5％CO2培养箱中培养48小时左右，出现典型的细胞病变(CPE)且CPE达80％以上，此时收获病毒。将收获的病毒冻融三次，5000r/min离心20分钟去除细胞碎片，取上清液，经无菌检验、无支原体检验、鉴别检验和外源病毒检验合格，且经TCID50检测病毒含量不低于 107.5TCID50/ml，置-70℃以下保存，作为活免疫原。
取1.0mol/L的BEA和1.0mol/L的NaOH等体积混合，置37℃下水浴，每隔10分钟振摇1次，1小时后终止环化，即为0.5mol/L的BEI(二乙烯亚胺)。
在抗原中加入浓度为0.5mol/L的BEI至浓度为0.005mol/L，混合均匀后，37℃灭活30 小时。灭活终止时，立即在灭活病毒液中加入过滤除菌的1.0mol/L Na2S2O3溶液，使其终浓度为0.005mol/L，置2-8℃保存，作为灭活免疫原。
2.动物的选择
选择2.25-3.5kg的家兔(家兔为符合国家规定的清洁级实验动物)，耳缘静脉采血析出血清进行相关抗体的检测。具体检测内容、方法及结果见表2。
表2
Figure RE-GDA0003697047580000042
Figure RE-GDA0003697047580000051
3.免疫及抗体水平监测
①免疫动物及免疫程序
免疫程序分两组平行实验，每组5只家兔。
组1：
取制备好的活免疫原(猪轮状病毒活毒)，1ml/只对兔子进行首免(基础免疫)，每只兔子颈部肌肉注射猪轮状病毒活毒进行基础免疫。基础免疫14天后再对每只兔子颈部肌肉注射猪轮状病毒灭活抗原进行免疫，免疫剂量为1ml/只，而后每隔14天进行一次免疫(猪轮状病毒灭活抗原)，最后一次免疫加大剂量，免疫剂量为2ml/只。共计免疫4次，具体免疫程序见表3。
表3
Figure RE-GDA0003697047580000052
组2：
取制备好的免疫原(猪轮状病毒活毒和弗氏完全佐剂按1：1混合)，2ml/只对兔子进行首免(基础免疫)，每只兔子颈部肌肉注射猪轮状病毒抗原(猪轮状病毒活毒和弗氏完全佐剂按1： 1混合)进行基础免疫。基础免疫14天后再对每只兔子颈部肌肉注射猪轮状病毒灭活免疫原 (灭活免疫原和弗氏不完全佐剂按1：1混合)进行免疫，免疫剂量为2ml/只，而后每隔14天进行一次免疫(猪轮状病毒灭活抗原和弗氏不完全佐剂按1：1混合)，共计免疫5次，具体免疫程序见表4。
表4
Figure RE-GDA0003697047580000053
②抗体水平监测及方法
自第三次免疫后，每次免疫后7天通过耳缘静脉采血检测血清中猪轮状病毒的中和抗体效价和猪轮状病毒抗原。
将MA104细胞接种于96孔细胞培养板，待细胞长满单层时进行试验。在空白的96孔细胞培养板中每孔加入50μl无血清的DMEM培养基，随后将待检测的血清从1：4开始作连续倍比稀释，每个样品4个重复。用无血清的DMEM培养基将已测好TCID50的PoRV JS01 株病毒液稀释为100μl含5000个TCID50病毒液，同时设置5000TCID50/50μl、500TCID50/50μl、50TCID50/50μl、5TCID50/50μl和0.5TCID50/50μl 5个不同病毒含量的病毒对照。将稀释好的病毒液加入到血清稀释孔中，每孔50μl，置37℃、含5％CO2的培养箱中作用1小时。用无血清DMEM培养液将96孔板中已长满单层的MA104细胞洗2次，将感作完成的各血清病毒混合物接种到细胞孔中，每孔100μl。置37℃、含5％CO2的培养箱中吸附2小时。2小时后吸弃接种物，无血清DMEM培养液洗细胞单层2次，加入含5μg/ml胰酶的无血清DMEM 培养基，每孔100μl，37℃含5％CO2的培养箱继续培养。在上述96孔细胞培养板中设置8 孔细胞对照，每孔加入100μl含5μg/ml胰酶的无血清DMEM培养基。每日观察并记录细胞病变(CPE)情况，连续观察3日。血清毒性对照孔、正常细胞对照孔的细胞均应正常，病毒对照中5000TCID50、500TCID50以及50TCID50应全部孔出现细胞病变、5TCID50应有0～3个孔出现细胞病变、0.5TCID50应全部孔不出现细胞病变，按Reed-Muench法计算被检血清中PoRV 中和抗体的效价。
组1中第三次免疫后采血测定，中和效价仅能达到1:64，第四次加强免疫后最终抗体效价为1:128。
组2中第三次免疫后采血测定，中和效价即可达到1:128，通过5次免疫后最终抗体均超过1:512。
具体PoRV检测使用间接免疫荧光试验方法，将培养3日的细胞吸弃上清，加入预冷的无水乙醇溶液200μl，2～8℃固定30分钟；弃固定液，PBS洗3次，加入5％BSA 37℃封闭 1小时；弃封闭液加入抗PoRV VP6单克隆抗体37℃孵育1小时；弃一抗，PBS洗3次，加入AlexaFluor 488标记的羊抗鼠二抗37℃孵育1小时；弃二抗，PBS洗3次，加入100μl PBS 在荧光显微镜下观察。
4.血清采集与分离
最后一次免疫后7-10天耳缘静脉采血测定中和抗体效价，当抗体水平达到要求后(高于 1:256)，采用颈动脉放血法进行血清采集，最大程度保证无菌操作。使用的容器以及工具器械均需灭菌处理。
具体操作为：将兔进行仰卧保定后，将颈部毛剪干净，用碘酊消毒后再用75％酒精脱碘。局部消毒后，在靠近气管的一侧切开皮肤，钝性分离皮下组织与肌肉，找到强烈波动的颈动脉，轻轻用手指勾出并小心将其与颈静脉和迷走神经分开，剥离动脉外的结缔组织，将颈动脉的两端用止血钳夹住。用小手术剪在两止血钳之间的动脉上作一小切口，将一次性无菌软管一端插入动脉腔内并固定，另一端插入无菌的采血容器中，松开近血端的止血钳让血液流入采血容器中。待采血到兔失去挣扎能力时，按压其心脏部位以增加出血量。每只兔子采血时均需要更换器材和容器。
采血完毕后将采血容器密封好，置37℃条件下静置30min～1h。而后转入2-8℃过夜。第二天再无菌室II级生物安全柜内分离血清后，5000r/min离心30分钟，取上清。将分离的血清置于56℃水浴灭活30min，经0.22μm滤膜过滤后保存备用。
5.血清分装冻干保存
将上述分离灭活过滤后的血清加入终浓度为10％的海藻糖(冻干保护剂)，在无菌的条件下定量分装至安剖瓶中，2ml/瓶，冻干后抽真空封口置于-70℃以下保存。
6.特异性血清的检验
①血清的物理性状检验
随机选取1支冻干血清，按照《中国兽药典》方法检测其物理性状，血清冻干前应为微黄色或略带棕红色的透明液体，冻干后应为微黄色或红色疏松团块。
②无菌和支原体检验和真空度测定
随机选取1支冻干血清，按照《中国兽药典》方法进行无菌检验、支原体检验和真空度测定。结果显示均无菌生长与支原体生长，真空度检验均合格。
③剩余水分的测定
随机选取5支冻干血清，按照《中国兽药典》方法进行剩余水分的测定，5份样品的剩余水分含量分别为1.5％、1.4％、1.2％、1.1％和1.6％，均小于4.0％，检验合格。
⑥外源病毒检验
随机选取5支冻干血清，按照《中国兽药典》方法进行外源检测，结果显示无外源病毒污染，血清病毒血症检测均为阴性。
(三)、本发明制备的阳性血清中和能力试验
1.血清中和抗体效价的测定
随机抽取8支冻干血清，复溶后56℃灭活30min，1：4开始作连续2倍倍比稀释，每个样品4个重复。用无血清的DMEM培养基将已测好TCID50的PoRV JS01株病毒液稀释为 100μl含5000个TCID50病毒液，同时设置5000TCID50/50μl、500TCID50/50μl、50TCID50/50μl、5TCID50/50μl和0.5TCID50/50μl 5个不同病毒含量的病毒对照。将稀释好的病毒液加入到血清稀释孔中，每孔50μl，置37℃、含5％CO2的培养箱中作用1小时。用无血清DMEM培养液将96孔板中已长满单层的MA104细胞洗2次，将感作完成的各血清病毒混合物接种到细胞孔中，每孔100μl。置37℃、含5％CO2的培养箱中吸附2小时。2小时后吸弃接种物，无血清DMEM培养液洗细胞单层2次，加入含5μg/ml胰酶的无血清DMEM培养基，每孔100μl， 37℃含5％CO2的培养箱继续培养。在上述96孔细胞培养板中设置8孔细胞对照，每孔加入 100μl含5μg/ml胰酶的无血清DMEM培养基。每日观察并记录细胞病变(CPE)情况，连续观察3日。血清毒性对照孔、正常细胞对照孔的细胞均应正常，病毒对照中5000TCID50、500TCID50以及50TCID50应全部孔出现细胞病变、5TCID50应有0～3个孔出现细胞病变、0.5TCID50应全部孔不出现细胞病变，结果参考附图1，按Reed-Muench法计算被检血清中PoRV中和抗体的效价。中和抗体水平检测结果显示，中和抗体效价均大于1:320。
2.血清特异性检验
分别将PoRV、PEDV、TGEV、PDCoV、PPV、BVDV、PCV2毒株稀释成5000TCID50/0.1ml 的病毒液。病毒中和组取0.5ml病毒液与0.5ml的家兔血清混合；同时设立病毒对照组和细胞对照组。病毒对照组为0.5ml病毒液与0.5ml无血清DMEM培养基混合液；细胞对照组为0.5ml家兔血清与0.5ml无血清DMEM培养基混合液；以上3个试验组均置37℃作用1小时。将24孔培养板上生长的单层MA104细胞用无血清DMEM培养基洗涤3次，然后将作用后的3种混合液各接种4孔，每孔200μl，37℃、含5％CO2培养箱中吸附1小时，吸弃接种液，用无血清DMEM培养基洗涤3次，每孔加入1.0ml病毒培养基，置37℃、含5％CO2培养箱中继续培养。PEDV、TGEV和PDCoV试验组连续观察3日，每日观察细胞病变；PoRV、PPV、 PCV2和BVDV试验组培养3日后采用间接免疫法进行检测。结果显示，血清可以与PoRV中和，而不能中和PEDV、TGEV、PDCoV、PPV、BVDV和PCV2，特异性良好，结果参考附图2 与附图3。
(四)阳性血清在猪轮状病毒活疫苗外源病毒检验中的应用
选取制备好的阳性血清稀释成中和效价为1:32与本公司制备的3批猪轮状病毒活疫苗 (JS01株)进行外源病毒检验试验。按照《中国兽药典》方法取1头份疫苗与制备的阳性血清进行中和，进行外源病毒检验，结果显示，所有批次均未出现中和不完全的现象，且未出现阳性血清造成的细胞毒性。
实施例2
选取BEI灭活剂对猪轮状病毒KQ06株(猪轮状病毒疫苗生产毒株，保藏在CCTCC-中国典型培养物保藏中心，中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：V202222，名称猪轮状病毒PoRVKQ06 株)和HN01株(猪轮状病毒疫苗生产毒株，保藏在CCTCC-中国典型培养物保藏中心，中国武汉，保藏编号为CCTCC NO：V202221，名称猪轮状病毒PoRV HN01株)进行灭活试验。G5型KQ06株的VP4基因序列如SEQ ID NO：4所示，KQ06株的VP7基因序列如SEQ ID NO：3所示，KQ06株处于G5基因型分支。G4型HN01株的VP4基因序列如SEQ ID NO：6所示，HN01 株的VP7基因序列如SEQ ID NO：5所示。用DNAStar和MEGA7.0分析国内外多株不同地方 PoRV分离株VP7和VP4基因并制作其遗传进化树(图5和图6)。KQ06株与P[23]基因型参考毒株处于同一分支，属于P[23]基因型。HN01株与P[23]基因型参考毒株处于同一分支，属于P[23]基因型。
抗猪轮状病毒特异性血清制备
选择3～4kg家兔，第1次免疫用灭活的猪轮状病毒G4-HN01和G5-KQ06株病毒液皮下多点注射，免疫剂量为2.0ml(灭活前107.5TCID50/ml，与弗氏完全佐剂乳化)；第2次免疫用灭活的猪轮状病毒G4-HN01和G5-KQ06株病毒液皮下多点注射，免疫剂量为2.0ml(灭活前107.5TCID50/ml，与弗氏不完全佐剂乳化)；第3次免疫用灭活的猪轮状病毒G4-HN01和G5-KQ06 株病毒液皮下多点注射，免疫剂量为2.0ml(灭活前107.5TCID50/ml，与弗氏不完全佐剂乳化)，第4次免疫用灭活的猪轮状病毒G4-HN01和G5-KQ06株病毒液皮下多点注射，免疫剂量为 3.0ml(灭活前107.5TCID50/ml，与弗氏不完全佐剂乳化)，共免疫4次，每次间隔14日。第4 次免疫后14日无菌采血，分离血清，56℃灭活30分钟，0.22μm滤膜过滤后分装，置-70℃以下保存，或冻干后置-70℃以下保存。
抗体检测法
用3～5日龄健康易感仔猪20头，分为免疫组和空白对照组，每组5头。免疫组每头各经颈部肌肉注射猪轮状病毒G4/G5/G9型三价疫苗1.0ml，免疫后21日，连同条件相同的对照组，采血分离血清，用稀释至中和抗体效价为1：32的猪轮状病毒G4/G5/G9型特异性血清进行中和后分别检测血清中的PoRV G4/G5/G9型的中和抗体。如表5试验结果显示 G4\G5\G9型三价灭活疫苗免疫仔猪21日后，仔猪均能产生针对不同PORV基因型的高水平中和抗体，其中三个实验批次的PoRV G4型中和抗体平均值分别为106.8±19.5、103.8±24.4、107±19.5；三个实验批次的PoRV G5型中和抗体平均值分别为113.8±28.7、111.6±30.7、119.8±27.3；三个实验批次的PoRV G9型中和抗体平均值分别为114.8±39.3、122.0±37.6、 118±31.8。
表5 试制疫苗免疫仔猪PoRV中和抗体检测结果
Figure RE-GDA0003697047580000081
Figure RE-GDA0003697047580000091
序列表
<110> 武汉科前生物股份有限公司
<120> 一种猪轮状病毒特异性阳性血清及其制备方法
<141> 2022-04-07
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 950
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtatggta ttgaatatac cacagttcta acctttctga tatcaatagt tttattgaac 60
tatatattaa aatcactaac tagtgtaatg gactttataa tttatagatt tcttttaatt 120
attgctattg tgtcaccatt tgttaaagca cagaattatg gaattaatct accgattact 180
ggctccatgg atacagcata tgcaaattca tcacaacaag aaacattttt aacttcaacg 240
ttatgtttat attatcctac tgaagcatca actcaaattg gagatccaga atggaagaat 300
actttgtctc agttattctt aactaagggg tggccaactg gatcagttta tcttaaagaa 360
tataccgata tcgcttcatt ctcagttgat ccacaacttt attgtgatta taatgttgta 420
ttgatgaaat atgattcaac gttagagtta gatatgtctg aattagctga tttaattcta 480
aatgaatggt tatgtaaccc aatggatata acactatatt attatcagca aacaaatgag 540
gcgaacaaat ggatatcaat ggggcagtct tgtaccataa aagtatgtcc actaaataca 600
cagactttag gaataggttg cactactaca aatacagcga catttgaaga agtggctaaa 660
aatgaaaaat tagtaataac tgatgtcgtt gatggtgtaa accataaact tgatgtaact 720
acaaatacct gtacaattag gaattgtaag aaattaggac caagagagaa tgtggcaatt 780
gtacaagttg gtggctcaga agtgttagat attacagcag atccaactac tgcaccacaa 840
actgaacgta tgatgcgagt aaattggaag aaatggtggc aagttttcta tacagtagta 900
gattatatta atcaaattgt acaagttatg tccaaaagat cacggtcatt 950
<210> 2
<211> 2266
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgtagattt atcagatgaa atacaaatta ttggttctga aaagacgcag aacgtaacaa 60
taaatccagg accatttgct caaactggat atgcgccagt gaattgggga cctggagaaa 120
caaatgactc aacaacagtt gagccagtac ttgatggccc atatcaacct actacgttta 180
atccaccagt aagttattgg atactattgt ccccgtctaa tgctggagta gtagtggagg 240
gaacaaataa ttcagataga tggttagcca cgatactgat tgagcctaat gttacgtcac 300
aaagcagaac atatacccta tttggacagc aagaacagat aacggttgag aatgtttcaa 360
caacaaagtg gaaattcgtg gacttggcca aaactgacgt taatggaaca tttacacagc 420
atggaccgtt actgtctgat acaaagctct atggagtgat gaaatttagc ggcagactat 480
atacatacaa tggtgagacg ccgaatgcaa ctactggtta ttataccaca actaactatg 540
acacagtaaa tatgacatca cactgtgatt tttacattat accacgatct gaagagaacg 600
catgtacaaa ttacatcaat aatggattac caccaataca aaatactaga aatgtagttc 660
cagtatccct aacttctaga tcaattgtac acactagagc tcaggcgaat gaagatattg 720
ttgtatcaaa aacttcattg tggaaagaaa tgcagtataa tagagatata actatacgtt 780
ttaaatttgc gaatgctata attaaatctg gtggtctagg gtataagtgg tctgagattt 840
catttaaacc ggcaaattat caatacaatt atacgcggga tggggagatg atcacagctc 900
atacaacatg ttcagttaat ggaattaatg acttcagtta taacggcggt tcgttgccaa 960
cagatttcgt tatatccaga tatgaagtaa ttaaagaaaa ttcatacgtt tatgtagact 1020
attgggatga ctctcaagct tttagaaata tggtatatgt taggtcatta tcagccaact 1080
taaattcagt gatttgtact ggaggaaatt acgacttcag attgccagtt ggtgcatggc 1140
cggtaatgac tggtggcgct gtgtcactac gacccgcagg agtaacatta tcaacacagt 1200
tcactgattt tgtatcgtta aattcactaa gattcagatt cagtttatca gtagaagaac 1260
caccattcgc tattgcacgt actagagtat caggtttgta tggtttacca gctgcaaatc 1320
caaataacgg aaaagattac tatgagatat taggaagatt ttcgcttata tcattagtac 1380
catcgaatga cgattatcag acgccaatta tgaattcagt aacagtcaga caggatttag 1440
aaaggcagtt aaatgaattg cgtcaagagt tcaattcact atcacaagaa atagcaatgt 1500
cacaacttat tgatctagct ctgttaccat tagatatgtt ttctatgttc actggtatta 1560
aaagtactat agatgcagct aaatctatgg ctactagtgt gatgaaaaaa ttcaaaagat 1620
ctaatctagc atcatctata tcaactttag cagactcatt atctgacgct gcttcatcaa 1680
tttcgagaaa cccttctata agatcagttg gatcatctgt atcagcatgg acagacatat 1740
ctacgcaagt aacagacata tccgacacat taagttcagt atcaacgcaa acgtccacaa 1800
taagcagacg attgagatta aaagaaatta caactcaaac agaaggtatg aattttgatg 1860
atatttcagc tgcagtgttg aaaacgaaaa tagataaatc agttcaaata tccccgaata 1920
cattaccaga cgtagtaacc gaagcttcag aaaaattcat accaaatcga gcttatagag 1980
ttataaaaga tgatgaagtg ttggaagctg gaacggacgg acgattcttc gcatataaag 2040
ttgatacttt tgatgagatt ccatttgatg tacagaaatt tgcagattta gtcactgact 2100
cgcctgtgat atctgctata atagatttta aaacgttgaa aaatttgaat gacaattatg 2160
gaataactag agaacaagct ttcaatttac ttagatcgga tcctagagta ttacgggaat 2220
ttataaatca agaaaatcca ataattcgta atagaataga acaact 2266
<210> 3
<211> 950
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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atagtcgtgc ttgcaccatt tattaaaacc cagaattacg gaattaattt accaataact 180
ggatctatgg atacgccata tgcgaattct actacaagtg aaacattttt gacttcgaca 240
ttatgtttat attatccaaa tgaagcagct acagaaattg cagatacaaa atggacagaa 300
acattgtcac agttatttct aacaaaggga tggccgacag ggtcagttta ctttaaagga 360
tatgcagata ttgcgtcatt ttctgtagaa ccacaattat actgtgacta taatattgta 420
ctaatgaaat atgatgaaaa tttacagtta gatatgtctg aattggctga tttaatattg 480
aatgaatggc tatgtaatcc aatggacata acgttatatt attatcagca aacagatgaa 540
gctaacaaat ggatatcaat gggaacatca tgtacgatta aagtatgtcc cctaaataca 600
cagactctcg gaataggatg tacgactaca gacataaatt catttgaaac agttgctaat 660
gcagagaaac tagctataac tgatgttgtc gacggggtca atcataaact ggacgtaacg 720
acgaacacat gtactataag aaattgtaaa aaactaggac caagagaaaa tgttgctgta 780
attcaggtag gaggtccaaa tatactcgac ataacagctg atccaacaac tgcaccacag 840
actgaaagga tgatgcgtat aaattggaag agatggtggc aagtctttta tacaatagtt 900
gattatgtca atcagattgt gcaagtcatg tccaagcgat cgcgctcctt 950
<210> 4
<211> 2273
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgtagatct atcagatgaa atacaaacta ttggttctga aaaaacgcaa gacgtaacaa 60
taaatccagg accatttgct caaactggat atgcaccagt gaattgggga cccggggaaa 120
caaatgattc aacaacagtt gagccagtac ttgatggtcc atatcaacca actacattca 180
atccaccagt aagttattgg atactattat ctccatctaa tgcaggagta gtagtggagg 240
ggacaaataa ctcagatagg tggttagcca caatactaat tgaacccaat gtaacgtcac 300
aaagtagaac atatactcta tttggacagc aagaacaaat tacagttgag aatgtttcaa 360
cgacgaagtg gaagttcgta gatctggcta aaaccgacat taatggaaca tttacacagt 420
acggaccatt actatcagac acaaagcttt atggagtgat gaaatttagt ggcagactat 480
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cttgtacgaa ttatattaat aatggattac caccaataca gaacactaga aatgtagttc 660
cagtatccct gacttctaga tcaattgtac acactagagc tcaagcgaat gaagatattg 720
ttgtatcaaa aacttcattg tggaaagaaa tgcagtataa tagagatata actatacgtt 780
tcaagtttgc gaacgctata attaaatctg gtggtctagg atataagtgg tctgagattt 840
catataaacc agcaaattat caatataact atacacgaga tggggaaacg atcacagctc 900
atacaacgtg ttcagttaat ggaattaatg atttcagtta taatggcggt tcactgccaa 960
cagatttcgt catatctaga tacgaagtaa ttaaagaaaa ttcatacgtt tatgtagatt 1020
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cattaccaga tatagtaacc gaggcttcag aaaaattcat accaaatcga gcttataggg 1980
ttataaaaga tgatgaagtg ttagaagctg gaacggatgg acgattcttc gcatataaag 2040
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gaataactag agaacaagct ttcaatttac ttagatcgga tcctagagtg ctacgggaat 2220
ttataaatca agaaaatcca ataattcgta atagaataga acaacattat atg 2273
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<212> DNA
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<212> DNA
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caccatttgc catcgcacgt actagagtat caggattgta tggtttacca gctgcgaatc 1320
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aaaggcaatt aaatgaattg cgtcaagagt ttaattcact atcacaagaa atagcaatgt 1500
cacaacttat tgatttagct ttattaccat tagatatgtt ttctatgttc actggcatta 1560
aaagcactat tgatgctgct aaatctatgg ctactagtgt gatgaagaaa tttaaaagat 1620
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ctacgcaagt gacagatata tctgacgtat taagttcagt atcaacacaa acatccacaa 1800
taagtagacg gttgagatta aaagaaatta caactcaaac ggagggtatg aattttgatg 1860
atatttcagc tgcagtgtta aaaacgaaaa tagataaatc agttcaaata tcaccgaata 1920
cattaccaga tatagtaacc gaggcttcag aaaaattcat accaaatcga gcttataggg 1980
ttataaaaga tgatgaagtg ttagaagctg gaacggatgg acgattcttc gcatataaag 2040
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cgcctgtgat atctgctata atagatttta aaacgttgaa aaatttgaat gacaattatg 2160
gaataactag agaacaagct ttcaatttac ttagatcgga tcctagagtg ctacgggaat 2220
ttataaatca agaaaatcca ataattcgta atagaataga acaactaata tgtgttaagg 2280
gtg 2283

Claims (9)

1.一种猪轮状病毒特异性阳性血清的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选用满足条件的兔：体重2.25-3.5kg，符合国家规定的清洁级实验动物，且其不带有病原体及其抗体，病原体包括杂菌、支原体、牛病毒性腹泻病毒、猪流行腹泻病毒、猪轮状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒中的任一种或多种的组合；
(2)免疫原制备：制备猪轮状病毒的病毒液，取上清液经无菌检验、无支原体检验、鉴别检验和外源病毒检验合格，且病毒含量不低于107.5TCID50/mL作为活免疫原；
将活免疫抗原，作为灭活免疫原；
(3)免疫接种：分别对每只兔进行5次免疫接种：
第一次免疫接种：对每只兔颈部肌肉注射按1：1混合的2ml的活免疫原和弗氏完全佐剂；
中间4次免疫接种：第一次免疫接种后每隔14天分别对每只兔进行颈部肌肉注射按1：1混合的2ml的灭活免疫原和弗氏不完全佐剂；
(4)采集兔血清:最后一次免疫接种后7-10天采集兔血清检测血清中猪轮状病毒的中和抗体效价和猪轮状病毒抗原，确认兔血清为猪轮状病毒抗体阳性且细胞中和抗体效价在1：256以上，即得猪轮状病毒特异性阳性血清。
2.根据权利要求1所述的猪轮状病毒特异性阳性血清的制备方法，其特征在于，猪轮状病毒的病毒液的制备步骤为：将猪轮状病毒按0.05～0.1MOI的剂量接种长满单层的MA104细胞，37℃、5％CO2培养箱中培养48小时，当CPE达80％或以上时收获病毒液，经冻融三次后，离心去除细胞碎片。
3.根据权利要求1所述的猪轮状病毒特异性阳性血清的制备方法，其特征在于，将活免疫抗原灭活包括：在活免疫原中加入BEI，混合均匀后，37℃灭活，加入Na2S2O3溶液过滤除菌，置2-8℃保存。
4.根据权利要求3所述的猪轮状病毒特异性阳性血清的制备方法，其特征在于，所述将活免疫抗原灭活包括：在活免疫抗原中加入浓度为0.5mol/L的BEI至浓度为0.005mol/L，混合均匀后，37℃灭活30小时，灭活终止后，加入浓度为1.0mol/L的Na2S2O3溶液至终浓度为0.005mol/L，进行过滤除菌，置2-8℃保存，作为灭活免疫原。
5.一种猪轮状病毒特异性阳性血清，其特征在于，采用权利要求1～3中任一项所述的猪轮状病毒特异性阳性血清的制备方法制得。
6.根据权利要求5所述的猪轮状病毒特异性阳性血清，其特征在于，所述猪轮状病毒特异性阳性血清的效价在1：320以上。
7.根据权利要求6所述的猪轮状病毒特异性阳性血清，其特征在于，所述猪轮状病毒为保藏编号为CCTCC NO：V202222的猪轮状病毒KQ06株，保藏在中国典型培养物保藏中心，该KQ06株的VP4基因序列如SEQ ID NO：4所示，KQ06株的VP7基因序列如SEQ ID NO：3所示。
8.根据权利要求6所述的猪轮状病毒特异性阳性血清，其特征在于，所述猪轮状病毒为保藏编号为CCTCC NO：V202221，的猪轮状病毒HN01株，保藏在中国典型培养物保藏中心，该HN01株的VP4基因序列如SEQ ID NO：6所示，HN01株的VP7基因序列如SEQ ID NO：5所示。
9.根据权利要求6所述的猪轮状病毒特异性阳性血清，其特征在于，所述猪轮状病毒为保藏编号为CCTCC NO：V202191，的猪轮状病毒CH09株，保藏在中国典型培养物保藏中心，该CH09株的VP4基因序列如SEQ ID NO：2所示，CH09株的VP7基因序列如SEQ ID NO：1所示。
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