CN103289986B - 牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL及其制备方法与应用 - Google Patents
牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL及其制备方法与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL及其制备方法与应用。本发明以牛布鲁氏菌S19基因组DNA为模板，得到bp26基因的上游同源臂，BLS基因、L7/L12基因和bp26基因的下游同源臂；将前述基因片段依次连接，得到片段Δbp26-BL；分别对pRE112和Δbp26-BL双酶切，连接，得到自杀性同源重组质粒；将该质粒导入S19-Δbp26菌株的感受态细胞中，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子，再将同源重组单交换子涂布于选择培养基上培养，获得牛布鲁氏菌重组菌S19-Δbp26-BL。该菌株具有良好的遗传稳定性，生长特性和毒力大小好，可作为一种标记疫苗株用于临床。
Description
技术领域
本发明涉及到重组细菌疫苗领域，特别涉及一种牛布鲁氏菌（Brucellaabortus）重组菌株S19-Δbp26-BL及其制备方法与应用，该菌株是在缺失其bp26基因的位置插入自身两个主要免疫原性基因BLS和L7/L12得到。
背景技术
布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的人兽共患传染病，防控该病一直是以应用疫苗进行预防为主。布鲁氏菌疫苗种类较多，重组蛋白疫苗与DNA疫苗保护性有限，灭活疫苗保护期短。目前用于布鲁氏菌病防控的减毒菌株主要有国外的牛型19号弱毒菌株（S19）和羊型ReV.1弱毒菌株，国内研制的羊型5号（M5）弱毒菌株和猪型2号（S2）弱毒菌株。弱毒苗造价便宜，免疫保护持续时间长，免疫保护效率高，但是这些弱毒疫苗同样存在缺陷。这些光滑型布鲁氏菌弱毒疫苗免疫动物后，会在动物机体诱导产生S-LPS抗原“O”链特异性抗体，很难与野毒株布鲁氏菌感染相区分，干扰常规布鲁氏菌病的诊断。如果广泛应用这样的疫苗就对该病流行病学调查、探查疫源产生很大的障碍。许多国家与地区限制布鲁氏菌血清学方法检测呈阳性动物的肉制品、奶制品进出口，给国际贸易产生严重的阻碍，特别是对牧区经济产生重要的影响。除此之外，现有的布鲁氏菌的减毒活疫苗都对动物会产生不同程度的副作用，再引起动物轻度流产的同时也会感染人类。所以构建安全性高、无返祖、能区分自然感染与人工主动免疫、保护性能好的布鲁氏菌标记弱毒疫苗是当务之急。
BP26蛋白是一种具有强免疫原性的外周浆蛋白，且几乎存在于所有布鲁菌菌株中。研究表明BP26蛋白具有良好的免疫活性，自然感染或人工免疫后都可以在血清中检测出针对此抗原的特异性抗体。bp26基因的缺失对布鲁氏菌的毒力和免疫原性几乎没有影响，并不会影响细菌本身的生长繁殖。
L7/L12编码的核蛋白在布鲁氏菌的核糖体亚单位中以四个拷贝的形式存在，其氨基末端可与L10核糖体蛋白形成二聚体，羧基末端在多肽合成的延伸过程中，可以与延伸因子EF-TU和EF-G相结合，并在GTP水解过程中发挥重要作用。研究发现，从布鲁氏菌中提取的L7/L12蛋白能特异性地刺激感染动物的单核细胞，并上调INF-γ的转录和表达，从而起到保护作用。BLS编码2,4-二氧四氢蝶啶合成酶，此蛋白酶以二聚体的形式形成五聚物，60个亚单位可以排列成20面体衣壳形式，有类似于霍乱毒素（CT）的佐剂作用，而在安全性和激活Thl型为主的免疫反应方面BLS又强于CT，BLS重组质粒免疫动物，可产生IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM等多种特异性抗体，用布鲁氏菌544A攻毒，可显著降低细胞负荷。2007年，Juliana Cassataro（Improved Immunogenicity of aVaccination Regimen Combining a DNA Vaccine Encoding Brucella melitensis OuterMembrane Protein31(Omp31)and Recombinant Omp31Boosting.Clin VaccineImmunol.2007,14(7):869–874.）等，将Omp31的loop区的27个氨基酸连于BLS，重组蛋白免疫B1LB/c小鼠，用绵羊附睾型布鲁氏菌攻毒，保护性与ReV.1疫苗相当，可见BLS不仅有特异性的免疫保护，还有佐剂效应。
发明内容
本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法。
本发明的另一目的在于提供通过上述制备方法得到的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL。
本发明的再一目的在于提供上述牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL在制备用于治疗和/或预防布鲁氏菌病的疫苗中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：一种牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，包括以下步骤：
（1）自杀性同源重组质粒的构建
①以牛布鲁氏菌S19基因组DNA为模板做PCR扩增，用引物P1和P2扩增，得到bp26基因的上游同源臂；用引物P3和P4扩增，得到bp26基因的下游同源臂；用引物B1/B2扩增，得到BLS基因；用引物B3/B4扩增，得到L7/L12基因；
P1：5’-GATGGTACCCGATGCAGCAAGACAGTATT-3’（横线部分为KpnI酶切位点）；
P2：5’-CCTCGTGCTTGGACATAAAATCTCCTACAGGAAAAGTT-3’；
P3：5’-AAGGTTGAACTCAAGTAAATAGCCGGGGTATGACG-3’；
P4：5’-CGAGAGCTCGTGGCATCCCCTTGTTTC-3’（横线部分为Sac1酶切位点）；
B1：5’-ATGTCCAAGCACGAGGC-3’；
B2：5’-GGAACCTGGAGAGGCTCCGAATTTTTT-3’；
B3：5’-AGCCTCTCCAGGTTCCGCTGATCTCGCAAAGATCGTT-3’；
B4：5’-TTACTTGAGTTCAACCTTGGCG-3’；
②利用Overlap PCR的方法，首先将步骤①制备的BLS基因和L7/L12基因相连接，连接好的片段再与步骤①制备的bp26基因的上、下游同源臂进行Overlap PCR，得到了用于同源重组的目的片段Δbp26-BL；
③用SacI和KpnI分别对自杀性质粒载体pRE112和Δbp26-BL基因片段进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段Δbp26-BL和载体片段pRE112连接，得到自杀性同源重组质粒pRE-Δbp26-BL；
（2）牛布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选
①将自杀性同源重组质粒pRE-Δbp26-BL导入牛布鲁氏菌基因缺失株S19-Δbp26的感受态细胞中；接着涂布于含有氯霉素的胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基（TSA-YE）平板上，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子；同引物P1和P4将PCR鉴定正确的同源重组单交换子在胰蛋白胨大豆肉汤培养基（TSB）中培养，松弛质粒抗性；
②接着将同源重组单交换子涂布于TSA-YE-Sucrose选择培养基上培养，利用自杀性同源重组质粒pRE-Δbp26-BL中sacB基因对蔗糖的敏感性，对自杀质粒进行消除，利用引物P1和P4对TSA-YE-Sucrose选择培养基上生长的菌落进行PCR筛选，获得同源重组双交换子，即得到牛布鲁氏菌重组菌S19-Δbp26-BL；
步骤（1）①中所述的PCR扩增的条件优选为94℃5min；94℃30s、53℃30s、72℃1min，30个循环；72℃5～10min；
步骤（1）②中所述的Overlap PCR的条件优选为94℃5min预变性；94℃30s、55℃30s、72℃3min，30个循环；72℃5～10min；
步骤（2）①中所述的导入的方式优选为通过电转化方式导入；
所述的电转化的条件优选为1mm电极杯，1.8kv，400Ω；
步骤（2）①中所述的氯霉素在所述的胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基中的终浓度优选为5μg/ml；
步骤（2）①中所述的培养的条件优选为37℃培养36～48h；
步骤（2）①中所述的PCR鉴定的条件优选如下：94℃5min预变性；94℃30s、55℃30s、72℃3min，30个循环；72℃5～10min；
步骤（2）②中所述的TSA-YE-Sucrose选择培养基的组成如下：胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基+终浓度为质量体积比7%的蔗糖；
所述的TSA-YE-Sucrose选择培养基优选通过如下步骤制备得到：将配制好的胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基灭菌后，降温至40～50℃时加入经过滤除菌的浓度为质量体积比50%的蔗糖水溶液，使得蔗糖的终浓度为质量体积比7%；
步骤（2）②中所述的培养的条件优选为37℃培养至少48h；
一种牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL，通过上述方法制备得到；
所述牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL在制备治疗和/或预防布鲁氏菌病疫苗中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
（1）本发明得到的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL由于bp26基因的缺失可以作为一种标记疫苗株用于临床，从而有效的区分自然感染与人工免疫；同时，又可以通过主要免疫原性蛋白BLS和L7/L12的表达量的增加而对加强疫苗的防治效果。
（2）实验证明本发明提供的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL具有良好的遗传稳定性，其生长特性和毒力大小与牛布鲁氏菌S19、牛布鲁氏菌基因缺失株S19-Δbp26相比均无明显差异。该牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL具有良好的免疫原性，接种BALB/c小鼠后，产生的抗BLS及L7/L12的抗体水平高于亲本株S19。
（3）所述牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL为构建更为安全有效并且能够区分人工免疫与野毒感染的新型基因工程疫苗奠定基础。
附图说明
图1是BLS、L7/L12基因及BLS和L7/L12重叠得到的基因片段BL的琼脂糖凝胶电泳图，其中：泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为BLS基因片段，泳道2为L7/L12基因片段，泳道3为BLS和L7/L12重叠得到的基因片段BL。
图2是bp26基因的上、下游同源臂基因片段及与BL片段重叠得到的基因片段的琼脂糖凝胶电泳图，其中：泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为bp26的上游同源臂基因片段，泳道2为BL基因片段，泳道3为bp26的上游同源臂与BL基因片段重叠后的基因片段，泳道4为bp26的下游同源臂基因片段，泳道5为bp26基因的上、下游同源臂基因片段与BL片段重叠得到的基因片段Δbp26-BL。
图3是pRE-Δbp26-BL的酶切结果的琼脂糖凝胶电泳图，其中：泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为未经酶切的pRE-Δbp26-BL质粒，泳道2为使用SacI和KpnI双酶切pRE-Δbp26-BL质粒后得到的片段。
图4是牛布鲁氏菌基因缺失株S19-Δbp26同源重组单交换子筛选的琼脂糖凝胶电泳图，其中：泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为S19-Δbp26阳性对照，泳道2为Δbp26-BL阳性对照，泳道3～9为S19-Δbp26株同源重组单交换子；泳道10为空白对照。
图5是同源重组双交换子筛选的琼脂糖凝胶电泳图，其中：泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为S19-Δbp26阳性对照，泳道2为Δbp26-BL阳性对照，泳道3～15为同源重组双交换子，泳道16为空白对照。
图6是牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL遗传稳定性的验证结果图，其中：泳道M为DNA分子质量标准，泳道1为S19-Δbp26阳性对照，泳道2为Δbp26-BL阳性对照，泳道3～12分别为S19-Δbp26-BL第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20代菌落，泳道13为空白对照。
图7是牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL生长曲线的测定结果图。
图8是牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL免疫小鼠后对小鼠脾脏重量影响的结果图。
图9是牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL免疫小鼠后对小鼠脾脏菌落数检测的结果图。
图10是牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL免疫小鼠后小鼠血清抗体的ELISA检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中所涉及的材料：
①Pfu Ultra II Fusion HS DNA Polymerase高保真酶购自Stratagene公司；限制性内切酶Kpn I、Sac I、T4DNA连接酶、DNA Marker等购于TaKaRa公司；胶回收试剂盒、小量质粒提取试剂盒为Omega公司产品；QIAamp DNA提取试剂盒为QIAGEN公司产品；胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）购自青岛海博生物技术有限公司。
②牛布鲁氏菌（Brucella abortus）S19株购于中国兽药监察所；
③以下生物材料均已在文献“布鲁氏菌bp26基因缺失株的构建，中国兽医科学，2011,41（03）：280-286”公开：牛布鲁氏菌基因缺失株S19-Δbp26、大肠杆菌DH5αλpir（基因型为supE44ΔlacU169(φ80lacZΔM15)hsdR17recA1 endA1gyrA96thi-relA1λpi）、及pRE112自杀质粒（cat,sacB,oriTRP4,oriVR6K,MCS）。
实施例1
（1）自杀性同源重组质粒的构建
①菌基因组DNA的提取：按照QIAamp DNA抽提试剂盒说明提取牛布鲁氏菌S19株基因组DNA。
②引物的设计与合成：参考Genbank中布鲁氏菌S19株（NC-010742）的基因序列，根据实验的需求设计引物，如表1所示。其中引物P1/P2、P3/P4分别用来扩增bp26基因的上、下游同源臂，并分别于引物P1和P4的5’端引入KpnI和ScaI的酶切位点；引物B1/B2用来扩增BLS基因；引物B3/B4用来扩增L7/L12基因。上述引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
表1用于扩增不同基因片段的PCR引物序列
③不同基因片段的PCR扩增：以牛布鲁氏菌S19株的基因组DNA为模板，用相应的引物扩增bp26基因的上、下游同源臂及BLS和L7/L12的基因片段；利用Overlap PCR的方法，首先将BLS和L7/L12基因片段相连接，连接好的片段再与bp26基因的上、下游同源臂进行Overlap PCR。扩增bp26基因的上、下游同源臂的PCR反应程序同BLS和L7/L12的基因片段的PCR扩增反应程序均为：94℃30s，53℃30s，72℃1min，30个循环；Overlap PCR的反应程序为：94℃5min预变性；94℃30s，55℃30s，72℃3min，30个循环。
通过质量体积比1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1和图2所示，BLS的大小为472bp，L7/L12的大小为372bp，bp26基因的上游同源臂的大小为847bp，bp26基因的下游同源臂的大小为909bp，BLS和L7/L12重叠得到的基因片段BL的大小为843bp，bp26的上游同源臂与BL基因片段重叠后的基因片段的大小为1690bp、bp26基因的上、下游同源臂基因片段与BL片段重叠得到的基因片段Δbp26-BL的大小为2599bp，与理论值相符。
④自杀性同源重组质粒的构建：用KpnI和ScaI分别对自杀性质粒载体pRE112和Δbp26-BL进行双酶切，双酶切的反应体系为：10×L Buffer2.0μL，KpnI和ScaI各2.0μL，pRE112（浓度约1μg/μL）2.0μL，Δbp26-BL6.0μL，加入ddH2O使总体积达到20μL。将纯化回收的片段Δbp26-BL和载体片段pRE112用T4DNA连接酶（反应体系和反应条件按说明书操作）连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5αλpir。把用引物P1和P4经PCR鉴定正确的阳性克隆抽提质粒，SacI和KpnI双酶切验证，结果如图3所示，酶切后获得的片段与目的片段大小相同，进行基因测序，得到的序列与Δbp26-BL的序列完全一致，表明得到自杀性同源重组质粒pRE-Δbp26-BL。
（2）牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的构建及筛选
①牛布鲁氏菌基因缺失株S19-Δbp26感受态细胞的制备：接种S19-Δbp26株的单菌落于100mL TSB培养基中，37℃培养，培养至OD600=0.5，冷却30min。4000r/min离心10min，弃去培养基，用体积百分比10%的甘油洗涤3次。最后将获得的菌体重悬于2.5ml体积百分比10%的甘油水溶液中，按100μL/管分装于预冷的微量离心管中，置-80℃冰箱保存备用。
②通过电转化，Bio-rad电极杯1mm，1.8kv，400Ω将重组自杀性质粒pRE-Δbp26-BL导入牛布鲁氏菌基因缺失株S19-Δbp26感受态细胞中，将电转后的菌液涂布于含有氯霉素（5μg/ml）的TSA-YE平板上，37℃培养48h以上，在氯霉素的选择压力下，得到pRE-Δbp26-BL整合到牛布鲁氏菌基因组上的同源重组单交换子。利用引物P1和P4对菌落进行PCR筛选，PCR的条件是：94℃5min预变性；94℃30s、55℃30s、72℃3min，30个循环；72℃5～10min。PCR鉴定结果如图4所示，分别在2599bp与1847bp处有条带。
③将菌落PCR鉴定正确的同源重组单交换子在TSB中培养18h，松弛质粒抗性后，适当稀释涂布于TSA-YE-Sucrose选择培养基（TSA-YE培养基中含蔗糖，蔗糖的终浓度为质量体积比7%）上，37℃培养48h以上，利用质粒pRE-Δbp26-BL中sacB基因对蔗糖的敏感性，获得同源重组双交换子。利用引物P1和P4对菌落进行PCR筛选，PCR的条件是：94℃5min预变性；94℃30s、55℃30s、72℃3min，30个循环；72℃5～10min。在TSA-YE-Sucrose平板上生长的同源重组双交换子存在两种情况：一是pRE-Δbp26-BL重新从染色体上缺失（回复突变）；二是Δbp26-BL基因整合到基因组，而亲本Δbp26基因交换到载体中丢失，对同源重组双交换子做PCR鉴定结果如图5所示，条带为2599bp（即泳道7）的同源重组双交换子即为所要筛选的牛布鲁氏菌重组菌株，将其命名为S19-Δbp26-BL。
（3）牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的遗传稳定性验证
将所获得的S19-Δbp26-BL在TSA平板上连续传至20代，以引物P1/P4对TSA平板上的菌落进行PCR扩增，每两代进行一次菌落PCR和测序鉴定，验证重组菌的遗传稳定性，结果如图6所示，都扩增得到2599bp的条带，表明S19-Δbp26-BL具有良好的遗传稳定性。
（4）牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的生长曲线测定
将S19-Δbp26-BL、S19和S19-Δbp26分别涂布于TSA平板上，待长出单个菌落后，将单个菌落接种到新鲜的TSB培养液中，37℃200r/min摇菌约17h，至细菌达到对数生长期，收集菌体，将菌液浓度调整为同一数值（OD600=0.06），按照体积比1:100的比例接种于50mL TSB培养液中，37℃培养，每隔4h取出一定量的菌液，测定OD值并做10倍系列稀释，涂于TSA平板培养基上，每个稀释度3个平板。待菌落长出后，计数并统计，绘制生长曲线如图7所示，经统计学分析三种菌株的生长特性均无显著性差异。
（5）牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的小鼠试验
将40只4～6周龄的BALB/c小鼠（广东省实验动物中心），按每组10只分成4组。按105CFU/mice的接种剂量分别腹腔接种S19-Δbp26-BL、S19、S19-Δbp26和10mM、pH7.4的PBS溶液（空白对照组）。在接种后的第2周和第4周将BALB/c小鼠颈部拉断处死，每组5只，眼球静脉采血，离心取血清。无菌取脾脏称重并将脾脏匀浆，匀浆后将其作10倍系列稀释，取100μL涂大豆酪蛋白琼脂培养基（TSA）平板，37℃培养，菌落出现后进行数据统计分析。图8的结果显示，从脾脏重量来看，免疫2周后S19-Δbp26-BL所引起的炎症反应强度明显弱于S19，二者有显著性差异，但与S19-Δbp26差异不显著；免疫4周后，S19-Δbp26-BL所引起的炎症反应强度虽高于S19株，但并没有达到显著水平。图9的结果显示，从脾脏菌落数可知，免疫2周和4周时，三种菌株的脾脏菌落数均无显著性差异。
（6）牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL特异性抗体水平检测试验
用步骤（5）中采集的S19及S19-Δbp26-BL菌株免疫小鼠4周后的血清作为待检样本，用本实验室制备的BL融合蛋白作为抗原包被ELISA板，检测血清中抗BL的特异性抗体的水平，并进行统计学分析，步骤如下：
①BL融合蛋白的制备：用KpnI和Sac I分别对pET32a表达载体和基因测序正确的Δbp26-BL进行双酶切，双酶切的反应体系为：10×L Buffer2.0μL，KpnI和SacI各2.0μL，pET32a（浓度约1μg/μL）2.0μL，Δbp26-BL6.0μL，加入ddH2O使总体积达到20μL。将纯化回收的片段Δbp26-BL和载体片段pET32a用T4DNA连接酶（反应体系和反应条件按说明书操作）连接，并将连接产物转化入表达菌大肠杆菌BL21(DE3)（购自Novagen公司）中。挑取BL-pET-Δbp26-BL单菌落接种于于含Amp+（100μg/mL）LB液体培养基中，37℃200r/min过夜培养后。取上述培养菌按体积比1:50比例接种于新鲜的含Amp+（100μg/mL）LB培养液，37℃200r/min培养3h，加入IPTG（1.5mmol/L）诱导时间4h，收集菌体。超声破碎后，经HisTrap FF纯化重组蛋白，紫外分光光度计测定蛋白浓度为0.84mg/ml。
②BL-iELISA方法检测S19-Δbp26-BL特异性抗体水平：将纯化后的BL融合蛋白作为包被抗原，用包被液（pH值为9.6、0.05M碳酸盐缓冲液：Na2CO31.59g、NaHCO32.93g，加蒸馏水至1L）稀释成1μg/mL，每孔加入100μL，4℃过夜，用洗涤缓冲液PBST（pH值为7.4、0.15M磷酸盐缓冲液：KH2PO40.2g、Na2HPO4·12H2O2.9g、NaCl8g、KCl0.2g、Tween-200.5ml（即终浓度为体积百分比0.05%），加蒸馏水至1L）洗涤3次，每次3min，拍干；每孔加入质量体积比0.5%的牛血清白蛋白100μL，37℃封闭1h，洗涤方法同上；用步骤（5）中采集的S19及S19-Δbp26-BL菌株免疫小鼠4周后的血清作为待检血清，用二抗稀释液（质量体积比0.5%的牛血清白蛋白）按体积10倍稀释加到酶标板竖列，每孔200μL，其余每孔加二抗稀释液100μL，横向倍比稀释，每孔37℃作用1h，洗涤方法同上；每孔加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠HRP-IgG（用二抗稀释液按体积比1:5000稀释）100μL，37℃作用1h，PBST洗涤5次，每次3min，拍干；每孔加入100μL的底物显色液TMB（底物缓冲液为：NaHPO414.6g、柠檬酸9.33g、0.75%H2O26.4ml，pH值为5.4，加蒸馏水至1L；TMB使用液：TMB200g、无水乙醇100ml，使用时取底物缓冲液950μl和TMB使用液50μl混匀即为显色液），37℃作用10min，再加入终止液（2M硫酸）50μL终止反应，在2min内用酶标检测仪测定OD450nm值。
结果如图10所示，表明自身免疫原性基因BLS及L7/L12的加入确实能增强S19疫苗株的免疫原性。从而可以推测，新型疫苗株S19-Δbp26-BL较亲本株S19有更好的免疫保护效果。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)自杀性同源重组质粒的构建
①以牛布鲁氏菌S19基因组DNA为模板做PCR扩增，用引物P1和P2扩增，得到bp26基因的上游同源臂；用引物P3和P4扩增，得到bp26基因的下游同源臂；用引物B1/B2扩增，得到BLS基因；用引物B3/B4扩增，得到L7/L12基因；
P1：5’-GATGGTACCCGATGCAGCAAGACAGTATT-3’；
P2：5’-CCTCGTGCTTGGACATAAAATCTCCTACAGGAAAAGTT-3’；
P3：5’-AAGGTTGAACTCAAGTAAATAGCCGGGGTATGACG-3’；
P4：5’-CGAGAGCTCGTGGCATCCCCTTGTTTC-3’；
B1：5’-ATGTCCAAGCACGAGGC-3’；
B2：5’-GGAACCTGGAGAGGCTCCGAATTTTTT-3’；
B3：5’-AGCCTCTCCAGGTTCCGCTGATCTCGCAAAGATCGTT-3’；
B4：5’-TTACTTGAGTTCAACCTTGGCG-3’；
②利用Overlap PCR的方法，首先将步骤①制备的BLS基因和L7/L12基因相连接，连接好的片段再与步骤①制备的bp26基因的上、下游同源臂进行Overlap PCR，得到了用于同源重组的目的片段Δbp26-BL；
③用SacI和KpnI分别对自杀性质粒载体pRE112和Δbp26-BL基因片段进行双酶切，纯化；将纯化回收的片段Δbp26-BL和载体片段pRE112连接，得到自杀性同源重组质粒pRE-Δbp26-BL；
(2)牛布鲁氏菌重组菌株的构建及筛选
①将自杀性同源重组质粒pRE-Δbp26-BL导入牛布鲁氏菌基因缺失株S19-Δbp26的感受态细胞中；接着涂布于含有氯霉素的胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基平板上，在氯霉素的选择压力下，得到同源重组单交换子；同引物P1和P4将PCR鉴定正确的同源重组单交换子在胰蛋白胨大豆肉汤培养基中培养，松弛质粒抗性；
②接着将同源重组单交换子涂布于TSA-YE-Sucrose选择培养基上培养，利用自杀性同源重组质粒pRE-Δbp26-BL中sacB基因对蔗糖的敏感性，对自杀质粒进行消除，利用引物P1和P4对TSA-YE-Sucrose选择培养基上生长的菌落进行PCR筛选，获得同源重组双交换子，即得到牛布鲁氏菌重组菌S19-Δbp26-BL；
所述的TSA-YE-Sucrose选择培养基的组成如下：胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基+蔗糖，蔗糖的终浓度为质量体积比7％。
2.根据权利要求1所述的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于：步骤(1)①中所述的PCR扩增的条件为94℃5min；94℃30s、53℃30s、72℃1min，30个循环；72℃5～10min。
3.根据权利要求1所述的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于：步骤(1)②中所述的Overlap PCR的条件为94℃5min预变性；94℃30s、55℃30s、72℃3min，30个循环；72℃5～10min。
4.根据权利要求1所述的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于：步骤(2)①中所述的导入的方式为通过电转化方式导入。
5.根据权利要求4所述的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于：所述的电转化的条件为1mm电极杯，1.8kv，400Ω。
6.根据权利要求1所述的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于：步骤(2)①中所述的氯霉素在所述的胰酪胨大豆酵母浸膏琼脂培养基中的终浓度为5μg/ml。
7.根据权利要求1所述的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于：
步骤(2)①中所述的培养的条件为37℃培养36～48h；
步骤(2)②中所述的培养的条件为37℃培养至少48h。
8.根据权利要求1所述的牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL的制备方法，其特征在于：步骤(2)①中所述的PCR鉴定的条件如下：94℃5min预变性；94℃30s、55℃30s、72℃3min，30个循环；72℃5～10min。
9.一种牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的制备方法制备得到。
10.权利要求9所述牛布鲁氏菌重组菌株S19-Δbp26-BL在制备治疗和/或预防布鲁氏菌病疫苗中的应用。
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