CN107072225A - 用于提高资源生产的微藻培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了诱导或增加微藻中脂质和蛋白质生产的方法。本发明还公开了提高微藻生物质的方法。所述方法包括向培养基中接种微藻并在异养生长条件下繁殖微藻。异养生长条件包括避免接种的培养基暴露于光。所述方法进一步包括将氧输送至接种培养基中。另外，脂质、蛋白质和其它细胞组分可从公开的方法所培养的微藻中分离和纯化。

Description

用于提高资源生产的微藻培养方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2014年5月2日提交的美国临时申请第61/987,695号的优先权，该临时申请通过引用整体并入本文。
技术领域
本公开通常涉及培养微藻(microalgae)的方法。尤其是，所述方法能够用于微藻生物质、蛋白质和脂质的增产。本公开还涉及从本文描述的一种或多种方法所培养的微藻中分离的和/或纯化的微藻生物质、蛋白质和脂质。
背景技术
历史上，电力生产和现代运输所需的能量主要由化石燃料提供。虽然人类已经开发了其它能源(例如：风能、太阳能、水力发电、核能等)并且在全球范围中使用，但是我们仍然严重依赖化石燃料(例如汽油、柴油、燃料油、原油、煤和天然气)的燃烧以满足我们对能源和运输需求。然而，随着全球现代化对化石燃料能源的需求急剧增长，有些人预计全球能源需求在未来几十年将翻一番。
全球经济对能源需求的增加，已经对化石燃料及其产生的碳氢化合物产品的成本造成了越来越大的压力。当人们认为能源生产只是碳氢化合物的多种关键用途之一时，这种趋势尤其令人担忧。特别地，许多行业，包括基于生产或使用复合材料、塑料和工业化学品的那些工业，极大地依赖于作为其工艺和产品原料的碳氢化合物的可获得性。因此，找到作为能源和燃料来源的化石燃料的有效替代品，不仅有助于满足世界对能源日益增长的需求，而且还可以降低化石燃料带来的产品成本。
生物质中的能量提供了一种方法，既能潜在地减少了温室气体排放又能降低对基于化石燃料的基础设施的需求，并且，生物能通常被认为是解决可再生能源方案的重要资产。生物系统通过严格调节的代谢网络介导一系列生化反应，从而完成能量的利用。
微生物，例如微藻，有希望作为可再生原料，用于生产从乙醇到生物柴油的一系列生物燃料。藻类属于一种种类繁多的水生光合生物，通常分为大型藻类(即海藻)和微藻类，微藻类通常是单细胞的。虽然藻类生物燃料领域仍处于起步阶段，但微藻作为一种用于清洁、可持续燃料生产的资源是具有巨大潜力的。藻类是由太阳能生产化学能的有效光合生物，根据报道，当今大量的化石燃料，特别是石油，起源于史前大量繁殖的藻类。作为单细胞生物，由于它们缺乏支持和滋养陆生植物所需的大分子结构和维管束组织，因此，微藻能够产生大量的生物质作为小分子生物燃料前体。因此，藻类提供了将碳和其它有机底物转化为生物燃料的一种最直接途径。此外，这些水生微生物的大的表面积与体积比有利于吸收营养物质，这反映在许多物种中观察到的快速生长速率。
与陆地生物能源作物不同，微藻不需要肥沃的土地或大量的灌溉，而且它们可以被连续收获。有几种微藻甚至不需要淡水，可以在咸水、海水、甚至超盐水中生长。此外，由于微藻通过光合作用消耗二氧化碳(CO2)，因此大规模培养微藻甚至可以用于治理化石燃料燃烧排放的CO2。藻类生物质还能产生可供销售的次级副产物，例如抗氧化色素、食用蛋白和其它替代燃料作物所缺乏的营养油。然而，藻类生物燃料的大规模商业化依然存在障碍。这些挑战包括：(1)需要提高海藻油的生产力；和(2)需要改进利用藻类产生的油所需的加工技术。
附图说明
根据以下说明和所附权利要求，并结合附图，本发明所公开的具体实施方式将变得更加显而易见。
图1是根据本发明的具体实施方式在异养生长条件并引入氧的情况下进行培养之前或开始培养时微藻样品的显微照片。显微照片在第1天0900小时以400x的放大倍数获得。
图2是根据本发明的具体实施方式在异养生长条件并且引入氧的情况下培养的微藻样品的显微照片。显微照片在第1天2000小时以1000x的放大倍数获得。
图3是根据本发明的具体实施方式在异养生长条件并且引入氧的情况下培养的微藻样品的显微照片。显微照片在第2天0800小时以1000x的放大倍数获得。
图4是根据本发明的具体实施方式在异养生长条件并且引入氧的情况下培养的微藻样品的显微照片。显微照片在第2天1000小时以1000x的放大倍数获得。
图5是根据本发明的具体实施方式在异养生长条件并且引入氧的情况下培养的微藻样品的显微照片。显微照片在第2天1200小时以1000x的放大倍数获得。
图6是根据本发明的具体实施方式在异养生长条件并且引入氧的情况下培养的微藻样品的显微照片。显微照片在第3天0800小时以400x的放大倍数获得。
图7是描述根据本发明的具体实施方式在异养培养过程中指定时间点小球藻培养物生物质的图。
图8是描述根据本发明的具体实施方式在另一异养培养过程中指定时间点小球藻培养物生物质的图。
发明详述
本文描述了培养微藻的方法。在特定的具体实施方式中，本文描述的方法对于提供下述一种或多种物质的良好生产是有用的：微藻生物质、蛋白质或脂质。在某些此类具体实施方式中，本文描述的方法可以从微藻培养物得到高水平的脂质产量。根据本发明的方法可以用于生产微藻的培养物，其中微藻细胞含有高浓度的脂质，并且显著浓度的脂质释放至培养基中。例如，在某些具体实施方式中，本文描述的方法可以提供微藻培养物，其中微藻积聚了至少是它们细胞重量的25％的脂质，并且发酵液包括至少10％(v/v)的脂质。如本文所描述，根据本发明的方法还可适合于提供用微藻培养物进行的良好的或理想的生物质生产和/或良好的或理想的蛋白质生产。
本文还描述了实施所述方法的系统。此类系统的具体实施方式可包括一个或多个用于培养微藻的生物反应器。适合于实施本文描述的方法的生物反应器系统可包括如下的一个或多个：一个或多个生物反应器；一个或多个流体、气体和/或其它介质来源；循环管线(lines)或管道(conduits)，用于输送流体、气体、培养基、培养的藻类，等等；端口(ports)，用于流体、气体、培养基、培养的藻类等的输入或输出；一个或多个阀门，用于控制流体、气体和/或其它介质的流量；一个或多个泵；一个或多个储槽；和一个或多个压力槽，用于容纳加压的流体、气体和/或其它介质。在某些具体实施方式中，本文描述的生物反应器系统可包括一个或多个过滤器，用于收集、分离、递送和/或浓缩微藻、生长培养基、生长培养基的组分、一种或多种工艺气体、和/或存在于或被引入至生物反应器系统中的其它材料。
各种不同种类的微藻可适合用于本文描述的方法。在一些具体实施方式中，可使用单一种类的微藻，但是在其它具体实施方式中，本文描述的方法中使用的培养物可包括两种、三种、四种或更多种类的藻类。在进一步的具体实施方式中，本文描述的方法中使用的培养物可包括两种、三种、四种或更多种共同培养的藻类。使用的微藻可基于若干因素中的一种或多种来进行选择，所述因素包括，例如，期望的油产率、期望的蛋白质产量、接触工艺条件时微藻的生长与稳定性、和微藻提供可重复结果的能力，等等。可用于本文描述的方法的微藻种类的例子包括，但不限于，淡水和海洋微藻种类，诸如纤维藻属(Ankistrodesmus)，葡萄藻属(Botryococcus)，小环藻属(Cyclotella)，杜氏藻属(Dunaliella)，菱板藻属(Hantzschia)，微球藻属(Nannochloris)，菱形藻属(Nitzschia)，褐指藻属(Phaeodactylum)，栅列藻属(Scenedesmus)，裂丝藻属(Stichococcus)，扁藻属(Tetraselmis)，海链藻属(Thalassiosira)，隐甲藻属(Crypthecodinium)，新绿藻属(Neochloris)，或裂殖壶菌属(Schizochytrium)种类。在特定的具体实施方式中，微藻可以是小球藻属(Chlorella)的一种，例如，但不限于，小球藻(Chlorella fusca)，原始小球藻(C.protothecoides)，蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)，凯氏小球藻(C.kessleri)，普通小球藻(C.vulgaris)，啤酒小球藻(C.saccharophila)，沙堆小球藻(C.sorokiniana)，或椭圆小球藻(C.ellipsoidea)。在某些具体实施方式中，微藻可选自海洋微藻种类，诸如微拟球藻(Nannochloropsis)种类。
除非另有说明，否则本文描述的方法可以使用本领域技术人员公知的标准材料和设备来实施。例如，固体和液体生长培养基通常可从多种来源购买，适合多种微生物菌株的特定培养基的制备说明可以从http://www.utex.org/在线找到，该网站是由德克萨斯大学奥斯汀分校针对藻类的培养物保藏(UTEX)而进行维护的。通过咨询前面指出的URL，或者通过咨询保藏微生物培养物的其它组织，例如，SAG、CCAP或CCALA，能够确定本文描述的方法可使用的合适培养基。SAG是指哥根廷大学(哥根廷，德国)的藻类培养物保藏中心(CultureCollection of Algae)，CCAP是指由苏格兰海洋科学协会(苏格兰，联合王国)管理的藻类和原生动物培养物保藏机构，CCALA是指捷克共和国植物研究所的海藻实验室的培养物保藏机构。
虽然本领域先前描述的若干方法利用工程微藻或转基因微藻来提高微藻脂质产量，但是本文描述的方法不需要对微生物本身进行这样的修饰。如文本所描述以及实施例详细介绍的，利用非工程微藻或未经基因修饰的微藻，本文描述的方法的具体实施方式可快速获得高密度微藻培养物，培养的微藻中具有高脂质含量，并且发酵液中具有高浓度胞外脂质。在一些其它的具体实施方式中，本文描述的方法可利用工程微藻或转基因微藻。
容易理解的是，本文通常描述的具体实施方式是示例性的。下面对各种具体实施方式的更详细的描述并非意在限制本发明的范围，而仅仅是代表各种具体实施方式。此外，本领域技术人员在不脱离本发明范围的前提下可以改变本文描述的方法的步骤顺序或操作。换言之，除非特定的步骤顺序或操作对于具体实施方式的正确操作是必须的，否则特定步骤或操作的顺序或使用可被修改。
除非另有说明，否则本文使用的技术术语具有本领域公知的正常含义。为了清楚起见，结合实例对下述术语进行明确定义。
如本文所用，术语“生物质”是指由细胞生长和/或增殖所产生的物质。生物质可包含细胞和/或细胞内容物以及细胞外物质。细胞外物质包括，但不限于，细胞分泌的化合物(即，脂质)。
如本文所用，术语“生物反应器”是指在其中培养(可选地，悬浮培养)细胞的壳体(enclosure)或部分壳体。生物反应器的类型包括光生物反应器和发酵罐。如本文所用，术语“发酵罐”是指适合于异养培养和/或微藻培养物增殖的生物反应器。本文描述的用于培养、繁殖和收获藻类的系统包括至少一个生物反应器，并且，在特定的具体实施方式中，根据本发明的系统包括至少一个发酵罐。
如本文所用，术语“共培养”(co-culture)及其变型，例如“共同培养”(co-cultivate)，是指在相同培养物或生物反应器中存在两种或多种类型或种类的藻类细胞。
如本文所用，术语“培养的”(cultivated)及其变型，是指通过使用预设的培养条件使一种或多种细胞有目的的生长(即细胞尺寸、细胞内容物和/或细胞活性的增加)和/或繁殖(即通过有丝分裂使细胞数目增加)。生长与繁殖的组合可称为增殖。所述一种或多种细胞可以是微生物例如微藻的细胞。预设条件的例子包括在生物反应器中使用确定成分培养基(defined medium)(具有已知的特征，例如pH、离子强度、碳源(即碳源的类型和/或水平))、规定的温度、氧含量或水平、氧输送速率、二氧化碳水平和生长。该术语并不指自然条件下或者其它没有直接人为干预的条件下微生物的生长和繁殖，例如，最终石化产生地质原油的有机体自然生长。
如本文所用，术语“固定碳源”是指在常温常压下以固体或液体形式存在的含碳分子。
如本文所用，术语“碳氢化合物”是指：(a)只含氢原子和碳原子的分子，其中碳原子共价连接形成线型的、分枝的、环状或部分环状主链，氢原子连接至主链上；或者(b)仅主要含有氢原子和碳原子的分子，和通过一至四个化学反应能够转变为只含氢原子和碳原子的分子。后者的非限制性实例包括在碳原子和氢原子之间含有氧原子以形成醇分子的烃类，以及含有单一氧原子的醛类。将醇还原为只含有碳原子和氢原子的烃的方法是已知的。碳氢化合物的另一个例子是酯，其中有机基团代替含氧酸的一个氢原子(或多于一个的氢原子)。碳氢化合物的分子结构从最简单的结构向大分子量复杂结构变化，其中，最简单的结构是甲烷(CH4)形式，甲烷是天然气的组成成分，大分子量复杂结构例如是原油、石油和沥青中发现的沥青质。烃类可以是气体、液体或固体形式或者是这些形式的任意组合，并且在主链上具有一个或多个位于相邻碳原子之间的双键或三键。因此，术语“碳氢化合物”包括线型的、分枝的、环状的或部分环状的烷烃、烯烃、脂质和石蜡。实例包括，但不限于，丙烷、丁烷、戊烷、己烷、辛烷、三油精和鲨烯。
如本文所用，术语“疏水部分”(hydrophobic fraction)是指与水相相比在疏水相中更易溶解的材料部分(portion)或部分(fraction)。疏水部分基本不溶于水中和通常的非极性液体。
如本文所用，术语“营养的限制性浓度”是指培养物中限制培养的有机体繁殖的浓度。“营养的非限制性浓度”是在给定的培养时期支持最大繁殖的浓度。因此，当存在营养的限制性浓度时，给定的培养时期所产生的细胞数目低于营养是非限制性的时候。当营养以大于支持最大繁殖所需要的浓度存在时，称培养物中营养“过剩”。
如本文所用，术语“脂质”和“脂类”是指一类碳氢化合物，它们在非极性溶剂(诸如乙醚和氯仿)中是可溶的并且在水中是相对或完全不溶的。脂质分子具有这些性质是因为它们主要由长的碳氢化合物尾部组成，这些长的碳氢化合物尾部在性质上是疏水的。脂质的例子包括：脂肪酸(饱和的和不饱和的)；甘油酯或甘油糖脂(glycerolipids)(诸如单甘酯，双甘酯，甘油三酸酯，或者中性脂肪，和甘油磷脂(phosphoglycerides)或甘油磷脂(glycerophospholipids))；非甘油酯(鞘脂类，包括胆固醇和甾类激素在内的固醇脂类，包括萜类、脂肪醇、蜡和聚酮在内的异戊烯醇脂类(prenol lipids))；和复合脂质衍生物(糖-连接的脂质或糖脂，和蛋白质-连接的脂质)。如本文所用，术语“脂肪”是指称为“三酰基甘油酯”的脂质的亚组。
如本文所用，术语“细胞溶解”(lysis)和“细胞溶解”(lysing)是指脂膜的破坏，并且，即便存在，有机体的细胞壁足以释放至少一些细胞内容物。由破坏靶细胞完整性的已知机械、病毒学或渗透学的机制能够实施细胞溶解。在某些具体实施方式中，通过“细胞裂解”(cytolysis)来实施细胞溶解，“细胞裂解”是指在低渗环境中细胞的溶解。细胞裂解由如下引起：过度渗透，或者水向细胞内部运动(水化(hyperhydration))引起细胞破裂。如本文所用，术语“溶菌产物”(lysate)是指含有溶解的细胞的内容物的溶液、悬浮液或分散体。
如本文所用，术语“微藻”是指含有叶绿体并且可选地能够进行光合作用的真核微生物，或者是指能够进行光合作用的原核微生物。微藻包括：专性光合自养生物，其不能够将固定碳源代谢为能量，以及异养生物，其能够只依靠固定碳源生存。微藻可以是指细胞分裂之后不久就从姐妹细胞分离的单细胞生物，诸如衣藻属(Chlamydomonas)，并且，还可以是指例如团藻属(Volvox)的微生物，其是两种不同细胞类型的简单多细胞光合微生物。术语“微藻”还可以是指诸如小球藻属和杜氏藻属的细胞。术语“微藻”还可以包括显示细胞-细胞粘附的其它微生物光合生物，诸如阿格门氏藻属(Agmenellum)、项圈藻属(Anabaena)和桑堪藻(Pyrobotrys)。术语“微藻”还可以包括专性异养微生物，其已经丧失了进行光合作用的能力，诸如某些腰鞭毛虫藻类。
如本文所用，术语“培养基”(media)、“营养培养基”(culture media)和“生长培养基”(growth media)是指与微藻一起被包括在光生物反应器或发酵罐中的物质，有助于产生和/或保持一种环境，在该种环境中能够获得具有所期望性质的微藻培养物。此种培养基可以是固体或液体，典型地提供所期望的海藻生长所必需的一种或多种营养或物质，并且，通常能够从多种来源获得。如上所述，适合多种微藻菌株的培养基和培养基制备说明可以从http://www.utex.org/在线找到，该网站是由德克萨斯大学奥斯汀分校针对其藻类的培养物保藏(UTEX)而进行维护的。通过咨询保藏微生物培养物的其它组织，例如，SAG、CCAP或CCALA，能够确定本发明的方法可使用的其它合适培养基。SAG是指哥根廷大学(哥根廷，德国)的藻类培养物保藏中心(Culture Collection of Algae)，CCAP是指由苏格兰海洋科学协会(苏格兰，联合王国)管理的藻类和原生动物培养物保藏机构，CCALA是指捷克共和国植物研究所的海藻实验室的培养物保藏机构。
微藻的异养培养
本文描述的方法可以包括在异养生长条件下培养微藻培养物。虽然微藻异养培养的标准方法是已知的(参见，例如，Miao and Wu,J.Biotechnology,2004,11:85-93andMiao and Wu,Biosource Technology(2006)97:841-846)，本文描述的方法向此类方法中引入了新的方面，并且，已经发现在本文描述的异养生长条件下培养微藻培养物为高密度微藻培养物的快速繁殖提供了有利条件，其中，能够从前述高密度微藻培养物收获、获得、提取或分离到脂质、蛋白质和海藻生物质。虽然本文描述的方法和系统一般是在脂质或产碳氢化合物藻类的情况下进行描述的，但是本发明的方法和系统并不限于此。如本文所详细描述的，一系列微藻可以采用本文描述的方法和系统进行培养，并且，培养条件可以根据收获的资源来进行调整。特别地，在某些具体实施方式中，可以将培养条件调整为着重于生物质、蛋白质或脂质的生产。在某些具体实施方式中，可以将微藻的培养条件调整为提高生物质中选定的组分或物质的产量。例如，包括但不限于pH、温度、营养组成和/或营养浓度的条件可以被修改以调整或提高生物质中选定的组分或物质的产量。
通常，在本文描述的方法中，可以将微藻接种至盛装于发酵罐中的培养基。接种之后，在细胞开始生长之前，有一段迟滞期(也称为“迟滞阶段”)。迟滞期之后，生长速率将稳步提高，并进入对数期(也称为“指数期”)。反过来，指数期之后生长减慢，原因是营养减少和/或有毒物质增加。在缓慢生长之后，生长停止，微藻细胞进入稳定期或稳定状态，这取决于提供给细胞的具体环境。培养物中的微藻细胞所进行的脂质生产可发生在对数期或之后，包括稳定期，其中营养可被提供或可获得以便在没有细胞分裂时脂质生产仍继续。
可以从实验室规模到商业规模来大批量培养微藻。已知的发酵罐，例如已知的钢制发酵罐，可用于调节出多种培养容积以用于根据本发明描述的微藻培养物的异养培养。与用于啤酒和/或葡萄酒生产的发酵罐类似的发酵罐是合适的，例如用于酒精生产的大型、商业规模的发酵罐。发酵可以是大规模液体发酵，例如在悬浮培养物中进行，并且，如本文所描述，发酵步骤可以包括从细胞的少量培养物开始，所述少量培养物通过细胞的生长和繁殖能扩大为大生物量。
适合微藻异养生长的培养基可以盛装在用于本文描述的方法的发酵罐中。虽然生长培养基可包括固体和液体组分，但是生长培养基通常是为微藻培养提供有利环境的水溶液、悬浮液(suspension)、分散体(dispersion)、乳液(emulsion)或浆体(slurry)。一旦向包含在发酵罐中的培养基中接种微藻培养物并且微藻开始生长，就形成了发酵液。发酵液包括生长培养基以及非活细胞物质，微藻排泄的废产物，和微藻分泌的脂质或其它物质。如本文所用，术语“发酵液”不包括发酵罐中包含的由微藻的完整活细胞组成的部分。
引入至发酵罐的微藻接种物可包括单一种类的微藻或者共培养的两种或更多种。此外，多种不同种类的微藻可适合用于本文描述的方法，并且在特定的具体实施方式中，培养的微藻可包括本文详细描述的一种或多种微藻。在接种至发酵罐之前，可以先为异养繁殖制备或“准备”微藻接种物。在一些具体实施方式中，用于接种发酵罐的微藻可通过首先在自养繁殖条件下(诸如光生物反应器)培养需要的微藻种类而产生。在某些此类具体实施方式中，可以采用用于选定的微藻自养培养的标准条件。当微藻接种物通过使用自养生长条件首先培养微藻而产生时，可以繁殖微藻自养培养物以提供具有1％至4％藻类固体含量的培养物。或者，可以繁殖自养培养物以提供具有大约0.5g/L至大约50g/L藻类固体含量的培养物。在特定的具体实施方式中，可以繁殖培养物以提供具有选自如下的藻类固体含量的培养物：大约1g/L至大约50g/L，大约1g/L至大约40g/L，大约1g/L至大约30g/L，大约1g/L至大约20g/L，大约1g/L至大约10g/L，和大约1g/L至大约6g/L。在某些具体实施方式中，藻类固体含量可以是生物质的度量。一旦获得具有所需固体含量的自养培养物，等份的培养物就可以被去除和浓缩(例如，通过离心或过滤(例如通过膜过滤))。如果需要，可对浓缩的微藻进行洗涤与再次浓缩。为了形成加入到发酵罐中的接种物，可以将自养准备和浓缩的微藻在选择培养基中重新悬浮以提供所需体积和细胞密度的接种物。
一旦发酵罐中接种了所需的微藻，就可以在控制的培养条件下进行微藻的培养或共培养(繁殖两种或多种微藻)。随着发酵罐中培养物成熟，可以监控和调整培养条件。如本文所描述，可以控制培养基的温度、pH、营养曲线和输入到微藻培养物中的氧气流量。
用于黑暗期发酵罐的培养基可包括适当的营养源供生长、繁殖和目标资源(例如藻类生物质、蛋白质或脂质)的生产。在某些具体实施方式中，黑暗期发酵罐可包括不透明或基本不透明的壳体(例如，储槽(tank)或容器(vessel))。用于培养基的合适营养源可包括原材料，例如下述的一种或多种：固定碳源，诸如右旋糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、N-乙酰葡糖胺、甘油、弗罗里多苷(floridoside)、葡萄糖醛酸、玉米淀粉、解聚纤维素材料、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清或糖蜜；脂肪源，诸如脂肪或植物油；氮源，诸如蛋白质、大豆粉、玉米浆、氨(纯的或盐形式的)、硝酸酯或硝酸盐、分子氮或酵母提取物；磷源，诸如磷酸盐；和一种或多种辅酶或辅酶因子。培养基可利用的其它碳源，特别是葡萄糖源，包括小麦、土豆、稻和高粱。
在各种具体实施方式中，K(斯科特实验室)，一种混合的复合酵母营养物，可以被添加或引入至培养基。也可以使用其它混合的复合酵母营养。在一些具体实施方式中，所述混合的复合酵母营养可包括硫酸镁、泛酸钙、非活性酵母、硫胺素、叶酸、烟酸和/或磷酸氢二铵中的一种或多种。
在某些具体实施方式中，营养物酵素(ferm)(例如，营养物Vit EndTM(斯科特实验室))，一种特定的非活性酵母，可以被添加或引入至培养基。也可以使用其它特定的非活性酵母。
在一些具体实施方式中，微量矿物滴(微量矿物研究)，一种微量矿物添加剂，可以被添加或引入至培养基。也可以使用其它微量矿物添加剂。在多种具体实施方式中，微量矿物添加剂可包括钙(例如碳酸钙)、铁(例如甘氨酸螯合铁)、碘、镁(例如氧化镁)、氯化物(例如氯化钾)、硅、硒、磷、铬、锰、铜、钼、锌、钒、其它离子微量元素和/或其它微量元素中的一种或多种。在多种其它的具体实施方式中，微量矿物添加剂可包括如下中的一种或多种：铝、锑、砷(例如无机砷)、钡、铍、铋、硼、溴化物、镉、钙、碳酸盐、铈、铯、氯化物、铬、钴、铜、镝、铒、铕、氟化物、钆、镓、锗、金、铪、钬、铟、碘、铱、铁、镧、铅、锂、镥、镁、锰、汞、钼、钕、镍、铌、锇、钯、磷、铂、钾、镨、铼、铑、铷、钌、钐、钪、硒、硅、银、钠、锶、硫酸盐/硫、钽、碲、铽、铊、钍、铥、锡、钛、钨、钒、镱、钇、锌、锆和/或其它自然产生的微量矿物(即在海水中发现的自然产生的微量矿物)。
以如下浓度的一种或多种外源提供的固定碳源来提供一种或多种碳源：至少大约50μM、至少大约100μM、至少大约500μM、至少大约5mM、至少大约50mM和至少大约500mM。当用作固定碳源时，以选自大约2.5g/L至大约125g/L浓度范围的浓度来提供右旋糖。在以右旋糖作为固定碳源的特定具体实施方式中，培养基中右旋糖的浓度选自2.5g/L至100g/L、5g/L至100g/L和10g/L至100g/L。在其它此类具体实施方式中，培养基中右旋糖的浓度可选自2.5g/L至75g/L、5g/L至75g/L和10g/L至75g/L。在进一步的此类具体实施方式中，培养基中右旋糖的浓度可选自15g/L至65g/L、20g/L至55g/L和25g/L至50g/L。培养基中包含的右旋糖的量可以随着时间而增加，以确保足够的营养用于所期望的生长或产品特点。例如，当向发酵罐中接种微藻进行培养时，培养基可以包括浓度是2.5g/L至10g/L的右旋糖，随着培养过程的进行，右旋糖浓度会增加到50g/L至100g/L。
在一些具体实施方式中，可以确定用于微藻繁殖或在微藻繁殖期间使用的一种或多种碳源的总量或总体积。一种或多种碳源的总量可以是大约1000g/10L发酵液。在一些具体实施方式中，一种或多种碳源的总量可以是大约100g/10L发酵液至大约1000g/10L发酵液，大约 250g/10L发酵液至大约1000g/10L发酵液，大约500g/10L发酵液至大约1000g/10L发酵液，大约750g/10L发酵液至大约1000g/10L发酵液，和大约900g/10L发酵液至大约1000g/10L发酵液。
在多种具体实施方式中，如前所述，总量的一种或多种碳源可以不是一次或在一个时间点加入到培养基中。例如，总量的一种或多种碳源可以被分为不止一份(aliquot)。然后，一种或多种碳源的每一份在微藻繁殖过程中的不同时间点被加入到培养基和/或发酵液中。例如，在时间点零将一种或多种碳源的第一份加入到接种培养基中，在时间点零之后大约两小时将一种或多种碳源的第二份加入到接种培养基中，在时间点零之后大约四小时将一种或多种碳源的第三份加入到接种培养基中，等等。换言之，在繁殖过程中每30分钟，在繁殖过程中每小时，在繁殖过程中每两小时，在繁殖过程中每三小时，等等，可将一种或多种碳源的一份加入到接种培养基中。在某些具体实施方式中，被分成若干份的一种或多种碳源可以在繁殖过程中的不同时间点加入。例如，在繁殖过程中可以改变一种或多种碳源的每一份加入的时间间隔。
在某些具体实施方式中，丙三醇(本文中也称作“甘油”)可作为固定碳源。它可以被单独加入，或者与一种或多种其它固定碳源一起被加入。当它包含在培养基中时，它以大约0.05％至大约15％(v/v)的量包含在培养基中。在特定的具体实施方式中，包含在培养基中甘油的量选自大约1％至大约10％(v/v)。在进一步的具体实施方式中，甘油以选自大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％(v/v)的量包含在培养基中。
发酵罐中培养物的温度可被监控并维持在所需的范围。通常，温度可以维持在例如大约15℃至大约40℃之间。在特定的具体实施方式中，温度可以维持在选自如下的范围：大约15℃至大约35℃之间，大约15℃至大约30℃之间，大约15℃至大约25℃之间，大约25℃至大约35℃之间，大约30℃至大约35℃之间，和大约30℃至大约32℃之间。
发酵罐中微藻培养物的pH值也可以被控制和维持在大约4.0至大约9.5。在特定的具体实施方式中，pH值可以维持在选择下述之一的pH值范围：大约4.5至大约7.5，大约5.0至大约7.0，大约5.5至大约6.5，大约6.0至大约9.5，大约7.0至大约9.5。微藻培养物的pH值可以通过使用含水缓冲体系来维持。可以使用适合微藻生长的任何缓冲体系，在特定的具体实施方式中，氨水(NH4OH)和磷酸(H3PO4)可包含在培养基中以使培养物维持在所需要的pH。当用作缓冲体系时，氨还可以作为氮源并且磷酸还可以作为磷源。例如，氨以足够提供每100g藻类生物质大约1.0g至大约10g N2的量包含在培养基中。此外，磷酸以足够提供每100g藻类生物质大约1.0g至大约5g P2O5的量包含在培养基中。在特定的具体实施方式中，在培养过程中，培养基可保持在包括足够的氨以提供发酵液内每100g藻类生物质大约2g至大约7g N2的N2浓度，并且保持在包括足够的磷酸以提供发酵液内每100g藻类生物质大约1.0g至大约3g P2O5的P2O5浓度。
在发酵过程中也可以控制发酵培养物内氧的量。特别地，已发现，当微藻在发酵罐内生长和繁殖时，将氧(O2)输送至微藻培养物中可以使脂质产量增加。在一些具体实施方式中，氧可以是压缩的氧气。例如，氧气可以是大约75％至大约100％氧，大约80％至大约100％氧，大约90％至大约100％氧，大约90％至大约98％氧，大约95％氧，和大约98％氧。在某些具体实施方式中，可以从氧气发生器或氧呼吸袋中释放。根据本发明的方法中，对于每10L总体积的发酵液，氧以大约0.1L/分钟至大约2.5L/分钟的速度输送至培养物中。在特定的具体实施方式中，每10L总体积的发酵液，氧以选自如下的速度注入到培养物中：大约0.25L/分钟至大约4.5L/分钟，大约0.25L/分钟至大约2.0L/分钟，大约0.25L/分钟至大约1.5L/分钟，大约0.35L/分钟至大约1.5L/分钟。可以使用任何合适的方法将氧输送至培养物中。例如，可以向发酵罐提供输气管道以将氧引入培养物中，这样一来，氧会往上冒泡和/或在发酵液中扩散。此外，可以连续不断地将氧输送至培养物中，或者，可以在发酵罐内微藻培养物繁殖或保持期间在不同点在一个或多个选定的时期被输入。
微藻培养物可以在发酵罐内培养最短停留时间，并且，使用本文描述的方法可快速(例如，小于48小时)获得发酵液内高浓度的微藻。在特定的具体实施方式中，微藻培养物可以保持在发酵罐内一段时间，其选自至少24小时、至少36小时、至少48小时和至少60小时。在某些此类具体实施方式中，微藻培养物可以保持在发酵罐内一段时间，其选自至少20小时、至少30小时、至少40小时、至少50小时和至少60小时。这样的最短停留时间，连同本文详细描述的培养条件，可以产生高浓度微藻细胞。例如，在某些具体实施方式中，本文描述的方法可以产生48小时内显示微藻浓度范围是70-100g/L藻类，75-95g/L藻类和80-90g/L藻类的微藻培养物。
其它的组分和物质可以引入至发酵罐中使用的培养基，以便保持和/或实现所希望的微藻的生长、繁殖和/或脂质生产。在一个实施例中，已经发现，将啤酒花加入培养基中对于避免培养物中有不需要的微生物生长或者培养物被不需要的微生物污染是有效的，其中不需要的微生物例如是酵母或细菌，它们会抑制微藻的生长、健康和繁殖。如果将啤酒花加入到培养基中，每升微藻培养物使用大约5克至500克的啤酒花(5-500g/L)。在特定的具体实施方式中，每升微藻培养物使用大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475和500克的啤酒花。
在特定的具体实施方式中，可以调整发酵罐中的培养基和条件以产生适合藻类生物质、蛋白质或脂质生产的微藻培养物。当需要可提供高密度藻类生物质和高水平脂质生产的微藻培养物时，在一些具体实施方式中，培养基的pH值维持在大约5.4至7.0，温度维持在大约18℃至27℃，氧以每10L发酵液大约1.5L/分钟的速度输送至培养物中。
当需要可提供高密度藻类生物质和高水平蛋白质生产的微藻培养物时，在一些具体实施方式中，培养基的pH值维持在大约6.8至9.2，温度维持在大约21℃至33℃，氧以每10L发酵液大约0.35L/分钟的速度输送至培养物中。当需要可提供提高的藻类生物质的微藻培养物时，在一些具体实施方式中，培养基的pH值维持在大约5.5至6.2，温度维持在大约21℃至28℃，氧以每10L发酵液大约1.0L/分钟的速度输送至培养物中。在每一此类具体实施方式中，培养条件不仅有利于生产目标产物(即，脂质、蛋白质或生物质)，而且产生48小时内显示微藻浓度范围是70-100g/L藻类，75-95g/L藻类和80-90g/L藻类的微藻培养物。
当选择工艺条件以有利于脂质生产时，这些条件可使脂质生产是微藻的一阶函数。脂质生产力的三个不同标志(每升的干细胞重量，每升细胞外脂质的克数，和干细胞重量相对于脂质的百分比)可作为本文描述的方法的一部分被考虑和监测。根据本发明的方法可以提供微藻培养物中每升细胞外脂质的克数和干细胞重量相对于脂质的百分比的理想改进。在特定的具体实施方式中，本文描述的方法可产生这样的微藻培养物：微藻包括以干细胞重量计百分比至少是25％的脂质。例如，本文描述的方法可产生这样的微藻培养物：微藻包括以干细胞重量计百分比选自如下的脂质：至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％和至少80％。此外，在一些具体实施方式中，根据本发明的方法可产生包括至少10％(v/v)脂质的发酵液。例如，本文描述的方法可产生微藻培养物，其分泌高水平的脂质，产生发酵液，该发酵液包括选自至少10％(v/v)、至少15％(v/v)、至少20％(v/v)和至少25％(v/v)的量的脂质。在进一步的具体实施方式中，本文描述的方法可产生微藻培养物，其中微藻产生高水平的细胞内脂质(即，以干细胞重量计包含在微藻内的高水平脂质)和包含在发酵液内的高水平细胞外脂质。
在一些具体实施方式中，微藻生物质的增加与微藻脂质产量的增加相对应。例如，随时微藻培养物的生物质增加，微藻培养物中微藻产生的脂质的量也增加。在某些具体实施方式中，微藻培养物的生物质以与微藻产生的脂质增加速率大约相同的速率增加。在某些其它具体实施方式中，微藻培养物的生物质以比微藻产生脂质的速率更大的速率增加。在某些其它具体实施方式中，微藻培养物的生物质以比微藻产生脂质的速率更小的速率增加。
图1-6是描绘普通小球藻(Chlorella vulgaris)样品的显微照片，其中，在30L发酵液中在异养生长条件下并引入氧来培养普通小球藻样品。发酵液的含量在下面的实施例1中进行描述。图1是描绘根据本发明的具体实施方式在异养生长条件并引入氧的条件下进行培养之前或培养开始时微藻样品的显微照片。显微照片是在第1天0900小时获得，400x放大。如图1所描绘，藻类细胞是可见的，包括与自养生长条件下培养的微藻细胞所产生的脂质水平差不多的脂质水平。进一步，周围的发酵液基本是清澈的并且基本是无脂质的。
图2是描绘根据本发明的具体实施方式在异养生长条件并引入氧培养的微藻样品的显微照片。显微照片是在第1天2000小时获得，1000x放大。图2描绘了一簇细胞，其中单个细胞平均来说比图1的单个细胞更大。由图2还可看出，至少一些微藻细胞在尺寸上是异常的(即比正常的大)。进一步，图2中脂质是可见的，其是分布在微藻细胞周围基本清楚的点。
图3是描绘根据本发明的具体实施方式在异养生长条件并引入氧培养的微藻样品的显微照片。显微照片是在第2天0800小时获得，1000x放大。与图1和2的微藻细胞相比，图3描绘了分布在微藻细胞簇周围的脂质数量的增加。新的微藻细胞是可见的，这些细胞小而饱满。
图4是描绘根据本发明的具体实施方式在异养生长条件并引入氧培养的微藻样品的显微照片。显微照片是在第2天1000小时获得，1000x放大。图4显示细胞间隙基本充满了脂质。此外，这些细胞比自养生长条件下培养的微藻细胞更大，并且这些细胞也可包括大量的脂质，其中至少一些细胞主要是由脂质组成。
图5是描绘根据本发明的具体实施方式在异养生长条件并引入氧培养的微藻样品的显微照片。显微照片是在第2天1200小时获得，1000x放大。图5中的微藻细胞也比自养生长条件下培养的细胞更大，并且也包括大量的脂质。另外，至少一些细胞主要是由脂质组成。至少部分地由于存在脂质，聚集或成簇的微藻细胞是可见的。
图6是描绘根据本发明的具体实施方式在异养生长条件并引入氧培养的微藻样品的显微照片。显微照片是在第3天0800小时获得，400x放大。在该时间点，可以确定至少有一些微藻细胞已经停止生长。大约在该时间点，微藻细胞的生长已经达到了稳定时期。
参考图1-6，当焦点通过微藻细胞膜时，包括脂质的大体“发光的”中心是可见的。如果变换焦点，相同的细胞会因为焦点对着细胞壁而变暗。在整个时间进程中，如图1-6所描绘，随着微藻培养的进行，“发光的”中心的尺寸通常会增大。
在一些具体实施方式中，诱导微藻中脂质产生的方法可包括将微藻接种至培养基和在异养生长条件下繁殖微藻。异养生长条件可包括抑制、限制或减少接种的培养基暴露于光。在一些具体实施方式中，接种的培养基基本上处于暗环境中。例如，接种的培养基可以盛装在不透明或基本不透明的壳体内。在各种具体实施方式中，诱导微藻中脂质产生的方法可进一步包括将氧输送或引入至接种的培养基中，以便使微藻以比标准生长条件或自养生长条件下生产速度更大的速度来产生脂质。在某些具体实施方式中，诱导微藻中脂质产生的方法可进一步包括在异养生长条件下繁殖微藻之前先在自养生长条件下培养微藻。
在各种具体实施方式中，对于每10L接种的培养基，按照大约0.1L/分钟至2.5L/分钟的速度将氧输送或引入至接种的培养基中。上文中讨论了输送氧的其它合适的速度。此外，可以通过输气管线将氧输送至接种的培养基，以便氧在接种的培养基中扩散。在一些具体实施方式中，可以将氧基本上连续不断地输送至接种的培养基，而在另一些具体实施方式中，可以在微藻繁殖期间的一个或多个时间段将氧输送至接种的培养基。
在某些具体实施方式中，本文公开的方法可进一步包括监控接种的培养基的温度和将接种的培养基的温度保持在合适的温度范围内(即大约15℃至大约40℃)。在各种具体实施方式中，方法进一步包括监控接种的培养基的pH值和将接种的培养基的pH值保持在合适的pH值范围内(即大约4.0至大约9.5)。可以采用含水缓冲体系或者其它合适的机制或体系来保持pH值。另外，如上所述，其它合适的温度和/或pH值范围也在本发明公开的范围内。当加入微藻接种物时(即，在时间零)，可以收集培养物并对其进行处理以便确定各种条件(即，pH、温度等)的起始数据点。在某些具体实施方式中，接种的培养基可以盛装在黑暗期发酵罐(dark phase fermentor)中，其放置在黑暗或基本黑暗空间中。在某些具体实施方式中，可对黑暗期发酵罐进行配置，以便发酵罐中的培养基不暴露于光。在各种具体实施方式中，可对黑暗期发酵罐进行配置，以便发酵罐中的培养基只暴露于有限水平或较弱水平的光。放置黑暗期发酵罐的空间的温度可调整至有助于黑暗期发酵罐保持所需要的温度。如上所述，其它的机制也可用于将培养物调整或保持在所需的温度。
在各种具体实施方式中，微藻可选自如下种类的至少一种：纤维藻属(Ankistrodesmus)，葡萄藻属(Botryococcus)，小球藻属(Chlorella)，隐甲藻属(Crypthecodinium)，小环藻属(Cyclotella)，杜氏藻属(Dunaliella)，菱板藻属(Hantzschia)，微球藻属(Nannochloris)，微拟球藻(Nannochloropsis)，新绿藻属(Neochloris)，菱形藻属(Nitzschia)，褐指藻属(Phaeodactylum)，微球藻属(Nannochloris)，裂丝藻属(Stichococcus)，扁藻属(Tetraselmis)，海链藻属(Thalassiosira)，和/或，裂殖壶菌属(Schizochytrium)。在某些具体实施方式中，微藻可选自如下的至少一种：小球藻(Chlorella fusca)，原始小球藻(Chlorellaprotothecoides)，蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，凯氏小球藻(Chlorellakessleri)，普通小球藻(Chlorella vulgaris)，啤酒小球藻(Chlorella saccharophila)，沙堆小球藻(Chlorella sorokiniana)，和/或，椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)。
在一些具体实施方式中，可以在发酵罐内处理培养基。如上所述，培养基可包括一种或多种碳源、脂肪源、氮源、磷源、和/或一种或多种辅酶或辅酶因子。碳源可选自如下的至少一种：右旋糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、N-乙酰葡糖胺、甘油、弗罗里多苷(floridoside)、葡萄糖醛酸、玉米淀粉、解聚纤维素材料、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清和/或糖蜜。
在一些具体实施方式中，脂肪源可选自脂肪和/或植物油的至少一种。同样地，氮源可选自如下的至少一种：蛋白质、大豆粉、玉米浆、氨、硝酸酯、硝酸盐、分子氮和/或酵母提取物。如上所述，其它合适的脂肪源和氮源也在本发明的范围内。
在各种具体实施方式中，诱导微藻中蛋白质产生的方法也可包括向培养基中接种微藻和在异养生长条件下繁殖微藻。如上所述，异养生长条件可包括抑制、限制或减少接种的培养基暴露于光。在各种具体实施方式中，诱导微藻中蛋白质产生的方法可进一步包括将氧输送至接种的培养基中，以便使微藻以比标准生长条件或自养生长条件下微藻生产速度更大的速度来产生蛋白质。
在某些具体实施方式中，诱导微藻中蛋白质产生的方法可进一步包括将接种的培养基的pH值维持在6.8至9.2之间。该方法还包括将接种的培养基的温度保持在大约21℃至大约33℃。在某些具体实施方式中，该方法进一步包括每10L接种的培养基以大约0.5L/分钟至大约4.0L/分钟的速度将氧输送至接种的培养基。
在一些具体实施方式中，诱导产生增加的微藻生物质的方法可包括将微藻接种至培养基和在异养生长条件下繁殖微藻。另外，如上所述，异养生长条件可包括抑制、限制或减少接种的培养基暴露于光。在某些具体实施方式中，诱导产生增加的微藻生物质的方法可进一步包括将氧输送至接种的培养基中，以便使微藻生物质以比标准生长条件或自养生长条件下的速度更大的速度来增加。
在某些具体实施方式中，诱导产生增加的微藻生物质的方法可进一步包括将接种的培养基的pH值维持在大约5.5至大约6.2。该方法还可包括将接种的培养基的温度维持在大约21℃至大约28℃。在各种具体实施方式中，该方法进一步包括每10L接种的培养基以大约0.5L/分钟至大约4.0L/分钟的速度将氧输送至接种的培养基。
在某些具体实施方式中，从采用本文公开的一种或多种方法培养的微藻中可以获得、提取、分离和/或纯化到一种或多种脂质和/或蛋白质。
在各种具体实施方式中，引入至黑暗期发酵罐的微藻接种物可以是绿藻(例如，微藻可具有绿色或者基本上是绿色)。在一些具体实施方式中，绿藻处于其执行光合作用的状态。当在上述条件或方法下培养时，绿藻可以转变成白皙藻(blonde algae)。例如，白皙藻可具有大体上的白色。
在某些具体实施方式中，白皙藻可转变成或回变为绿藻。白皙藻存活不会超过56小时，并且可能会在56小时内转变成或回变为绿藻。大约56小时之后，如果不恢复到自养生长条件下繁殖，那么白皙藻可能会死。在一些具体实施方式中，白皙藻向绿藻的转变或回变可包括收集白皙藻样品和将白皙藻样品引入或回送至光生物反应器。例如，白皙藻样品可接触或被供给营养，营养包括但不限于二氧化碳、磷酸氢二铵和/或日光(或其它合适的光源)。白皙藻向绿藻的转变或回变可在大约两周内发生。在一些具体实施方式中，白皙藻向绿藻的转变可在如下时间段发生：大约一周至大约四周内，大约1.5周至大约3.5周内，大约1.5周至大约3周内，或大约2周至大约2.5周内。在各种具体实施方式中，二氧化碳的引入和/或曝气(aeration)可引发或重启白皙藻样品或培养物中的光合作用过程。在某些具体实施方式中，绿藻可在将氧引入至培养基中大约两个小时内转变为白皙藻，如上所述。在某些其它的具体实施方式中，在将氧引入至培养基中大约两个小时至大约4小时内或者在将氧引入至培养基中大约两个小时至大约6小时内，绿藻可转变为白皙藻。
在一些具体实施方式中，将绿藻转变为白皙藻的过程可对藻类加压。将绿藻转变为白皙藻的过程可使藻类的生长被抑制、停止，或者减弱光合作用的机制或过程。在某些具体实施方式中，不产生或生成糖和/或氧，藻类细胞会接触或过度接触它们的天然副产物，并且一些藻类细胞会死亡而另一些藻类细胞存活。在一些具体实施方式中，至少一部分存活的藻类细胞会放弃自然过程(即光合作用)并利用碳和/或氧来产生或生成脂质。这一过程可被称为“超产”(hyper production)。例如，白皙藻可进入超产的条件或状态。在一些具体实施方式中，当白皙藻开始或进入超产时，白皙藻可高速率(高于野生型的速率)产生一种或多种类型的脂质。在发酵期间，白皙藻可受压以便白皙藻产生相较于未受压的藻类水平得到提高的脂质。在某些具体实施方式中，脂质的超产最终会达到稳定期或基本停止。例如，白皙藻过度受压或者一大部分白皙藻细胞被加压并且白皙藻细胞不能继续存活。
在一些具体实施方式中，白皙藻的生长速度或者异养生长条件下并引入了氧所培养的微藻的生长速度可迅速加快(即溶液中藻类细胞的数量会成倍增加)。在同一时间或者基本在同一时间，白皙藻细胞或者异养生长条件下并引入了氧所培养的微藻细胞以增加的速度产生脂质。例如，白皙藻中或者异养生长条件下并引入了氧所培养的微藻中脂质产生的速度大于绿藻中或自养生长条件培养的微藻中脂质产生的速度。当白皙藻产生脂质时，脂质可以从白皙藻细胞释放或排放至周围的溶液。类似地，当异养生长条件并引入氧所培养的微藻产生脂质时，脂质可以从微藻细胞释放或排放至周围的溶液。脂质的增产一直继续，直到白皙藻转化过程停止或者停止在异养生长条件并引入氧来培养微藻。在某些具体实施方式中，培养基的总体积是大于10％至大约20％脂质，并且培养基中的白皙藻细胞或者异养生长条件并引入氧所培养的微藻细胞可包括大约60％至大约80％脂质含量。相反，自养生长条件下繁殖的小球藻属通常包括大约5％至大约14％脂质含量并且通常不排放大量的脂质。白皙藻中或者异养生长条件并引入氧所培养的微藻中脂质的这种增产可在大约48小时内发生。
回收微藻产生的脂质
培养过程完成之后，微藻可从发酵液中分离，并且可收获微藻产生的生物质和/或蛋白质或脂质。采用任何合适的方法可以收获或者收集根据本文描述的方法由微藻产生的脂质(例如，碳氢化合物、脂肪酸、醛、醇和烷)。一旦收集了，脂质和/或碳氢化合物可被进一步精制以生产例如油、燃料或油脂化学品。
当收集存在于发酵液中的细胞外脂质时，可以通过过滤将发酵液与微藻及其它有机物质分离，然后对含有脂质的过滤的发酵液进行离心。离心分离了疏水层中的脂质，疏水层不同于含水层，亲水污染物在其中易于分开，如果过滤之后固体微粒仍存在于发酵液中，那么离心也可将这类物质以沉淀物的形式与脂质物质分离。另外，可使用蛋白酶处理含有细胞或细胞碎片的物质以便在离心之前或之后降解污染蛋白质。在某些情况下，污染蛋白质可共价地与碳氢化合物或碳氢化合物前体连接，其中碳氢化合物前体在去除蛋白质之后可形成碳氢化合物。在其它情况下，碳氢化合物分子可存在于也含有蛋白质的制剂中。可将蛋白酶加入到碳氢化合物制剂中以降解蛋白质(例如，可使用来自灰色链霉菌的蛋白酶(西格玛-奥德里奇，产品目录号P5147))。分解之后，纯化碳氢化合物，去除剩余蛋白质、肽片段和氨基酸。可以采用离心和过滤来完成该纯化。
因为本文描述的方法会产生高浓度的细胞外脂质，所以在一些具体实施方式中，可以采用如下方法来回收脂质：细胞外脂质可以在体内与活微藻细胞分离，然后微藻细胞返回生物反应器继续用于根据本文描述的方法(例如，用作制备加入到发酵罐的微藻培养物的起点)。在特定的具体实施方式中，将微藻与生长培养基中存在的细胞外脂质分离可以采用如下方法来实现：在其它无菌环境中，使细胞接触无毒提取溶剂，随后将活细胞与提取溶剂的疏水部分及脂质分离，其中分离的活细胞随后返回培养容器，例如发酵罐或光生物反应器(参见Biotechnol Bioeng.2004Dec.5；88(5):593-600and BiotechnolBioeng.2004Mar.5；85(5):475-81)。
根据本文描述的方法生产的脂质也可采用全细胞提取而分离。首先破碎细胞，可以采用上面描述的离心来从整个细胞物质(cell mass)中收集细胞内碳氢化合物、细胞膜/细胞壁相连的碳氢化合物以及细胞外碳氢化合物。裂解(lysing)微生物的步骤可以采用任何合适方法来实现，包括热诱导裂解，加入碱，加入酸，使用例如蛋白酶的酶和例如淀粉酶的多糖降解酶，使用超声波，机械裂解，使用渗压震扰，用裂解病毒感染，和/或，表达一种或多种裂解基因。可以进行裂解以释放微生物产生的细胞内分子。裂解微生物的这些方法可以单独使用，或者同时或依次相结合使用。在一些具体实施方式中，在培养结束之后，通过离心将微藻与发酵液分离以产生浓缩的糊状物。离心可能不会从微生物中去除大量的细胞内水并且不是干燥步骤。然后，使用洗涤液(例如，D1水)洗涤生物质以去掉发酵液的生物质和碎片。可选地，在细胞破碎前干燥(烘干、冻干等)洗涤的微藻生物质。或者，发酵完成时，细胞不与一些或全部发酵液分离而直接裂解。例如，当细胞裂解时，细胞的比例是细胞:细胞外流体的比例小于1:1(v:v)。
多种方法可用于将碳氢化合物和脂质与细胞裂解物分离。例如，可以使用疏水溶剂，例如己烷，来提取脂质(参见Frenzetal.1989,Enzyme Microb.Technol.,11:717)。典型地，有机溶剂无需先分离裂解组分，可直接被加入到裂解物中。在一种具体实施方式，上述的一种或多种方法所产生的裂解物可与有机溶剂接触一段时间，该时间足以使脂质和/或碳氢化合物组分与有机溶剂形成溶液。一些情况下，溶液可被进一步精制以回收具体需要的脂质或碳氢化合物组分。溶剂提取方法，例如使用己烷作为溶剂，是本领域公知的。也可以使用如下方法来提取脂质：液化(参见，例如，Sawayama,et al.1999,Biomass andBioenergy 17:33-39和Inoue,et al.1993,Biomass Bioenergy6(4):269-274)；油液化(参见，例如，Minowa,et al.1995,Fuel74(12):1735-1738)；和超临界CO2萃取(参见，例如，Mendes,et al.2003,lnorganica Chimica Acta 356:328-334)。
实施例
通过以下实施例对上述公开的方法和成分进行说明。根据本发明公开的内容，本领域技术人员将意识到，这些实施例的变型和本发明公开的方法及成分的其它实施例可通过有限实验而得到。
实施例1
根据本文公开的方法制备微藻的各种培养物。在每一种培养物中，将5-50mL的微藻接种物悬浮在培养基体积是10L至30L的发酵罐中。使用自养培养的微拟球藻与卜列东小球藻(Chlorella plethocoides)的浓缩浆体制备微藻接种物，其中微藻固体含量为2g/L至4g/L。对于体积为30L的培养基，其包括：
在每个情况中，将培养基和微藻培养物在发酵罐中混合，并在温度为18-35℃、pH为3.5-9.5的条件下培养24小时。在繁殖期间(20-30小时)，以每10L培养的微藻大约0.1-1.0L/分钟的速率将氧气鼓泡通入微藻培养物中。所得微藻生物质的范围为大约45g/L至大约85g/L，其中脂质占微藻干细胞的重量多达40％-70％，并且至少占发酵液的13％-21％(v/v)。
实施例2
准备十组(10)小球藻繁殖物，以优化微藻生物质的生产。表1描述了在不同时间点(例如：0h、4h、6h等)这10组繁殖物的接种培养基的平均体积(以升计量)。还示出了在各个时间点引入到接种培养基中的平均糖量(以克计)。糖作为微藻的营养源而被引入。还示出了在各个时间点引入到接种培养基中的氨量(以ml计，在溶液中稀释至100g/L)。引入氨以调节接种培养基的pH。
继续参考表1，各个时间点的起始pH被描述，随后是终止pH(即，用氨调节pH之后)。“CT mm”列表示样品离心后15ml离心管内的微藻物质或生物质的高度。每个样品的体积约15ml，并以约5000rpm的速度离心或旋转约10分钟。特定时间点的华氏温度(°F)也被表明。最后一列(CT ml A75)表示，在离心管底部收集的微藻物质由高度向体积的换算。A75指离心分离后，微藻物质作为离心管底部藻类的收集物，其是约75％的藻类(即A75)和25％的水分。总A75ml＝以ml计量的总发酵罐体积。
图7是描述如表1所示的以ml值计的总A75的曲线图。如图所示，显示了在每个时间点以ml(毫升)表示的微藻生物质。该图显示了A75的总体积。每个样品首先在不加入氧气的异养生长条件下繁殖大约10小时。大约10小时后，将氧引入微藻的每组繁殖物中，并在整个剩余的繁殖过程中引入氧。因此，表1中的0小时时间点，是在以上所述的不引入氧的10小时培养期结束时测量的。如图7所示，在大约28小时时间点至大约30小时时间点，微藻生物质的增加减慢和/或趋于稳定。
表1:小球藻繁殖物平均-生物质
*稀释溶液得到100g/L
13.5mm＝0.5ml
0.037037A75/CT mm
实施例3
准备十组(10)小球藻繁殖物，以优化蛋白质的生产。表2描述了这10组繁殖物的接种培养基在不同时间点(例如0小时，4小时，6小时等)以升计量的体积。还示出了在各个时间点引入到接种培养基中的平均糖量(以克计)。如上所述，糖作为微藻的营养源而被引入。还示出了在各个时间点引入到接种培养基的氨量(以ml计，在溶液中稀释得到100g/L)。与上述相同，引入氨以调节接种培养基的pH。
继续参考表2，描述了终止pH(即，使用氨调节pH之后)。“CT mm”列表示样品离心后15ml离心管内的微藻物质的高度。每个样品的体积大约为15ml，并以大约5000rpm的速度离心或旋转大约10分钟。特定时间点以华氏温度计量的最高温度也被表明。最后一列表示在离心管的底部收集的微藻物质由高度向体积的换算，如实施例2所描述。
表2:小球藻繁殖物平均-蛋白质
*稀释溶液得到100g/L
13.5mm＝0.5ml
0.037037A75/CT mm
图8为描述如表2所示的以ml值计的总A75的曲线图。如图所示，显示了在每个时间点以ml(毫升)表示的微藻生物质。此图显示了A75的总体积。每个样品首先在异养生长条件、不引人氧的情况下繁殖大约10小时。大约10小时后，将氧气引入每组微藻繁殖物中，并在整个剩余的繁殖过程中引入氧。因此，表1中的0小时时间点是从如上所述不引入氧的10小时培养期结束时测量的。因此，0小时时间点是在异养生长条件开始约10小时后。如图8所示，在约28小时时间点至约30小时时间点，微藻生物质的增加减慢和/或趋于平稳。
如本领域普通技术人员将理解的，本发明公开的每个具体实施方式可以包括其具体陈述的元素，步骤，成分或组分，其中每个方案基本上由其组成或由其组成。如本文所用，过渡术语“包括”指包括但不限于并且允许甚至大量包含未指定的元素，步骤，成分或组分。过渡短语“由...组成”排除任何未指定的元素，步骤，成分或组分。过渡短语“基本上由...组成”将具体实施方式的范围限制为指定的元素，步骤，成分或组分，和那些对具体实施方式没有实质影响的部分。
除非另有说明，在说明书和权利要求书中出现的表示成分的量、性质(如分子量)、反应条件等的所有数字，在所有情况下应理解为由术语“大约”修饰。因此，除非特别指出，否则说明书和所附权利要求中所述的数值参数是近似值，其值可以根据本发明寻求获得的期望性质而变化。至少，为了不限制权利要求的范围，每个数值参数应当至少被理解为根据普通舍入法则对发明中的有效数字进行计算而得到的。当需要进一步明确时，在结合使用规定的数值和范围时，术语“大约”对于本领域技术人员具有合理的数值均归属于它的含义，即，表示稍微多于或略小于所述值或范围，在所述值的±20％范围内；所述值的±19％范围内；所述值的±18％范围内；所述值的±17％范围内；所述值的±16％范围内；所述值的±15％范围内；所述值的±14％范围内；所述值的±13％范围内；所述值的±12％范围内；所述值的±11％范围内；所述值的±10％范围内；所述值的±9％范围内；所述值的±8％范围内；所述值的±7％范围内；所述值的±6％范围内；所述值的±5％范围内；所述值的±4％范围内；所述值的±3％范围内；所述值的±2％范围内；或所述值的±1％范围内。
尽管阐述本发明宽范围的数值范围和参数是近似值，但在具体实施例中阐述的数值会尽可能地精确报道。然而，任何数值固有地必然包含由在它们各自的测试测量中发现的标准偏差导致的某些误差。
除非本文另有说明或与上下文明显矛盾外，在本发明的上下文中(特别是在所附权利要求的上下文中)使用的术语“一”(a)、“一个”(an)、“该”(the)和类似的术语都应被解释为单数和复数。本文中引用的数值范围仅仅用作每个落在该范围内的数值的简写方法。除非本文另有说明，否则每个单独的值被并入本说明书中，如同其在本文中被单独引用一样。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法可以以任何合适的顺序进行。本文提供的任何和所有实施例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地阐明本发明，而不对本发明的所要求保护的范围构成限制。说明书中的语言不应被解释为对实践本发明有必要的但未要求保护的元素。
本发明替代元素的分组或实施例的分组不应被解释为限制。每个群组成员可以单独地被引用和要求保护，也可以与本文中其它的群组成员或其它元素结合起来被引用和要求保护。可以预期的是，为了方便和/或专利性，群组中的一个或多个成员可以包括在组中或者被删除。当任何这样的包括或删除发生时，说明书被认为包括该修饰后的群组，从而能够满足所附权利要求中使用的所有马库什群组(Markush groups)的书面描述。
本文中描述了本发明的某些具体实施方式，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳方式。当然，在阅读上述描述后，这些所描述的实施例的变型对于本领域普通技术人员将变得显而易见。申请人预期本领域技术人员能够视情况采用这样的变型，并且申请人打算以不同于本文具体描述的方式实施本文公开的各种具体实施方式。因此，本发明包括附在权利要求书中所述主题的并且法律所允许的所有修改和等同物。此外，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾，否则本发明包括上述元素在其所有可能变型中的任何组合。
此外，整个说明书已经对许多专利和印刷出版物进行了参考。以上引用的每一个参考文献和印刷出版物都通过整体引用并入本文。
最后，应当理解的是，本文公开的具体实施方式是对本发明原理的说明。其它可以采用的变型也包括在本发明的范围内。因此，作为示例而非限制，可以根据本文的教导利用本发明的替代配置。因此，本发明不限于被精确地示出和描述的内容。
本文所示的细节仅是示例性的，并且仅对本发明的优选具体实施方式进行了说明性讨论，并且被认为是理解本发明的原理和各种实施例概念方面最有用的描述。
在本发明中使用的定义和解释旨在控制未来的任何解释，除非在以下实施例中清楚明确地修改，或者当应用该含义呈现任何无意义或基本上无意义的解释时，该术语将使其无意义或基本上无意义，该定义应取自Webster's Dictionary，第3版或本领域普通技术人员已知的字典，例如Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology(Ed.Anthony Smith，Oxford University Press，Oxford，2004)。
在不脱离本发明基本原理的情况下，对上述实施例的细节进行多处改变，对于本领域技术人员来说是显而易见的。因此，本发明的范围应仅由所附权利要求书来确定。

Claims (43)

1.一种提高微藻中脂质产量的方法，所述方法包括：
向培养基中接种微藻；
在异养生长条件下培养微藻；和
将氧输送至接种的培养基中。
2.根据权利要求1所述的方法，其中微藻以大于自养生长条件下微藻生产速率的速率生产脂质。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在异养生长条件下培养微藻包括减少接种的培养基暴露于光。
4.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中在异养生长条件下培养微藻包括使接种的培养基处于大体上黑暗的环境中。
5.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中按照每10L接种的培养基大约0.1L/分钟至大约2.5L/分钟的速度将氧输送至接种的培养基。
6.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中通过输气管线将氧输送至接种的培养基以便氧在接种的培养基中扩散。
7.根据前述权利要求任一项所述的方法，进一步包括：
从接种的培养基中收集一种或多种目标脂质。
8.根据前述权利要求任一项所述的方法，其中微藻在异养生长条件下进行培养之前大体是绿色的，并且，其中微藻在开始将氧输送至接种的培养基至少4小时之后大体是白色的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中微藻选自下述的至少一种：纤维藻属、葡萄藻属、小球藻属、隐甲藻属、小环藻属、杜氏藻属、菱板藻属、微球藻属、微拟球藻、新绿藻属、菱形藻属、褐指藻属、栅列藻属、裂丝藻属、扁藻属、海链藻属和裂殖壶菌属。
10.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
在向培养基中接种微藻之前先在自养生长条件下培养微藻。
11.根据权利要求1所述的方法，其中培养基包含碳源。
12.根据权利要求11所述的方法，其中碳源选自下述的至少一种：右旋糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、N-乙酰葡糖胺、甘油、弗罗里多苷、葡萄糖醛酸、玉米淀粉、解聚纤维素材料、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清和糖蜜。
13.根据权利要求11或12所述的方法，其中培养基进一步包含脂肪源、氮源、磷源、辅酶和辅酶因子中的至少一种。
14.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
对接种的培养基的温度进行监控；和
将接种的培养基的温度保持在大约15℃至大约40℃。
15.根据权利要求1所述的方法，进一步包括：
对接种的培养基的pH值进行监控；和
将接种的培养基的pH值保持在大约4.0的pH值至大约9.5的pH值。
16.一种分离的且纯化的脂质，由前述权利要求任一项所述的方法生产。
17.一种提高微藻中蛋白质产量的方法，所述方法包括：
向培养基中接种微藻；
在异养生长条件下培养微藻；和
将氧输送至接种的培养基中。
18.根据权利要求17所述的方法，其中微藻以大于自养生长条件下微藻生产速率的速率生产蛋白质。
19.根据权利要求17或18所述的方法，其中在异养生长条件下培养微藻包括减少接种的培养基暴露于光。
20.根据权利要求17-19任一项所述的方法，其中在异养生长条件下培养微藻包括使接种的培养基处于大体上黑暗的环境中。
21.根据权利要求17-20任一项所述的方法，其中按照每10L接种的培养基大约0.1L/分钟至大约2.5L/分钟的速度将氧输送至接种的培养基。
22.根据权利要求17-21任一项所述的方法，其中通过输气管线将氧输送至接种的培养基以便氧在接种的培养基中扩散。
23.根据前述权利要求任一项所述的方法，进一步包括：
从接种的培养基中收集一种或多种目标蛋白质。
24.根据权利要求17所述的方法，其中微藻选自下述的至少一种：纤维藻属、葡萄藻属、小球藻属、隐甲藻属、小环藻属、杜氏藻属、菱板藻属、微球藻属、微拟球藻、新绿藻属、菱形藻属、褐指藻属、栅列藻属、裂丝藻属、扁藻属、海链藻属和裂殖壶菌属。
25.根据权利要求17所述的方法，进一步包括：
在向培养基中接种微藻之前先在自养生长条件下培养微藻。
26.根据权利要求17所述的方法，其中培养基包含碳源。
27.根据权利要求26所述的方法，其中碳源选自下述的至少一种：右旋糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、N-乙酰葡糖胺、甘油、弗罗里多苷、葡萄糖醛酸、玉米淀粉、解聚纤维素材料、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清和糖蜜。
28.根据权利要求26或27所述的方法，其中培养基进一步包含脂肪源、氮源、磷源、辅酶和辅酶因子中的至少一种。
29.根据权利要求17-28任一项所述的方法，进一步包括：
将接种的培养基的pH值保持在大约6.8的pH值至大约9.2的pH值；
将接种的培养基的温度保持在大约21℃至大约33℃；和
按照每10L接种的培养基大约0.1L/分钟至大约2.5L/分钟的速度将氧输送至接种的培养基。
30.一种分离的且纯化的蛋白质，由权利要求17-29任一项所述的方法生产。
31.一种增加微藻生物质的诱导生产方法，所述方法包括：
向培养基中接种微藻；
在异养生长条件下培养微藻；和
将氧输送至接种的培养基中。
32.根据权利要求31所述的方法，其中微藻生物质以大于自养生长条件下微藻的速率增加。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中异养生长条件包括减少接种的培养基暴露于光。
34.根据权利要求31-33任一项所述的方法，其中在异养生长条件下培养微藻包括使接种的培养基处于大体上黑暗的环境中。
35.根据权利要求31-34任一项所述的方法，其中按照每10L接种的培养基大约0.1L/分钟至大约2.5L/分钟的速度将氧输送至接种的培养基。
36.根据权利要求31-35任一项所述的方法，其中通过输气管线将氧输送至接种的培养基以便氧在接种的培养基中扩散。
37.根据权利要求31-35任一项所述的方法，其中微藻选自下述的至少一种：纤维藻属、葡萄藻属、小球藻属、隐甲藻属、小环藻属、杜氏藻属、菱板藻属、微球藻属、微拟球藻、新绿藻属、菱形藻属、褐指藻属、栅列藻属、裂丝藻属、扁藻属、海链藻属和裂殖壶菌属。
38.根据权利要求31所述的方法，进一步包括：
在向培养基中接种微藻之前先在自养生长条件下培养微藻。
39.根据权利要求31所述的方法，其中培养基包含碳源。
40.根据权利要求39所述的方法，其中碳源选自下述的至少一种：右旋糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、半乳糖、木糖、甘露糖、鼠李糖、N-乙酰葡糖胺、甘油、弗罗里多苷、葡萄糖醛酸、玉米淀粉、解聚纤维素材料、甘蔗、甜菜、乳糖、乳清和糖蜜。
41.根据权利要求39或40所述的方法，其中培养基进一步包含脂肪源、氮源、磷源、辅酶和辅酶因子中的至少一种。
42.根据权利要求31-41任一项所述的方法，进一步包括：
将接种的培养基的pH值保持在大约5.5的pH值至大约6.2的pH值；
将接种的培养基的温度保持在大约21℃至大约28℃；和
按照每10L接种的培养基大约0.1L/分钟至大约2.5L/分钟的速度将氧输送至接种的培养基。
43.根据权利要求31或42所述的方法，其中按照每10L接种的培养基大约1.0L/分钟的速度输送氧。
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