KR20170008353A - 미세조류에서의 트리글리세라이드(tag) 또는 바이오디젤 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 미세조류에서 바이오디젤을 생산하는 방법에 있어서, 일정기간 미세조류를 증식 배양하는 제1단계; 상기 제1단계와 구별하여, 일정기간 미세조류에 압력 스트레스를 가해 세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 트리글리세라이드의 형태로 전환시키는 제2단계; 및 트리글리세라이드부터 바이오디젤을 전환시키는 제3단계를 포함하는 것이 특징인 바이오디젤 생산방법을 제공한다.
본 발명은 트리글리세라이드 함유 지방방울(lipid droplet; LDs)을 다량 축적할 수 있기 때문에 바이오디젤 제조를 위한 전단계의 오일 추출비용을 크게 낮출 수 있다. 따라서, 저비용 및 산업상 적용가능한 스케일로 미세조류에서 바이오디젤을 생산할 수 있다.
본 발명은 트리글리세라이드 함유 지방방울(lipid droplet; LDs)을 다량 축적할 수 있기 때문에 바이오디젤 제조를 위한 전단계의 오일 추출비용을 크게 낮출 수 있다. 따라서, 저비용 및 산업상 적용가능한 스케일로 미세조류에서 바이오디젤을 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 미세조류에서의 트리글리세라이드(TAG) 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 태양에너지를 이용하여 CO2를 먹이로 자라는 미세조류의 지질 성분을 바이오디젤로 전환하는 기술에 관한 것으로, CO2 처리 및 친환경 수송용 연료 생산에도 유용하다.
식용 작물로부터의 바이오연료 생산이 점차적으로 증가함에 따라, 식품 및 연료 생산 사이에서 농경지 확보에 대한 경쟁이 치열해지고 있다. 계속하여 증가하고 있는 인구에 식품 공급원을 지속적으로 유지하기 위해서는, 화석연료를 대체할 수 있는 바이오연료용 새로운 공급원료가 절실히 필요하다.
녹조(green alga)와 같은 미세조류는 태양광 및 이산화탄소를 사용하여 탄수화물 및 지방의 형태로 화학적 에너지를 생산하며 세포 성장에 필요한 단백질을 합성하기 위해 질소를 필요로 하는 광합성 미생물이다. 미세조류의 광합성 능력은 식물보다 우수하다. 또한, 해상, 해안가 또는 황무지 이용이 가능하여 육상토지 이용에서 식용작물과 무경쟁이고, 다양한 물 자원 (하수, 해수, 폐수)을 이용 및 재활용할 수 있다.
또한, 미세조류는 다른 광합성 생물에 비하여 이산화탄소를 포집하는 속도와 세포가 성장하는 속도가 빠르며 인공적인 배양이 손쉽기 때문에 대규모 생물공정을 통하여 대량으로 생산될 수 있다. 미세조류는 1세대 바이오연료 원료(콩, 유채 등)에 비해 단위면적당 바이오매스 생산성이 50-100배 이상 높다.
많은 미세조류는 빠른 속도로 성장하고 다량의 바이오매스(biomass)를 생산하며, 또한 특정 배양 조건에서 용이하게 바이오디젤로 변환가능한 다량의 오일을 축적할 수 있다. 이에 따라, 미세조류는 재생가능한 그린 에너지 생산을 위한 대체원(alternative source)으로 각광받고 있다.
스트레스 조건 (특히, 질소 고갈 상태; nitrogen depletion) 하에서, 미세조류는 상당량의 중성 지방(주로 트리글리세롤; TAGs)을 지방방울(lipid droplet; LDs)이라 지칭되는 세포 소기관(cellular organelles)으로 축적하기 시작한다.
TAG 합성에 필요한 지방산은 새로(de novo) 합성되거나 막지질로부터 재순환된 아실기 사슬(recycled acyl chain)으로부터 생성된다.
실험실에서 널리 사용되는 배양 조건하에서, 외부에서 제공되는 아세테이트(acetate)는 새로운 합성 경로(de novo pathway)를 통한 TAG 생산을 촉진시킨다. 특정 조건하에서의 TAG 합성에 관련된 각 경로들의 정확한 기여도는 아직 밝혀지지 않은 상태이다.
종래 연구를 통해, 세포의 TAG 함량이 온도, 빛 강도, 질소 결핍, 인 제한(phosphorus limitation), 철 농도 및 염도(salinity)와 같은 적당한 배양 환경 하에서 현저히 증가될 수 있음이 밝혀졌다. 여러 스트레스 조건들 중에서, 질소 결핍(nitrogen starvation)이 조류(algae)에서 TAG 축적을 유도하는데 있어 가장 효과적인 방법이다. 그러나, (i) 질소 결핍은 광합성 반응을 감소시켜 전반적인 바이오매스 생성을 감소시키고, (ii) 산업적인 측면에서, 질소를 제거하는 공정은 상당량의 에너지, 시간 및 비용이 소모되므로, TAG 축적을 위해 질소 결핍 조건을 이용하는 것은 이상적이지 않다.
본 발명은 세포 배양 중 질소 결핍 조건을 포함하지 않고 미세조류의 성장과 다량의 바이오매스의 획득 단계와 별도로, 다양한 미세조류에 적용할 수 있는 세포 내 TAG 축적 유도 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 제1양태는 미세조류에서의 트리글리세라이드(TAG) 제조방법에 있어서, 미세조류의 증식 배양 조건이 아닌 상태에서, 미세조류에 압력 스트레스를 가해 세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 트리글리세라이드의 형태로 전환시키는 단계를 포함하는 것이 특징인 트리글리세라이드 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제2양태는 미세조류에서의 트리글리세라이드(TAG) 제조방법에 있어서, 일정기간 미세조류를 증식 배양하는 제1단계; 및 상기 제1단계와 구별하여, 일정기간 미세조류에 압력 스트레스를 가해 세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 트리글리세라이드의 형태로 전환시키는 제2단계를 포함하는 것이 특징인 트리글리세라이드 제조방법을 제공한다.
본 발명의 제3양태는 미세조류에서 바이오디젤을 생산하는 방법에 있어서, 일정기간 미세조류를 증식 배양하는 제1단계; 상기 제1단계와 구별하여, 일정기간 미세조류에 압력 스트레스를 가해 세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 트리글리세라이드의 형태로 전환시키는 제2단계; 및 트리글리세라이드부터 바이오디젤을 전환시키는 제3단계를 포함하는 것이 특징인 바이오디젤 생산방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 자세히 설명한다.
미세조류는 태양 에너지를 화학에너지로 전환시킬 수 있으며 이산화탄소를 고정하여 탄수화물, 지질, 단백질 등의 바이오매스로 전환시킬 수 있다.
미세조류 세포는 특별한 성분으로 구성되어 있지 않으며 식물과 비슷하다. 광합성에 관여하는 색소와 같은 물질 이외에도 소화성이 높은 탄수화물, 식품으로 사용되기에 충분한 함량의 단백질, 함량이 식품(1~35%)이나 바이오연료(20~80%)용으로 적합한 지질 등의 기본 물질로 구성되어 있다(표 1; 미세조류 바이오매스의 화학적 조성(% of dry mass)). 지질 성분은 바이오디젤로 사용될 수 있다(도 1).
미세조류 바이오매스의 화학적 조성은 배지성분 뿐만 아니라 환경적 요인, 세포 회수 처리법, 세포 건조법에 의해서도 좌우된다.
정수압(hydrostatic pressure)은 박테리아 및 다른 미생물 세포에 있어서 치사 또는 거의 치사에 가까운 손상을 입힌다. 종래 연구에 따르면 박테리아 세포에 있어서 침투 벽(penetration barrier)으로서의 기능을 정상적으로 하는데 중요한 것으로 알려진, 단백질과 같은 박테리아 세포 외피(cell envelope)에 존재하는 물질 및 막에 결합된 인지질과 당지질에, 높은 정수압이 영향을 미치는 것으로 보고되어 있다. 50 atm 정도로 높은 이산화탄소 압력은 미세조류가 가스 흡수를 조절하는 것을 방해하고 이산화탄소가 막을 통과하도록 하여 세포 내에 손상을 입히는 것으로 알려져 있다. 그러나, 미세조류 세포에 대한 5~15 atm 정도의 약한 압력의 영향에 대해서는 아직 연구가 이루어지지 않았다.
미세조류는 스트레스 조건들에서 트리글리세라이드(TAG)의 형태로 에너지를 저장할 수 있고, 압력이 막에 결합된 지질에 영향을 줄 수 있다는 것을 고려하여 실험한 결과, 본 발명자들은 막 결합 지질로부터 안정적인 저장 형태인 TAG(바이오디젤 생산에 보다 적합함)로의 세포내 지질의 위치 변경(translocation)에 있어서 압력 속성을 발견하였다.
본 발명자들은 짧은 시간(예, 2시간 정도) 동안 온화한 가압 하에 발휘되는 스트레스를 통해 미세조류 내의 TAG 축적(accumulation)을 유도할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 미세조류에 온화한 압력 스트레스를 가한 결과, 세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 트리글리세라이드의 형태로 전환시킬 수 있다는 것을 발견하였다.
한편, 미세조류 배양은 비용이 가장 크고 시간(예, 7일~14일)도 오래 걸린다. 따라서, 지질(lipid)을 다량으로 생성하기 위해 미세조류를 빠른 시간에 키우는 것이 중요하다.
본 발명은 이러한 발견들에 기초한 것으로, 일정기간 미세조류의 증식 배양 공정과 구별하여, 증식 배양된 미세조류에 짧은 시간동안 미세조류를 손상시키지 않는 온화한 압력을 가해 트리글리세라이드 축적(accumulation) 유도 공정을 수행하는 것이 특징이다. 즉, 본 발명은 우선 미세조류의 성장과 바이오매스의 획득에 초점을 맞춰서 진행한 후, 온화한 가압을 통해 트리글리세라이드 축적(accumulation) 유도 공정을 별도로 수행하는 이단배양을 포함하는 것이 특징이다.
온화한 가압(5~15 atm)은 살아있는 미세조류의 세포에 스트레스를 주어 세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 중성 지질, 특히 트리글리세라이드(TAG)의 형태로 빠르게 변환되도록 유도한다(도 4). 지질 클래스 조성 연구(lipid class compositional study)를 통해, 가압 스트레스 하에 당지질(막 관련 지질 형태)이 중성 지질(특히, TAG)로 변환함을 확인하였다(도 9). 도 10은 압력 처리 전후의 전자현미경 사진을 나타내며, 압력 처리에 따라 트리글리세라이드(TAG)가 증가한 것을 알 수 있다.
10 ~ 15 atm의 가압 반응조에서 10-100 g cell/L의 미세조류 세포농도에서도 유사한 수준으로 TAG가 증가하였으며(도 7), 이는 본 발명이 산업상 적용가능한 스케일의 기술로 실현가능하다는 것을 알 수 있다.
<미세조류의 증식 배양 단계>
본 발명에 따른 미세조류의 증식 배양 단계는 세포 증식 뿐만 아니라 세포 성장과 물질 생산을 포함할 수 있다.
이상적인 미세조류가 갖추어야 할 요건은 여러 가지가 있지만 우선 세포 내 대사산물의 생산성이 높아야 한다. 고 생산성은 흔히 세포 성장과 물질 생산으로 구성되는 이단 공정을 거쳐서 달성될 수 있다.
현재 상업화에 사용되는 균주는 Spirulina, Chlorella, Dunaliella, Haematococcsu, Nannochloropsis 등이 있다. 일반적으로 미세조류를 배양하기 위한 배지의 조성은 균종과 배양 조건에 따라 다르다.
상용화를 위한 대규모 공정은 일반적으로 무균 유지와 공정제어가 어려우므로 극한 pH, 고온, 고염 등의 극한 환경에서도 안정되고 감염에 강한 균주를 선택하는 것이 중요하다.
미세조류 세포의 고속 성장을 위해서는 필수원소들(탄소, 질소, 인, 황)과 미량 원소들(철, 마그네슘 등)이 배양배지에 반드시 포함되어야 한다.
최대 수율의 바이오매스 획득을 위해 미세조류 배양 시스템의 온도, pH, 광량, 영양분(무기염)과 이산화탄소 농도를 엄격하게 조절할 수 있다.
미세조류는 대기 혹은 연소 배가스의 이산화탄소를 바이오매스로 포집할 수 있다. 특히 Chlorococcum littorale는 40% (v/v)까지 고농도의 이산화탄소에 대해 높은 내성과 1 gcell/L/day 이상의 이산화탄소 고정률을 보인다. 또한, Scenedesmus obliquus와 Spirulina도 온도가 30℃로 조절된 3단 연속식 tubular photobioreactor에서 높은 수준의 이산화탄소 고정률을 나타낸다. Spirulina은 6% 이산화탄소에서 최대 비성장속도 0.44 /day와 6% 이산화탄소에서 최대생산성 0.22 g/L/day를 보인다. Spirulina obliquus SJTU-3, Chlorella pyrenoidosa SJTU-2, Botryococcus braunii SI-30는 높은 농도(30∼50%)의 이산화탄소를 각각 total lipid, polyunsaturated fatty acid, hydrocarbon의 고 축적을 위해 사용된다. 배가스는 이산화탄소 농도가 높아서 광호흡에 의한 광합성 저해가 발생할 우려가 있지만 황이나 질소를 또 다른 영양분으로 내포하고 있어서 바이오매스 생산성을 30% 정도 향상시킬 수 있는 장점을 지닌다.
미세조류는 고농도 염에 대한 내성을 지니므로 담수(fresh water), 기수(brackish water), 염수(highly saline water), 해수(marine water) 등 여러 가지 종류의 물을 이용하여 광배양기(photobioreactor) 에서 액상 배양이 가능하다.
예를 들면, 특정 조건에 의해 세포 내 오일 함량이 높을수록 미세조류에 의하여 생산되는 바이오연료의 열량은 높아진다. 이러한 바이오매스 입자의 크기는 분말형태의 석탄이나 셀룰로오스와 비슷한 정도의 수 μm (Chlorella의 경우 5∼110 μm)부터 수백 μm까지 다양하다. 특히 cyanobacteria(‘blue algae’)와 같은 일부 미세조류는 탄소나 질소 영양분이 없어도 배양될 수 있으므로 생산비용 측면에서 효율적이다.
미세조류에 요구되는 광량은 고등 식물에 비하여 작지만 400 mmol/m2·s까지는 광량이 증가함에 따라 대사활성도 증가한다. 예를 들어, Chlorella와 Scenedesmus의 포화 광세기는 200 mmol/m2·s 정도이다. 호열성 Chlorogleopsis 종은 최적 광도는 36.9 mmol/m2·s 이지만 높은 광도(246.1 mmol/m2·s)와 낮은 광도(36.9 mmol/m2·s)에서도 세포 적응성이 뛰어나 잘 자란다. 그러나 최적 광도에서 광독립영양 성장을 하던 대부분의 미세조류는 낮은 광도의 환경에 놓이게 되면 종속영양 성장으로 바꾸며 일부 균주는 혼합영양 성장을 나타낸다. 그러나, 일정 세기 이상의 광도에서는 오히려 광저해에 의하여 세포 성장이 낮아진다. 이러한 최적 광도의 조절은 실외 배양보다는 실내 배양에서 더 중요하며 세포에 따라 그 최적 값이 다르다. 유전공학적으로 chlorophyll 안테나 크기를 줄임으로써 바꿀 수 있다.
온도는 미세조류 세포의 생리적 형태적 반응을 조절하는 주요 인자이다. 온도가 높을수록 더 높은 세포성장속도가 나타나며 최적의 온도에서 미세조류 효소들은 최대의 활성을 나타낸다. 최적 온도는 미세조류 종에 따라 다르지만 대부분 25∼35 ℃의 범위이며 광조건과 같은 환경에 따라서도 다르다.
대부분의 미세조류는 중성 pH가 최적이지만 Spirulina platensis와 C. littorale와 같은 일부 미세조류 종은 각각 알카리(pH 9)나 산성(pH 4) 조건이 최적이다. bioreactor 내에서 CO2 혹은 CO3 2-의 농도 증가는 pH를 변화시켜 pH 조절에 큰 영향을 미칠 수 있다. 배지 내의 NH3와 NH4 +도 산화반응을 두고 물분자와 경쟁하여 산소를 발생시킬 수 있다. 따라서, 어떤 경우에는 광생물반응기의 pH 조절이 CO2와 NH4 +농도 조절에 의해 이루어진다.
질소 결핍 조건에서 Chlorella emersonii(63%), Chlorella minutissima (56%), Chlorella vulgaris (57.9%), Chlorella luteoviridis (28.8%), Chlorella capsulata (11.4%), Chlorella pyrenoidosa (29.2%), Neochloris oleoabundans (35∼54%)와 같은 미세조류들의 지질 함량은 증가한다. 특히, Neochloris는 지질 중 triglyceride 가 차지하는 비율이 80%로서 2.2배나 증가한다.
현재 상업적으로 생산되고 있는 미세조류들(Chlorella, Spirulina, Dunaliella)의 대부분은 매우 선택적인 환경에서 자라며, 따라서 개방형 배양에서도 타 생물종(algae, protozoa)에 의해 오염되지 않는다. 즉, Chlorella는 영양이 풍부한 배지에서 자라며 Spirulina는 pH와 bicarbonate 농도가 높은 환경에서 자라고 Dunaliella는 매우 높은 염도에서 자란다.
반면에 생육 환경에 대한 선택적 잇점이 없는 대부분의 다른 미세조류 종들은 폐쇄형 배양으로 생산해야 한다. 따라서, 수산 양식 먹이로 이용되는 해양 미세조류(Skeletonema, Chaetoceros, Thalassiosira, Tetraselmis, Isochrysis)와 long-chain polyunsaturated fatty acids을 생산하는 Crypthecodinium cohnii 등 대부분의 미세조류들에 대한 대량 배양 기술이 개체마다 환경에 맞게 특이적으로 개발되어 있다.
미세조류의 광합성에 의해 생산되는 산소가 고농도로 축적되면 미세조류의 생산성을 감소시킬 수도 있지만 미세조류 배양에는 이산화탄소 주입이 더욱 중요하고 필수적이다. 이를 위해 농도가 낮은 대기 가스보다는 농도가 높은 산업 잔류 가스를 기포로 주입하는 것이 더 적합하다. 주입에 드는 에너지 비용을 줄이기 위해서는 가스의 물질 전달 효율을 높일 수 있는 염기조건에서 생육 가능한 균주가 최적이다.
미세조류 배양 기술 중 종속영양 배양법은 이산화탄소 포집과 바이오매스 획득의 효율 측면에서 유리하지만 비용이 많이 든다. 반면에 자가영양 배양법은 고농도 및 대량 배양기술의 확립을 통해 배양 효율을 높인다면 대규모 상용 공정으로 이어질 수 있다. 또한, 개방형 배양 장치는 만들어서 조작하기 쉽지만 배양 조건을 유지하기 힘들고 오염되기 쉬우며 세포 수확 비용이 높다는 단점이 있기 때문에 온도, pH 등의 선택적인 배양 환경을 조성하기에 알맞은 폐쇄형 배양기가 바이오매스의 대량 생산에 적합하다. 그러나 폐쇄형 배양 시스템에는 목적에 맞는 특정 광배양기 형태(vertical, flat plate, annular, plastic bags, air lifted glass, plastic tubular reactor 등)의 디자인, 에너지 소모적인 pumping, sparging과 같은 내부 공정의 최적화, 반응기 재질 비용의 최소화 등이 요구된다. 이때, Chlorococum과 같은 균주에 대해서는 이산화탄소의 포집을 원활하게 하기 위하여 20% (v/v)의 희석률에 의한 반연속식 배양 기술이 추가로 사용될 수 있다. 대체적으로 폐쇄형 광반응기는 고부가 가치 유용물질의 생산을 위해 적합하고, 개방형 배양은 바이오연료 생산을 위한 바이오매스 생산에 적합하다.
일반적으로 연속조업의 광배양기 생산성은 정상 상태의 바이오매스 농도에 희석 속도를 곱하여 얻어지는데 반응기 표면(혹은 내부)의 광 조도, 유체역학적 조업 변수 등에 의존한다. 여러가지 반응기 형태들(helical, vertical, horizontal 등) 중에서 관형(tubular type) 반응기가 태양광 흡수와 그림자 효과 제거, 이산화탄소 분산, 온도 조절, 세포 침착 방지 측면에서 가장 낫다. 특히, 열전달이 최적화된 나선 관형 원뿔 광배양기(conical helical tubular photobioreactor)를 이용한다면, 일년 내내 다양한 장소에서 더 적은 조업 에너지를 투입하여 더 많은 바이오매스를 생산하기 위해, 내부로 흘리는 유체의 최적 온도를 계절과 시각에 따라 미리 예측할 수 있다.
또한, Chlorella, Haematococcus pluvialis 등의 다양한 미세조류에 대해서도 반응기를 이용한 배양이 이루어졌고 평균 이상의 우수한 생산성을 나타내었다.
미세조류 바이오매스를 분리하고 농축하는 과정은 경제적이고 효율적인 공정으로 구성되어야 한다. 기존 화학공정에서 발전되어온 고열, 고압과 같은 고에너지를 사용하는 추출 및 분리와 같은 방법들은 화학공정이 아닌 생물 공정에 적용하기에는 효율적이지 못한 측면이 있다. 바이오매스 harvest는 일반적으로 하나 이상의 고-액 분리 단계를 요구하며, 미세조류 바이오매스 생산에서 중요한 공정 중 하나이다. 이 포집 과정은 flocculation, filtration, flotation, centrifugal sedimentation 등을 포함하며, 이중 어떤 공정들은 상당히 에너지 소모적이다.
바이오매스 회수공정은 2단계로 구성되는데 먼저 bulk harvesting은 bulk suspension로부터 바이오매스를 분리하는 공정이다. 이 공정은 일반적으로 100∼800배의 concentration factor를 통하여 최종적으로 2∼7% total solid matter를 얻을 수 있다.
이후에 진행되는 thickening은 더욱 에너지 집약적인 단계로서centrifugation, filtration, ultrasonic aggregation와 같은 기술을 통하여 slurry를 농축하는 공정이다.
<세포막에
결합되어
있는 극성 지질을
트리글리세라이드의
형태로 전환하는 단계>
본 발명은 미세조류에서 트리글리세라이드(TAG) 제조시, 바이오매스 증가와 관련있는 미세조류의 증식 배양 공정과 별도로(도 2 중 3번 또는 4번 단계에서), 미세조류에 압력 스트레스를 가해 세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 트리글리세라이드의 형태로 전환시키는 단계를 수행하는 것이 특징이다. 또한, 상기 단계를 통해 미세조류 내 트리글리세라이드 축적(accumulation)을 유도할 수 있다(도 3 및 도 4).
본 발명은 실험을 통해 세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 트리글리세라이드의 형태로 전환시키는 각 미세조류에 적합한 압력 스트레스를 선정할 수 있다는 것이 또다른 특징이다.
세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 트리글리세라이드의 형태로 전환하는 단계에서, 압력 스트레스는 5~15 atm인 것이 바람직하고, 압력스트레스는 1 시간 내지 10 시간 동안 가해지는 것이 바람직하다.
압력 스트레스는 5~15 atm의 공기를 사용할 수 있다. 공기 외 질소, 헬륨, 수소, 이산화탄소, 메탄 등 다양한 가스를 단독 또는 혼합하여 활용 가능하다. 또한, CO2를 함유한 다양한 산업배가스를 활용할 수 있으나, CO2가 미세조류 배양배지의 pH를 감소시켜 미세조류의 성장 및 대사산물에 영향을 줄 수 있으므로 사용 전에 주의가 필요하다. 가스 가격 및 가스 공급을 위한 가스압축기 또는 송풍기의 내구성/가격측면에서 공기의 사용이 바람직하다.
또한, 압력 스트레스와 함께, 기존에 TAG를 증가시키는 것으로 알려진 스트레스를 추가로 가하는 경우 TAG 축적을 더욱 증가시킬 수 있다. 압력 스트레스와 함께, 추가로 가할 수 있는 스트레스의 비제한적인 예로는 fenpropimorph 화합물 스트레스, 삼투압 스트레스, 광 스트레스 등이 있다.
도 8에 도시된 바와 같이, 압력과 더불어, 화합물(살진균제인 fenpropimorph; 50 ppm), 삼투압 스트레스(염화나트륨; 1M) 및 강한 빛(200 μmol/m2·s) 등의 다른 스트레스가 가해짐에 의해, TAG 축적이 더욱 증가되었다.
본 발명은 1 일 ~ 14 일 동안, 바람직하게는 4 일 ~ 10 일간 제1단계를 수행하고, 1 시간 ~ 10 시간 동안, 바람직하게는 1 시간 ~ 6 시간동안 제2단계를 수행할 수 있다.
제1단계 및 제2단계는 각각 분리된 반응기, 즉 광생물반응기 및 압력 반응기(도 5)에서 수행할 수 있다.
<후단 공정>
미세조류 회수는 제1단계 이후 및/또는 제2단계 이후에 수행할 수 있다.
미세조류는 타 식물종에 비해 비교적 작고 단일 세포이기 때문에 세포를 회수하는데 드는 비용이 높다. 원심분리를 고가의 공정이므로 대신에 여과. 침전, 부유와 같은 방법을 사용할 수 있다. 또는 생육의 특정 단계에서 응집성이 높은 균주를 선택하는 것이 바람직하다.
바이오매스와 최종 생산물의 높은 농도를 위해 바이오매스의 건조공정을 수행할 수 있다. 일반적으로 건조는 열을 필요로 하기 때문에 methane drum dryer나 다른 oven-type dryer를 사용할 수 있다.
건조 후에는 생산물을 추출하기 위하여 미세조류를 파쇄하는 과정을 거칠 수 있다. 미세조류의 세포벽과 생산물의 특성에 따라 여러 가지 세포파쇄법이 있다. 저 비용으로 세포파쇄를 하려면 Nannochloropsis와 같이 크기가 작고 세포벽이 두꺼운 균주보다는 크기가 크고 세포벽이 얇은 균주가 적합하다.
<
트리글리세라이드로부터
바이오디젤
전환 단계>
석유대체연료 중 바이오디젤은 식물성 기름이나 동물성 지방의 주성분인 트리글리세라이드(triglyceride)로부터 다양한 촉매와 반응조건에서 알코올(주로 메탄올)과 반응하여 얻어지는 지방산 알킬에스테르(alkyl ester) 형태이다.
바이오디젤은 기존 석유디젤과 물성이 유사하여, 디젤자동차에 직접 또는 일정비율로 혼합하여 사용 가능한 연료이다. 바이오디젤은 석유디젤에 비해 독성이 낮고, 생분해성을 가지며, 바이오디젤을 연료로 사용한 자동차의 배출가스는 입자상 물질(PM)이나 독성가스 물질이 현저히 낮다.
이와 같이 환경적으로 유리한 바이오디젤은 하기 반응식 1과 같은 방법으로 합성이 되며, 보다 생산비를 낮추기 위해 다양한 촉매(예, KOH와 같은 염기성 촉매)와 반응조건들이 연구되고 있다.
[반응식 1]
한편, 바이오디젤은 파라핀성분 뿐만 아니라 바이오디젤을 구성하고 있는 포화지방산기의 종류 및 지방산 조성이 다양할 수 있다.
추가로, 컬럼크로마토그래피를 통해 바이오디젤을 정제할 수 있다.
본 발명은 트리글리세라이드 함유 지방방울(lipid droplet; LDs)을 다량 축적할 수 있기 때문에 바이오디젤 제조를 위한 전단계의 오일 생산 및 추출비용을 크게 낮출 수 있다. 따라서, 저비용 및 산업상 적용가능한 스케일로 미세조류에서 바이오디젤을 생산할 수 있다.
도 1은 미세조류로부터 바이오디젤을 생산하는 개념도를 도시한 것이다.
도 2는 미세조류를 원료로 한 바이오디젤 생산 공정 및 각 요소 기술에 해당하는 단계를 숫자로 도시한 것이다.
도 3은 일반적인 지질 생합성 공정을 도시한 것이다.
도 4는 미세조류에 온화한 압력 스트레스를 짧은 시간 가해 세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 트리글리세라이드의 형태로 전환시켜, 지질 자리이동(translocation)을 유도하는 본 발명의 개념도이다.
도 5는 본 발명에 따라 회수된 미세조류에 압력 스트레스를 가할 수 있는 압력 반응기의 일 구체예이다.
도 6은 압력(1, 10 & 15 atm) 및 압력을 가한 시간에 따른 TAG 양 변화를 도시한 그래프이다.
도 7은 상이한 바이오매스 농도((a) 10 g cell/L 및 (b) 100 g cell/L)에서 TGA 함량에 대한 가압 효과를 도시한 그래프이다.
도 8은 가압과 함께, (a) 50 ppm Fenpropimorph; (b) 1M NaCl; (c) high light를 가했을 때 TGA 함량에 대한 결합된 가압 효과를 도시한 그래프이다.
도 9는 Chlorella sp. KR-1 에 가압한 경우 지질 조성 변화를 도시한 그래프이다. (a) 세포의 총 지질 함량; (b) 상이한 클라스에 상대적인 지질 함량.
도 10은 압력 처리 전후의 전자현미경 사진을 나타낸 도이다. (b) 및 (d)는 각각 (a) 및 (c)를 확대한 사진을 나타낸다. (L) 지방방울(lipid droplet); (S) 전분 (starch); (C) 엽록체(chloroplast); (적색 화살표) 생성된 지방방울(budding lipid droplet); (청색 화살표) 세포막 분해(membrane disintegration).
도 2는 미세조류를 원료로 한 바이오디젤 생산 공정 및 각 요소 기술에 해당하는 단계를 숫자로 도시한 것이다.
도 3은 일반적인 지질 생합성 공정을 도시한 것이다.
도 4는 미세조류에 온화한 압력 스트레스를 짧은 시간 가해 세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 트리글리세라이드의 형태로 전환시켜, 지질 자리이동(translocation)을 유도하는 본 발명의 개념도이다.
도 5는 본 발명에 따라 회수된 미세조류에 압력 스트레스를 가할 수 있는 압력 반응기의 일 구체예이다.
도 6은 압력(1, 10 & 15 atm) 및 압력을 가한 시간에 따른 TAG 양 변화를 도시한 그래프이다.
도 7은 상이한 바이오매스 농도((a) 10 g cell/L 및 (b) 100 g cell/L)에서 TGA 함량에 대한 가압 효과를 도시한 그래프이다.
도 8은 가압과 함께, (a) 50 ppm Fenpropimorph; (b) 1M NaCl; (c) high light를 가했을 때 TGA 함량에 대한 결합된 가압 효과를 도시한 그래프이다.
도 9는 Chlorella sp. KR-1 에 가압한 경우 지질 조성 변화를 도시한 그래프이다. (a) 세포의 총 지질 함량; (b) 상이한 클라스에 상대적인 지질 함량.
도 10은 압력 처리 전후의 전자현미경 사진을 나타낸 도이다. (b) 및 (d)는 각각 (a) 및 (c)를 확대한 사진을 나타낸다. (L) 지방방울(lipid droplet); (S) 전분 (starch); (C) 엽록체(chloroplast); (적색 화살표) 생성된 지방방울(budding lipid droplet); (청색 화살표) 세포막 분해(membrane disintegration).
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1: 계통(strain) 및 배양조건
자생 담수 미세조류인 Chlorella sp. KR-1을 대한민국 영월군에 있는 강줄기(stream)에서 분리하였다. 미세조류 배양은 7L의 파이렉스 기포탑형 광생물반응기(b-PBR, 길이 1180 mm; 내부직경 85 mm; 작업 부피(working volume) 6L)에서 수행하였다. 이때 10 (v/v)% 이산화탄소를 함유한 공기를 0.75 L/min의 속도로 공급하였으며 28 내지 31로 온도가 조절되는 공간에서 12 형광 램프(빛의 강도: ca. 80 μmol photons/m2·s)의 조명을 조사하여 배양하였다. 배지는 3 mM 질산칼륨이 함유된 개선된 광합성 N8 배지를 사용하였다. 1L의 개선된 N8 배지에 함유된 화합물은 하기와 같다: 505.5 mg KNO3, 740 mg KH2PO4, 259.8 mg Na2HPO4, 50 mg MgSO4·7H2O, 17.5 mg CaCl2·2H2O, 11.5 mg FeNaEDTA·3H2O, 3.2 mg ZnSO4·7H2O, 13 mg MnCl2·4H2O, 18.3 mg CuSO4·5H2O 및 7 mg Al2(SO4)3·18H2O. 배지는 0.2 μm 기공막 필터를 통해 멸균하였으며 pH는 6.5로 조절하였다.
b-PBR은 반응기 바닥으로부터 10 (v/v)% 이산화탄소를 함유한 공기가 지속적으로 공급되며 공급된 가스는 0.2 μm PTFE 환기 필터(Minisart 2000, Satorius Stedium Biotech., Germany)를 통과하였다. 또한, b-PBR은 유량(mass-flow) 조절기(MKP, Korea) 및 유량계(flow meter)(Dwyer Instruments., USA)에 의해 조절되었으며, 28 내지 31℃로 온도가 조절되는 공간에서 지속적인 조사(백색 형광 램프, ~170 μmol/m2·s)를 유지하였다.
실시예
2: 압력 반응기(pressure reactor) 및 압력 실험(pressure experiment)
압력 반응기의 도면을 도 5에 나타내었다. 압력 반응기의 주요 구성은 스테인레스 스틸 반응조, 모터가 부착된 교반기, 압력 측정기, 안전 밸브, 워터 재킷(water jacket) 및 바닥에 있는 시료 수집 포트로 이루어져 있다. 스테인레스 스틸 튜빙은 가압 가스를 실린더로부터 니들 밸브(needle valve)를 통해 반응조로 운반시킨다.
실시예 1에 따라 4일 또는 7일 배양 후, 바로 압력 실험을 수행하거나 원심분리(3800xg, 10분)를 통해 세포를 수거하여 압력 실험을 위해 소정의 바이오매스 농도로 준비하였다.
기지의 농도 및 부피(ca. 100 mL)를 갖는 조류 현탁액을 압력 실린더에 옮기고 모터가 부착된 교반기를 이용하여 100 rpm으로 교반하였다. 순환 수조가 연결된 워터 재킷을 이용하여 반응조의 온도를 30℃로 유지하였다. 반응기 내부에 5 내지 15 atm의 공기 압력을 가하였으며, 가압 조건하에서 성장한 세포를 대조군으로 대기압 하에서 성장한 세포와 비교분석하였다.
실험예
1: 분석 방법 및 고찰
바이오매스 농도는 OD660 값을 인자(factor) 0.2244로 곱하여(multiplying) 계산하였다. 이때, 인자(factor) 0.2244는 OD660 값 대 세포건조무게(dry-cell weight; DCW)의 변이(variation)의 플롯으로부터 계산된 값이다. OD는 자외선-가시광선 분광기(UV-Vis spectrophotometry, Optizen 2120UV, Mecasys Co., Korea)로 측정하였다. 세포건조무게(DCW)를 측정하기 위하여, 원(fresh) 시료는 무게를 측정해 놓은 GF/C 필터(Whatman, UK)를 이용하여 각각 다른 생장 시간에 여과하였으며, 여과 후 증류수로 두번 세척하고 105℃에서 2시간 동안 건조하여 무게를 측정하였다. 필터무게를 제외하고 세포건조무게(DCW)를 계산하였다.
실시예 2에 따른 압력실험 이후, 세포를 원심분리(3800xg, 10분)하여 수거하고 동결건조기(FD5512, IlShin BioBase Co., Korea)를 이용하여 4일 이상 동결건조하였다.
약 10 mg의 건조 세포로부터 추출한 총 지질을 5 mL 클로로포름/메탄올(2:1 v/v)에 혼합한 후 6시간 동안 격렬하게 교반하였다. 격렬하게 교반하는 상태에서 2 mL 증류수를 5분간 첨가하고 4000xg로 원심분리하였다. 원심분리 후, 아래의 유기층을 분리하고 0.2 μm PTFE 필터가 부착된 플라스틱 실린지(Minisart SRP15, Satorius Stedium, Germany)로 여과한 후, 회전 진공 증발기(EZ2 PLUS, Genevac Ltd., UK)로 건조하였다.
TAG를 정량하기 위하여, 지질 추출물을 약 50 μL의 클로로포름에 재용해시킨 후 TLC판(Silica gel Al foils, Fluka, USA)에 로딩하였다. TLC판에서 중성 지방을 분리하기 위하여, 헥산/디에틸 에테르/아세트산 혼합 용매(80/30/1, 부피로)로 전개하였다. 아세톤:증류수(4:1, v/v)에 용해된 0.01%(w/v) 프리뮬린(primuline, Sigma) 용액을 분사하여 UV하에서 지질 스팟(lipid spot)을 확인하였다. TAG 밴드를 TLC판으로부터 수거하고 정량하였다. 정량은, 밀도계측(densitometry) 및 ImageJ 소프트웨어(RSB, USA)를 이용한 이미지 분석, 또는 에스테르교환반응(transesterification) 후의 가스크로마토그래피(GC) 분석을 통해 수행하였다.
TAG의 지방산 함량은 직접적인 에스테르교환 방법으로 측정하였다. 상기에서 수거된 TAG 밴드를 10분에 걸쳐 2 mL 클로로포름/메탄올(2:1 v/v)에 첨가한 후 격렬하게 교반하였으며, 교반 후, 1 mL 클로로포름, 내부표준물질(500 mg/L)로서의 헵타데칸산(heptadecanoic acid), 1 mL 메탄올 및 300 μL 황산(95%)을 차례대로 첨가하고 5분간 잘 교반한 후 100℃에서 10분간 방치하였다. 추가적으로 1 mL의 증류수를 첨가하고 격렬하게 혼합한 후, 실온으로 냉각하고 4000xg로 원심분리하였다. 원심분리 후, 아래의 유기층을 분리하고 0.2 μm PTFE 필터가 부착된 플라스틱 실린지로 여과하였다.
FAME는 FID 검출기(frame ionization detector) 및 HP-INNOWax 캐필러리 컬럼(0.32 mm(I.D.) x 30 m, Agilent Technologies, USA)이 부착된 가스크로마토그래피(GC)를 이용하여 분석하였다. 상세한 GC 분석 조건은 선행문헌에 기재된 내용을 참고하였다(Na et al., Biotechnology letters, 2011, 33(5), 957).
도 6은 실시예 2에 따라 상이한 압력을 가한 미세조류 Chlorella sp. KR-1에서 시간 경과에 따른 상대적인 TAG 함량을 표시한 것이다. 이때, 대조군(1기압)의 0시간에서의 TAG 값을 100%로 하여, 상대적인 TAG 함량을 나타낸 것이다. 이 경우, 가압 시간은 2시간 정도가 TAG 함량 증가 측면에서 가장 효율적이었다.
도 7은 상이한 바이오매스 농도의 미세조류 Chlorella sp. KR-1 에서 TGA의 FAME 함량에 대한 가압 효과(TAG 양 변화)를 도시한 그래프이다. 고농도 100g cell/L로 처리했을 경우에도 TAG양이 증가하였으며, 이는 본 발명이 process 측면에서 큰 이점이 있다는 것을 뒷받침해준다.
도 8은 Chlorella sp. KR-1에 가압과 함께, (a) 50 ppm Fenpropimorph; (b) 1M NaCl; (c) high light(200 μmol/m2·s) 를 가했을 때 TGA의 FAME 함량에 대한 결합된 가압 효과를 도시한 그래프이다. 이때, 대조군은 TAG양 증가를 위해 각 그래프 도 8 (a)(b)(c)에서 적용된 압력으로 가압 스트레스만 준 경우이다. 압력만을 스트레스로 줄 경우 보다 기존에 TAG를 증가시키는 것으로 알려진 NaCl, Fen.(화학물질), high light 등의 스트레스 인자를 함께 가했을 경우 TAG가 더 증가하였다.
도 9는 실시예 2에 따라 Chlorella sp. KR-1 에 가압한 경우 지질 조성 변화((a) 세포의 총 지질 함량; (b) 상이한 클래스들에 상대적인 지질 함량)를 도시한 그래프이다. 총 지질 함량은 압력인자에 따라 변하지 않았다. 변하는 양은 Neutral lipid (주로 TAG)이므로, 이로부터 Glycolipids(MGDG/DGDG - rich in DAG)에서 Neutral lipid (TAG)로 변환이 유도되었다는 것을 알 수 있다. 즉, 도 4에 도시한 바와 같이, 세포 및 이의 소기관(Chloroplast/mitochondria/endoplasmic reticulum) 의 세포막으로부터 가압에 의해 지질 자리이동(translocation)이 유도되었다.
Claims (11)
- 미세조류에서의 트리글리세라이드(TAG) 제조방법에 있어서,
미세조류에 압력 스트레스를 가해 세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 트리글리세라이드의 형태로 전환시키는 단계를 포함하는 것이 특징인 트리글리세라이드 제조방법.
- 미세조류에서의 트리글리세라이드(TAG) 제조방법에 있어서,
일정기간 미세조류를 증식 배양하는 제1단계; 및
상기 제1단계와 구별하여, 일정기간 미세조류에 압력 스트레스를 가해 세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 트리글리세라이드의 형태로 전환시키는 제2단계
를 포함하는 것이 특징인 트리글리세라이드 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 압력 스트레스는 5 내지 15 atm인 것이 특징인 트리글리세라이드 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 미세조류에 압력 스트레스를 가해 미세조류 내 트리글리세라이드 축적(accumulation)을 유도하는 것이 특징인 트리글리세라이드 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 압력 스트레스와 함께, fenpropimorph 화합물 스트레스, 삼투압 스트레스, 광 스트레스를 추가로 가해 미세조류 내 트리글리세라이드 축적을 더욱 증가시키는 것이 특징인 트리글리세라이드 제조방법.
- 제2항에 있어서, 1 일 내지 14 일 동안 제1단계를 수행하고, 1 시간 내지 10 시간 동안 제2단계를 수행하는 것이 특징인 트리글리세라이드 제조방법.
- 제2항에 있어서, 제1단계 및 제2단계는 동일한 반응기 또는 각각 분리된 반응기에서 수행하는 것이 특징인 트리글리세라이드 제조방법.
- 제2항에 있어서, 제2단계 이전에 배양배지로부터 미세조류를 회수하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 트리글리세라이드 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 10 내지 100 g cell/L의 미세조류 세포농도 및 10 내지 15 atm의 가압 하에 미세조류 내 트리글리세라이드 축적(accumulation)을 유도하는 것이 특징인 트리글리세라이드 제조방법.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 압력 스트레스를 가한 미세조류를 분말화 또는 오일 추출하는 단계를 더 포함하는 것이 특징인 트리글리세라이드 제조방법.
- 미세조류에서 바이오디젤을 생산하는 방법에 있어서,
일정기간 미세조류를 증식 배양하는 제1단계;
상기 제1단계와 구별하여, 일정기간 미세조류에 압력 스트레스를 가해 세포막에 결합되어 있는 극성 지질을 트리글리세라이드의 형태로 전환시키는 제2단계; 및
트리글리세라이드부터 바이오디젤을 전환시키는 제3단계
를 포함하는 것이 특징인 바이오디젤 생산방법.
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| KR1020150099139A KR101769875B1 (ko) | 2015-07-13 | 2015-07-13 | 미세조류에서의 트리글리세라이드(tag) 또는 바이오디젤 제조방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020150099139A KR101769875B1 (ko) | 2015-07-13 | 2015-07-13 | 미세조류에서의 트리글리세라이드(tag) 또는 바이오디젤 제조방법 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20190017162A (ko) * | 2017-08-10 | 2019-02-20 | 더 유니버시티 오브 브리티쉬 콜롬비아 | 아미노산 보충을 이용한 미세조류에서 가치 있는 화학물질과 바이오연료 전구체 향상 |
| KR102107539B1 (ko) * | 2019-12-18 | 2020-05-07 | 송성은 | 침투이행성과 식이유용성이 증진된 아스타잔틴 및 유용지방산을 포함하는 미세조류 마이크로 분말의 제조방법 |
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-
2015
- 2015-07-13 KR KR1020150099139A patent/KR101769875B1/ko active IP Right Grant
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