CN107177541A - 一种产羟基脂肪酸的工程菌株及其制备方法和应用 - Google Patents

一种产羟基脂肪酸的工程菌株及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107177541A
CN107177541A CN201710515975.1A CN201710515975A CN107177541A CN 107177541 A CN107177541 A CN 107177541A CN 201710515975 A CN201710515975 A CN 201710515975A CN 107177541 A CN107177541 A CN 107177541A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
aliphatic acid
digestion
fatty acid
regulatory factor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710515975.1A
Other languages
English (en)
Inventor
万霞
肖康
陈文超
王炼
徐琳
龚阳敏
黄凤洪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Original Assignee
Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences filed Critical Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Publication of CN107177541A publication Critical patent/CN107177541A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0071—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14)
    • C12N9/0077—Oxidoreductases (1.) acting on paired donors with incorporation of molecular oxygen (1.14) with a reduced iron-sulfur protein as one donor (1.14.15)
    • C12N9/0081—Cholesterol monooxygenase (cytochrome P 450scc)(1.14.15.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y114/00—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14)
    • C12Y114/15—Oxidoreductases acting on paired donors, with incorporation or reduction of molecular oxygen (1.14) with reduced iron-sulfur protein as one donor, and incorporation of one atom of oxygen (1.14.15)
    • C12Y114/15006—Cholesterol monooxygenase (side-chain-cleaving) (1.14.15.6), i.e. cytochrome P450scc

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种产羟基脂肪酸的工程菌株及其制备方法和应用。所述工程菌株包括：P450BM3基因、硫脂酶基因和脂肪酸调控因子fadR，P450BM3基因的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，硫脂酶基因为序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，脂肪酸调控因子fadR的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。所述方法包括：将P450BM3基因和硫脂酶基因分别连接到第一表达载体上，得到第一重组表达载体；将脂肪酸调控因子fadR连接到第二表达载体上，得到第二重组表达载体；将所述第一重组表达载体和所述第二重组表达载体共同转入感受态细胞中，得到重组菌株，即所述工程菌株。该工程菌株可利用微生物发酵的方式合成羟基脂肪酸，使得合成羟基脂肪酸的过程简单，且反应条件温和，属于环境友好的反应条件。

Description

一种产羟基脂肪酸的工程菌株及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种产羟基脂肪酸的工程菌株及其制备方法和应用。
背景技术
羟基脂肪酸(HFAs)是脂肪酸分子长链碳位非羧基碳原子上具有单个或多个羟基的一类有机羧酸，广泛存在于植物、动物以及微生物中。近年来研究发现羟基脂肪酸具有一系列的生理作用，如抗菌性、抗炎性和抗糖尿病等。与常规脂肪酸相比，HFAs中羟基的存在使得它们具有一些特殊的性质，如HFAs具有较高的活性、黏性、稳定性和溶剂混溶性，在食品、化工、制药、化妆品等行业具有广泛的用途，尤其是ω-HFAs可以作为合成绿色聚合物材料的理想原料，合成的聚合物能够对高温和化学制品具有耐受力，并具有一定的弹性和较高的生物相容性，安全无毒，因此受到人们的青睐。
自然界中的羟基脂肪酸主要来自蓖麻种子中的蓖麻油酸。但蓖麻种子还含有剧毒物质蓖麻毒蛋白和一些过敏原蛋白，这为栽培、收获、贮运及加工蓖麻带来诸多不便，这使得由自然界中获得的羟基脂肪酸已经远不能满足人们的需求，为了克服上述缺陷，人们采用化学法合成羟基脂肪酸。
在实现本发明的过程中，发明人发现现有技术至少存在以下问题：
化学法合成羟基脂肪酸由于合成的羟基脂肪酸羟基位点特异性差，反应中需要使用强酸强碱因而对环境造成污染等，使化学法合成羟基脂肪酸受到了一定的局限。
发明内容
为了解决现有技术中化学法合成羟基脂肪酸羟基位点特异性差且污染环境的问题，本发明实施例提供了一种产羟基脂肪酸的工程菌株及其制备方法和应用。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种产羟基脂肪酸的工程菌株，所述工程菌株包括：P450BM3基因、硫脂酶基因和脂肪酸调控因子fadR，所述P450BM3基因的序列如序列表中SEQID NO.1所示，所述硫脂酶基因为序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述脂肪酸调控因子fadR的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。
另一方面，本发明实施例提供了一种制备上述工程菌株的方法，所述方法包括：
将所述P450BM3基因和所述硫脂酶基因分别连接到第一表达载体上，得到第一重组表达载体。
将所述脂肪酸调控因子fadR连接到第二表达载体上，得到第二重组表达载体。
将所述第一重组表达载体和所述第二重组表达载体共同转入感受态细胞中，得到重组菌株，即所述工程菌株。
具体地，所述感受态细胞为敲除了fadD基因的大肠杆菌感受态细胞。
具体地，所述将所述P450BM3基因和所述硫脂酶基因分别连接到第一表达载体上，得到第一重组表达载体，包括：
采用限制性内切酶EocRI和限制性内切酶NotI分别对所述P450BM3基因与所述第一表达载体进行双酶切，将酶切后的所述P450BM3基因与酶切后的所述第一表达载体连接，得到第一连接产物。
采用限制性内切酶BglII和限制性内切酶XhoI分别对所述第一连接产物和所述硫脂酶基因进行双酶切，将酶切后的所述硫脂酶基因与酶切后的所述第一连接产物连接，得到第一重组表达载体。
进一步地，所述第一表达载体为pACYCDuet-1。
具体地，所述将所述脂肪酸调控因子fadR连接到第二表达载体上，得到第二重组表达载体，包括：
采用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶HindIII分别对所述脂肪酸调控因子fadR和所述第二表达载体进行双酶切，得到酶切后的所述脂肪酸调控因子fadR和酶切后的所述第二表达载体，将所述酶切后的脂肪酸调控因子fadR与酶切后的所述第二表达载体连接，得到所述第二重组表达载体。
具体地，所述第二表达载体为载体pET-28a(+)。
又一方面，本发明实施例提供了一种上述工程菌株在合成羟基脂肪酸中的应用，所述应用包括：
活化所述重组菌株。
发酵活化后的所述重组菌株，并加入诱导剂进行诱导，得到诱导产物。
在所述诱导产物中提取羟基脂肪酸，得到所述羟基脂肪酸。
具体地，采用发酵培养基发酵活化后的所述重组菌株，所述发酵培养基为含有抗生素和浓度为0.5％的葡萄糖的M9培养基，其中，所述抗生素包括浓度50μg/mL的卡纳霉素和浓度为34μg/mL的氯霉素。
进一步地，所述发酵培养基还包括浓度为2％的甘油。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供了一种产羟基脂肪酸工程菌株，该工程菌株包括：P450BM3基因、硫脂酶基因和脂肪酸调控因子fadR，植物来源的硫脂酶基因与P450BM3基因和脂肪酸调控因子fadR进行共表达，使获得的羟基脂肪酸的产量得到提高，特别是中链羟基脂肪酸的产量得到了很大的提高，其中，羟基化酶P450BM3基因能特异性地催化中链脂肪酸ω-1，ω-2和ω-3碳位处的羟基化反应，生成中链ω-羟基脂肪酸；本发明实施例提供了一种制备该工程菌株的方法，该方法能够高效快速生产该工程菌株，同时，使得制备出的工程菌株所合成的羟基脂肪酸的产量得到提高，特别是中链羟基脂肪酸的产量得到了很大的提高；本发明实施例还提供了该工程菌株在合成羟基脂肪酸中的应用，该应用利用微生物发酵的方式合成羟基脂肪酸，使得合成羟基脂肪酸的过程简单，且反应条件温和，属于环境友好的反应条件。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例二提供的第一连接产物的构建图；
图2为本发明实施例二提供的第二连接产物的构建图；
图3为本发明实施例三提供的所获得的重组菌株(BD-APCcF)的脂肪酸分析的结果图，其纵坐标为发酵培养基上清液中的羟基脂肪酸组成(HFAs from supernatant)，单位为mg/L。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。
本发明实施例所用化学试剂均购置于国药或Sigma公司，基因和引物合成由擎科公司完成，限制性内切酶和T4-DNA连接酶均购置于Biolabs公司。
实施例一
本发明实施例提供了一种产羟基脂肪酸的工程菌株，该工程菌株包括：P450BM3基因、硫脂酶基因和脂肪酸调控因子fadR，P450BM3基因的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，硫脂酶基因为序列如序列表中SEQ ID NO.2所示(硫脂酶基因为GenBank U31813所示的CcFatB1)，脂肪酸调控因子fadR的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。
本发明实施例提供了一种产羟基脂肪酸的工程菌株，该工程菌株包括：P450BM3基因、硫脂酶基因和脂肪酸调控因子fadR，植物来源的硫脂酶基因与P450BM3基因和脂肪酸调控因子fadR进行共表达，使工程菌株所能获得的羟基脂肪酸(羟基脂肪酸指碳链上碳原子数为12-18的羟基脂肪酸)的产量得到提高，特别是中链羟基脂肪酸的产量得到了很大的提高，其中，羟基化酶P450BM3基因能特异性地催化中链脂肪酸ω-1，ω-2和ω-3碳位处的羟基化反应，生成中链ω-羟基脂肪酸，该工程菌株可利用微生物发酵的方式合成羟基脂肪酸，使得合成羟基脂肪酸的过程简单，且反应条件温和，属于环境友好的反应条件。同时，该工程菌株具有高效的分泌系统，使得几乎全部新合成的羟基脂肪酸均分泌到培养基中，这能够降低后期羟基脂肪酸的提取纯化的成本。
实施例二
本发明实施例提供了一种制备实施例一的工程菌株的方法，该方法包括：
将P450BM3基因、硫脂酶基因分别连接到第一表达载体上，得到第一重组表达载体，在实现时，采用限制性内切酶EocRI和限制性内切酶NotI分别对P450BM3基因和第一表达载体进行双酶切，将酶切后的P450BM3基因与酶切后的第一表达载体连接，得到第一连接产物，采用限制性内切酶BglII和限制性内切酶XhoI分别对第一连接产物和硫脂酶基因进行双酶切，将酶切后的硫脂酶基因与酶切后的第一连接产物连接，该第一连接产物的结构如图1所示，得到第一重组表达载体。
其中，该硫脂酶基因为序列如GenBank U31813所示的CcFatB1(由武汉金开瑞生物工程有限公司合成)，CcFatB1来自Cocos nucifera。
其中，第一表达载体可以为pACYCDuet-1(购买于Novagen公司)。
在本实施例中，可以采用如序列表中SEQ ID NO:4所示的上游引物和如序列表中SEQ ID NO:5所示的下游引物扩增P450BM3基因，采用如序列表中SEQ ID NO:6所示的上游引物和如序列表中SEQ ID NO:7所示的下游引物扩增CcFatB1基因。扩增条件为：4.8μlddH2O、10μl 2×Prime Star GC Buffer、2μl浓度为2.5mM的dNTP mix、1μl浓度为10μM的上游引物、1μl浓度为10μM的下游引物、0.2μl Takara Prime Star Taq酶和基因组DNA(基因组DNA为P450BM3基因或CcFatB1基因)。其中，基因组DNA可以采用质粒小提试剂盒(天根公司提供)进行提取，且提取过程参照质粒小提试剂盒的说明书。扩增的条件可以为：98℃预变性5min；98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸85s，扩增20个循环，每次循环结束后退火温度增加0.5℃；98℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸85s，扩增15个循环；72℃延伸6min，分别获得扩增产物，将扩增产物分别采用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳检测结果与实际一致。利用胶回收试剂盒(购置于天根公司)回收目的基因片段，将所得目的基因片段用于连接产物的制备。
具体地，将得到的P450BM3基因和第一表达载体分别用限制性内切酶EcoRI和限制性内切酶NotI进行双酶切，P450BM3基因的酶切体系为：30μl P450BM3基因(浓度为30ng/μl)、5μl 10×K buffer、5μl EcoRI、5μl NotI、5μl ddH2O，第一表达载体的酶切体系为：5μl第一表达载体(浓度为30ng/μl)、5μl 10×K buffer、5μl EcoRI、5μl NotI、30μl ddH2O，酶切反应条件为：37℃，酶切3h。酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，并回收目的片段，回收方法按照胶回收试剂盒(购置于天根公司)说明书进行。将回收到的P450BM3基因和第一表达载体的片段用T4-DNA连接酶进行连接，连接体系为：13μl P450BM3基因、4μl第一表达载体、1μl 10×buffer、0.5μl T4-DNA连接酶，连接条件为：16℃连接反应过夜。最终得到第一连接产物。
采用限制性内切酶BglII和限制性内切酶XhoI分别对第一连接产物和硫脂酶基因进行双酶切，硫脂酶基因酶切体系为：30μl硫脂酶基因、5μl 10×H buffer、5μl BglII、5μlXhoI、5μl ddH2O，第一连接产物酶切体系为：30μl第一连接产物、5μl 10×H buffer、5μlBglII、5μl XhoI、5μl ddH2O，酶切反应条件为：37℃，酶切3h。将酶切后的硫脂酶基因与酶切后的第一连接产物连接，连接体系及连接条件参照前面步骤，得到第一重组表达载体。
将脂肪酸调控因子fadR连接到第二表达载体上，得到第二重组表达载体。
具体地，脂肪酸调控因子fadR的克隆和连接。使用TaKaRa公司提供的细菌基因组提取试剂盒提取大肠杆菌(E.coli)MG1655的总基因组DNA，用高保真酶(Phusion High-Fidelity DNA Polymerase，Thermo)进行脂肪酸调控因子fadR片段的扩增，采用如序列表中SEQ ID NO:8所示的上游引物和如序列表中SEQ ID NO:9所示的下游引物扩增脂肪酸调控因子fadR，扩增条件为34μl ddH2O、10μl 5×HF buffer、1μl浓度为10mM的dNTP、1μl浓度为10μM的上游引物、1μl浓度为10μM的下游引物、1μl Phusion高保真酶和2μl大肠杆菌MG1655的总基因组DNA(浓度为100ng/μl)。扩增程序为98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s，扩增30个循环；72℃延伸10min，获得扩增产物脂肪酸调控因子fadR，将扩增产物脂肪酸调控因子fadR采用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳检测结果与实际一致。利用胶回收试剂盒(购置于天根公司)回收目的基因片段，将所得目的基因片段用于连接产物的制备。
将第二连接载体和扩增得到的脂肪酸调控因子fadR分别用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶HindIII进行双酶切，得到酶切后的脂肪酸调控因子fadR和酶切后的第二连接载体。在本实施例中，第二表达载体可以为载体pET-28a(+)(购买于Novagen公司)。将酶切后的脂肪酸调控因子fadR与酶切后的载体pET-28a(+)连接，连接体系及连接条件参照前面步骤，得到第二重组表达载体，该第二重组表达载体的结构如图2所示。
将第一重组表达载体和第二重组表达载体共同转入感受态细胞中，得到重组菌株，即工程菌株。
具体地，感受态细胞为敲除了fadD基因的大肠杆菌感受态细胞E.coli BL21(DE3)。其中，敲除fadD基因的方法可以采用常规的细菌基因敲除方法，敲除了fadD基因的大肠杆菌感受态细胞能够明显提高羟基脂肪酸的产量，尤其是中链羟基脂肪酸ω3-OH-C14:1的产量，这是由于fadD基因负责编码酰基辅酶A合成酶(Acyl-CoA synthetase)，该fadD基因敲除后能够显著抑制脂肪酸的降解，相比于未敲除fadD基因的大肠杆菌感受态细胞，敲除fadD基因后的大肠杆菌感受态细胞的羟基脂肪酸的产量可以增加一倍，尤其是中链羟基脂肪酸ω3-OH-C14:1，ω3-OH-C14:0，ω2-OH-C14:0和ω1-OH-C14:0的含量分别增加了两到三倍。
具体地，在转入过程中可以采用本领域常用的热击法。具体方法包括：将-70℃保存的大肠杆菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞的离心管置于冰上溶解，将第一重组表达载体和第二重组表达载体共同加入到溶解后的感受态细胞中，得到混合溶液，轻轻混匀离心管中的混合溶液后于冰上静置30min；再将离心管置于42℃水浴锅中热击60s，注意操作过程中动作要轻柔，将离心管置于冰上静置2min，向离心管中加入500mL新鲜的LB液体平板培养基，于37℃恒温摇床上振荡培养1h，将离心管取出于4000rpm离心1min，去除上清液，得到沉淀，将沉淀涂布于添加有抗生素的LB固体平板培养基(成分包括5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和10g/L氯化钠)上，并置于37℃恒温培养下过夜培养，挑取LB固体平板培养基上的单菌落进行PCR检测，检测得到阳性的重组菌株。
进一步地，检验重组菌株，具体方法包括：将重组菌株采用如序列表中SEQ ID NO:10所示的上游引物和如序列表中SEQ ID NO:11所示的下游引物进行PCR扩增。PCR扩增的反应体系和扩增程序均为常规扩增体系和扩增程序。具体地，反应体系可以为：4.8μl ddH2O、10μl 2×Prime Star GC Buffer、2μl浓度为2.5mM的dNTP mix、1μl浓度为10μM的上游引物、1μl浓度为10μM的下游引物、0.2μl Takara Prime Star Taq酶和单菌落的基因组DNA。
其中，单菌落的基因组DNA可以采用质粒小提试剂盒(天根公司提供)进行提取，且提取过程参照该质粒小提试剂盒的说明书，PCR扩增的条件为：98℃预变性5min；98℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸85s，扩增20个循环，每次循环结束后退火温度增加0.5℃；98℃变性30s，65℃退火30s，72℃延伸85s，扩增15个循环；72℃延伸6min，得到菌落扩增产物。将菌落扩增产物采用浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，电泳检测结果与实际一致则为阳性的重组菌株，即工程菌株。
本发明实施例提供了一种制备工程菌株的方法，该方法能够高效快速生产该工程菌株，同时，使得制备出的工程菌株所合成的羟基脂肪酸的产量得到提高，特别是中链羟基脂肪酸的产量得到了很大的提高。
实施例三
本发明实施例提供了一种工程菌株在合成羟基脂肪酸中的应用，该应用包括：活化经过检验为阳性的重组菌株，包括：将阳性的重组菌株涂布于LB固体平板培养基(成分包括5g/L酵母提取物、10g/L蛋白胨和10g/L氯化钠)上过夜培养。
发酵活化后的阳性的重组菌株，并加入诱导剂进行诱导，得到诱导产物。
具体地，发酵时采用发酵培养基，发酵培养基为含有抗生素和浓度为0.5％的葡萄糖的M9培养基(M9培养基成分包括：15.13g/L十二水合磷酸氢二钠、3g/L磷酸二氢钾、1g/L氯化铵、0.5g/L氯化钠和2mM硫酸镁)，抗生素包括浓度为50μg/mL的卡纳霉素和浓度为34μg/mL的氯霉素。同时，将活化后的阳性的重组菌株按照1％的接种量接种至发酵培养基中，发酵条件为37℃200r pm培养至重组菌株生长到对数期(OD600为0.6)。采用含有浓度为0.5％的葡萄糖的M9培养基作为发酵培养基，能够使重组菌株直接利用葡萄糖的糖酵解转化为乙酰辅酶A，乙酰辅酶A随后通过FASII系统逐渐积累并产生酰基载体蛋白从而产生羟基脂肪酸，且产生的羟基脂肪酸能够分泌到培养基中。在发酵后促进游离的中链羟基脂肪酸的产生，且游离的中链羟基脂肪酸主要包括3-OH-C14:0和少量的3-OH-C14:1。
具体地，该发酵培养基还可以包括浓度为2％的甘油，甘油作为一种来源丰富、成本低廉的碳源，在其进入糖酵解的过程中能产生大量的还原力，促进羟基化反应，进一步提高羟基脂肪酸的产量。
同时，本实施例提供的方法采用廉价的碳源葡萄糖和廉价的碳源甘油替换传统的游离脂肪酸来生产羟基脂肪酸，从而降低了制备羟基脂肪酸的成本。
发酵活化后的重组菌株，并加入诱导剂进行诱导，得到诱导产物；在诱导产物中提取羟基脂肪酸。其中，诱导剂可以为浓度1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导条件可以为30℃150rpm振荡培养16h。离心诱导产物，收集上清液，分离提取上清液中的羟基脂肪酸。
在上清液中分离并提取羟基脂肪酸的方法包括：取4mL上清液加入500μl冰醋酸、500μl 12％(w/v)的氯化钠水溶液、25μg内标(C21:0游离脂肪酸)和2mL乙酸乙酯，室温振荡20min后进行离心，离心后收集上层有机相，并用氮气吹干。向吹干的产物中加入750μl甲脂化试剂(CH3OH:HCl＝9:1，v/v)，于80℃水浴3h，冷却至室温后再分别加入0.5mL0.9％(w/v)的氯化钠水溶液和0.4mL的正己烷经过漩涡振荡后，静置待溶液分层后取上清液至于1.5mL离心管中，经过8000rpm离心10min。为了检测羟基脂肪酸的存在，需要对甲酯化脂肪酸进行硅烷化反应，取甲酯化后的脂肪酸氮气吹干后加入等体积的硅烷化试剂RC-2(99％BSTFA+1％TMCS，REGIS)，置于90℃反应1h，冷却至室温后可直接用于气相色谱-质谱对脂肪酸分析。
脂肪酸分析
本实施例采用安捷伦公司的GC7890A-5795C气质联用仪测定硅烷化化样品的羟基脂肪酸组成，色谱条件如下：
色谱柱：HP-5(30m×320μm×0.25μm)毛细管柱，三轴检测器(Triple-Axisdetector)；进样体积：1μl，分流比：20:1；程序升温：初温50℃，保持1min，15℃/min升温至250℃，保持10min；进样口和检测器温度分别为250℃和280℃。
对上清液进行脂肪酸分析，共检测到19种羟基脂肪酸，19种羟基脂肪酸包括ω1-OH-C12/C14/C16/C18、ω2-OH-C12/C14/C16/C18、ω3-OH-C12/C14/C16/C18、3-OH C14:0和3-OH C14:1。在上清液中检测到羟基脂肪酸，证明本实施例构建的重组菌株具有高效的分泌系统，使得几乎全部新合成的羟基脂肪酸均分泌到培养基中，这显著降低了后期羟基脂肪酸提取纯化的成本。
经过分析可知，如图3所示，该重组菌株(BD-APCcF)产生的总羟基脂肪酸的量达到137.5mg/L，约占总游离脂肪酸含量的75％。该菌株对生产ω3/ω2/ω1-C14羟基脂肪酸具有显著的偏好性，ω3/ω2/ω1-C14羟基脂肪酸的产量达到10 2.7mg/L，占总羟基脂肪酸的74.7％。
本发明实施例提供了一种工程菌株在合成羟基脂肪酸中的应用，该应用利用微生物发酵的方式合成羟基脂肪酸，使得合成羟基脂肪酸的过程简单，且反应条件温和，属于环境友好的反应条件，且该应用能够提高工程菌株的羟基脂肪酸的产量，特别是显著提高工程菌株的中链羟基脂肪酸的产量。同时，该工程菌株具有高效的分泌系统，在应用时，几乎全部新合成的羟基脂肪酸均分泌到培养基中，这能够降低后期羟基脂肪酸的提取纯化的成本。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110>中国农业科学院油料作物研究所
<120>一种产羟基脂肪酸的工程菌株及其制备方法和应用
<160>11
<170>PatentIn version 3.4
<210> 1
<211>3150
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atgacaatta aagaaatgcc tcagccaaaa acgtttggag agcttaaaaa tttaccgtta 60
ttaaacacag ataaaccggt tcaagctttg atgaaaattg cggatgaatt aggagaaatc 120
tttaaattcg aggcgcctgg tcgtgtaacg cgctacttat caagtcagcg tctaattaaa 180
gaagcatgcg atgaatcacg ctttgataaa aacttaagtc aagcgcttaa atttgtacgt 240
gattttgcag gagacgggtt atttacaagc tggacgcatg aaaaaaattg gaaaaaagcg 300
cataatatct tacttccaag cttcagtcag caggcaatga aaggctatca tgcgatgatg 360
gtcgatatcg ccgtgcagct tgttcaaaag tgggagcgtc taaatgcaga tgagcatatt 420
gaagtaccgg aagacatgac acgtttaacg cttgatacaa ttggtctttg cggctttaac 480
tatcgcttta acagctttta ccgagatcag cctcatccat ttattacaag tatggtccgt 540
gcactggatg aagcaatgaa caagctgcag cgagcaaatc cagacgaccc agcttatgat 600
gaaaacaagc gccagtttca agaagatatc aaggtgatga acgacctagt agataaaatt 660
attgcagatc gcaaagcaag cggtgaacaa agcgatgatt tattaacgca tatgctaaac 720
ggaaaagatc cagaaacggg tgagccgctt gatgacgaga acattcgcta tcaaattatt 780
acattcttaa ttgcgggaca cgaaacaaca agtggtcttt tatcatttgc gctgtatttc 840
ttagtgaaaa atccacatgt attacaaaaa gcagcagaag aagcagcacg agttctagta 900
gatcctgttc caagctacaa acaagtcaaa cagcttaaat atgtcggcat ggtcttaaac 960
gaagcgctgc gcttatggcc aactgctcct gcgttttccc tatatgcaaa agaagatacg 1020
gtgcttggag gagaatatcc tttagaaaaa ggcgacgaac taatggttct gattcctcag 1080
cttcaccgtg ataaaacaat ttggggagac gatgtggaag agttccgtcc agagcgtttt 1140
gaaaatccaa gtgcgattcc gcagcatgcg tttaaaccgt ttggaaacgg tcagcgtgcg 1200
tgtatcggtc agcagttcgc tcttcatgaa gcaacgctgg tacttggtat gatgctaaaa 1260
cactttgact ttgaagatca tacaaactac gagctggata ttaaagaaac tttaacgtta 1320
aaacctgaag gctttgtggt aaaagcaaaa tcgaaaaaaa ttccgcttgg cggtattcct 1380
tcacctagca ctgaacagtc tgctaaaaaa gtacgcaaaa aggcagaaaa cgctcataat 1440
acgccgctgc ttgtgctata cggttcaaat atgggaacag ctgaaggaac ggcgcgtgat 1500
ttagcagata ttgcaatgag caaaggattt gcaccgcagg tcgcaacgct tgattcacac1560
gccggaaatc ttccgcgcga aggagctgta ttaattgtaa cggcgtctta taacggtcat 1620
ccgcctgata acgcaaagca atttgtcgac tggttagacc aagcgtctgc tgatgaagta 1680
aaaggcgttc gctactccgt atttggatgc ggcgataaaa actgggctac tacgtatcaa 1740
aaagtgcctg cttttatcga tgaaacgctt gccgctaaag gggcagaaaa catcgctgac 1800
cgcggtgaag cagatgcaag cgacgacttt gaaggcacat atgaagaatg gcgtgaacat 1860
atgtggagtg acgtagcagc ctactttaac ctcgacattg aaaacagtga agataataaa 1920
tctactcttt cacttcaatt tgtcgacagc gccgcggata tgccgcttgc gaaaatgcac 1980
ggtgcgtttt caacgaacgt cgtagcaagc aaagaacttc aacagccagg cagtgcacga 2040
agcacgcgac atcttgaaat tgaacttcca aaagaagctt cttatcaaga aggagatcat 2100
ttaggtgtta ttcctcgcaa ctatgaagga atagtaaacc gtgtaacagc aaggttcggc 2160
ctagatgcat cacagcaaat ccgtctggaa gcagaagaag aaaaattagc tcatttgcca 2220
ctcgctaaaa cagtatccgt agaagagctt ctgcaatacg tggagcttca agatcctgtt 2280
acgcgcacgc agcttcgcgc aatggctgct aaaacggtct gcccgccgca taaagtagag 2340
cttgaagcct tgcttgaaaa gcaagcctac aaagaacaag tgctggcaaa acgtttaaca 2400
atgcttgaac tgcttgaaaa atacccggcg tgtgaaatga aattcagcga atttatcgcc 2460
cttctgccaa gcatacgccc gcgctattac tcgatttctt catcacctcg tgtcgatgaa 2520
aaacaagcaa gcatcacggt cagcgttgtc tcaggagaag cgtggagcgg atatggagaa 2580
tataaaggaa ttgcgtcgaa ctatcttgcc gagctgcaag aaggagatac gattacgtgc 2640
tttatttcca caccgcagtc agaatttacg ctgccaaaag accctgaaac gccgcttatc 2700
atggtcggac cgggaacagg cgtcgcgccg tttagaggct ttgtgcaggc gcgcaaacag 2760
ctaaaagaac aaggacagtc acttggagaa gcacatttat acttcggctg ccgttcacct 2820
catgaagact atctgtatca agaagagctt gaaaacgccc aaagcgaagg catcattacg 2880
cttcataccg ctttttctcg catgccaaat cagccgaaaa catacgttca gcacgtaatg 2940
gaacaagacg gcaagaaatt gattgaactt cttgatcaag gagcgcactt ctatatttgc 3000
ggagacggaa gccaaatggc acctgccgtt gaagcaacgc ttatgaaaag ctatgctgac 3060
gttcaccaag tgagtgaagc agacgctcgc ttatggctgc agcagctaga agaaaaaggc 3120
cgatacgcaa aagacgtgtg ggctgggtaa 3150
<210> 2
<211>1146
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
atggctacca cctctctggc ttctgctttc tgctctatga aagctgttat gctggctcgt 60
gacggtcgtg gtatgaaacc gcgttcttct gacctgcagc tgcgtgctgg taacgctcag 120
acctctctga aaatgatcaa cggtactaaa ttctcttaca ccgaatctct gaaaaaactg 180
ccggactggt ctatgctgtt cgctgttatc accaccatct tctctgctgc tgaaaaacag 240
tggaccaacc tggaatggaa accgaaaccg aacccgccgc agctgctgga cgaccacttt 300
ggtccgcatg gtctggtatt ccgccgtacc ttcgctatcc gttcttacga agttggtccg 360
gaccgttcta cctctatcgt tgctgttatg aaccacctgc aggaagctgc tctgaaccac 420
gctaaatctg ttggtatcct gggtgacggt ttcggtacta ccctggaaat gtctaaacgt 480
gacctgatct gggttgttaa acgtacccac gttgctgttg aacgttaccc ggcttggggt 540
gacaccgttg aagttgaatg ctgggttggt gcttctggta acaacggtcg tcgtcacgac 600
ttcctggttc gtgactgcaa aaccggtgaa atcctgaccc gttgcacctc tctgtctgtt 660
atgatgaaca cccgtacccg tcgtctgtct aaaatcccgg aagaagttcg tggtgaaatc 720
ggtccggctt tcatcgacaa cgttgctgtt aaagacgaag aaatcaaaaa accgcagaaa 780
ctgaacgact ctaccgctga ctacatccag ggtggtctga ccccgcgttg gaacgacctg 840
gacatcaacc agcacgttaa caacatcaaa tacgttgact ggatcttaga aaccgttccg 900
gactctatct tcgaatctca ccacatctct tctttcacca tcgaataccg tcgtgaatgc 960
accatggact ctgttctgca gtctctgacc accgtttctg gtggttcttc tgaagctggt 1020
ctggtttgcg aacacctgct gcagctggaa ggtggttctg aagttctgcg tgctaaaacc 1080
gaatggcgtc cgaaactgac cgactctttc cgtggtatct ctgttatccc ggctgaatct 1140
tctgtt 1146
<210> 3
<211>720
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atggtcatta aggcgcaaag cccggcgggt ttcgcggaag agtacattat tgaaagtatc 60
tggaataacc gcttccctcc cgggactatt ttgcccgcag aacgtgaact ttcagaatta 120
attggcgtaa cgcgtactac gttacgtgaa gtgttacagc gtctggcacg agatggctgg 180
ttgaccattc aacatggcaa gccgacgaag gtgaataatt tctgggaaac ttccggttta 240
aatatccttg aaacactggc gcgactggat cacgaaagtg tgccgcagct tattgataat 300
ttgctgtcgg tgcgtaccaa tatttccact atttttattc gcaccgcgtt tcgtcagcat 360
cccgataaag cgcaggaagt gctggctacc gctaatgaag tggccgatca cgccgatgcc 420
tttgccgagc tggattacaa catattccgc ggcctggcgt ttgcttccgg caacccgatt 480
tacggtctga ttcttaacgg gatgaaaggg ctgtatacgc gtattggtcg tcactatttc 540
gccaatccgg aagcgcgcag tctggcgctg ggcttctacc acaaactgtc ggcgttgtgc 600
agtgaaggcg cgcacgatca ggtgtacgaa acagtgcgtc gctatgggca tgagagtggc 660
gagatttggc accggatgca gaaaaatctg ccgggtgatt tagccattca ggggcgataa 720
<210> 4
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
ggaattcatg acaattaaag aaatgcctca g 31
<210>5
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
ccgctcgagt cccagcccac acgtcttttg 30
<210>6
<211> 27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
ggaattcatg gctaccacct ctctggc 27
<210>7
<211> 29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
ccgctcgaga acagaagatt cagccggga 29
<210>8
<211> 33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
cgggatccga tggtcattaa ggcgcaaagc ccg 33
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
ccgctcgagt cgcccctgaa tggctaaatc acc 33
<210>10
<211> 27
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
ggaattcatg gctaccacct ctctggc 27
<210>11
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
ccgctcgaga acagaagatt cagccggga 29

Claims (10)

1.一种产羟基脂肪酸的工程菌株，其特征在于，所述工程菌株包括：P450BM3基因、硫脂酶基因和脂肪酸调控因子fadR，所述P450BM3基因的序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，所述硫脂酶基因为序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，所述脂肪酸调控因子fadR的序列如序列表中SEQ ID NO.3所示。
2.一种制备如权利要求1所述的工程菌株的方法，其特征在于，所述方法包括：
将所述P450BM3基因和所述硫脂酶基因分别连接到第一表达载体上，得到第一重组表达载体；
将所述脂肪酸调控因子fadR连接到第二表达载体上，得到第二重组表达载体；
将所述第一重组表达载体和所述第二重组表达载体共同转入感受态细胞中，得到重组菌株，即所述工程菌株。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述感受态细胞为敲除了fadD基因的大肠杆菌感受态细胞。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述将所述P450BM3基因和所述硫脂酶基因分别连接到第一表达载体上，得到第一重组表达载体，包括：
采用限制性内切酶EocRI和限制性内切酶NotI分别对所述P450BM3基因和所述第一表达载体进行双酶切，将酶切后的所述P450BM3基因与酶切后的所述第一表达载体连接，得到第一连接产物；
采用限制性内切酶BglII和限制性内切酶XhoI分别对所述第一连接产物和所述硫脂酶基因进行双酶切，将酶切后的所述硫脂酶基因与酶切后的所述第一连接产物连接，得到第一重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述第一表达载体为pACYCDuet-1。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述将所述脂肪酸调控因子fadR连接到第二表达载体上，得到第二重组表达载体，包括：
采用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶HindIII分别对所述脂肪酸调控因子fadR和所述第二表达载体进行双酶切，得到酶切后的所述脂肪酸调控因子fadR和酶切后的所述第二表达载体，将所述酶切后的脂肪酸调控因子fadR与酶切后的所述第二表达载体连接，得到所述第二重组表达载体。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二表达载体为载体pET-28a(+)。
8.一种如权利要求1所述的工程菌株在合成羟基脂肪酸中的应用，其特征在于，所述应用包括：
活化所述重组菌株；
发酵活化后的所述重组菌株，并加入诱导剂进行诱导，得到诱导产物；
在所述诱导产物中提取羟基脂肪酸，得到所述羟基脂肪酸。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，采用发酵培养基发酵活化后的所述重组菌株，所述发酵培养基为含有抗生素和浓度为0.5％的葡萄糖的M9培养基，其中，所述抗生素包括浓度50μg/mL的卡纳霉素和浓度为34μg/mL的氯霉素。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基还包括浓度为2％的甘油。
CN201710515975.1A 2017-04-27 2017-06-29 一种产羟基脂肪酸的工程菌株及其制备方法和应用 Pending CN107177541A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710289166 2017-04-27
CN2017102891663 2017-04-27

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107177541A true CN107177541A (zh) 2017-09-19

Family

ID=59844621

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710515975.1A Pending CN107177541A (zh) 2017-04-27 2017-06-29 一种产羟基脂肪酸的工程菌株及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107177541A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113462708A (zh) * 2020-03-31 2021-10-01 天津大学 合成游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株及其构建方法和用途
EP3746551A4 (en) * 2018-01-31 2021-11-03 The Regents Of The University Of Michigan BIOCATALYZER AND METHOD FOR SYNTHESIS OF MIXED DISULFIDE CONJUGATES OF THIENOPYRIDINE COMPOUNDS
CN114561415A (zh) * 2022-04-08 2022-05-31 清华大学 一种在微生物中用油酸调控基因表达的方法及其应用

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3746551A4 (en) * 2018-01-31 2021-11-03 The Regents Of The University Of Michigan BIOCATALYZER AND METHOD FOR SYNTHESIS OF MIXED DISULFIDE CONJUGATES OF THIENOPYRIDINE COMPOUNDS
CN113462708A (zh) * 2020-03-31 2021-10-01 天津大学 合成游离脂肪酸重组大肠杆菌菌株及其构建方法和用途
CN114561415A (zh) * 2022-04-08 2022-05-31 清华大学 一种在微生物中用油酸调控基因表达的方法及其应用
CN114561415B (zh) * 2022-04-08 2023-08-22 清华大学 一种在微生物中用油酸调控基因表达的方法及其应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107177541A (zh) 一种产羟基脂肪酸的工程菌株及其制备方法和应用
CN107099516A (zh) 7β‑羟基甾醇脱氢酶突变体及其在熊脱氧胆酸合成中的应用
CN102191208A (zh) 高产多杀菌素的基因工程菌及其制备方法
CN105441371B (zh) 一种基因工程菌及其在生产辅酶q10中的应用
CN106520715B (zh) 一种短链脱氢酶及其基因、重组表达载体、基因工程菌及其在虾青素手性中间体合成中的应用
CN106164282A (zh) 有机化合物的半合成途径
CN109777793A (zh) 一种gdsl脂肪酶、基因工程菌及其应用
JP2002508929A (ja) リノール酸イソメラーゼ
CN101993903A (zh) 一种用于生产子囊霉素的发酵培养基及其发酵方法
CN103820405A (zh) 一种通过无细胞蛋白质合成系统表达脂肪酸脱饱和酶的方法
CN108138126B (zh) 一种分枝杆菌基因工程菌及其在制备甾体化合物中的应用
CN103131659B (zh) 一种耐有机溶剂脂肪酶、其编码基因、产生菌株及应用
CN104894043A (zh) 一种产γ-氨基丁酸的工程菌及其构建和应用
CN107488639A (zh) 甲苯单加氧酶及其在手性亚砜生物催化合成中的应用
Gao et al. Identification of a GDSL lipase from Streptomyces bacillaris and its application in the preparation of free astaxanthin
Zaplana et al. Lachnospiraceae are emerging industrial biocatalysts and biotherapeutics
CN112175890A (zh) 一种以食用菌分泌乙醇脱氢酶的基因工程菌
CN116987603A (zh) 一种高产大麻萜酚酸的重组酿酒酵母菌株及其构建方法与应用
CN108728474A (zh) 一种利用蓝藻合成丙烯酸的方法
KR102579073B1 (ko) 슈도모나스 유래 리폭시게나아제 기반 재조합 대장균 및 이를 이용한 히드록시 지방산 및 이차 지방알콜 제조방법
JP4221476B2 (ja) イコサペンタエン酸生合成遺伝子群をクローニングしたプラスミド及びイコサペンタエン酸を産生するラン藻
CN105331647A (zh) 一种微生物体内合成脂肪醇乙酸酯的方法
CN108795955A (zh) 一种硝基还原酶基因cnrB及其编码的蛋白和应用
Jin et al. Enhanced extraction genistein from pigeon pea [Cajanus cajan (L.) Millsp.] roots with the biotransformation of immobilized edible Aspergillus oryzae and Monacus anka and antioxidant activity evaluation
CN104560800A (zh) 一种苯丙酮酸还原酶及其在不对称合成(r)-苯乳酸中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20170919