CN108728474A - 一种利用蓝藻合成丙烯酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用蓝藻合成丙烯酸的方法，步骤如下：1)首先，基于蓝藻Syn7942的NSI基因构建整合载体NSI，重组得到载体NSI‑ceaS2；2)将重组载体NSI‑ceaS2转化至蓝藻Syn7942细胞内，然后通过氯霉素固体培养基初步筛选出单克隆转基因蓝藻Syn7942；3)将筛选出的单克隆转基因蓝藻Syn7942转接至带有氯霉素抗性的液体培养基中，待蓝藻生长出后，提取蓝藻基因组，进行目的基因的PCR验证；4)将验证成功的单克隆转基因蓝藻Syn7942转接至液体培养基培养，待蓝藻长到OD730大于或等于1时，添加IPTG诱导基因ceaS2的表达，该酶将以蓝藻光合作用产生的三磷酸甘油醛(G3P)或磷酸二羟基丙酮(DHAP)为底物，催化合成丙烯酸；5)分离提纯。本发明以蓝藻为底盘生物进行改造合成丙烯酸，生产原料仅需阳光和水分等，生产设备和生产环境构建简单，不需要大量用电，因此相较于其它生产方法，生产成本大幅度降低。

Description

一种利用蓝藻合成丙烯酸的方法

技术领域

本发明涉及一种利用蓝藻合成丙烯酸的方法，属于合成生物学领域。

背景技术

蓝藻(Cyanobacteria)是一类通过光合作用获取能量的细菌，又名蓝绿藻、蓝绿菌或蓝细菌，其形态结构简单，无固定细胞核，体内含有的藻蓝蛋白和变藻蓝蛋白加上叶绿体蛋白使之呈现出蓝绿色。蓝藻是地球上最早出现的藻类，是最简单、最原始的单细胞生物，在漫长的进化过程中，蓝藻把地球变成氧化型地球，并被内吞成植物的叶绿体，可以认为蓝藻是最简单的光合作用单位。

由于蓝藻独特的能进行光合作用的生理特性，许多科学家将蓝藻看作一种“生物光反应器”，通过它将空气中的二氧化碳和水变成人类需要的化工产品和一些高价值的天然产物。对蓝藻进行基因改造来生物合成这些产品具有许多优势：(1)目前许多常见蓝藻的基因组，如聚球藻、集胞藻、鱼腥藻等，都已经被测序完毕，同时由于蓝藻的基因组小、结构简单，科学家已经发明了一套针对蓝藻细胞的成熟、易操作的基因编辑体系；(2)相对于高等动植物，蓝藻具有微生物生长快速的特点，适于进行产品的大规模生产操作；(3)蓝藻的适应能力很强，能在很多恶劣环境中生存，同时蓝藻需要的生存条件非常简单，甚至只需阳光和水分就能存活，因此在大规模培养时不仅能大幅度节省原料成本，而且不需要占用耕地资源，避免了和生产食物粮食等竞争土地资源的冲突。(4)蓝藻通过光合作用吸收空气中的二氧化碳并产生氧气排放到空中，因此大规模培养蓝藻能有效地缓解人类不断使用化石原料等造成的“温室效应”，起到一定的环保作用。所以使用蓝藻作为合成生物学中的底盘生物，具有广大的前景和巨大的价值。

丙烯酸分子式：C3H4O2；英文名称：Acrylic acid；CAS：79-10-7；分子量：72.06；物理性质：与水混溶，可混溶于乙醇、乙醚，无色液体，有刺激性气味；熔点为13℃，沸点为141℃，闪点为54℃，密度为1.05g/cm。

丙烯酸是重要的有机合成原料及合成树脂单体，是聚合速度非常快的乙烯类单体。是最简单的不饱和羧酸，由一个乙烯基和一个羧基组成。纯的丙烯酸是无色澄清液体，带有特征的刺激性气味。它可与水、醇、醚和氯仿互溶。大多数用以制造丙烯酸甲酯、乙酯、丁酯、羟乙酯等丙烯酸酯类。丙烯酸及丙烯酸酯可以均聚及共聚，其聚合物用于合成树脂、合成纤维、高吸水性树脂、建材、涂料等工业部门。丙烯酸作为市场需求排名近20位的大宗化学品，丙烯酸及其聚合物等在工业生产、航空航天、污水处理、医用材料及纳米材料等方面都有广泛的应用。随着科技的发展，人们对绿色环保材料的需求日益增加，使得以丙烯酸作为有机合成原料和合成树脂单体的功能性材料越来越受到人们的青睐。

丙烯酸工业生产主要采用丙烯氧化法。丙烯先与氧气反应生成丙烯醛，丙烯醛再去氧作用生成丙烯酸，转化率较高。尽管该法存在诸多优点，但是原料依赖于传统化石能源，污染重、耗能高、不可持续。目前也有利用半生物合成法或生物全合成法来合成丙烯酸，例如利用大肠杆菌或酿酒酵母等发酵来生物合成丙烯酸的方法，虽然这些生物合成法解决了产量低和部分环境污染等问题，但由于生产过程中的原料、设备及水电等成本太高，无法实现大规模生产。

本发明通过改造蓝藻生产丙烯酸旨在解决上面提到的这些技术难题，开发出一种产量高、无污染、生产周期短、成本低且环保的根皮素生物合成方法。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种利用蓝藻合成丙烯酸的生物合成方法，该方法产量高、无污染、生产周期短、成本低且环保。

本发明的目的是通过以下技术解决方案来实现的：

一种利用蓝藻合成丙烯酸的方法，所述方法包括如下步骤：

1)首先，基于蓝藻Syn7942的NSI基因构建整合载体NSI，再根据蓝藻Syn7942细胞密码子偏好性优化基因ceaS2的密码子，然后将此基因插入到载体NSI上，得到重组载体NSI-ceaS2；

2)基于蓝藻Syn7942在自然状态下能够吸收外源基因的特性，将重组载体NSI-ceaS2转化至蓝藻Syn7942细胞内，然后通过氯霉素固体培养基初步筛选出单克隆转基因蓝藻Syn7942；

3)将筛选出的单克隆转基因蓝藻Syn7942转接至带有氯霉素抗性的液体培养基中，待蓝藻生长出后，提取蓝藻基因组，进行目的基因的PCR验证；

4)将验证成功的单克隆转基因蓝藻Syn7942转接至液体培养基，在一定条件下培养，待蓝藻长到OD730大于或等于1时，添加IPTG诱导基因ceaS2的表达，表达的酶以蓝藻光合作用产生的三磷酸甘油醛或磷酸二羟基丙酮为底物为底物合成丙烯酸；

5)对产物丙烯酸进行分离提纯。

优选的，所述步骤2)中氯霉素固体培养基的组成基于专用于培养蓝藻的BG11培养基，添加氯霉素和琼脂，氯霉素终浓度为25-30ug/L，琼脂终浓度为15g/L，所述BG11培养基配方为：

1)磷酸氢二钾 3.17g/100ml

2)硫酸镁 7.5g/100ml

3)氯化钙 3.6g/100ml

4)柠檬酸 0.6g/100ml

5)柠檬酸铁铵 0.6g/100ml

6)EDTA·2Na·2H₂O 0.105g/100ml

7)碳酸钠 2.0g/100ml

8)A5包括：

H₃BO₃ 2.8g/L

MnCl₂·4H₂O 1.81g/L

ZnSO₄·7H₂O 0.22g/L

Na₂MoO₄·2H₂O 0.39g/L

CuSO₄·5H₂O 0.08g/L

CoCl₂·6H₂O 0.01g/L；

配制BG11培养基时，取2)、3)、4)、6)、7)、A5溶液各1mL，加入1.5g NaNO₃，混匀后加蒸馏水定容至1L，然后高温灭菌，等溶液冷却后再往里加入1mL的1)和5)溶液，即完成BG11液体培养基配制。

优选的，所述步骤3)和步骤4)中液体培养基的组成基于专用于培养蓝藻的BG11培养基，添加氯霉素，氯霉素终浓度为25-30ug/L，所述BG11培养基配方为：

1)磷酸氢二钾 3.17g/100ml

2)硫酸镁 7.5g/100ml

3)氯化钙 3.6g/100ml

4)柠檬酸 0.6g/100ml

5)柠檬酸铁铵 0.6g/100ml

6)EDTA·2Na·2H₂O 0.105g/100ml

7)碳酸钠 2.0g/100ml

8)A5包括：

H₃BO₃ 2.8g/L

MnCl₂·4H₂O 1.81g/L

ZnSO₄·7H₂O 0.22g/L

Na₂MoO₄·2H₂O 0.39g/L

CuSO₄·5H₂O 0.08g/L

CoCl₂·6H₂O 0.01g/L；

配制BG11培养基时，取2)、3)、4)、6)、7)、A5溶液各1mL，加入1.5g NaNO₃，混匀后加蒸馏水定容至1L，然后高温灭菌，等溶液冷却后再往里加入1mL的1)和5)溶液，即完成BG11液体培养基配制。

优选的，所述步骤4)中，培养条件如下：100-200rpm旋转，30-35℃光照培养至OD730大于1.0时，添加IPTG至终浓度为1mM，培养24-120h。

优选的，所述丙烯酸的分离提纯操作如下：

取IPTG诱导后培养的转基因蓝藻培养液100mL，用高压破碎仪破碎蓝藻细胞，然后10000rpm，离心10min，取上清液，用高效液相色谱仪检测丙烯酸。

本发明生产丙烯酸与现有技术的不同之处在于：

1)以蓝藻为底盘生物进行改造合成丙烯酸，生产原料仅需阳光和水分等，生产设备和生产环境构建简单，不需要大量用电，因此相较于其它生产方法，生产成本大幅度降低；

2)以改造微生物为技术基础，在微生物体内进行生物酶的催化合成，避免大规模的提取、分离、纯化过程，从生产成本和对环境友好方面容易控制；

3)本工艺在生产设备的规模和数量上比其他方法要要少，操作简单，易于产业转化；

4)本工艺仅在生产的最后步骤有分离纯化工序，产品纯化工艺简单，产品质量比一般方法纯度更好、含量更高；

5)合成过程没有废液排放，环境友好，无污染，可持续生产，本发明工艺从经济、环境和职业健康角度均为优良的工业化生产指路线。

本专利用到的物种及基因见下表1。

表1专利中用到的物种

附图说明

图1为本发明的丙烯酸生物合成路线图；

图2和图3为本发明中用到的质粒图谱。

具体实施方式

以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。

实施例1

质粒构建过程：根据蓝藻Syn7942的NSI基因序列，按照附图2中的质粒图谱构建整合载体NSI。然后根据本发明中提供的基因ceaS2氨基酸序列，按照蓝藻Syn7942细胞密码子偏好性设计相应基因的核酸序列，将基因ceaS2送商业公司合成，设计20bp左右大小的同源臂，按照附图3中的质粒图谱，利用一步克隆试剂盒，将这两个基因构建于整合载体NSI上。

实施例2转化过程：

1)取2mL生长密度OD730为0.8～1.2的野生型Syn7942于离心管中，然后10000rpm，离心2min，去掉上清液；

2)用1mL 10mM氯化钠溶液混匀上一步中的沉淀物，然后10000rpm，离心2min，去掉上清液；

3)用1mL已灭菌的无抗BG11液体培养基混匀上一步中的沉淀物，然后10000rpm，离心2min，去掉上清液；

4)用100uL已灭菌的无抗BG11液体培养基混匀上一步中的沉淀物，然后向其中加入200ng的质粒DNA。用锡箔纸彻底密封该离心管(避光处理)，然后在摇床中，100rpm，30℃培养10小时；

5)将上一步离心管中的蓝藻全部涂到含有25ug/mL氯霉素的BG11固体培养基上，将平板放入30℃光照培养箱中，待1到2个星期长出蓝藻单克隆后进行后续验证。

(除离心外，以上其余操作必须在超净台中完成，保证无菌环境)

实施例3转基因蓝藻的验证和产物的检测过程：

挑取10个左右含有25ug/mL氯霉素BG11固体培养基上长出来的单克隆蓝藻菌斑，接入5mL25ug/mL氯霉素BGS1液体体培养基中培养，待蓝藻培养好后，提取基因组，以设计好的引物PCR验证ceaS2目的基因，并PCR将产物送测序，确定基因序列是否正确；将验证正确的转ceaS2的蓝藻Syn7942接入100mL BG11液体培养基中光照培养，待OD730为1时，添加底物对羟基苯丙酸，同时添加IPTG诱导ceaS2两个基因表达，表达的酶以蓝藻光合作用产生的三磷酸甘油醛或磷酸二羟基丙酮为底物为底物合成丙烯酸，然后分别取诱导后培养1天、3天、5天时的转基因蓝藻，用高压破碎仪破碎蓝藻细胞，对产物分离提纯后，用高效液相色谱仪检测。

(以上实验均用野生型Syn7942做阴性对照实验)

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡是在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应在本发明的保护范围之列。

序列表

<110> 嘉兴欣贝莱生物科技有限公司

<120> 一种利用蓝藻合成丙烯酸的方法

<130> 2018201806

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1529

<212> DNA

<213> 蓝藻(Synechococcus elongatus PCC7942)

<400> 1

tatcaagatt gctggggaag aaccgaccat ccacaacgcg atcgagcggc tgcttggcaa 60

aaaccgtaag gaaatcgagc aaattgccaa ggagaccctc gaaggcaact tgcgtggtgt 120

tttagccagc ctcacgccgg agcagatcaa cgaggacaaa attgcctttg ccaaaagtct 180

gctggaagag gcggaggatg accttgagca gctgggtcta gtcctcgata cgctgcaagt 240

ccagaacatt tccgatgagg tcggttatct ctcggctagt ggacgcaagc agcgggctga 300

tctgcagcga gatgcccgaa ttgctgaagc cgatgcccag gctgcctctg cgatccaaac 360

ggccgaaaat gacaagatca cggccctgcg tcggatcgat cgcgatgtag cgatcgccca 420

agccgaggcc gagcgccgga ttcaggatgc gttgacgcgg cgcgaagcgg tggtggccga 480

agctgaagcg gacattgcta ccgaagtcgc tcgtagccaa gcagaactcc ctgtgcagca 540

ggagcggatc aaacaggtgc agcagcaact tcaagccgat gtgatcgccc cagctgaggc 600

agcttgtaaa cgggcgatcg cggaagcgcg gggggccgcc gcccgtatcg tcgaagatgg 660

aaaagctcaa gcggaaggga cccaacggct ggcggaggct tggcagaccg ctggtgctaa 720

tgcccgcgac atcttcctgc tccagaagct cgagtccctg ctcgtcacgc tttcaggcac 780

cgtgccagat atcgacgtgg agtcgatcac tgtgattggc gaaggggaag gcagcgctac 840

ccaaatcgct agcttgctgg agaagctgaa acaaaccacg ggcattgatc tggcgaaatc 900

cctaccgggt caatccgact cgcccgctgc gaagtcctaa gagatagcga tgtgaccgcg 960

atcgcttgtc aagaatccca gtgatcccga accataggaa ggcaagctca atgcttgcct 1020

cgtcttgagg actatctaga tgtctgtgga acgcacattt attgccatca agcccgatgg 1080

cgttcagcgg ggtttggtcg gtacgatcat cggccgcttt gagcaaaaag gcttcaaact 1140

ggtgggccta aagcagctga agcccagtcg cgagctggcc gaacagcact atgctgtcca 1200

ccgcgagcgc cccttcttca atggcctcgt cgagttcatc acctctgggc cgatcgtggc 1260

gatcgtcttg gaaggcgaag gcgttgtggc ggctgctcgc aagttgatcg gcgctaccaa 1320

tccgctgacg gcagaaccgg gcaccatccg tggtgatttt ggtgtcaata ttggccgcaa 1380

catcatccat ggctcggatg caatcgaaac agcacaacag gaaattgctc tctggtttag 1440

cccagcagag ctaagtgatt ggacccccac gattcaaccc tggctgtacg aataaggtct 1500

gcattccttc agagagacat tgccatgcc 1529

<210> 1

<211> 572

<212> PRT

<213> 棒状链霉菌(Streptomyces clavuligerus)

<400> 1

Met Ser Arg Val Ser Thr Ala Pro Ser Gly Lys Pro Thr Ala Ala His

1 5 10 15

Ala Leu Leu Ser Arg Leu Arg Asp His Gly Val Gly Lys Val Phe Gly

20 25 30

Val Val Gly Arg Glu Ala Ala Ser Ile Leu Phe Asp Glu Val Glu Gly

35 40 45

Ile Asp Phe Val Leu Thr Arg His Glu Phe Thr Ala Gly Val Ala Ala

50 55 60

Asp Val Leu Ala Arg Ile Thr Gly Arg Pro Gln Ala Cys Trp Ala Thr

65 70 75 80

Leu Gly Pro Gly Met Thr Asn Leu Ser Thr Gly Ile Ala Thr Ser Val

85 90 95

Leu Asp Arg Ser Pro Val Ile Ala Leu Ala Ala Gln Ser Glu Ser His

100 105 110

Asp Ile Phe Pro Asn Asp Thr His Gln Cys Leu Asp Ser Val Ala Ile

115 120 125

Val Ala Pro Met Ser Lys Tyr Ala Val Glu Leu Gln Arg Pro His Glu

130 135 140

Ile Thr Asp Leu Val Asp Ser Ala Val Asn Ala Ala Met Thr Glu Pro

145 150 155 160

Val Gly Pro Ser Phe Ile Ser Leu Pro Val Asp Leu Leu Gly Ser Ser

165 170 175

Glu Gly Ile Asp Thr Thr Val Pro Asn Pro Pro Ala Asn Thr Pro Ala

180 185 190

Lys Pro Val Gly Val Val Ala Asp Gly Trp Gln Lys Ala Ala Asp Gln

195 200 205

Ala Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Lys His Pro Val Leu Val Val Gly

210 215 220

Ala Ala Ala Ile Arg Ser Gly Ala Val Pro Ala Ile Arg Ala Leu Ala

225 230 235 240

Glu Arg Leu Asn Ile Pro Val Ile Thr Thr Tyr Ile Ala Lys Gly Val

245 250 255

Leu Pro Val Gly His Glu Leu Asn Tyr Gly Ala Val Thr Gly Tyr Met

260 265 270

Asp Gly Ile Leu Asn Phe Pro Ala Leu Gln Thr Met Phe Ala Pro Val

275 280 285

Asp Leu Val Leu Thr Val Gly Tyr Asp Tyr Ala Glu Asp Leu Arg Pro

290 295 300

Ser Met Trp Gln Lys Gly Ile Glu Lys Lys Thr Val Arg Ile Ser Pro

305 310 315 320

Thr Val Asn Pro Ile Pro Arg Val Tyr Arg Pro Asp Val Asp Val Val

325 330 335

Thr Asp Val Leu Ala Phe Val Glu His Phe Glu Thr Ala Thr Ala Ser

340 345 350

Phe Gly Ala Lys Gln Arg His Asp Ile Glu Pro Leu Arg Ala Arg Ile

355 360 365

Ala Glu Phe Leu Ala Asp Pro Glu Thr Tyr Glu Asp Gly Met Arg Val

370 375 380

His Gln Val Ile Asp Ser Met Asn Thr Val Met Glu Glu Ala Ala Glu

385 390 395 400

Pro Gly Glu Gly Thr Ile Val Ser Asp Gly Phe Phe Arg His Tyr Gly

405 410 415

Val Leu Phe Ala Arg Ala Asp Gln Pro Phe Gly Phe Leu Thr Ser Ala

420 425 430

Gly Cys Ser Ser Ala Gly Tyr Gly Ile Pro Ala Ala Ile Gly Ala Gln

435 440 445

Met Ala Arg Pro Asp Gln Pro Thr Phe Leu Ile Ala Gly Asp Gly Gly

450 455 460

Phe His Ser Asn Ser Ser Asp Leu Glu Thr Ile Ala Arg Leu Asn Leu

465 470 475 480

Pro Ile Val Thr Val Val Val Asn Asn Asp Thr Asn Gly Leu Ile Glu

485 490 495

Leu Tyr Gln Asn Ile Gly His His Arg Ser His Asp Pro Ala Val Lys

500 505 510

Phe Gly Gly Val Asp Phe Val Ala Leu Ala Glu Ala Asn Gly Val Asp

515 520 525

Ala Thr Arg Ala Thr Asn Arg Glu Glu Leu Leu Ala Ala Leu Arg Lys

530 535 540

Gly Ala Glu Leu Gly Arg Pro Phe Leu Ile Glu Val Pro Val Asn Tyr

545 550 555 560

Asp Phe Gln Pro Gly Gly Phe Gly Ala Leu Ser Ile

565 570

Claims (5)

1.一种利用蓝藻合成丙烯酸的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1)首先，基于蓝藻Syn7942的NSI基因构建整合载体NSI，再根据蓝藻Syn7942细胞密码子偏好性优化基因ceaS2的密码子，然后将此基因插入到载体NSI上，得到重组载体NSI-ceaS2；

2)基于蓝藻Syn7942在自然状态下能够吸收外源基因的特性，将重组载体NSI-ceaS2转化至蓝藻Syn7942细胞内，然后通过氯霉素固体培养基初步筛选出单克隆转基因蓝藻Syn7942；

3)将筛选出的单克隆转基因蓝藻Syn7942转接至带有氯霉素抗性的液体培养基中，待蓝藻生长出后，提取蓝藻基因组，进行目的基因的PCR验证；

4)将验证成功的单克隆转基因蓝藻Syn7942转接至液体培养基，在一定条件下培养，待蓝藻长到OD730大于或等于1时，添加IPTG诱导基因ceaS2的表达，表达的酶以蓝藻光合作用产生的三磷酸甘油醛或磷酸二羟基丙酮为底物为底物合成丙烯酸；

5)对产物丙烯酸进行分离提纯。

2.根据权利要求1所述的利用蓝藻合成丙烯酸的方法，其特征在于：所述步骤2)中氯霉素固体培养基的组成基于专用于培养蓝藻的BG11培养基，添加氯霉素和琼脂，氯霉素终浓度为25-30ug/L，琼脂终浓度为15g/L，所述BG11培养基配方为：

1)磷酸氢二钾3.17g/100ml

2)硫酸镁7.5g/100ml

3)氯化钙3.6g/100ml

4)柠檬酸0.6g/100ml

5)柠檬酸铁铵0.6g/100ml

6)EDTA·2Na·2H₂O 0.105g/100ml

7)碳酸钠2.0g/100ml

8)A5包括：

H₃BO₃ 2.8g/L

MnCl₂·4H₂O 1.81g/L

ZnSO₄·7H₂O 0.22g/L

Na₂MoO₄·2H₂O 0.39g/L

CuSO₄·5H₂O 0.08g/L

CoCl₂·6H₂O 0.01g/L；

配制BG11培养基时，取2)、3)、4)、6)、7)、A5溶液各1mL，加入1.5g NaNO₃，混匀后加蒸馏水定容至1L，然后高温灭菌，等溶液冷却后再往里加入1mL的1)和5)溶液，即完成BG11液体培养基配制。

3.根据权利要求1所述的利用蓝藻合成丙烯酸的方法，其特征在于：所述步骤3)和步骤4)中液体培养基的组成基于专用于培养蓝藻的BG11培养基，添加氯霉素，氯霉素终浓度为25-30ug/L，所述BG11培养基配方为：

1)磷酸氢二钾3.17g/100ml

2)硫酸镁7.5g/100ml

3)氯化钙3.6g/100ml

4)柠檬酸0.6g/100ml

5)柠檬酸铁铵0.6g/100ml

6)EDTA·2Na·2H₂O 0.105g/100ml

7)碳酸钠2.0g/100ml

8)A5包括：

H₃BO₃ 2.8g/L

MnCl₂·4H₂O 1.81g/L

ZnSO₄·7H₂O 0.22g/L

Na₂MoO₄·2H₂O 0.39g/L

CuSO₄·5H₂O 0.08g/L

CoCl₂·6H₂O 0.01g/L；

配制BG11培养基时，取2)、3)、4)、6)、7)、A5溶液各1mL，加入1.5g NaNO₃，混匀后加蒸馏水定容至1L，然后高温灭菌，等溶液冷却后再往里加入1mL的1)和5)溶液，即完成BG11液体培养基配制。

4.根据权利要求1所述的利用蓝藻合成丙烯酸的方法，其特征在于：所述步骤4)中，培养条件如下：100-200rpm旋转，30-35℃光照培养至OD730大于1.0时，添加IPTG至终浓度为1mM，培养24-120h。

5.根据权利要求1所述的利用蓝藻合成丙烯酸的方法，其特征在于：所述丙烯酸的分离提纯操作如下：

取IPTG诱导后培养的转基因蓝藻培养液100mL，用高压破碎仪破碎蓝藻细胞，然后10000rpm，离心10min，取上清液，用高效液相色谱仪检测丙烯酸。