JP2002508929A - リノール酸イソメラーゼ - Google Patents

リノール酸イソメラーゼ

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ディーシーブイ・インコーポレイテッド・ドゥーイング・ビジネス・アズ・バイオ−テクニカル・リソーシィズ
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Abstract

(57)【要約】 本発明は単離されたリノール酸イソメラーゼならびにその核酸およびアミノ酸配列を提供する。また、本発明は固定化細菌細胞または単離されたリノール酸イソメラーゼを用いる油からのＣＬＡの生産方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の分野】
本発明は単離されたリノール酸イソメラーゼ酵素(linoleate isomerase enzym
e)、リノール酸イソメラーゼ酵素をコードする核酸分子、リノール酸イソメラー
ゼ酵素を含有する固定化細胞、および単離されたリノール酸イソメラーゼ酵素、
核酸分子および／または固定化細胞を用いてリノール酸またはリノレン酸をＣＬ
Ａに変換する方法に関する。
【０００２】
【発明の背景】
用語「ＣＬＡ」はここでは共役リノール酸および共役リノレン酸を共に記載す
るための上位概念的用語として用いられる。該ＣＬＡ化合物（シス，トランス）
−９，１１−リノール酸および（トランス，シス）−１０，１２，リノール酸は
認識された栄養補給物であり、またマウスにおける表皮発癌および前胃新生物な
らびに発癌物質に誘導されたラット乳癌の効果的な阻害剤である。また、ＣＬＡ
はニワトリ、マウスおよびラットにおいて免疫刺激によって引き起こされた有害
効果を妨げることが示され、血管形成性の食餌を摂食させたウサギにおいて高密
度リポ蛋白質コレステロールに対する低密度リポ蛋白質コレステロールの比率を
減少させることが示された。また、ＣＬＡはマウス、ラット、ニワトリおよびブ
タモデルにおいて体脂肪を減少させる。また、ＣＬＡはダイエットに含ませた場
合に皮膚病巣を治療するのに効果的であることが示されている。
【０００３】 ＣＬＡは実質的に全ての食物において種々の量で天然に生じる。ＣＬＡの主の
天然源は反芻動物に由来する乳製品、牛肉および食物である。米国においては牛
肉、牛脂、子牛肉、羊肉（３−４ｍｇ ＣＬＡ／ｇ脂肪；８４％シス−９，トラ
ンス−１１および乳製品（３−７ｍｇ ＣＬＡ／ｇ脂肪；８０−９０％シス−９
，トランス−１１）は最高濃度のＣＬＡを有する。２−３倍高いＣＬＡ濃度はオ
ーストラリアの乳製品および牧草を与えた牛肉および羊肉で見出される非常に低
い濃度のＣＬＡ（０．１−０．９ｍｇ ＣＬＡ／ｇ脂肪；約４０％各々シス−９
、トランス−１１およびトランス−１０、シス−１２）は市販の植物油で見出さ
れる。
【０００４】 ＣＬＡはリノール酸代謝の通常の中間体である。ウシにおいて、天然細菌叢に
よって生産される更に代謝されない（シス，トランス）−９，１１−ＣＬＡは脂
質に、ついで宿主の組織および乳に取り込まれる。動物は乳、乳製品またはＣＬ
Ａ含有肉のごときダイエット源から、またはＣＬＡダイエット補給物からＣＬＡ
を摂取し、それを正常な組織および乳に取り込む。
【０００５】 ＣＬＡはリノール酸またはリノレン酸のアルカリ異性化、またはリノール酸、
リノレン酸またはその誘導体を含有する植物油のアルカリ異性化から合成により
得ることができる。アルカリ性条件下におけて約１８０℃で植物油を加熱するこ
とは、２つの反応を触媒する：（１）トリグリセリド脂質骨格からの脂肪酸エス
テル結合が加水分解され、遊離脂肪酸を生じる；および（２）２以上の適当な二
重結合を持つ非共役不飽和脂肪酸が共役される。典型的にはヒマワリ油から作成
された現時点で入手可能な市販のＣＬＡ油は、更に精製することなく販売される
。それらはＣＬＡ異性体ならびに他の飽和および不飽和脂肪酸の混合物を含有す
る。一般に、化学合成は約２０−３５％の（シス，トランス）−９，１１−ＣＬ
Ａおよび約２０−３５％の（トランス，シス）−１０，１２−ＣＬＡを生じ、残
りは種々の他の異性体である。非活性の非天然異性体が存在することにより、（
シス，トランス）−９，１１−ＣＬＡおよび／または（トランス，シス）−１０
，１２−ＣＬＡを精製し、またはこれらをヒトで使用するために、これらの有益
でない非天然異性体の安全性を立証し且つ規制認可得をる必要性が導かれる。し
かしながら、アルカリ異性化によって作成されたＣＬＡからＣＬＡの単一異性体
を単離するのは経済的には可能でない。分別結晶化手法を用い、１０，１２−Ｃ
ＬＡに対して９，１１−ＣＬＡを豊富にすることができ、逆も可能である。Lode
rs Croklaan B.V.に対するWO97/18320に記載されたもう１つのアプローチは、リ
パーゼを用いて１０，１２−ＣＬＡを選択的にエステル化し、かくして、９−１
１／ＣＬＡ画分を豊富とする。しかしながら、前記方法の何れも高純度の単一異
性体ＣＬＡの生産を可能としない。
【０００６】 化学的変換の欠点を克服する１つの方法は、リノール酸、リノレン酸またはそ
の誘導体のＣＬＡへの全細胞変換または酵素的変換である。生物学的系が、かか
る生物学的系が利用できる所望の化学化合物を生産する化学的合成の効果的な代
替法であることはよく知られている。リノール酸をＣＬＡに変換するためのリノ
ール酸イソメラーゼ酵素の存在は３０年以上に亘って知られているが、該酵素を
首尾よく単離した者は未だいない。また、それは未だ単離されていないので、リ
ノール酸イソメラーゼ酵素は配列決定されていない。
【０００７】 多くの微生物において、リノール酸イソメラーゼ酵素はリノール酸を生物水素
化工程における中間体としてのＣＬＡに変換する。KeplerおよびToveは、Butyri
vibrio fibrisolvensにおいてこの酵素を同定した。Kepler and Tove, J. Biol.
Chem., 1966, 241, 1350。しかしながら、それらは活性因子を可溶化できない 。すなわち、それらはかなり純粋な何れかの形態で酵素を単離することができな
い。Kepler and Tove, J. Biol. Chem., 1967, 242, 5686。加えて、初期の研究
は、遊離カルボシキル基およびシス−９、シス−１２二重結合部位を保有する化
合物のみがリノール酸イソメラーゼによって異性化されることを示した。Kepler
and Tove, Methods in Enzymology, 1969, 14:105-109およびKepler et al., J
. Biol. Chem., 1970, 245, 3612。
【０００８】 従って、リノール酸イソメラーゼ酵素を精製し同定し、および／または組換え
技術によってそれを生産する必要性が依然として存在している。また、異性化に
脂肪酸中の遊離カルボン酸基の存在を必要としないリノール酸イソメラーゼ酵素
を見出して同定する必要性も依然として存在している。加えて、全細胞または単
離されたリノール酸イソメラーゼ酵素を利用するＣＬＡの生産方法に対する必要
性が依然として存在してる。
【０００９】
【発明の概要】 本発明は、一般に、単離されたリノール酸イソメラーゼ核酸分子、単離された
リノール酸イソメラーゼ蛋白質、リノール酸イソメラーゼの作用を増加させる遺
伝的修飾を有する固定化細菌細胞、およびかかる核酸分子、蛋白質および細胞を
用いてＣＬＡを生産する方法に関する。
【００１０】 本発明の１つの実施形態は単離されたリノール酸イソメラーゼに関する。本発
明に含まれるのは、Lactobacillus、Clostridium、Propionibacterium、Butyriv
ibrioおよびEubacterium、特に、Lactobacillus reuteri、Clostridium sporoge
nes、Propionibacterim acnes、Butyrivibrio fibrisoves、Propionibacterium
acidipropionici、Propionibacterium freudenreichiiおよびEubacterium lentu
mからのリノール酸イソメラーゼである。特に好ましいリノール酸イソメラーゼ には、Lactobacillus reuteri、Clostridium sporogenesおよびPropionibacteri
m acnesからのリノール酸イソメラーゼが含まれる。
【００１１】 １つの実施形態において、本発明の単離されたリノール酸イソメラーゼはリノ
ール酸およびリノレン酸を、（シス，トランス）−９，１１−リノール酸および
／または（トランス，シス）−１０，１２−リノール酸を含めたＣＬＡに変換す
る。本発明のリノール酸イソメラーゼは１以上の以下の生化学的特徴のうち１以
上を有するリノール酸イソメラーゼを含む：約５０ｋＤａまたは約６７ｋＤａの
サイズ；約６．８または約７．５の最適ｐＨ；少なくとも約１０００ナノモルｍ
ｇ−１分−１の特異的リノール酸異性化活性；リノール酸については約８．１μ
ＭのＫｍ、約７．５のｐＨ最適値、オレイン酸についての約８０μＭのＫｉ；お
よび／または約６０μＭリノール酸において減少する初期速度。本発明のリノー
ル酸イソメラーゼは膜結合もしくは可溶性酵素何れかであり得る。本発明のリノ
ール酸イソメラーゼは脂質物質を含むことができる。
【００１２】 もう１つの実施形態において、本発明の単離されたリノール酸イソメラーゼは
、ストリンジェント条件下で、配列番号：４、配列番号：８、配列番号：１０、
配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列
番号：２６よりなる群から選択される配列の相補体を含む核酸分子にハイブリダ
イズする核酸分子によってコードされたアミノ酸配列を含む。もう１つの実施形
態において、単離されたリノール酸イソメラーゼは、核酸配列配列番号：１７と
の１００％同一性を有する少なくとも２４個の隣接ヌクレオチドを有する核酸配
列を含む核酸分子によってコードされる。更にもう１つの実施形態において、本
発明の単離されたリノール酸イソメラーゼは配列番号：１、配列番号：５、配列
番号：９、配列番号：１１および配列番号：１８よりなる群から選択されるアミ
ノ酸配列との少なくとも約７０％同一性を持つアミノ酸配列を含む。
【００１３】 好ましくは、単離されたリノール酸イソメラーゼは配列番号：４、配列番号：
８、配列番号：１０、配列番号：１４、配列番号１５、配列番号：１６、配列番
号：１７および配列番号：２６よりなる群から選択される核酸配列を含む核酸分
子によってコードされ、配列番号：１７が最も好ましい。本発明の単離されたリ
ノール酸イソメラーゼは配列番号：１、配列番号：５、配列番号：９、配列番号
：１１、配列番号：１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する蛋白質
を含み、配列番号：１８が最も好ましい。また、本発明に含まれるのは、配列番
号：１８との１００％同一性を持つ少なくとも８個の隣接アミノ酸を有するアミ
ノ酸配列を有する蛋白質を含めたリノール酸イソメラーゼ蛋白質の相同体、およ
びリノール酸イソメラーゼ核酸分子の天然に生じる対立遺伝子変異体によってコ
ードされる蛋白質である。
【００１４】 １つの実施形態において、リノール酸イソメラーゼは、限定されるものではな
いが有機支持体、生体ポリマー支持体および無機支持体を含む。
【００１５】 本発明のもう１つの実施形態は、本発明の単離されたリノール酸イソメラーゼ
に選択的に結合する単離された抗体に関する。
【００１６】 本発明の更にもう１つの実施形態は、リノール酸およびリノレン酸よりなる群
より選択される化合物を含む油を、本発明の単離されたリノール酸イソメラーゼ
酵素と接触させ、該化合物の少なくとも一部をＣＬＡに変換することを含むＣＬ
Ａの生産方法に関する。１つの実施形態において、当該化合物はトリグリセリド
の形態であり、該方法は更に該油を加水分解酵素と接触させてトリグリセリドの
少なくとも１部を遊離脂肪酸に変換することを含む。かかる加水分解酵素はリパ
ーゼ、ホスホリパーゼおよびエステラーゼを含むことができる。また、本発明の
方法はＣＬＡを回収する工程を含むことができる。該ＣＬＡは（シス，トランス
）−９，１１−リノール酸および／または（トランス，シス）−１０，１２−リ
ノール酸を含むことができる。該油は限定されるものではないがヒマワリ油ヒマ
ワリ油、サフラワー油、トウモロコシ油、亜麻仁油、菜種油、イワシ油、ニシン
油、カワシ油、落花生油、ゴマ油、シソ油、綿実油、大豆油、脱水ヒマシ油およ
びクルミ油を含むことができる。本発明の１つの実施形態において、リノール酸
イソメラーゼ酵素は、有機支持体、生体ポリマー支持体および無機支持体を含む
ことができる固体支持体に結合されている。
【００１７】 本発明のもう１つの態様は、（ａ）配列番号：１、配列番号：５、配列番号：
９、配列番号：１１および配列番号：１８よりなる群から選択されるアミノ酸配
列を有する蛋白質をコードする核酸配列を含む核酸分子；（ｂ）（ａ）の該アミ
ノ酸配列の何れかの相同体をコードする核酸分子、ここに、該相同体はそのよう
なアミノ酸配列におけるアミノ酸と１００％同一性を有する少なくとも８個の隣
接アミノ酸を含み；（ｃ）（ａ）の該アミノ酸配列の何れかをコードする核酸分
子の天然に生じる対立遺伝子変異体を含む核酸分子；および（ｄ）（ａ）、（ｂ
）または（ｃ）の該核酸分子の何れかに対して相補的である核酸分子よりなる群
から選択される単離された核酸分子に関する。好ましくは、本発明の単離された
核酸分子はリノール酸イソメラーゼ相同体を含めたリノール酸イソメラーゼをコ
ードする。１つの実施形態において、かかる単離された核酸分子は、ストリンジ
ェント条件下で、配列番号：４、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１
４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：２６よりな
る群から選択される核酸配列を有する核酸分子、および／またはかかる核酸配列
の何れかの相補体にハイブリダイズする。もう１つの実施形態において、本発明
の単離された核酸分子は、配列番号：４、配列番号：８、配列番号：１０、配列
番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号
：２６よりなる群から選択される核酸配列との少なくとも約７０％同一性を有す
る核酸配列を含む。更にもう１つの実施形態において、本発明の単離された核酸
分子は核酸配列配列番号：１７との１００％同一性を有する少なくとも２４個の
隣接ヌクレオチドを有する核酸配列を含む。本発明の好ましい核酸分子は、スト
リンジェントハイブリダイゼーション条件下で、ｎＣＬＡ８７、ｎＣＬＡ５９６ 、ｎＣＬＡ１７０９、ｎＣＬＡ３５５６、ｎＣＬＡ１７７６およびｎＣＬＡ７１ １３ よりなる群から選択される核酸分子にハイブリダイズする分子を含む。より
好ましくは、本発明の単離された核酸分子は配列番号：４、配列番号：８、配列
番号：１０、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１
７および配列番号：２６よりなる群から選択される配列を有し、配列番号：１７
がより好ましい。本発明の単離された核酸分子は、好ましくは、前記したごとく
本発明のリノール酸イソメラーゼ蛋白質をコードする。
【００１８】 本発明の単離された核酸分子は、限定されるものではないが、Lactobacillus 、Clostridium、Propionibacterium、ButyrivibrioおよびEubacteriumを含めた 微生物からのリノール酸イソメラーゼ核酸分子を含み、Lactobacillus reuteri 、Clostridium sporogenes、Propionibacterim acnes、Butyrivibrio fibrisove
s、Propionibacterium acidipropionici、Propionibacterium freudenreichiiお
よびEubacterium lentumが特に好ましい。最も好ましいリノール酸イソメラーゼ
核酸分子はLactobacillus reuteri、Clostridium sporogenesまたはPropionibac
terim acnesからのものである。
【００１９】 また本発明に含まれるものは本発明の単離された核酸分子を含む組換え分子、
組換えウイルスおよび組換え細胞である。１つの実施形態において、本発明の組
換え細胞は、限定されるものではないが、Lactobacillus reuteri、Clostridium
sporogenes、Propionibacterim acnes、Propionibacterium freudenreichii、P
ropionibacterium acidipropionici、Escherichia coli、Bacillus subtilis、B
acillus licheniformis、Butyrivibrio fibrisolvens、またはEubacterium lentu
mを含む微生物からのものであり、Escherichia coli、Bacillus subtilisおよび
Bacillus licheniformisが好ましい。
【００２０】 本発明の更にもう１つの実施形態はリノール酸イソメラーゼをコードする単離
された核酸分子で形質転換した組換え細胞を培養することを含む、リノール酸イ
ソメラーゼを生産する方法に関する。
【００２１】 本発明のもう１つの実施形態は、リノール酸およびリノレン酸よりなる群から
選択される化合物を含む油を、本発明の単離された核酸によってコードされる単
離されたリノール酸イソメラーゼ酵素と接触させて、化合物の少なくとも一部を
ＣＬＡに変換することを含むＣＬＡの生産方法に関する。
【００２２】 本発明の更なる実施形態は、リノール酸イソメラーゼの作用を増加させる遺伝
的修飾を有する固定化細菌細胞に関する。該細胞は限定されるものではないが、
Lactobacillus、Clostridium、Propionibacterium、Butyrivibrio、Escherichia
、BacillusおよびEubacterium細胞を含む微生物であり得る。１つの実施形態に おいて、遺伝的修飾の結果、細菌細胞によってリノール酸イソメラーゼが過剰生
産される。遺伝的修飾の結果、リノール酸イソメラーゼの少なくとも１つのアミ
ノ酸の欠失、挿入、逆位、置換および誘導体化よりなる群から選択される少なく
とも１つのアミノ酸修飾がもたらされ、かかる修飾の結果、増大したリノール酸
イソメラーゼ作用、減少した基質阻害および／または減少した産物阻害を生じる
。もう１つの実施形態において、遺伝的修飾は本発明のリノール酸イソメラーゼ
をコードする組換え核酸分子での細胞の形質転換を含み、ここに、組換え核酸分
子は転写制御配列に作動可能に連結している。組換え核酸分子は、リノール酸イ
ソメラーゼの相同体をコードする核酸配列を含めた前記単離された核酸分子の何
れかを含むことができる。１つの実施形態において、かかる相同体はアミノ酸配
列配列番号：１８に対して１００％相同性を持つ少なくとも８個の隣接アミノ酸
を有するアミノ酸配列を有する。
【００２３】 １つの実施形態において、組換え核酸分子は細菌細胞のゲノムに組み込まれる
。もう１つの実施形態において、リノール酸イソメラーゼをコードする組換え核
酸分子はリノール酸イソメラーゼの作用を増加させる遺伝的修飾を含み、もう１
つの実施形態において、遺伝的修飾はリノール酸イソメラーゼの基質および／ま
たは産物阻害を減少させる。
【００２４】 もう１つの実施形態において、本発明の固定化細菌細胞は溶解される。細胞は
、グルタルアルデヒド（これに制限されない）を含む二官能性または多官能価架
橋剤で架橋することによって、固定化されうる。
【００２５】 本発明の更にもう１つの実施形態はリノール酸およびリノレン酸よりなる群か
ら選択される化合物を含む油を、リノール酸イソメラーゼを有する固定化細菌細
胞と接触させて化合物の少なくとも一部をＣＬＡに変換するＣＬＡの生産方法に
関する。細菌細胞はLactobacillus、Clostridium、Propionibacterium、Butyriv
ibrio、Escherichia、BacillusおよびEubacterium細胞、好ましくは、Lactobaci
llus reuteri、Clostridium sporogenes、Propionibacterim acnes、Propioniba
cterium freudenreichii、Propionibacterium acidipropionici、Escherichia c
oli、Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis、Butyrivibrio fibrisoves、
およびEubacterium lentum、最も好ましくは、Escherichia coli、Bacillus sub
tilisまたはBacillus licheniformisを含む微生物からのものであり得る。該細 胞はリノール酸イソメラーゼを有する天然に生じる細菌細胞、または前記した遺
伝的に修飾された微生物であり得る。好ましくは、遺伝的に修飾された微生物は
増大したリノール酸イソメラーゼ作用を有する。該化合物は、トリグリセリドの
少なくとも一部が遊離脂肪酸に変換されるようにトリグリセリドの形態の化合物
を含むことができる。該方法の他の特徴はＣＬＡを生産するための該方法である
。
【００２６】
【発明の詳細な記述】 本発明の１つの実施形態は単離されたリノール酸イソメラーゼ酵素である。単
離されたリノール酸イソメラーゼを用いてリノール酸、リノレン酸またはその誘
導体からＣＬＡを生成させることができる。より具体的には、単離されたリノー
ル酸イソメラーゼはリノール酸を共役リノール酸に変換できおよび／またはリノ
レン酸を共役リノレン酸に変換することができる。用語「共役」とは、不飽和化
合物において単結合と交互に２以上の二重結合を有する分子を言う。リノール酸
イソメラーゼは、リノール酸および９，１２−ジエン部位を含有する他の不飽和
脂肪酸を、次いで更に代謝されて９−１１モノエン部位を含有する他の脂肪酸に
代謝される９，１１−共役ジエン部位に変換する微生物における生分解経路の一
部である。例えば、ほとんどのリノール酸イソメラーゼは（シス，シス）−９，
１２−リノール酸を生物水素化経路における中間体としての（シス，トランス）
−９，１１−リノール酸に変換する。多くの場合、ＣＬＡの形成に続いて、他の
ＣＬＡ異性体に代謝され、ならびにモノエン脂肪酸のごとき非−ＣＬＡ化合物に
代謝される。しかしながら、Lactobacillus reuteriは最終生成物としてのＣＬ Ａを生産し蓄積する。Propionibacteriun acnesのごとき他の微生物は（シス， シス）９−１２−リノール酸を（トランス，シス）−１０，１２−リノール酸に
変換する。
【００２７】 用語「単離されたリノール酸イソメラーゼ」とは、リノール酸イソメラーゼ活
性を有する粗抽出物よりも活性の有意な増加を達成するための十分に純粋な形態
のその天然環境外のリノール酸イソメラーゼを言う。かかるリノール酸イソメラ
ーゼは限定されるものではないが精製されたリノール酸イソメラーゼ、組換えに
より生産されたリノール酸イソメラーゼ、膜結合リノール酸イソメラーゼ、脂質
と複合体化されたリノール酸イソメラーゼ、人工膜を有するリノール酸イソメラ
ーゼ、可溶性リノール酸イソメラーゼおよび他の蛋白質を含有する単離されたリ
ノール酸イソメラーゼを含むことができる。「人工膜」とは、リノール酸イソメ
ラーゼを含有する天然膜の一部ではない何れかの膜様構造を言う。
【００２８】 本発明の単離されたリノール酸イソメラーゼはその特異的活性によって特徴づ
けることができる。「特異的活性」とは、リノール酸の酵素によるＣＬＡへの変
換速度を言う。より具体的には、それは単位時間当たりの酵素の１ｍｇについて
のＣＬＡに変換されたリノール酸の分子数を言う。好ましくは、本発明の単離さ
れたリノール酸イソメラーゼは少なくとも約１０００ナノモルｍｇ−１分−１、
より好ましくは少なくとも約１０，０００ナノモルｍｇ−１分−１、より好まし
くは少なくとも約１００，０００ナノモルｍｇ−１分−１の特異的活性を有する
。
【００２９】 単離されたリノール酸イソメラーゼを特徴づけるもう１つの方法はそのミカエ
リス−メンテン定数（Ｋｍ）によるものである。Ｋｍは定常状態の条件下での酵
素−リノール酸複合体の動的（すなわち、速度）定数である。好ましくは、本発
明の単離されたリノール酸イソメラーゼは約７．５のｐＨおよび約２０℃の温度
において少なくとも約８．１μＭのＫｍを有する。
【００３０】 リノール酸イソメラーゼを特徴付けるもう１つの方法はオレイン酸阻害速度定
数（Ｋｉ）によるものである。具体的には、Ｋｉはオレイン酸−酵素複合体の解
離速度である。好ましくは、本発明の単離されたリノール酸イソメラーゼは約７
．５のｐＨおよび約２０℃の温度において約５０μＭないし約１００μＭのＫｉ 、より好ましくは１００μＭより大のＫｉを有し、阻害がないのが最も好ましい
。
【００３１】 単離されたリノール酸イソメラーゼを特徴付ける更にもう１つの方法はその初
期速度（ｖ０）、すなわち、生成物形成の初期速度によるものである。初期速度
ｖ０とは酵素によるリノール酸のＣＬＡへの初期変換速度を言う。具体的には、
それは単位時間についての酵素１ｍｇ当たりのＣＬＡに変換されたリノール酸の
分子の数を言う。好ましくは、約７．５のｐＨにおける単離されたリノール酸イ
ソメラーゼの最大初期速度定数は少なくとも約１００ナノモル／（蛋白質の秒−
ｍｇ）、より好ましくは少なくとも約１，０００ナノモル／（蛋白質の秒−ｍｇ
）、最も好ましくは少なくとも約１０，０００ナノモル／（蛋白質の秒−ｍｇ）
。
【００３２】 単離されたリノール酸イソメラーゼは更にその最適ｐＨによって特徴付けるこ
とができる。最適ｐＨとは、リノール酸イソメラーゼが最大初期速度を有するｐ
Ｈを言う。好ましくは、最適ｐＨは約５および約１０の間、より好ましくは約６
および約８の間、最も好ましくは約６．８ないし約７．５である。
【００３３】 本発明の単離されたリノール酸イソメラーゼの更なる実施形態は、後記する核
酸分子の何れかによってコードされる蛋白質を含む。
【００３４】 本発明の更なる実施形態はリノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子を含
む。１つの実施形態において、かかる核酸分子は、ストリンジェントハイブリダ
イゼーション条件下で、天然に生じるリノール酸イソメラーゼをコードする遺伝
子の相補体、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：９、配列番号：１１およ
び／または、配列番号：１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードす
る核酸分子の相補体を含む核酸分子、または配列番号：４、配列番号：８、配列
番号：１０、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１
７または配列番号：２６を有する核酸分子の相補体を含む核酸分子にハイブリダ
イズする単離された核酸分子を含む。他の実施形態において、本発明は、配列番
号：１、配列番号：５、配列番号：９、配列番号：１１および／または配列番号
：１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含む蛋白質をコードする単離さ
れた核酸分子および配列番号：４、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：
１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７または配列番号：２６
の核酸配列を有する単離された核酸分子を含む。
【００３５】 本明細書中で用いるごとく、本発明のリノール酸イソメラーゼ遺伝子（すなわ
ち、リノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子）は単離された天然リノール
酸イソメラーゼ遺伝子およびその相同体を含むことができ、その後者は後記にて
詳細に記載する。本発明の核酸分子は、（限定されるものではないが、転写、翻
訳または翻訳後制御領域のごとき）その遺伝子によってコードされるリノール酸
イソメラーゼ蛋白質の生産を制御する１以上の調節領域ならびにその全長または
部分コーディング領域を含むことができる。本発明の単離されたリノール酸イソ
メラーゼ核酸分子はリノール酸イソメラーゼ活性を有する蛋白質を必ずしもコー
ドしないことに注意すべきである。リノール酸イソメラーゼ核酸分子は、例えば
、切形、突然変異または不活性蛋白質をコードすることができる。かかる遺伝子
およびかかる遺伝子によってコードされた蛋白質は診断アッセイにおいて、例え
ば、後記実施例に記載するごとく抗体生産のごとき他の目的で有用である。
【００３６】 本明細書で用いるごとく、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、
核酸分子を用いて同様の核酸分子を同定する標準的なハイブリダイゼーション条
件を言う。かかる標準的な条件は例えばSambrook et al., Molecular Cloning:A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press, 1989に開示されている 。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲、はここに出典明示してその全部を本明細書の一部
とみなす（特にページ９．３１−９．６２参照）。加えて、適当なハイブリダイ
ゼーションを計算する式および種々の程度のヌクレオチドのミスマッチを許すハ
イブリダイゼーションを達成するための洗浄条件は、例えば、Meinkoth et al.,
1984, Anal. Biochm. 138, 267-284に開示されている；Meinkothら、前掲、は出
典明示してその全部を本明細書の一部とみなす。
【００３７】 更に詳しくは、本明細書中で言及するストリンジェントハイブリダイゼーショ
ンおよび洗浄条件は、ハイブリダイゼーション反応においてプローブするのに使
用される核酸分子と少なくとも約７０％、より特別には少なくとも約７５％、最
も特別には少なくとも約８０％核酸配列同一性を有する核酸分子の単離を可能と
する条件を言う。かかる条件は、ＤＮＡ：ＲＮＡまたはＤＮＡ：ＤＮＡハイブリ
ッドが形成されるか否かに応じて変化するであろう。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッ
ドについての計算された融解温度はＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドについてのもの
よりも１０℃低い。特別の実施形態において、ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリッドにつ
いてのストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、約２０℃および約３５
℃の間、より好ましくは約２８℃および約４０℃の間、より好ましくは約３５℃
および約４５℃の間の温度の６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ＋）のイオン強度にお
けるハイブリダイゼーションを含む。特別の実施形態において、ＤＮＡ：ＲＮＡ
ハイブリッドについてのストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、約３
０℃および約４５℃の間、より好ましくは約３８℃および約５０℃の間、より好
ましくは約４５℃および約５５℃の間の温度の６×ＳＳＣ（０．９Ｍ Ｎａ＋）
のイオン強度におけるハイブリダイゼーションを含む。これらの値は約１００ヌ
クレオチドよりも大きい分子、０％ホルアミドおよび約４０％のＧ＋Ｃ含有量に
ついての融解温度の計算に基づく。あるいは、ＴｍはＳａｍｂｒｏｏｋら、前掲
、ページ９．３１ないし９．６２に記載されているごとく経験的に計算すること
ができる。
【００３８】 本発明の好ましいリノール酸イソメラーゼ核酸分子は、配列番号：４、配列番
号：８、配列番号：１０、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、
配列番号：１７および／または配列番号：２６より選択される核酸配列と少なく
とも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも
約９０％同一性を有する核酸配列を含む核酸分子を含む。また、本発明の好まし
いリノール酸イソメラーゼ核酸分子は配列番号：４、配列番号：８、配列番号：
１０、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７およ
び／または配列番号：２６から選択される核酸配列を含む核酸分子を含む。また
、本発明の好ましいリノール酸イソメラーゼ核酸分子はｎＣＬＡ８７、ｎＣＬＡ ５９６ 、ｎＣＬＡ１７０９、ｎＣＬＡ１．１、ｎＣＬＡ２．３、ｎＣＬＡ３５５ １ 、ｎＣＬＡ１７７６および／またはｎＣＬＡ７１１３から選択される核酸分子
を含む核酸分子を含む。本明細書で用いるごとく、パーセント（％）同一性とは
、表１で確認される欠陥パラメーターでのＢＬＡＳＴ相同性サーチを言う。
【００３９】 表 １ ＢＬＡＳＴサーチパラメータ ＜ヒストグラム＞ 各サーチについてのスコアのヒストグラムを表示する；欠陥はイエスである（
ＢＬＡＳＴマニュアル中のパラメータＨ参照）。 ＜記載＞ 報告された配列をマッチングさせる短い記載の数を特定された数に制限する；
欠陥限界は１００記載である（マニュアルページ中のパラメータＶ参照）。また
、ＥＸＰＥＣＴおよびＣＵＴＯＦＦ参照。 ＜整列＞ 高いスコアのセグメント対（ＨＳＰ）が報告されている特定された数にデータ
ーベース配列を制限する；欠陥限界は５０である。これよりも多いデーターベー
ス配列が偶然にも報告されている統計学的に閾値を満足するならば（後記ＥＸＰ
ＥＣＴおよびＣＵＴＯＦＦ参照）、最大の統計学的有意性を規定するマッチング
のみが報告される（ＢＬＡＳＴマニュアル中のパラメータＢ参照）。 ＜ＥＸＰＥＣＴ＞ データーベース配列に対するマッチングを報告するための統計学的有意性閾値
；KarlinおよびAltschul (1990)の推計学モデルに従って、１０のマッチングが 単に偶然により見出されることが予測されるように、欠陥値は１０である。マッ
チングに帰せられる統計学的有意性はＥＸＰＥＣＴ閾値よりも大きいならば、該
マッチングは報告されないであろう。より低いＥＸＰＥＣＴ閾値はより厳格であ
り、報告されるより少ない偶然のマッチングに導く。分率値は許容される（ＢＬ
ＡＳＴマニュアルにおけるパラメーターＥ参照）。 ＜ＣＵＴＯＦＦ＞ 高スコアリングセグメント対を報告するためのカットオフスコア。欠陥。欠陥
値はＥＸＰＥＣＴ値（前記参照）から計算される。ＨＳＰは、それらに帰せられ
る統計学的有意性がカットオフ値と同等なスコアを有する孤立ＨＳＰに帰せられ
るのと少なくとも同定度高い場合のみＨＳＰはデータベース配列で報告される。
より高いカットオフ値はより厳格で、報告されるべきより少ない偶然のマッチン
グに導く（ＢＬＡＳＴマニュアル中のパラメーターＳ参照）。典型的には、有意
性閾値はＥＸＰＥＣＴを用いてより直感的に管理することができる。 ＜マトリックス＞ ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＸ、ＴＢＬＡＳＴＮおよびＴＢＬＡＳＴＸのための
別のスコアリングマトリックスを特定する。欠陥マトリックスはＢＬＯＳＵＭ６
２である（HenikoffおよびHenikoff, 1992）。有効な別の選択はＰＡＮ４０、Ｐ
ＡＭ１２０、ＰＡＭ２５０およびＩＤＥＮＴＩＴＹを含むＢＬＡＳＴＮで別のス
コアリングマトリックスは利用できない；ＢＬＡＳＴＮ要求におけるＭＡＴＲＩ
Ｘ指令を特定することは、エラー応答に戻る。 ＜ストランド＞ ＴＢＬＡＳＴＮサーチをデータベース配列の丁度頂部または底部ストランドに
制限する；またはＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸまたはＴＢＬＡＳＴＸサーチをク
エリー配列の頂部または底部ストランド上の丁度リーディングフレームに制限す
る。 ＜フィルター＞ WoottonおよびFederhenのＳＥＧプログラムによって測定されるごとき（Compu
ters and Chemistry、1993）、低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメン ト、またはClaverieおよびStatesのＳＮＵプログラム（Computers and Chemistr
y, 1993）、または、ＢＬＡＳＴＮについて、TatusovおよびLipnanのＤＵＳＴプ
ログラム（調製中）によって決定されたごとき短い周期性内部反復よりなるセグ
メントをマスクする。フィルターリングは、ｂｌａｓｔ出力（例えば、共通の酸
性−、塩基性−またはプロリンリッチ領域に対してのヒット）からの統計学的に
有意であるが生物学的に興味のない報告を排除することができ、データベース配
列に対する具体的マッチングで利用できるクエリー配列のより生物学的に興味が
ある領域が残る。
【００４０】 フィルタープログラムによって見出された低複雑性配列は、ヌクレオチド配列
（例えば、「ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮ」）中の文字「Ｎ」および蛋白質配列
（例えば、「ＸＸＸＸＸＸＸＸＸ」）を用いて置換される。使用者は、「Advanc
ed options for the BLAST server」ページ上の「Filter」オプションを用いる ことによってフィルターリングを切ることができる。
【００４１】 フィルターリングはクエリー配列（またはその翻訳産物）のみに適用され、デ
ータベース配列には適用されない。欠陥フィルターリングはＢＬＡＳＴＮについ
てはＤＵＳＴであり、他のプログラムについてはＳＴＧである。
【００４２】 ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴＥ中の配列に適用する場合、何も全くＳＥＧ、ＳＭＵま
たは双方によってマスクされないのは異常と言うのではなく、従って、フィルタ
ーリングは常には効果を生じることは予測されない。更に、ある場合には、配列
はその全部がマスクされ、それは未フィルタークエリー配列に対して報告されて
いる何れかのマッチングの統計学的有意性が疑われるべきことを示す。
【００４３】 ＮＣＢｌ−ｇｉ 受託および／または遺伝子座名称に加えてNCBl gi 識別子が出力中で示される
ようにする。
【００４４】 本発明によると、単離された核酸はその天然培地から取り出された（すなわち
ヒトの操作に付された）核酸分子であり、ＤＮＡ、ＲＮＡあるいはＤＮＡまたは
ＲＮＡの誘導体を含むことができる。それ自体、（「単離された」は核酸分子が
精製された程度を反映しない。本発明の単離されたリノール酸イソメラーゼ核酸
分子はその天然源から単離することができるか、あるいは組換えＤＮＡ技術（例
えば、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学構成を用
いて生産することができる。単離されたリノール酸イソメラーゼ核酸分子は、例
えば、天然対立遺伝子変異体および、本発明のリノール酸イソメラーゼをコード
する、または天然遺伝子単離体とストリンジェント条件下で安定なハイブリッド
を形成する（すなわち、リノール酸イソメラーゼ核酸相同体）を形成する核酸分
子の能力に修飾が実質的に干渉しないようにヌクレオチド挿入、欠失、置換およ
び／または逆位によって修飾された核酸分子を含むことができる。単離されたリ
ノール酸イソメラーゼ核酸分子は縮重を含むことができる。本明細書中で用いる
ごとく、ヌクレオチド縮重とは異なるヌクレオチドコドンによって１つのアミノ
酸がコードされ得る現象を言う。かくして、本発明のリノール酸イソメラーゼを
コードする核酸分子の核酸配列は縮重により変化することができる。
【００４５】 リノール酸イソメラーゼ核酸分子相同体は当業者に知られた多数の方法を用い
て生産することができる（例えば、Sambrookら参照）。例えば、核酸分子は、限
定されるものではないが、古典的な突然変異誘発および組換えＤＮＡ技術（例え
ば、核酸断片の部位特異的突然変異誘発、化学処理、制限酵素切断、連結および
／またはＰＣＲ増幅）、またはオリゴヌクレオチド混合物の合成および核酸分子
の混合物およびその組合せを「形成する」混合物グループの連結を含めた種々の
技術を用いて修飾することができる。核酸分子相同体はリノール酸イソメラーゼ
遺伝子とのハイブリダイゼーションによって、または核酸分子によってコードさ
れる蛋白質の機能（例えば、リノール酸をＣＬＡに変換する能力）をスクリーニ
ングすることによって選択することができる。加えて、本発明の核酸分子相同体
は核酸配列配列番号：１７と１００％同一性を有する少なくとも２４個の隣接ヌ
クレオチドを含む核酸分子、より好ましくは、核酸配列配列番号：１７と１００
％同一性を有する少なくとも約３０個、より好ましくは少なくとも約４２個の隣
接ヌクレオチドを含むことができる。同様に、核酸分子相同体は、アミノ酸配列
配列番号：１８と１００％同一性を有する少なくとも８個、好ましくは１０個、
より好ましくは１４個の隣接アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する蛋白質を
コードする。本発明によると、用語「隣接ヌクレオチド」は中断しない配列で結
合されていることを意味する。第２の配列と「１００％同一性」を有する第１の
配列は、第１の配列が第２の配列に正確にマッチし、ヌクレオチドまたはアミノ
酸の間にギャップはないことを意味する。
【００４６】 本発明の１つの実施形態は、核酸分子を宿主細胞に導入して組換え細胞を形成
することができる何れかのベクターに挿入された本発明の少なくとも１つの単離
された核酸分子を含む組換えベクターを含む。かかるベクターは、本発明の核酸
分子に天然では隣接していないことが見出されている核酸配列である異種核酸配
列を含有する。ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡ何れか、原核生物または真核生物
何れかであり得るが、典型的にはウイルスまたはプラスミドである。本発明のリ
ノール酸イソメラーゼ核酸分子のクローニング、配列決定および／または操作で
組換えベクターを用いることができる。ベクターは染色体外エレメント（例えば
、プラスミド）として発現させることができるか、あるいはそれを染色体に組込
むことができる。全ベクターを所定の位置に留めることができるか、あるいはあ
る条件下では、プラスミドＤＮＡを欠失し、本発明の核酸分子の後ろに残すこと
ができる。組込まれた核酸分子は、染色体プロモーター制御した、天然もしくは
プラスミドプロモーター制御下、または幾つかのプロモーター制御の組合せ下と
することができる。核酸分子の単一または複数コピーを染色体に組み込むことが
できる。
【００４７】 ここでは組換え分子として言及される１つのタイプの組換えベクターは、組換
え分子を形成させるための１以上の転写制御配列に作動可能に連結した本発明の
核酸分子を含む。本明細書で用いる「組換え分子」の語句は、一義的には、転写
制御配列に作動可能に連結した核酸分子または核酸配列を言うが、「核酸分子」
の語句と互換的に用いることができる。本発明によると、「作動可能に連結した
」の語句は、当該分子が宿主細胞にトランスフェクトされた（すなわち、形質転
換された、形質導入された、トランスフェクトされた、コンジュゲートされたま
たは導かれた）場合に発現することができるように、核酸分子を転写制御配列に
連結させることを言う。転写制御配列は開始、伸長および転写の停止を制御する
配列である。特に重要な転写制御配列はプロモーター、エンハンサー、オペレー
ターおよびリプレッサー配列のごとき転写開始を制御するものである。適当な転
写制御配列は、本発明のリノール酸イソメラーゼを発現するのに有用な組換え細
胞の少なくとも１つで機能することができる何れかの転写制御配列を含む。種々
のかかる転写制御配列が当業者に知られている。好ましい転写制御配列は細菌、
菌類（例えば酵母）、昆虫、植物もしくは動物細菌で機能するものを含む。
【００４８】 ＤＮＡまたはＲＮＡ何れかであり得る本発明の組換え分子は、転写調節配列、
複製起点、および組換え細胞に適合する他の調節配列のごとき更なる調節配列を
含むことができる。１つの実施形態において、宿主細胞染色体に組み込まれるも
のを含めた本発明の組換え分子は、発現されたリノール酸イソメラーゼが蛋白質
を生産する細胞から分泌されるのを可能とするための分泌シグナル（すなわち、
シグナルセグメント核酸配列）を含有する。適当なシグナルセグメントは、本発
明のリノール酸イソメラーゼと天然では会合するシグナルセグメントまたは本発
明のリノール酸イソメラーゼの分泌を指令することができる異種シグナルセグメ
ントを含む。もう１つの実施形態において、本発明の組換え分子は、発現された
リノール酸イソメラーゼが宿主細胞の膜に送達され挿入されるのを可能とするリ
ーダー配列を含む。適当なリーダー配列は本発明のリノール酸イソメラーゼと天
然では会合するリーダー配列、またはリノール酸イソメラーゼの細胞膜への送達
および挿入を指令することができる何れの異種リーダー配列も含む。
【００４９】 本発明の１以上の組換え分子を用いて本発明のコードされた産物（すなわち、
リノール酸イソメラーゼ蛋白質）を生産することができる。１つの実施形態にお
いて、コードされた産物は、蛋白質を生産するのに効果的な条件下で本明細書に
記載した核酸分子を発現させることによって生産される。コードされた蛋白質を
生産するための好ましい方法は、宿主細胞を１以上の組換え分子でトランスフェ
クトして組換え細胞を形成させることによる。トランスフェクトするための適当
な宿主細胞はトランスフェクトできる何れかの細菌、菌類（例えば酵母）、昆虫
、植物または動物細胞を含む。宿主細胞は非トランスフェクト細胞または少なく
とも１つの核酸分子で既に形質転換された細胞であり得る。本発明で使用される
好ましい宿主細胞は、限定されるものではないが、属Lactobacillus、Clostridi
um、Propionibacterium、Butyrivibrio、Eubacterium、EscherichiaおよびBacil
lusを含めた、本発明のリノール酸イソメラーゼの発現に適した何れの微生物細 胞も含む。特に好ましい宿主細胞は、限定されるものではないが、Escherichia
coliおよびBacillus種を含めた、特に限定されるものではないがEscherichia co
li、Bacillus subtilisおよびBacillus licheniformisを含めた産業的発現宿主 として適当な細菌細胞を含む。
【００５０】 １つの実施形態において、本発明の単離されたリノール酸イソメラーゼ蛋白質
は、当該蛋白質を生成するのに効果的な条件下で蛋白質を発現する細胞を培養し
、該蛋白質を回収することによって生産する。培養に好ましい細胞は本発明の組
換え細胞である。効果的な培養条件は限定されるものではないが効果的な培地、
バイオリアクター、温度、ｐＨおよび蛋白質生産を可能とする酸素条件を含む。
効果的な培地とは、細胞を培養して本発明のリノール酸イソメラーゼ蛋白質を生
じる何れの培地をもいう。かかる培地は、典型的には、同化性炭素、窒素および
リン酸源、および適当な塩、ミネラル、金属およびビタミンのごとき他の栄養物
を有する水性培地を含む。適当な培地および培養条件の例は実施例セクションに
詳細に記載する。本発明の細胞は通常の発酵バイオリアクター、震盪フラスコ、
試験管、マイクロタイター皿およびペトリプレート中で培養することができる。
培養は組換え細胞に適した温度、ｐＨおよび酸素含有量にて行うことができる。
かかる培養条件は同業者の技量内のものである。
【００５１】 生産で用いるベクターおよび宿主系に応じて、本発明の得られた蛋白質は組換
え細胞内に留まり；発酵培地に分泌され；E. coliにおけるペリプラズム空間の ごとき２つの細胞膜の間の空間に分泌され；あるいは細胞またウイルス膜の外側
表面に保持することができる。
【００５２】 「蛋白質を回収する」というフレーズは蛋白質を含有する全発酵培地を収集す
ることをいい、分離または精製の更なる工程を伴う必要はない。本発明の蛋白質
は、限定されるものではないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交
換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動、疎水性相互作用クロマトグラフィー、
ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロ
マトグラフィー、クロマトフォーカシング示差可溶化のごとき種々の標準的蛋白
質精製技術を用いて精製することができる。本発明の蛋白質は、好ましくは、「
実質的に純粋な」形態で回収する。本明細書で用いる「実質的に純粋な」とは、
生物触媒または他の試薬としての蛋白質の効果的な使用を可能とする純度をいう
。
【００５３】 組換えウイルスとしてここにいうもう１つのタイプの組換えベクターは、ウイ
ルス外被にパッケージされ、細胞へのウイルスのデリバリー後に細胞で発現させ
ることができる組換え分子を含む。限定されるものではないが、アルファウイル
ス、バクロウイルス、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルスお
よびレトロウイルスに基づくものを含めた多数の組換えウイルス粒子を用いるこ
とができる。
【００５４】 本明細書で用いるごとく、リノール酸イソメラーゼ蛋白質に関する核酸分子の
記載（例えば、リノール酸イソメラーゼをコードする核酸分子）とは、全長リノ
ール酸イソメラーゼ蛋白質、切形リノール酸イソメラーゼ蛋白質、融合蛋白質、
またはかかる蛋白質の何れかの相同体で有り得る単離されたリノール酸イソメラ
ーゼを含む。本発明によると、リノール酸イソメラーゼ蛋白質相同体は、１個ま
たは数個に限定されず少なくとも１個または数個が欠失した（例えば、ペプチド
のごとき蛋白質の切形バージョン）、挿入された、逆にされた、置換されたおよ
び／または誘導体化された（例えば、グリコシル化、リン酸、アセチル化、ミリ
ストイル化、プレニル化、パルミチル化、アミド化および／またはグリコシルホ
スファチジルイノシトールの添加による）リノール酸イソメラーゼ蛋白質を含む
。リノール酸イソメラーゼ蛋白質相同体は、本明細書で開示されたリノール酸イ
ソメラーゼアミノ酸配列の何れか、特にアミノ酸配列配列番号：１８に対して１
００％同一性を有する少なくとも８個、好ましくは少なくとも１０個、より好ま
しくは少なくとも１４個の隣接アミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する蛋白質
を含む。同様に、リノール酸イソメラーゼ蛋白質相同体は本明細書に開示された
リノール酸イソメラーゼ核酸分子の何れか、特に配列番号：１７に対して１００
％相同性を有する少なくとも２４個、好ましくは少なくとも３０個、より好まし
くは少なくとも４２個を含む核酸配列によってコードされた蛋白質を含む。また
、リノール酸イソメラーゼ蛋白質相同体は、配列番号：１、配列番号：５、配列
番号：９、配列番号：１１および／または配列番号：１８よりなる群から選択さ
れるアミノ酸配列を有する蛋白質に対して免疫応答を誘導する少なくとも１つの
エピトークを有する蛋白質として同定することができる。幾つかの実施形態にお
いて、リノール酸イソメラーゼ蛋白質相同体は測定可能なリノール酸イソメラー
ゼ酵素活性を有する。もう１つの実施形態において、リノール酸イソメラーゼの
相同体は、相同体をコードする核酸配列が天然リノール酸イソメラーゼをコード
する核酸分子に（すなわち該分子と）（すなわち、天然リノール酸イソメラーゼ
アミノ酸配列をコードする核酸ストランドの相補体に）ストリンジェント条件下
でハイブリダイズすることができる天然リノール酸イソメラーゼアミノ酸配列と
十分に同様のアミノ酸配列を有する蛋白質である。本発明のリノール酸イソメラ
ーゼをコードする核酸配列の核酸配列相補体とは、核酸配列がリノール酸イソメ
ラーゼをコードするストランドに対して相補的である（すなわち、該ストランド
とで競合的二重ラセンを形成することができる）核酸ストランドの核酸配列をい
う。所与のアミノ酸配列をコードする二本鎖ＤＮＡは一本鎖ＤＮＡおよび該一本
鎖ＤＮＡに対する相補体である配列を有するその相補的ストランドを含むことが
認識されよう。それ自体、本発明のリノール酸イソメラーゼをコードする核酸分
子は二本鎖または一本鎖とすることができ、配列番号：１、配列番号：５、配列
番号：９、配列番号：１１および／または配列番号：１８よりなる群から選択さ
れるアミノ酸配列をコードする核酸配列と、および／または配列番号：１、配列
番号：５、配列番号：９、配列番号：１１および／または配列番号：１８よりな
る群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸の相補体とストリンジェント
ハイブリダイジェーション条件下で安定なハイブリッドを形成する核酸分子を含
む。相補的配列を推定する方法は当業者に知られている。アミノ酸配列決定およ
び核酸配列決定技術は全くエラーがないというのではないので、ここに提示する
配列はせいぜい本発明のリノール酸イソメラーゼのみかけの配列を表すことを注
意すべきである。
【００５５】 リノール酸イソメラーゼ相同体は天然対立遺伝子変異または天然突然変異の結
果で有り得る。また、本発明のリノール酸イソメラーゼ相同体は、限定されるも
のではないが、蛋白質に対する直接的修飾あるいは例えば、ランダムまたは標的
化突然変異誘発を行うための古典的または組換えＤＮＡ技術を用いる蛋白質をコ
ードする遺伝子に対する修飾を含めた当該分野で知られた技術を用いて生産する
ことができる。リノール酸イソメラーゼをコードする核酸の天然に生じる対立遺
伝子変異体は、配列番号：１、配列番号：５、配列番号：９、配列番号：１１お
よび／または配列番号：１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードす
るが、例えば突然変異または組換えによって引き起こされた天然変異のため同様
であるが同一ではない配列を有する遺伝子としてゲノム中の実質的に同一の遺伝
子座（または複数遺伝子座）で起こる遺伝子である。天然対立遺伝子変異体は、
典型的には、それらが比較されるべき遺伝子によってコードされた蛋白質のそれ
に対して同様な活性を有する蛋白質をコードする。１つのクラスの対立遺伝子変
異体は、同一蛋白質をコードすることができるが、遺伝暗号の縮重のため異なる
核酸配列を有する。また、対立遺伝子変異体は遺伝子の５’または３’非翻訳領
域に（例えば、調節制御領域に）、改変を含むことができる。対立遺伝子変異体
は当業者によく知られており所与の細菌種内で見出されると予測される。という
のはゲノムはハプロイドでありおよび／または２以上の細菌種の群内にあるから
である。
【００５６】 また、リノール酸イソメラーゼ蛋白質は、（遺伝子転写および翻訳を増強する
ためのコドン修飾を有する遺伝子のごとき）突然変異した遺伝子の、および（膜
酵素の可溶性形態を生じさせるために除去した膜結合ドメインを有する遺伝子、
または組換え宿主中に貧弱に許容される除去されたシグナル配列を有する遺伝子
のごとき）切形遺伝子の遺伝子融合（例えば、組換え酵素の可溶性活性形態を過
剰発現させるのに使用するためのもの）の発現産物を含む。本発明のリノール酸
イソメラーゼ蛋白質および蛋白質相同体はリノール酸イソメラーゼ酵素活性を有
しない蛋白質を含む。かかる蛋白質は、例えば、抗体の生産におよび診断アッセ
イに有用である。
【００５７】 全長蛋白質、切形蛋白質、融合蛋白質および相同体を含めた本発明の単離され
たリノール酸イソメラーゼは：実施例に説明したごときリノール酸および／また
はリノレン酸をＬＣＡに変換する蛋白質の能力；実施例に記載された蛋白質の生
化学特性；リノール酸イソメラーゼに対する抗体への選択的結合によって；およ
び／または実施例に開示された他のリノール酸イソメラーゼアミノ酸および核酸
配列との相同性直接的に同定することができる。
【００５８】 本発明の蛋白質および／または相同体の最小サイズは、対応する天然蛋白質を
コードする核酸分子の相補的配列とで安定なハイブリッドを形成することができ
る核酸分子によってコードされるのに十分なサイズである。それ自体、かかる蛋
白質をコードする核酸分子のサイズは核酸組成物と核酸分子および相補的配列と
の間のパーセント相同性ならびにハイブリダイゼーション条件自体（例えば、温
度、塩濃度およびホルムアミド濃度）に依存する。かかる核酸分子の最小サイズ
は、典型的には、もし核酸分子がＧＣ−リッチであれば、長さが少なくとも約１
２ないし約１５ヌクレオチドであり、もしそれがＡＴ−リッチであれば、長さが
少なくとも約１５ないし約１８塩基である。それ自体、本発明のリノール酸イソ
メラーゼをコードするのに使用される核酸分子または相同体の最小サイズは長さ
が約１２ないし約１８ヌクレオチドである。現実的制限の他に、核酸分子が遺伝
子の一部、全遺伝子、または複数遺伝子、またはその一部を含むことができる点
でかかる核酸分子の最大サイズに対して制限はない。同様に、本発明のリノール
酸イソメラーゼ蛋白質または相同体の最小サイズは長さが約４ないし約６アミノ
酸であり、好ましいサイズは、全長、多価（すなわち、その各々が機能を有する
１を超えるドメインを有する融合蛋白質）、またはかかる蛋白質の機能的部分が
望まれるものであるか否かに依存する。
【００５９】 本発明の好ましいリノール酸イソメラーゼは、配列番号：１、配列番号：５、
配列番号：９、配列番号：１１および／または配列番号：１８から選択されるア
ミノ酸配列と少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約８０％、最も好
ましくは少なくとも約９０％同一性を含む。本発明の好ましいリノール酸イソメ
ラーゼは配列番号：１、配列番号：５、配列番号：９、配列番号：１１および／
または配列番号：１８から選択されるアミノ酸配列を含む蛋白質を含む。本発明
の好ましいリノール酸イソメラーゼはＰＬＣＡ３５、ＰＣＬＡ２８、ＰＣＬＡ１ ５８ 、ＰＣＬＡ３２４および／またはＰＣＬＡ５９１から選択される蛋白質を含
む蛋白質を含む。
【００６０】 また、本発明は、１以上の融合セグメントに付着されたリノール酸イソメラー
ゼ含有ドメインを含む融合蛋白質を含む。本発明で使用される適当な融合セグメ
ントは、限定されるものではないが、蛋白質の安定性を増強し；他の酵素活性（
例えば、９，１２−ジエン脂肪酸を９，１２−脂肪酸に加水分解するリパーゼ、
ホスホリパーゼ、またはエステラーゼ）を供する；および／または（例えば、ア
フィニティークロマトグラフィーによって）リノール酸イソメラーゼの精製を助
けることができるセグメントを含む。適当な融合セグメントは所望の機能を有す
る（例えば、増加した安定性、溶解性、作用または活性を損なう；エステルの加
水分解のごとき他の酵素活性を供するおよび／または蛋白質の精製を簡素とする
）何れかのサイズのドメインであり得る。融合セグメントは蛋白質のリノール酸
イソメラーゼ含有ドメインのアミノ酸および／またはカルボキシル末端に接合す
ることができる融合セグメントは切断に感受性でリノール酸イソメラーゼの直接
的回収を可能とすることができる。融合蛋白質は、好ましくは、リノール酸イソ
メラーゼ含有ドメインのカルボキシルおよび／またはアミノ末端何れかに付着し
た融合セグメントを含めた蛋白質をコードする融合核酸分子で形質転換した組換
え細胞を培養することによって生産された。
【００６１】 リノール酸イソメラーゼ細菌および菌類を含めた種々の微生物から単離するこ
とができる；例えば、Lactobacillus,Clostridium,Propionibacterium,Butyrivi
brioおよびEubacteriumのごとき細菌属はリノール酸イソメラーゼ活性を有する 。特に、Lactobacillus reuteri、Clostridium sporogenes、Propionibacterium
acnes、Butyrivibrio fibrisolvens、Propionibacterium acidipropionici、Pr
opionibacterium freudenreichiiおよびEubacterium lennumはリノール酸イソメ
ラーゼを含有する。特に好ましいリノール酸イソメラーゼはLactobacillus reut
eriリノール酸イソメラーゼである。他の好ましいリノール酸イソメラーゼはPro
pionibacterium acnesおよびClostridium sporogenesからのリノール酸イソメラ
ーゼである。
【００６２】 本発明の方法によってかなり高い収率のＣＬＡを生じさせるには、微生物を遺
伝子的に修飾してリノール酸イソメラーゼの作用を増加させ、好ましくは、リノ
ール酸イソメラーゼ、それによりＣＬＡの生産を増強する。本明細書で用いるご
とく、本明細書で記載した細菌の好ましい属の何れかのごとき遺伝的に修飾され
た微生物は、所望の結果が達成される（すなわち、リノール酸イソメラーゼの作
用を増加させる）ように、その正常（すなわち、野生型または天然に生じる）形
態から修飾された（すなわち、突然変異させたまたは変化させた）ゲノムを有す
る。微生物の遺伝子的修飾は古典的株開発および／または分子遺伝学技術を用い
達成することかできる。かかる技術は、一般に、例えば、Sambrook et al., 198
9, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labs Press
に開示されている。文献Sambrookら、前掲は出典明示して本明細書の一部とみな
す。加えて、組換え技術を介する微生物の遺伝子的修飾についての技術は実施例
セクションに詳細に記載されている。
【００６３】 遺伝的に修飾された微生物は、挿入されたかかる修飾が微生物内で所望の効果
を提供するように、核酸分子が挿入され、欠失されまたは修飾された（例えば、
ヌクレオチドの挿入、欠失、置換、および／または逆位によって、すなわち突然
変異させた）微生物を含むことができる。
【００６４】 本発明によると、遺伝的に修飾された微生物は、組換え技術を用いて修飾され
ている微生物を含む。本明細書で用いるごとく、遺伝子発現の増大、遺伝子の機
能、または遺伝子産物（すなわち、当該遺伝子によってコードされた蛋白質）の
機能の結果となる遺伝的修飾を遺伝子の不活化（完全または部分的）、欠失、中
断、ブロックまたは下降調節ということができる。例えば、かかる遺伝子によっ
てコードされた蛋白質の機能の減少の結果となる遺伝子における遺伝的修飾は、
遺伝子の完全な欠失（すなわち、当該遺伝子は存在せず、従って当該蛋白質は存
在しない）、蛋白質の不完全な翻訳または翻訳がない結果となる遺伝子における
突然変異（例えば、当該蛋白質は発現されない）、または蛋白質の天然機能を低
下させまたはなくする遺伝子における突然変異（例えば、酵素活性または作用が
減少したまたは全くない蛋白質が発現される）の結果となり得る。遺伝子の発現
または機能の増加の結果となる遺伝的修飾は遺伝子の増幅、過剰生産、過剰発現
、活性化、増強、付加または上昇調節ということができる。
【００６５】 本発明の１つの実施形態において微生物の遺伝的修飾はリノール酸イソメラー
ゼの作用を増加または減少させる。かかる遺伝的修飾は何れのタイプの修飾も含
み、特に、組換え技術によっておよび古典的突然変異によってなされた修飾を含
む。リノール酸イソメラーゼの作用（または活性）を増大させることに対する言
及は、酵素の増大した機能の結果となり酵素のより高い活性（例えば特異的活性
またはイン・ビボ酵素活性）、酵素の減少した阻害または分解および酵素の過剰
発現を含む問題の微生物における何れの遺伝的修飾をもいうことに注意すべきで
ある。例えば、遺伝子コピー数は増大させることができ、発現レベルは天然プロ
モーターのそれよりも高いレベルの発現を与えるプロモーターの使用によって増
化させることができ、あるいは遺伝子は酵素の作用を増大させる遺伝子工学また
は古典的突然変異誘発によって改変することができる。同様に、酵素の作用を減
少させることへの言及は酵素の減少した機能の結果となる微生物における何れの
遺伝的修飾をもいい、酵素の減少した活性（例えば、特異的活性）、酵素の増加
した阻害または分解および酵素の発現の低下または排除を含む。例えば、本発明
の酵素の作用は酵素の生産をブロックしもしくは減少させ、酵素をコードする遺
伝子を「ノックアウト」させ、酵素活性を低下させ、または酵素の活性を阻害す
ることによって減少させることができる。酵素の生産のブロックまたは低下は、
増殖培地中に誘導性化合物の存在を必要とするプロモーターの制御下に当該酵素
をコードする遺伝子を置くことを含むことができる。インデューサーが培地から
枯渇するような条件を確立することによって、酵素をコードする遺伝子（および
従って酵素合成）の発現のスイッチを切ることができる。また、酵素の活性のブ
ロックまたは低下は、参照してここに組み込まれる米国特許第４，７４３，５４
６号に記載されているものと同様の切り出し技術アプローチを使用することを含
む。このアプローチを用いるには、注目する酵素をコードする遺伝子を、遺伝子
のゲノムからの特異的制御された切り出しを可能とする特異的遺伝子配列の間に
クローンする。切り出しは、米国特許第４，７４３，５４６号に記載されている
ごとく例えば培養の培養温度のシフトまたは幾つかの他の物理的または栄養的シ
グナルによって促進することができる。
【００６６】 本発明の１つの実施形態において、遺伝的に修飾された微生物はＣＬＡを合成
する増強された能力を有する微生物を含む。本発明によると、産物を「合成する
増大した能力」は、微生物が同一条件下で培養した野生型微生物と比較して増大
した量の産物を生産するように生成物の合成に関連する経路における何れの増強
または上昇調節をもいう。本発明の１つの実施形態において、ＣＬＡを合成する
微生物の能力の増強はリノール酸イソメラーゼ遺伝子の発現の増幅によって達成
される。リノール酸イソメラーゼの発現の増幅は、例えば、リノール酸イソメラ
ーゼ遺伝子をコードする組換え核酸分子の導入によって、または天然リノール酸
イソメラーゼ遺伝子よりも優れた調節制御を修飾することによって細菌細胞にお
いて達成することができる。
【００６７】 従って、リノール酸イソメラーゼ遺伝子をコードする核酸配列を含む組換え核
酸分子で形質転換した細菌を提供するのは本発明の実施形態である。かかる核酸
配列を含む好ましい組換え核酸分子は、配列番号：１、配列番号：５、配列番号
：９、配列番号：１１または配列番号：１８から選択されるアミノ酸配列を含む
リノール酸イソメラーゼをコードする核酸配列を含む組換え核酸分子を含む。本
発明の他の好ましい組換え核酸分子は配列番号：４、配列番号：８、配列番号：
１０、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７また
は配列番号：２６の群から選択される核酸配列を含む核酸分子を含む。前記の同
定された核酸分子は、リノール酸イソメラーゼをコードする野生型（すなわち天
然に生じる）核酸配列を含む核酸分子を表す。リノール酸イソメラーゼの相同体
をコードする核酸配列（すなわち、修飾されたおよび／または突然変異した）を
含む遺伝的に修飾された核酸分子は本発明によって含まれ、ここに詳細に記載さ
れる。
【００６８】 従って、低下した基質阻害および／または低下した産物阻害を持つリノール酸
イソメラーゼを有する微生物を提供するのが本発明の更にもう１つの実施形態で
ある。低下した基質および／または産物阻害を持つリノール酸イソメラーゼは突
然変異した（すなわち、遺伝的に修飾された）リノール酸イソメラーゼ遺伝子と
することができ、例えば、遺伝的修飾の何れかの適当な方法によって生産するこ
とができる。例えば、リノール酸イソメラーゼをコードする組換え核酸分子は、
エラー傾向ＰＣＲによるごとき、ヌクレオチドを挿入し、欠失し、および／また
は置換する何れの方法によって修飾することができる。この方法によって、遺伝
子は、増幅に用いるＤＮＡポリメラーゼによって高頻度の誤った取り込みエラー
に至る条件下増幅される。その結果、高頻度の突然変異がＰＣＲ産物いて得られ
る。次いで、突然変異されていない組換えリノール酸イソメラーゼ核酸分子を担
う微生物と比較して、増大したＣＬＡ生産をテスト微生物に与える能力につき突
然変異体遺伝子をテストすることによって低下した基質および／または産物阻害
につきスクリーニングすることができる。天然に生じるリノール酸イソメラーゼ
酵素に対して、酵素の特異的活性が同一であるかまたは現実には減少した場合で
さえ、リノール酸イソメラーゼの減少した基質および／または産物阻害は、典型
的には、増大した作用を持つリノール酸イソメラーゼの結果となることに注意す
べきである。従って、天然に生じるリノール酸イソメラーゼと比較して未修飾も
しくは減少した特異的活性さえ有する、増大した作用および増大したイン・ビボ
酵素活性を持つ遺伝的に修飾されたリノール酸イソメラーゼを生じさせるのが本
発明の実施形態である。また、本発明は、増大した特異的活性を持つ遺伝的に修
飾されたリノール酸イソメラーゼが含まれる。
【００６９】 従って、突然変異体または相同体リノール酸イソメラーゼをコードする核酸配
列を含む遺伝的に修飾された組換え核酸分子で形質転換した微生物提供するのが
本発明の実施形態である。かかるリノール酸イソメラーゼはここではリノール酸
イソメラーゼ相同体ということができる。蛋白質相同体はここに詳細に記載され
る。かかる核酸配列を含む好ましい組換え核酸分子は、配列番号：１、配列番号
：５、配列番号：９、配列番号：１１または配列番号：１８よりなる群から選択
されるアミノ酸配列を含むリノール酸イソメラーゼをコードする核酸配を含む組
換え核酸分子を含む。他の好ましい組換え核酸分子は配列番号：４、配列番号：
８、配列番号：１０、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列
番号：１７または配列番号：２６の群から選択される核酸配列を含む。本発明で
有用な特に好ましい遺伝的に修飾された組換え核酸分子は、ｎＣＬＡ８７、ｎＣ
ＬＡ５９６、ｎＣＬＡ１７０９、ｎＣＬＡ１．１、ｎＣＬＡ２．３，ｎＣＬＡ３ ５５１ 、ｎＣＬＡ１７７６および／またはｎＣＬＡ７１１３の群から選択される
核酸分子を含む核酸分子を含む。
【００７０】 本発明のもう１つの実施形態は単離されたリノール酸イソメラーゼ酵素を用い
て油からＣＬＡを生産する方法である。該方法は当業者に知られた拡販されたタ
ンク、プラグ−フローカラムリアクターまたは他の装置を用いてバッチまたは連
続様式で作動させることができる。該油は遊離脂肪酸、遊離脂肪酸の塩（例えば
、石鹸）、およびリノール酸、リノレン酸およびその混合物を含有する混合物か
ら選択される化合物を含む。好ましくは、該油は少なくとも約５０重量％、より
好ましくは少なくとも約６０重量％、最も好ましくは少なくとも約８０重量％の
化合物を含む。本発明の該方法は該化合物の少なくとも一部をＣＬＡに変換する
。好ましくは、該油の少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％
、最も好ましくは少なくとも約９５％がＣＬＡに変換される。
【００７１】 本発明の前記方法でいうような油を含有する種々の動物および植物源が入手で
きる。好ましくは、該油はヒマワリ油、サフラワー油、トウモロコシ油、亜麻仁
油、ヤシ油、菜種油、イワシ油、ニシン油、カラシ種子油、落花生油、ゴマ油、
シソ油、綿実油、大豆油、脱水ヒマシ油およびクルミ油よりなる群から選択され
る。
【００７２】 化合物がトリグリセリドの形態である場合、該方法は該油を加水分解酵素と接
触させてトリグリセリドの少なくとも一部を遊離脂肪酸に変換することを含む。
加水分解酵素はトリグリセリドのエステル結合を切断して遊離脂肪酸を得ること
ができる何れの酵素も含む。好ましくは、加水分解酵素はリパーゼ、ホスホリパ
ーゼおよびエステラーゼよりなる群から選択される。トリグリセリドを加水分解
する酵素の使用は当業者によく知られている。
【００７３】 別法として、脂肪酸のトリグリセリドを含む油は化学的に分解してトリグリセ
リドの少なくとも一部を遊離脂肪酸に変換することができる。トリグリセリドの
遊離脂肪酸への化学的変換は当業者によく知られている。例えば、水酸化物、炭
酸塩および炭酸水素塩のごとき塩基を用いる塩基性条件下で、トリグリセリドを
加水分解して脂肪酸を得ることができる。塩基の例は水酸化ナトリウム、水酸化
カルシウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化マグネ
シウム、炭酸カルシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸リチウムおよび炭酸水素リ
チウムを含む。別法として、酸を用いる酸性条件下でトリグリセリドを加水分解
して遊離脂肪酸を得ることができる。酸の例は塩酸、硫酸、リン酸、ならびに酢
酸およびギ酸のごときカルボン酸を含む。
【００７４】 本発明の好ましい方法において、リノール酸イソメラーゼを固体支持体に、す
なわち、固定化酵素に結合させる。本明細書中で用いるごとく、固体支持体に結
合したリノール酸イソメラーゼ（すなわち、固定化リノール酸イソメラーゼ）は
固定化単離リノール酸イソメラーゼ、リノール酸イソメラーゼ酵素を含有する固
定化細菌細胞、安定化昆虫細胞および安定化細胞／膜ホモジネートを含む。安定
化昆虫細胞および安定化細胞／膜ホモジネートは、リノール酸イソメラーゼを発
現する天然に生じる微生物からの、または本明細書中の他の箇所に開示する遺伝
的に修飾された微生物からの細胞およびホモジネートを含む。かくして、リノー
ル酸イソメラーゼを固定化する方法は後記するが、かかる方法は固定化細菌細胞
に同等に適用することができ、かかる実施形態においては細胞を溶解させること
ができることが認識されよう。
【００７５】 酵素を固定化する種々の方法は、Industrial Enzymology 第２版, Godfrey,T.
およびWest, S.編, Stockton Press, New York, N.Y., 1996, 267-272ページ、I
mmobilized Enzymes, Chibata, I編, Halsted Press,New York, N.Y., 1978；En
zymes and Immobilized Cells in Biotechnology, Laskin, A.編, Benjnin/Cumm
ings Publishing Co.,INC., Menlo Park, California,1985;およびApplied Bioc
hemistry and Bioengineering, vol.4, Chibata, I.およびWingald, Jr., L.編,
Academic Press, New York, N.Y., 1983に開示されており、これらを出典明示 して本明細書の一部とみなす。
【００７６】 略言すれば、固体支持体とは、単離されたリノール酸イソメラーゼ酵素の活性
に有意に影響することなくリノール酸イソメラーゼとで結合を形成することがで
きる何れの固体有機、生体ポリマーまたは無機支持体をもいう。有機固体支持体
の例はポリスチレン、ナイロン、テノール−ホルムアルデヒド樹脂、アクリルコ
ポリマー（例えば、ポリアクリルアミド）、安定化された無傷全細胞、および安
定化された粗製全細胞／膜ホモジネイトのごときポリマーを含む。生体ポリマー
支持体の例はセルロース、ポリデキストラン（例えば、Sephadex（登録商標））
、アガロース、コラーゲンおよびキチンを含む。無機支持体の例はガラスビーズ
（多孔性および非多孔性）、ステンレス鋼、金属酸化物（例えば、ＺｒＯ２、Ｔ
ｉＯ２、Ａｌ２Ｏ３およびＮｉＯのごとき多孔性セラミックス）および砂を含む
。好ましくは、固体支持体は安定化無傷細胞および／または粗製細胞ホモジネー
トよりなる群から選択される。かかる支持体の調製は最小の取扱いおよびコスト
しか要しない。加えて、かかる支持体は酵素の優れた安定性を提供する。
【００７７】 安定化された無傷細胞および／または細胞／膜ホモジネートは、例えば、細胞
および細胞ホモジネートを安定化するために二官能性架橋剤（例えば、グルタル
アルデヒド）を用いることによって生産することができる。無傷細胞および細胞
膜双方において、細胞壁および膜は固定化支持体として作用する。かかる系にお
いて、完全な膜蛋白質は「最良の」脂質膜環境にある。無傷細胞またはホモジネ
ートで出発するかを問わず、この系において、細胞はもはや「生きていない」か
または「代謝して」おり、あるいは「休止している」（すなわち、細胞は代謝能
力および活性なリノール酸イソメラーゼを維持するが培養条件下では増殖してい
ない）；何れの場合においても、固定化細胞もしくは膜は生物触媒として働く。
【００７８】 リノール酸イソメラーゼは吸着、（共有結合を含めた）架橋および包括を含め
た種々の方法によって固体支持体に結合させることができる。吸着はファン・デ
ル・ワールス力、水素結合、イオン結合または疎水性結合によることができる。
吸着固定化のための固定支持体の例はポリマー吸着剤およびイオン交換樹脂を含
む。ビーズ形態の固定支持体は特に良く適合する。吸着固定支持体の粒子サイズ
は、基質（例えば油）が所望の速度でリアクターを通って流れる間に固定化酵素
がメッシュフィルターによってリアクターに保持されるように選択することがで
きる。多孔性粒状支持体にて、吸着プロセスを制御して、リノール酸イソメラー
ゼまたは細菌細胞が粒子のキャビティー内に包埋されるようにでき、かくして、
活性の許容されない喪失なくして保護を提供する。
【００７９】 リノール酸イソメラーゼの固体支持体への架橋は、固体支持体およびリノール
酸イソメラーゼとの間の化学的結合を形成することを含む。架橋は一般に中間化
合物を用いてリノール酸イソメラーゼを固体支持体に連結させることを含むが、
中間化合物を使用することなく直接的に酵素および固体支持体の間で共有結合を
達成することもできることが認識されるであろう。架橋は、通常、酵素のカルボ
キシル基、アミノ基、硫黄基、ヒドロキシ基または他の官能基を活性化し、それ
を固体支持体に付着させるために二官能性または多官能性試薬を使用する。「活
性化する」なる用語は、官能基における結合の形成を可能とする官能基の化学的
変換をいう。アミノ基活性化試薬の例は水溶性カルボジイミド、グルタルアルデ
ヒド、臭化シアン、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、トリアジン、塩化
シアヌルおよびカルボニルジイミダゾールを含む。カルボキシル基活性化試薬の
例は水溶性カルボジイミドおよびＮ−エチル−５−フェニルイソオキサゾリウム
−３−スルホネートを含む。チロシル基活性化試薬はジアゾニウム化合物を含む
。スルフヒドリル基活性化試薬の例はジチオビス−５，５’−（２−ニトロ安息
香酸），およびグルタチオン−２−ピリジルジスルヒドを含む。固体支持体に直
接的に酵素を共有結合させるためのシステムは、Eupergit（登録商標）, Rohm P
harma (Darmstadt, Germany)から入手可能なポリメタクリレートビーズ支持体、
Sterling Organicsから入手可能なキーゼルグール（Macrosorbs），「Biofix」 支持体としてのEnglish China Clayから入手可能なカオリナイト、W, R, Grase から入手可能なシラン化によって活性化することができるシリカゲル、およびＵ
ＯＰ（Des Plains、IL）から入手可能な高密度アルミナを含む。
【００８０】 また、包括を用いてリノール酸イソメラーゼを固定化することもできる。リノ
ール酸イソメラーゼの包括は、とりわけ、（有機または生物学的ポリマーを用い
る）ゲル、（マイクロカプセル化を含めた）小胞、半透膜または他のマトリック
スの形成を含む。酵素の包括で用いる物質の例はコラーゲン、ゼラチン、カンテ
ン、セルローストリアセテート、アルギネート、ポリアクリルアミッド、ポリス
チレン、ポリウレタン、エポキシ樹脂、カラギーナンおよび卵アルブミンを含む
。ポリマー、該ポリマーの幾つか、特にセルローストリアセテートを用いてそれ
が繊維に紡糸される間に酵素を包括することができる。ポリアクリルアミドゲル
のごとき他の物質を溶液中で重合して酵素を包括することができる。光増感剤の
存在下で紫外光照射で架橋されたポリマーを形成することによって、重合可能な
ビニル末端基で機能化されるポリグリコールオリゴマーのごとき更に他の物質が
酵素を包括することができる。
【００８１】 本発明の方法によって生産されるＣＬＡは通常の方法によって回収することが
できる。
【００８２】 ＣＬＡは共溶媒系にて（例えば、レシチンで乳化した）乳化油を含む２相水性
−油系、最も好ましくは、水をほとんど含有しないすなわち、（酵素活性に必要
な最小の水のみ）油流を含む２相水性油系で生産することができる。本発明のリ
ノール酸イソメラーゼの更なる特徴は、それがより高いｌｏｇＰ溶媒によって阻
害されないことである。事実、驚くべきことに、ある場合には、本発明のリノー
ル酸イソメラーゼは非混和性溶媒を用いる場合にリノール酸のＣＬＡへのより高
い変換を供することが見出された。ＣＬＡは種々の溶媒系を用いて生産すること
ができる。例えば、ＣＬＡは水性系または水性および有機系の組合せを用いて生
産することができる。好ましくは、リノール酸イソメラーゼを用いるＣＬＡ生産
のための溶媒系は水、ヘキサン、ベカン、ヘキサデカンおよびプロピレングリコ
ールよりなる群から選択される溶媒を含む。
【００８３】 本発明のなおもう１つの実施形態は、ここに開示された本発明の微生物、核酸
分子および蛋白質から形成された産業発現系を利用するＣＬＡ生産方法に関する
。この方法においては、リノール酸イソメラーゼを発現する天然に生じる微生物
から、またはここに記載したごとき（組換え微生物を含めた）遺伝的に修飾され
た微生物から形成された固定化無傷全細胞または細胞／膜ホモジネート（ここに
、微生物は本発明のリノール酸イソメラーゼを安定に発現する）は、適当な培養
系（例えば、発酵器）中で増殖するであろう。安定化された細胞もしくはホモジ
ネートは、本明細書中の他の箇所で特定されたパラメーターに従い、リノール酸
および／またはリノレン酸をＣＬＡに変換する生物変換プロセスで生物触媒とし
て働くであろう。１つの実施形態において、生物触媒は数回再使用（すなわち、
リサイクル）されるであろう。好ましい実施形態において、リノール酸および／
またはリノレン酸含有油流を、最小量の水の存在下で生物触媒に添加する。
【００８４】 本発明の更にもう１つの実施形態は、核酸配列配列番号：１６に相補的なｎＣ
ＬＡ３５５１のストランドに位置し、核酸配列配列番号：２１を有するオープン
リーディングフレームを含むｎＣＳＮ７２６と命名された核酸分子に関する。配
列番号：２１は配列番号：１６のヌクレオチド位置１ないし７２６と相補的なス
トランドに位置し、開始コドンは、リノール酸イソメラーゼをコードする本発明
の核酸分子の推定開始コドンからほぼ２７５ヌクレオチド上流にある。配列番号
：２１の推定アミノ酸配列は配列番号：２２によって表される。配列番号：２２
を含む蛋白質はＰＣＳＮ２４２とここではいう。配列番号：２２を含む蛋白質の
Ｃ−末端部分は配列番号：２２には含まれない。本発明者らは、配列番号：２１
の核酸配列がStreptococcus pneumomiae（Q03158）からのコンピテンス−特異的
ヌクレアーゼ（ＤＮＡエントリヌクレアーゼ）と６６．６％同一であり、アミノ
酸配列配列番号：２２はこのコンピテンス−特異的ヌクレアーゼについてのアミ
ノ酸配列と配列に対して５１−７２％同一であることを示した（実施例５参照）
。従って、ＰＣＳＮ２４２はコンピテンス−特異的ヌクレアーゼの少なくとも一
部を表す可能性があると考えられる。ＰＣＳＮ２４２は、配列番号：３４によっ
てここでは表されるアミノ酸配列を有するＰＣＳＮ２４７内に含有される。配列
番号：３４は配列番号：３３によってここでは表されるnCSN744と命名された核 酸分子によってコードされる。アミノ酸配列は配列番号：３４は前記したコンピ
テンス−特異的ヌクレアーゼについてのアミノ酸配列に対して約５７％同一であ
り、約７１％同である。（ＢＬＡＳＴ、標準的なパラメーター） 本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明のリノール酸イソメラーゼをコー
ドするオープンンリーディングフレームから上流に位置したオープンンリーディ
ングフレームを含み、核酸配列配列番号：２７を有するｎＢＳＰ９４１と命名さ
れた核酸分子に関する。配列番号：２７の推定アミノ酸配列は配列番号：２８に
よって表される。配列：２８を含む蛋白質はここではＰＢＳＰ３１２という。本
発明者らは、配列番号：２８のアミノ酸配列がBasillus subtilisからのパーミ アーゼ（p54425）に対して（標準的なＢＬＡＳＴパラメーターを用いて）約５６
％同一、約７４％同様であることを示した（実施例５参照）。従って、PBSP312は
パーミアーゼの少なくとも一部を表すと考えられる。
【００８５】 後記実施例５に記載されているごとく、本発明の１つの実施形態は本発明のリ
ノール酸イソメラーゼをコードするオープンリーディングフレームから約１２２
ヌクレオチド下流に位置したオープンリーディングフレームを含む、ｎＵＮＫ１ ６５６ と命名された核酸分子である。核酸分子ｎＵＮＫ１６５６は配列番号：１
９によって表される核酸配列を含み、その推定アミノ酸配列は配列番号：２０に
よって表される。配列番号：２０を有する蛋白質はここではＰＵＮＫ１２１８と
いう。ＰＵＮＫ１２１８は配列番号：３６によって表された推定アミノ酸配列を
有するＰＵＮＫ１５１３と命名されたより大きな蛋白質内に含有される。配列番
号：３６はｎＵＮＫ１５４０と命名された核酸分子によってコードされ、その核
酸配列は配列番号：３５によって表される。ＰＵＮＫ１５１３のＣ−末端は不完
全である。
【００８６】 本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明のリノール酸イソメラーゼをコー
ドするオープンリーディングフレームから上流に位置するオープンリーディング
フレームを含むｎＵＮＫ２６００と命名された核酸分子である。核酸分子ｎＵＮ
Ｋ２６００は配列番号：２９によって表される核酸配列を含み、その推定アミノ
酸配列は配列番号：３０によって表される。配列番号：３０を有する蛋白質はこ
こではＰＵＮＫ２１９９という。
【００８７】 本発明の更にもう１つの実施形態は、本発明のリノール酸イソメラーゼをコー
ドするオープンリーディングフレームから上流に位置したオープンリーディング
フレームを含むｎＵＮＫ３８４９と命名された核酸分子である。核酸分子ｎＵＮ
Ｋ３８４９は配列番号：３１によって表される核酸配列を含み、その推定アミノ
酸配列は配列番号：３２によって表される。配列番号：３２を有する蛋白質はこ
こではＰＵＮＫ３２８２という。
【００８８】
【実施例】
実施例は当業者に知られていると考えられる多数の分子生物学、微生物学、免
疫学および生化学技術を含むことに注意されたい。かかる技術の開示は、例えば
、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲および関連文献で見い出すことができる。特記しな
い限り、すべてのカラムクロマトグラフィーは４℃で行った。
【００８９】 実施例１ この実施例は種々の微生物での全細胞生物変換を用いるリノール酸からのＣＬ
Ａ生産を説明する。用語「全細胞生物変換」とは微生物による適当な基質のＣＬ
Ａへの変換をいう。
【００９０】 種々の他の微生物はＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から購入
し、０．５％酵母エキス、０．００５％ヘミン、０．００１％ビタミンＫ１、０
．０５％システインおよび０．０１％レザズリンを補足したブレインハートイン
ヒュージョンブロス（Ｄｉｆｃｏ）で増殖させた。培養は３７℃において約１２
ないし約１６時間、ヘッドスペースが制限された密閉容器中で増殖させ、収穫し
、新鮮な培地で洗浄した。培養ストックを約−８０℃にて１０％グリセロール中
で維持した。
【００９１】 Lactobacillus reuteri Pyr8（その全体を参照してここに組み込まれる、1997
年10月7日に発行されたCookらに対する米国特許第5,674,901号の関連で、America
n Type Culture Collection(ATCC), 米国VA20110、 Manassas, University Boule
vard 10801に1996年2月15日に寄託されたATCC受託番号55739）はマディソン州の
ウィスコンシン大学の食糧研究所のMichael Pariza博士から入手した。該生物を
、ヘッドスペースが制限された密閉容器中、MRS Lactobacillusブロス（ＢＢＬ ）上で増殖させた。３７℃で約３６ないし４０時間、撹拌することなく２−Ｌビ
ン中で大規模な培養を増殖させた（１ないし２％接種物）、遠心によって収穫し
、０．１Ｍビス−トリス、０．９％ＮａＣｌ ｐＨ６．０緩衝液（バッファー）
で１回洗浄し、ただちに用いるかまたは約−８０℃で保存した。
【００９２】 前記したごとく培養物を増殖させ、収穫した。洗浄した細胞を新鮮な増殖培地
または種々の濃度のリノール酸を含有する０．１ＭトリスｐＨ８．０緩衝液何れ
かに再懸濁させた。
【００９３】 シェーカーで２００ｒｐｍ撹拌されたじゃま板付きの２５０ｍｌ震盪フラスコ
中で、室温にて好気性生物変換を行った。
【００９４】 嫌気性生物変換は３７℃にて９５％窒素／５％二酸化炭素ヘッドスペース下で
密閉された１５０ｍｌ血清ビン中で行った。培地は、Ｎ２／ＣＯ２雰囲気下で１
５分間沸騰することによって培地を嫌気的に培地を調製し、ヒダを付けたセプタ
ムでシールし、オートクレーブ処理した。ＭＲＳブロス（ＢＢＬ）はＬ．ｒｅｕ
ｔｒｉで使用した。補足されたブレインハートインヒュージョンブロスを他の微
生物での嫌気性生物変換で用いた。
【００９５】 試料を適当な間隔で採取し、実施例２に記載されたごとくにＣＬＡにつき分析
した。幾つかの実験において、種々の洗剤を０．１−０．５％の最終濃度まで添
加した。有機溶媒を用いる実験において、ヘキサン（ｌｏｇＰ＝３．６）デカン
（ｌｏｇＰ＝５．６）またはヘキサデカン（ｌｏｇＰ＝８．６）中に溶解させた
５％（ｖ／ｖ）ストックとしてリノール酸を供した。室温でインキュベートした
１２５ｍｌのジャマ板付き震盪フラスコ中の約２０ｍｌの水性細胞懸濁液に約５
ｍｌ溶媒を添加した。
【００９６】 図１Ａおよび１Ｂは、好気性（図１Ａ）および嫌気性（図１Ｂ）条件下でのCl
ostridium sporogenes ATCC25762による全細胞生物変換の結果を示す。図１Ａに
示すごとく、好気性条件下で、C. sporogenes ATCC25762はリノール酸を（シス 、トランス）−９，１１−ＣＬＡに迅速に変換する。しかしながら、遅延された
全細胞生物変換の結果、（シス、トランス）−９，１１−ＣＬＡが減少し、（ト
ランス，トランス）−９，１１−ＣＬＡおよび（トランス、トランス）−１０，
１２−ＣＬＡが増加する。C. sporogenes ATCC25762は嫌気性条件下でリノール 酸から（シス、トランス）−９，１１−ＣＬＡを生じる（図１Ｂ）；しかしなが
ら（トランス、トランス）ＣＬＡは嫌気性条件下では観察されなかった。
【００９７】 図２Ａおよび２Ｂは好気性（図２Ａ）および嫌気性（図２Ｂ）条件下でのC. b
ifermentans ATCC638による全細胞生物変換の結果を示す。リノール酸は、嫌気 性条件下（図２Ｂ）よりも好気性条件下（図２Ａ）でC. bifermentans ATCC638 によって（シス，トランス）−９，１１−ＣＬＡにより迅速に変換される。最高
の（シス，トランス）−９，１１−ＣＬＡ濃度は好気性条件下で約１時間ないし
約５時間において観察される。C. Sordellii ATCC9714は好気性および嫌気性両 条件下でリノール酸を（シス，トランス）−９，１１−ＣＬＡに変換する（デー
ターは示さず）。
【００９８】 図３Ａ、３Ｂおよび４は、各々、Propionibacterium jensnii ATCC14073（図 ３Ａ）、P. acnes ATCC6919（図３Ｂ）、およびP. acidipropionici ATCC25562 （図４）による全細胞生物変換の結果を示す。興味深いことには、好気性条件下
でP. acidipropioniciはリノール酸を（シス、トランス）−９，１１−ＣＬＡに
変換するが、P. acnesはリノール酸を（トランス、シス）−１０，１２−ＣＬＡ
に変換する。
【００９９】 図５はLactobacillus reutriによる全細胞生物変換の結果を示す。他の微生物
とは異なり、リノール酸からL. reutriによって形成された（シス、トランス） −９，１１−ＣＬＡの濃度は時間と共に有意には減少しない。Ｔｗｅｅｎ−８０
またはトリトンＸ−１００のごとき種々の非イオン性洗剤の添加は（シス、トラ
ンス）−９，１１−ＣＬＡ形成を有意には増加させない。
【０１００】 実施例２ 本実施例はリノール酸のＣＬＡへの変換量を測定するための脂肪酸分析につい
ての手法を記載する。
【０１０１】 ０．５ｍｌの５Ｍ ＮａＣｌを添加した約１ｍｌないし約２．５ｍｌの水性試
料から脂肪酸を抽出した。テフロンライニング処理した蓋付きのガラススクリュ
ーキャップ中にて、クロロホルムーメタノールの５ｍｌの２：１混合物と共に試
料を震盪した。２相を分離し、約１ないし２ｍｌのクロロホルム層を取り出した
。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮した。Chin et al., J. Food compositi
on, 1992, 5:185-192の手法の修飾によって、濃縮された脂肪酸をメチルエステ ルに変換した。６０℃まで予備加熱したメタノール中の約６ｍｌの４％ＨＣｌを
、脂肪酸試料を含有するガラスチューブに添加した。該チューブをテフロンライ
ニングした蓋でシールし、チューブヒーター中、６０℃で２０分間インキュベー
トし、次いで室温まで冷却し、２ｍｌの水および３ｍｌのヘキサンを添加した。
震盪後、有機層を分離し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、ガスクロマトグラフィーによ
って分析した。４つのＣＬＡピークの順番は、（１）（シス，トランス）−９，
１１−ＣＬＡ、（２）（トランス，シス）−１０，１２−ＣＬＡ（３）（シス，
シス）−９，１１−ＣＬＡおよび（シス，シス）−１０，１２−ＣＬＡおよび（
４）（トランス，トランス）−９，１１−ＣＬＡ）および（トランス，トランス
）−１０，１２−ＣＬＡ）であった。
【０１０２】 実施例３ この実施例はＬ．ｒｅｕｔｒｉからのリノール酸イソメラーゼの精製を記載す
る。
【０１０３】 洗剤可溶性蛋白質画分は以下のごとくに調製した。凍結した細胞を解凍し、氷
上の破壊緩衝液に懸濁した。L. reutriについての標準的な破壊緩衝液は０．１ Ｍビスートリス（Calbiochem Ultrol グレード）ｐＨ５．８（４℃）、１０ｍＭ
ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭジチオスレイトールを含むものであっ
た。他の生物では、ビスートリス緩衝液の代わりにｐＨ７．５のトリス緩衝液を
用いた。SLM Aminco フレンチプレスを用いて細胞懸濁液を１８，０００ｐｓｉ で破壊した。抽出物を１２，０００×ｇにて３０分間遠心した。１００，０００
×ｇにて９０分間遠心することによって上清を更に分画して可溶性画分および膜
ペレットを得た。膜ペレットを再懸濁し（ほぼ５ｍｇ／ｍｌ）、磁性フリーを用
いて軽く撹拌しつつ、洗剤緩衝液（０．１ＭビスートリスｐＨ５．８、０．２５
Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭジチオスレイトール、０．３％オク
チルチオグリコピラノシド（OTGP, CALBIOCHEM ULTROL グレード））で４℃にて
４−１８時間で抽出した。１００，０００×ｇにての９０分間の遠心後、上清（
すなわち、洗剤可溶性蛋白質画分）を更に方法Ａ、ＢまたはＣ（後掲）によって
精製した。
【０１０４】 方法Ａ 洗剤可溶性蛋白質画分を低塩緩衝液（０．１ＭビスートリスｐＨ５．８、１０
ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭジチオスレイトール、１０％グリセロール、０．３％Ｏ
ＴＧＰ）に対して一晩透析し、予め低塩緩衝液で平衡化した２．１×１５ｃｍＤ
ＥＡＥ−５ＰＷカラム（TosoHaas）に適用した。カラムを１Ｍ ＮａＣｌを含有
する同緩衝液（高塩緩衝液）で洗浄した（４ｍｌ／分）。この工程からの結果を
図６に示す。蛋白質濃度を２８０ｍＭで連続的にモニターした。約４ｍｌ画分を
収集し、イソメラーゼ活性につき検定した。抽出物中のイソメラーゼ活性を２０
ｐｐｍリノール酸で測定した。有意なイソメラーゼ活性を持つ画分を合わせ、Ａ
ｍｉｃｏｎ限外濾過セルを用いて濃縮した。次いで、濃縮した画分を１．６×５
５ｃｍのSuperdex-200（Pharmacia）ゲル濾過カラムに適用した。０．１Ｍビス ートリスｐＨ５．８、０．２Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、２ｍＭジチオ
スレイトール、０．３％ＯＴＧＰを含有する緩衝液で、０．５ｍｌ／分にてカラ
ムを展開した。２．０ｍｌの画分を収集し、イソメラーゼ活性につき検定した。
活性画分を収集し、濃縮し、０．１ＭビスートリスｐＨ５．８、１０ｍＭ ＫＨ ２ ＰＯ４、１０％グリセロール、２ｍＭジチオスレイトール、０．３％ＯＴＧＰ
、０．２Ｍ ＮａＣｌで平衡化したヒドロキシルアパタイトカラム（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ ５ｍｌ ＣＨＴ−ＩＩカートリッジ）に適用した。４００ｍＭ ＫＨ２Ｐ
Ｏ４を含有する同緩衝液を用いリン酸を増大させてカラムを洗浄し（１ｍｌ／分
）、結果を図７に示す。１２．５％アクリルアミドゲル上のPharmacia Phast Sy
stemを用いるＳＤＳ ＰＡＧＥに活性画分を付した。イソメラーゼ活性は、４５
ないし７０キロダルトン（ｋＤ）の範囲のゲル上の４つのバンドに相関した。
【０１０５】 方法Ｂ 洗剤可溶性蛋白質画分をアフィニティーカラムに適用した。次いで、該アフィ
ニティーカラムを、低塩緩衝液（７５ｍｌ）、高塩緩衝液（５０ｍｌ）および０
．１ＭビスートリスｐＨ５．８、１Ｍ ＮａＣｌ、０．３％ＯＴＧＰ、２ｍＭジ
チオスレイトール、１０％グリセロール、２０％１，２−プロパンジオールを含
むリノール酸緩衝液（１００ｍｌ）で順次洗浄した（１ｍｌ／分）。
【０１０６】 アフィニティーカラムは以下のごとくに調製した。Pharmacia EAH Sepharose ４Ｂを洗浄し、脱イオン水中のスラリーとして懸濁した。５倍過剰のリガンド（
リノール酸またはオレイン酸）を等容量の１，２−プロパンンジオールに添加し
た。固体Ｎ−エチルーＮ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩
酸塩（ＥＤＣ）を０．１Ｍまで添加し、ｐＨを５．０あたりに調整し、室温にて
一晩の遅い転倒によって混合した。ゲルをガラスフリット漏斗上に収集し、５０
％１，２−プロパンジオール、０．１Ｍ酢酸カリウムｐＨ４．０、０．５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、および０．１ＭトリスｐＨ８．２で順次十分に洗浄した。次いで、樹脂
を洗浄し、低塩緩衝液に懸濁させ、それを用いて１．６×２０ｃｍアフィニティ
カラムを調製した。
【０１０７】 方法Ｃ 洗剤可溶性蛋白質画分は方法Ａに記載されたごとくＤＥＡＥ−５ＰＷカラムを
用いるクロマトグラフィーによって精製した。イソメラーゼ活性を含有する画分
を合わせ、濃縮し、限外濾過によって脱塩した。ｐＨ８．３の２５ｍＭトリエタ
ノールアミン、１ｍＭジチオスレイトール、０．３％ＯＴＧＰを含む緩衝液で予
め平衡化したＭｏｎｏ ＰＨＲ５／２０カラム（Pharmacia, 0.5×20cm）に適用
した。次いで、ｐＨ６．５の１０％Polybufer96（Pharmacia）、０．３％ＯＴＧ
Ｐ、１ｍＭジチオスレイトールを含む緩衝液でカラムを溶出させ、１ｍｌ画分を
収集した。図８に示すごとく、蛋白質のいくらかは初期画分（画分５−１５）に
存在し、イソメラーゼ活性を含有する画分は典型的には画分２７および４７の間
に溶出させた。イソメラーゼ活性を含有する画分を合わせ、方法Ａに記載された
ごとくSuperdex-200ゲル濾過カラムを用いるクロマトグラフィによって更に精製
した。イソメラーゼ活性を含有する画分は約１６０ｋＤの質量を持つ単一バンド
として溶出した。この同バンドは編成ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で泳動し、約７０
ｋＤの単一バンドが得られた。当業者に知られた技術を用い、この７０ｋＤバン
ドを切り出し、Ｎ−末端アミノ酸の配列決定に付した。約３５アミノ酸の部分的
Ｎ−末端アミノ酸配列が推定され、配列番号：１としてここでは表す。配列番号
：１の配列を有する蛋白質をＰＣＬＡ３５という。アミノ酸配列決定技術は全く
エラーがないというのではないので、配列番号：１はせいぜい見かけの部分的Ｎ
−末端アミノ酸配列を表すことに注意すべきである。
【０１０８】 実施例４ この実施例は画分または蛋白質のイソメラーゼ活性の存在を決定するための手
法を記載する。この実施例は動的アッセイを行うための方法も記載する。
【０１０９】 リノール酸イソメラーゼ活性は、実施例２に記載されたガスクロマトグラフィ
ーによってまたは分光測定によってＣＬＡ定量を介して検定した。酵素アッセイ
は、特記しない限り、１００万当たり２０部（ｐｐｍ）のリノール酸を含む０．
１Ｍトリス緩衝液ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭジチオスレイトール
中で行った。
【０１１０】 約５０ないし約２５０μＬの酵素試料を反応のための１．５ｍｌの酵素検定緩
衝液に添加した。約１ないし約２ｍｌの水性相を酵素反応から分離し、約３ｍｌ
のヘキサンで抽出した。幾つかの実験において、および洗剤を含有するクロマト
グラフィー画分にて、０．５ｍｌのメタノールおよび０．５ｍｌの５Ｍ ＮａＣ
ｌ溶液をまず添加して相分離を増強した。有機層を分離し、２３４ｎｍの吸光度
を、ＨＰ８４５２Ａダイオードアレイ分光光度計を用いて測定した。活性のレベ
ルに応じて、クロマトグラフィー画分の検定混合物を、ヘキサンでの抽出の約１
ないし約２４時間前に室温でインキュベートした。
【０１１１】 動的検定は室温にて０．５ｍｌの水晶キュベット中にて直接的に行い、２３４
ｎｍで連続的にモニターした。反応は、１，２−パロパンジオール中で調製した
濃縮ストックからのリノール酸の添加によって開始した。反応緩衝液はそれが１
０％１，２−プロパンジオールを含有する以外は前記と同一であった。
【０１１２】 実施例５ この実施例は本発明のLactobacillus reuteriリノール酸イソメラーゼ核酸分 子の核酸クローニングおよび配列決定を示す。
【０１１３】 アミノ酸配列決定および核酸配列決定技術は全くエラーがないというのではな
いので、この実施例および後記の実施例に提示した配列はせいぜい本発明のリノ
ール酸イソメラーゼの見掛けの配列を表すことに注意すべきである。
【０１１４】 配列番号：１のアミノ酸残基１−７および２３−２９の配列に対応する、２組
の十分に変性されたオリゴヌクレオチドプライマーを合成した。
【０１１５】 ＣＬＡＯ１と命名された第１のオリゴヌクレオチドプライマーは以下の配列を
有していた： ５’−ｅｇｔ ｇａａ ｔｔｃ ＡＴＧ ＴＡ（Ｔ／Ｃ）ＴＡ（Ｔ／Ｃ）（Ｔ
／Ａ）（Ｃ／Ｇ）Ｎ ＡＡ（Ｔ／Ｃ）ＧＧＮ ＡＡ−３’ （ＥｃｏＲＩ部位および５’末端の（下部ケース文字として示された）３つの過
剰の塩基を含む）（配列番号：２）。
【０１１６】 ＣＬＡＯ２と命名された第２のオリゴヌクレオチドプライマーは以下の配列を
有していた： ５’−ａｃｔ ｇｇａ ｔＣＣ ＮＡＣ（Ｔ／Ａ／Ｇ）ＡＴ（Ａ／Ｇ）ＡＴ
ＮＧＣ（Ａ／Ｇ）（ＴＧ（Ｃ／Ｔ）ＴＴ−３’ （ＢａｍＨＩ部位および５’末端の（下部ケース文字として示された）３つの過
剰塩基を含む）（配列番号：３）。
【０１１７】 ＰＣＲ産物は最適ＰＣＲ条件下でL. reuteriゲノムＤＮＡから増幅し、ゲル精
製した。予測されたサイズ（約１００ｂｐ）を持つＰＣＲ産物の単一バンドが３
％アガロースゲルで検出された。ＰＣＲ産物を精製し、ＳｒｆＩ部位においてベ
クターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｐ）ＳＫ（＋）（Strategen）にクローン 化された。潜在的組換えプラスミドは制限消化および配列決定によって分析した
。
【０１１８】 配列決定された４つのクローンは、ｎＣＬＡ８７とここでは命名される同一配
列（配列番号：４）を持つ約８７ヌクレオチドのインサートを含有する。推定さ
れるアミノ酸配列（配列番号：５）は実施例３で同定されるリノール酸イソメラ
ーゼのＮ−末端配列とマッチする。配列番号：５の配列を有する一部をＰＣＬＡ ２８ とここではいう。
【０１１９】 逆ＰＣＲ増幅のアプローチを用いて、配列ｎＣＬＡ８７をコードするＮ−末端
をフランクするＤＮＡ断片をクローン化した。ＣＬＡ０３およびＣＬＡ０４（各
々、配列番号：６および配列番号：７）と命名された２つのオリゴヌクレオチド
プライマーを逆ＰＣＲのために設計した。ＣＬＡ０３はｎＣＬＡ８７（配列番号
：４）のヌクレオチド２５−４１、およびｎＣＬＡ８７のＣＬＡ０４ヌクレオチ
ド４６−６７に対応する（配列番号：４）。
【０１２０】 Lactobacillus reuteri PYR8からのゲノムＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで消化
し、Ｔ４ ＤＮＡリゼーゼで処理して該分子を環状化し、得られた分子をＰＣＲ
産物における鋳型として用いた。５９２ヌクレオチドのＰＣＲ産物を精製し、Ｓ
ｒｆＩ部位においてベクターｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｐ）ＳＫ（＋）（St
ratagen）にクローン化し、配列決定した。この分子の５９６ｂｐ編集バージョ ンをここではｎＣＬＡ５９６（配列番号：８）と命名した。ｎＣＬＡ５９６はリ
ノール酸イソメラーゼ遺伝子の５’上流および３’下流配列を共に含有する。配
列中のＢａｍＨＩの部位は接合点を示すであろう。しかしながら、ＢａｍＨＩ部
位は配列中に検出されなかった。従って、ｎＣＬＡ５９６中の配列はそのＯＲＦ
および配列ｎＣＬＡ８７に対して仮に編集した。この仮に編集された配列は４７
５ヌクレオチドのＯＲＦを含有する。このＯＲＦの推定アミノ酸配列をＰＣＬＡ １５８ （配列番号；９）と命名する。配列番号：９の配列を有する部分をここで
はＰＣＬＡ１５８という。
【０１２１】 ＣＬＡ０３およびＣＬＡ０４を直ぐにフランクする配列はｎＣＬＡ８７中の配
列と同一であり、クローン化されたＰＣＲ産物との同一性を確認する。
【０１２２】 ｎＣＬＡ５９６を３２Ｐで標識し、異なる制限酵素で消化したLactobacillus
reuteri PYR8ゲノムＤＮＡのサザーンブロットにハイブリダイズさせた。ｎＣＬ
Ａ５９６の部分的リノール酸イソメラーゼ配列は１つのＡｇｅＩ部位および１つ
のＥｃｏ５８Ｉ部位を含有する。予測されるごとく、ゲノムＤＮＡをこれらの２
つの酵素で個々に消化した場合、２つのハイブリダイゼーションバンドがサザー
ンブロットで観察された。ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ、ＰｖｕＩ，ＳａｌＩお
よびＸｈｏＩのごとき部分的イソメラーゼ配列を切断しない酵素で調製した消化
物では唯１つのハイブリダイゼーションバンドが検出されたにすぎず、他方、高
分子量領域（＞１０ｋｂ）におけるより散漫なハイブリダイゼーションシグナル
がＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩおよびＳｐｈＩ消化物で観察された。これらのデータは
、リノール酸イソメラーゼ遺伝子がLactobacillus reuteri PYR8のゲノム中で単
一コピーとして存在することを示す。
【０１２３】 完全なリノール酸イソメラーゼ遺伝子をクローンするために、逆ＰＣＲのアプ
ローチは以下の通りであった。前記したごとく、制限酵素ＡｇｅＩ部位はヌクレ
オチド位置２９５の配列番号：８（ｎＣＬＡ５９６）の中央に存在する。サザー
ンハイブリダイゼーションは、各々、L. reuteri ＰＹＲ８ゲノムＤＮＡ：約１
．１および約２．３ｋｂのＡｇｅＩ消化物中に２つのバンドを示した。L. reute
ri PYR8からのゲノムＤＮＡをＡｇｅＩで消化し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼで再度 連結し、ＰＣＲ反応において鋳型として用いた。最適条件下で、ＣＬＡ０３およ
びＣＬＡ０４のプライマー組を用いて約１．１ｋｂのＰＣＲ産物が生成され、プ
ライマー組ＣＬＡ０５およびＣＬＡ０６（各々、配列番号：１２および配列番号
：１３）を用いて２．３ｋｂの産物が生成した。ＣＬＡ０５はｎＣＬＡ５９６の
ヌクレオチド３２６−３４２に対応し、ＣＬＡ０６はｎＣＬＡ５９６のヌクレオ
チド３９６−４１４に対応する。これらの結果はサザーンブロットデーターと一
致する。
【０１２４】 両ＰＣＲ産物をＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｐ）ＳＫ（＋）（Stratagen）を クローンした。１．１ｋｂ断片を含有するクローンをｎＣＬＡ１．１と命名し、
２．３ｋｂ断片を持つクローンをｎＣＬＡ２．３と命名する。最初に、ｎＣＬＡ １．１ 中のＣＬＡ０３から上流の配列決定データーの約７００ヌクレオチドおよ
びｎＣＬＡ２．３中のＣＬＡ０６の下流の配列決定データーの７００ヌクレオチ
ドを得た。ｎＣＬＡ５９６、部分的ｎＣＬＡ１．１および部分的ｎＣＬＡ２．３ の配列を編集して、ここにｎＣＬＡ１７０９（配列番号：１０と命名した複合配
列を得た）。配列番号：１０の推定アミノ酸配列はここでは配列番号：１１とし
て表される。配列番号：１１の配列を有する蛋白質はこおではｐｃｌａ３２４と
いう。
【０１２５】 ｎＣＬＡ１７０９はイソメラーゼコーディング配列の一部ならびに５’上流配
列を含有する。精製されたポリペプチドの最初のアミノ酸に対応するＡＴＧコド
ンから上流の７３７ヌクレオチド配列を、ＢＬＡＳＴネットワークのＢｌａｓｔ
ｘ（オープンンリーディングフレーム）およびＢｌａｓｔｎ（ヌクレオチド）サ
ーチを用いることによって既知の配列と比較した。有意な相同性は何れのエント
リーでも見出されず、スコアはＢｌａｓｔｎでは１７６未満であり、Ｂｌａｓｔ
ｘでは１５３である。ＡＴＧ開始コドンから下流のコーディング配列は、Strept
ococcus pyogenes（Ｕ０９３５２）からの６７ｋＤミオシン−交差反応性のstre
ptococcal抗原との相同性：アミノ酸レベルで６９％同一性およびヌクレオチド レベルで６６％同一性を示した。同一のヌクレオチドの最長ストレッチは２３ヌ
クレオチドのものである。イソメラーゼコーディング配列はStaphylococcus aur
eus (L19300)からのＯＲＦに対する相同性：アミノ酸レベルおよびヌクレオチド
レベル双方において６２％同一性を示す。
【０１２６】 ｎＣＬＡ１．１およびｎＣＬＡ２．３の最初の配列決定に続き、両クローンを
完全に配列決定し（各々、配列番号：１４および配列番号：１５）、ｎＣＬＡ５ ９６ （配列番号：８）の配列と共にこれらの配列を組み立てて３５５１ヌクレオ
チドの核酸配列が得られ、これをｎＣＬＡ３５５１と命名し、これを配列番号：
１６によってここでは表す。配列番号：１４は配列番号：１６のヌクレオチド１
ないし１１７３にわたり、配列番号：１５は配列番号：１６のヌクレオチド１１
７４ないし３５５１にわたる。
【０１２７】 ｎＣＬＡ３５５１は３つのオープンンリーディングフレーム（図９；ＩＳＯＮ
，ＤおよびＥ）を含有し、最初のＯＲＦ（図９、ＩＳＯＭ）は配列番号：１６の
ヌクレオチド位置１０００ないし２７７５にわたる約１．８ｋｂ核酸分子であり
、ここでは配列番号：１７として表される。配列番号：１７は本発明のリノール
酸イソメラーゼをコードする。配列番号：１７によって表される核酸配列を有す
る核酸分子はここではｎＣＬＡ１７７６といい、配列番号：１８によって表され
るアミノ酸配列を有する５９１アミノ酸残基のほぼ６７ｋＤ（推定）蛋白質をコ
ードする。アミノ酸配列配列番号：１８を有する蛋白質をここではＰＣＬＡ５９ １ という。ＰＣＬＡ５９１の推定サイズはＳＤＳゲルで決定された精製イソメラ
ーゼ蛋白質のサイズと合致する。この最初のＯＲＦ（配列番号：１７）の最初の
コドンから上流の７つのヌクレオチドは、Lactobacillusで報告されているコン センサスリボソーム−結合−部位と同様の配列である。また、この最初のＯＲＦ
から上流には、−１０およびー３５プロモーター配列と同様の配列がある。これ
らの配列特徴は、ｎＣＬＡ３５５１の位置１０００における開始コドンが翻訳開
始コドンであるという結論と一致する。あるいは、ｎＣＬＡ３５５１の配列は、
最初のＯＲＦから上流にて、位置１０００の開始コドンから３６ヌクレオチド上
流で、イン・フレームで、縦列の２つのＡＴＧ開始コドンを有する。もしこれら
のコドンのうち１つが翻訳開始コドンであると、約１２アミノ酸のリーダーペプ
チドを生産することができ、これは引き続いて切断されて成熟イソメラーゼを形
成する。
【０１２８】 前記したごとくに決定されたリノール酸イソメラーゼの遺伝子の完全なコーデ
ィング配列（配列番号：１７）を、ＢＬＡＳＴネットワークのＢｌａｓｔｘ（オ
ープンンリーディングフレーム）およびＢｌａｓｔｘ（ヌクレオチド）サーチを
用いることによって既知の配列に対して比較した。配列番号：１７によってコー
ドされるリノール酸イソメラーゼは、従前に言及されている Staphylococcus py
ogenes（Ｕ０９３５２）６７ｋＤミオシンー交差反応性 streptococcal 抗原と ヌクレオチドレベルで６７％同一性およびアミノ酸レベルで７０％同一性を示し
た。該 Staphylococcus pyogenes（Ｕ０９３５２）蛋白質は５９０個のアミノ酸
残基を有する。配列番号：１７および前記 Staphylococcus aureus（Ｌ１９３０
０）遺伝子によってコードされるリノール酸イソメラーゼの間の相同性はわずか
に低い：核酸レベルで約６０％およびアミノ酸レベルで約６２％。これらのサー
チについての欠陥値でのＢＬＡＳＴ サーチパラメーターを表１に示す（前記参
照）。Staphylococcus pyogenes（Ｕ０９３５２）または Staphylococcus aureu
s（Ｌ１９３００）配列何れかにつきはっきりとした機能は以前には記載されて いなかった。
【０１２９】 ｎＣＬＡ３５５１の第２のオープンンリーディングフレーム（図９、Ｅ）は配
列番号：１６のヌクレオチド位置２８９６ないし３５５１であり、配列番号：１
９によって表される。配列番号：１９を有する核酸分子はここではｎＵＮＫ１６ ５６ といい、これは配列番号：２０のアミノ酸配列を有する約２１８個のアミノ
酸残基の蛋白質をコードする。配列番号：２０を有する蛋白質をここではＰＵＮ
Ｋ１２１８という。ＰＵＮＫ１２１８の機能は知られていない。ｎＵＮＫ１６５ ６ の配列を相同性につき既知の配列と比較し、有意な相同性は確認されなかった
。この第２のリーディングフレームは、リノール酸イソメラーゼをコードする最
初のオープンンリーディングフレーム（配列番号：１７）から１２２ヌクレオチ
ド下流に位置する。
【０１３０】 ｎＣＬＡ３５５１の第３のオープンンリーディングフレーム（図９、Ｄ）は、
配列番号：１６と相補的なｎＣＬＡ３５５１のストランド上に位置し、ここでは
配列番号：２１として表される。配列番号：２１は、配列番号：１６のヌクレオ
チド位置ないし１ないし７２６と相補的なストランド上に位置し開始コドン２７
５ヌクレオチドは配列番号：１７の推定開始コドンの位置１０００から上流にあ
る。配列番号：２１を有する核酸分子はここではｎＣＳＮ７２６といい、これは
配列番号：２２のアミノ酸配列を有する蛋白質の少なくとも一部をコードする。
配列番号：２２を含む蛋白質のＣ−末端部分は単離されたクローンには存在しな
かった。配列番号：２２を有する２４２アミノ酸残基蛋白質はここではＰＣＳＮ ２４２ という。データーベースサーチ（ＢＬＡＳＴ）はこの第３のＯＲＦの核酸
配列（配列番号：２１）がStaphylococcus pneumoniae（Ｑ０３１５８）からの コンピテンスー特異的ヌクレアーゼ（ＤＮＡエントリーヌクレアーゼ）と約６６
％同一であり、アミノ酸配列配列番号：２２はこのコンピテンスー特異的ヌクレ
アーゼについてのアミノ酸配列に対して約５１−７２％同一であることを示した
。従って、配列番号：１６の相補的ストランド上に同定された第３のＯＲＦがコ
ンピテンスー特異的ヌクレアーゼをコードすることが可能であると考えられる。
【０１３１】 実施例６ 以下の実施例はL. reuteri PYR8ゲノムにおいてイソメラーゼ遺伝子にフラン クする配列のクローニングを示す。
【０１３２】 逆ＰＣＲの第３ラウンドは、実施例５に記載されたごとくLactobacillus reut
eri PYR8からの環状化ゲノムＤＮＡで行った。この第３ラウンドはイソメラーゼ
遺伝子にフランクするより多くの配列をクローンするように設計された。ＣＬＡ
ｏ９およびＣＬＡｏ１０（各々、配列番号：２３および配列番号：２４）と命名
された２つのオリゴヌクレオチドプライマーをこのラウンドのＰＣＲのために設
計した。ＣＬＡｏ９（配列番号：２３）はｎＣＬＡ３５５１の配列の５’末端（
配列番号：１６のヌクレオチド６３−４０）の近くに設計された。ＣＬＡｏ１０
はｎＣＬＡ３５５１配列の３’末端（配列番号：１６のヌクレオチド３５０５−
３５２２）に対応するように設計された。
【０１３３】 より詳しくは、L. reuteri PYR8ゲノムＤＮＡをＳａｌＩで消化し、再度連結 し、オリゴヌクレオチドプライマーＣＬＡｏ９およびＣＬＡｏ１０で増幅した。
約３．５−４．０ｋｂのＰＣＲ産物をｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ ａｍｐ ＳＫ（
＋）にクローンし、配列決定した。この核酸分子をｎＳＡＬ３６８４と命名し、
配列番号：２５によってここでは表わす。
【０１３４】 ｎＳＡＬ３６８４の同一性はプライマーＣＬＡｏ９およびＣＬＡｏ１０にフラ
ンクする配列によって確認された。配列ｎＳＡＬ３６８４はユニークなＳＡＬＩ
部位を含有し、これは逆ＰＣＲ産物の接合点を示す。従って、配列ｎＳＡＬ３６ ４８ をＳａｌＩ部位でスプライスし、ｎＣＬＡ３５５１の配列の３’および５’
末端に付加した（配列番号：１６）。このほぼ７ｋｂ核酸分子をｎＣＬＡ７１１ ３ と命名し、ここでは配列番号：２６によって表す。
【０１３５】 ほぼ７ｋｂ L. reuteri PYR8ゲノムＤＮＡ（配列番号：２６）は、図９に模式
的に示す６つのオープンリーディングフレームを含有する。イソメラーゼ遺伝子
（ＩＳＯＭ）の５’上流に位置する４つのＯＲＦ（Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）および
イソメラーゼ遺伝子の３’下流に位置する１つのＯＲＦがある。
【０１３６】 ｎＣＬＡ７１１３の最初のオープンリーディングフレーム（図９、Ａ）は配列
番号：２６のヌクレオチド位置１ないし９４１にわたり、配列番号：２７によっ
て表される。配列番号：２７を有する核酸分子をここではｎＢＳＰ９４１といい
、これは配列番号：２８のアミノ酸配列を有する約３１２アミノ酸残基の蛋白質
をコードする。配列番号：２８を有する蛋白質をここではＰＢＳＰ３１２という
。データーベースサーチ（ＢＬＡＳＴ）は、この最初のＯＲＦ Ａ（配列番号：
２７）によってコードされた蛋白質のアミノ酸配列（配列番号：２８）は Bacil
lus subtilis（ｐ５４４２５）からのペルメアーゼに対して（標準的なＢＬＡＳ
Ｔパラメーターを用いて）約５６％同一であり、７４％同様であることを示した
。従って配列番号：２６の最初のＯＲＦ Ａはペルメアーゼをコードする可能性
があると考えられる。
【０１３７】 ｎＣＬＡ７１１３の第２のオープンリーディングフレームは配列番号：２６の
ヌクレオチド位置１１４６ないし１７４５にわたり、配列番号：２９によって表
される。配列番号：２９を有する核酸分子はここではｎＵＮＫ２６００といい、
これは配列番号：３０のアミノ酸配列を有する約１９９アミノ酸残基の蛋白質を
コードする。配列番号：３０を有する蛋白質をここではＰＵＮＫ２１９９という
。ＰＵＮＫ２１９９の機能は知られていない。ｎＵＮＫ２６００の配列を相同性
につき既知の配列と比較し、有意な相同性は確認されなかった。標準的な欠陥を
用いる最高のＢＬＡＳＴＰスコアは５１であった。
【０１３８】 ｎＣＬＡ７１１３の第３のオープンリーディングフレーム（図９、Ｃ）は配列
番号：２６のヌクレオチド位置１７４２ないし２５９０にわたり、配列番号：３
１によって表される。配列番号：３１を有する核酸分子をここではｎＵＮＫ３８ ４９ といいこれは配列番号：３２のアミノ酸配列を有する約２８２アミノ酸残基
の蛋白質をコードする。配列番号：３２を有する蛋白質をここではＰＵＫＮ３２ ８２ という。ＰＵＫＮ３２８２の機能は知られていない。ｎＵＮＫ３８４９の配
列を相同性につき既知の配列と比較し、有意な相同性は確認されなかった。標準
的な欠陥を用いる最高のＤｌａｓｔｐスコアは６８であった。
【０１３９】 ｎＣＬＡ７１１３の第４のオープンンリーディングフレーム（図９、Ｄ）は配
列番号：２６のヌクレオチド位置２６６２ないし３４０５にわたり、配列番号：
３３によって表される。配列番号：３３を有する核酸分子をここではｎＣＳＮ７ ４４ といい、これは配列番号：３４のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする
。配列番号：３４を有する２４７アミノ酸残基蛋白質をここではＰＣＳＮ２４７
という。実施例５で前記したＰＣＳＮ２４２（配列番号：２２）（ｎＣＬＡ３５ ５１ で同定された第３のＯＲＦ）はＰＣＳＮ２４７に含まれ、配列番号：３４の
アミノ酸位置１ないし２４２にわたる。同様に、ｎＣＳＮ７２６の核酸配列（配
列番号：２１）は配列番号：３３のヌクレオチド１ないし７２６にわたる。デー
ターベースサーチ（ＢＬＡＳＴ）は、アミノ酸配列配列番号：３４が前記したSt
reptococcus pneumoniae コンピテンスー特異的ヌクレアーゼについてのアミノ 酸配列に対して（標準的なパラメーターを用いて）約５７％同一であり、約７１
％同様であることを示した。
【０１４０】 ｎＣＬＡ７１１３の第５のオープンリーディングフレーム（図９、ＩＳＯＭ）
は、実施例５に記載したごとく、本発明のリノール酸イソメラーゼ（ＰＣＬＡ５
９１、配列番号：１８）をコードする核酸分子（ｎＣＬＡ１７７６、配列番号：
１７）である。
【０１４１】 ｎＣＬＡ７１１３の第６のオープンリーディングフレーム（図９、Ｅ）は配列
番号：２６のヌクレオチド位置５５７４−７１１３にわたり、配列番号：３５に
よって表される。配列番号：３５を有する核酸分子をここではｎＵＮＫ１１５４ ０ といい、これは配列番号：３６のアミノ酸配列を有する蛋白質をコードする。
配列番号：３６を有する５５３アミノ酸残基蛋白質をここではＰＵＮＫ１５１３
という。実施例５に記載したＰＵＮＫ１２１８（配列番号：２０）（ｎＣＬＡ３
５５１で確認された第２のＯＲＦ）はＰＵＮＫ１５１３に含まれ、配列番号：３
６のアミノ酸位置１ないし２１８にわたる。同様に、ｎＵＮＫ１６５６の核酸配
列（配列番号：１９）は配列番号：３５のヌクレオチド１ないし６５６にわたる
。ｎＵＮＫ１１５４０の配列を相同性につき既知の配列と比較し、有意な相同性
は確認されなかった。標準的な欠陥を用いるＰＵＮＫ１５１３についての最高の
Ｂｌａｓｔｐスコアは５１であった。ＰＵＮＫ１５１３のＣ−末端配列は不完全
である。
【０１４２】 イソメラーゼ遺伝子は非常にモノシストロンとして転写されるようである。こ
の結論は２つの観察に基づく。まず、イソメラーゼ遺伝子からすぐに上流に位置
するＯＲＦ（図９、Ｄ）は反対のストランドでコードされる。第２に、イソメラ
ーゼ遺伝子の停止コドンから下流の領域に逆反復ＤＮＡ配列が観察された（図１
０）。停止コドン後塩基６で出発するこの２８ヌクレオチド構造（配列番号：３
７）ただ１つのマッチしない塩基を有する。この構造はイソメラーゼ遺伝子のＲ
ＨＯ−依存性ステム−ループ転写ターミネーターとして機能し得た。従って、イ
ソメラーゼ遺伝子はモーシスト論として最も転写されるようであり、イソメラー
ゼ遺伝子から下流のオープンリーディングフレームは別々の転写単位ユニットに
存在するようであると結論される。
【０１４３】 L. reuteriからのリノール酸イソメラーゼは膜蛋白質である。というのは、そ
の活性は細胞蛋白質抽出物の膜画分でほとんど検出され、酵素を可溶化するのに
洗剤が必要であるからである。このデーターと合致して、イソメラーゼＯＲＦの
親水性プロットはアミノ酸残基２７ないし４２のＮ−末端配列に近い主要な疎水
性ドメインを示す。この疎水性ドメインは膜貫通セグメントならびに未切断シグ
ナルペプチドの一部として機能することができ、これは当該蛋白質を膜中に向け
る重要な役割を演じる。また、当該ペプチドはアミノ酸位置８９、１２４、３３
６および４３０において４つのシステイン残基を含有するのを認識するのは興味
深く、これは天然蛋白質が１個または２個の内部ジスルフィド結合を有し得るこ
とを示唆する。
【０１４４】 実施例７ 以下の実施例は E. coli におけるL. reuteri リノール酸イソメラーゼの発現
を示す。
【０１４５】 ２つのオリゴヌクレオチドを合成して（実施例５に記載した）L. reuteri PYR
8ゲノムＤＮＡからのイソメラーゼ遺伝子（プロモーター−ＯＲＦ−ターミネー ター）を増幅した。ヌクレオチドＣＬＡｏ７（配列番号：３８）、順方向プライ
マー、は配列ｎＣＬＡ７１１３の位置３２９６ないし３３１４（配列番号：２６
）に対応し、それは５’末端においてＳａｌＩ部位および３つの過剰な塩基を含
む（下側のケース）： ５’−ｇｃａｇｔｃｇａｃＧＧＡＧＴＴＡＡＧＡＣＴＧＡＡＴＴＡＧ−３’。
【０１４６】 ヌクレオチドＣＬＡｏ８Ｂ（配列番号：３９）、逆方向プライマー、は配列ｎ
ＣＬＡ７１１３の位置５５７７ないし５５９３（配列番号：２６）に対応し、そ
れは５’末端にＳａｌＩ部位および３つの過剰な塩基を含む（下側のケース）： ５’−ｃｔａｇｔｃｇａｃＧＣＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧＡＣ−３’。 ２．３ｋｂのＰＣＲ産物を、Ｓｒｆ１部位において、平滑末端と連結してｐＰＣ
Ｒ−Ｓｃｒｉｐｔ（Ａｍｐ）ＳＫとした。連結したＤＮＡをE. coli細胞に形質 転換した。両方の向きにインサートを持つクローンを選択し、イソメラーゼ遺伝
子の発現につきテストした。構築体＃１（図１）において、イソメラーゼ遺伝子
をｌａｃプロモーターから下流においた。構築体＃２（図１１）において、イソ
メラーゼ遺伝子をｌａｃプロモーターとは逆においた。
【０１４７】 イソメラーゼ活性を検出するために、異なるイソメラーゼ構築体で形質転換し
たE. coli細胞を中期対数相まで増殖させ、ＩＰＴＧにてまたはそれなくして１ ないし３時間誘導し、イソメラーゼ活性検定においてテストするために収穫した
。リノール酸をE. coli細胞と共に（生物変換）または粗製細胞溶解物と共にイ ンキュベートした。脂肪酸をヘキサンによって抽出し、ガスクロマトグラフィー
で分析した。E. coliにおいて両方のプラスミド構築体＃１およびプラスミド構 築体＃２にて、生物変換によってまたは粗製細胞溶解物によってイソメラーゼ活
性は検出されなかった。しかしながら、ＳＤＳ−ゲル分析は、ＩＰＴＧが、構築
体＃１で形質転換した細胞において６７ｋＤ蛋白質の発現を誘導したことを示し
た。予測されるイソメラーゼ蛋白質のサイズはイソメラーゼ遺伝子配列分析から
予測されたものであり、L. reuteri PYR8 から精製された天然イソメラーゼのサ
イズと良好に合致する。触媒活性の欠如は異種系におけるイソメラーゼの正しく
ない折り畳みおよび／または膜挿入の結果であり得る。
【０１４８】 ｐＥＴベクターを用いてイソメラーゼ遺伝子構築体を開発し、ここに、イソメ
ラーゼコーディング配列はＣ−末端においてＨｉｓタグに融合している。Ｈｉｓ
タグに対して特異的な市販の抗体を用い、たとえ酵素が不活性であったとしても
、E. coli、Lactobacillus、Bacillusまたは何れかの他の適当な発現宿主で合成
されたイソメラーゼーＨｉｓタグ融合蛋白質のレベルをウェスタンブロット分析
によってモニターすることが可能であろう。構築体はE. coliプラスミドで作成 されるであろうから、E. coli系を用いて当該方法をテストすることができよう 。イソメラーゼ−Ｈｉｓタグ蛋白質をE. coliで発現させて大量のイソメラーゼ 蛋白質を生産させた。この蛋白質はニッケルカラムでの変性条件下で更に精製し
、L. reuteri PYR8リノール酸イソメラーゼに対して特異的な抗体の生産で用い ることができる。天然宿主および組換え系におけるイソメラーゼ発現をこれらの
抗体でモニターすることができる。加えて、抗体を免疫スクリーニングで用いて
リノール酸イソメラーゼを生産する新しい微生物株を同定し、結局は更なるリノ
ール酸イソメラーゼ遺伝子のクローニングで助力することができる。
【０１４９】 更なる実験において、Ｈｉｓタグを持つＰＹＲ８イソメラーゼ遺伝子（構築体
＃３、図１１）で形質転換し、それを発現するE. coliを標準的な条件下で増殖 させてイソメラーゼ蛋白質の発現を調べた。クーマシーブルー染色ＳＤＳゲル上
で、６０および７０ｋＤの間のバンドが細胞溶解物で支配的であった。このバン
ドは誘導の前でさえ高レベルで存在した。しかしながら、ＩＰＴＧの付加は蛋白
質の非常に強力な過剰生産を誘導した（データーは示さず）。最高発現レベルが
ＩＰＴＧ誘導２時間後に達成された。この蛋白質バンドはウェスタンブロットで
抗−Ｈｉｓタグ抗体によって強力に認識され、これは、この蛋白質が正しいリノ
ール酸イソメラーゼ融合蛋白質に対応することを確認する（データーは示さず）
。
【０１５０】 リノール酸イソメラーゼ遺伝子を発現する細胞をＩＰＴＧ誘導４時間後に収穫
し、分析してイソメラーゼ−Ｈｉｓ融合蛋白質の位置を決定した。図１３は異な
る蛋白質画分の調製のための実験プロトコルの概略を示す。略言すれば、イソメ
ラーゼ−Ｈｉｓタグ融合蛋白質を発現するE. coli細胞をリゾチウムを含む非変 性緩衝液中で溶解させ、音波処理によって破壊した。全細胞溶解物を低速で遠心
して封入体をペレット化した。粗製封入体を０．２５％Ｔｗｅｅｎ２０および０
．１ｍＭ ＥＧＴＡで２回洗浄した。洗浄したペレットに保持された蛋白質は不
適当に折り畳まれたペプチドの高度に不溶性の凝集体であった（封入体）。全細
胞溶解物の低速遠心によって生じた上清を超遠心工程に付して膜（ペレット）を
可溶性蛋白質から分離した。洗剤を用いて膜蛋白質を可溶化し、次いで、これを
超遠心によって他の不溶性膜成分から分離した。全細胞溶解物および異なる蛋白
質画分をＳＤＳゲルにておよびウェスタンブロットによって分析した。イソメラ
ーゼ遺伝子を発現するE. coli細胞の全細胞溶解物において、６０および７０ｋ Ｄの間の蛋白質バンドのみがクーマシー染色後に観察できる。この蛋白質バンド
は封入体画分中に回収され、ウェスタンブロットによってイソメラーゼ−Ｈｉｓ
タグ融合体蛋白質であることが確認された。これらの実験で用いた条件下で、抗
体は、イソメラーゼ遺伝子構築体を含有しないE. coliの細胞溶解物において他 の蛋白質と交差反応しなかった。可溶性および膜画分中の融合蛋白質の量は検出
可能な限界下にあった。封入体画分中の融合蛋白質をＥＧＴＡおよびＴｗｅｅｎ
２０で十分に洗浄して他の汚染蛋白質を除去した。精製したペプチドを用いてＰ
ＹＲ８リノール酸イソメラーゼに特異的な抗体が生産されるであろう。
【０１５１】 本発明のリノール酸イソメラーゼを発現させるための更なる戦略は、限定され
るものではないが、（１）当該配列の単一疎水性ドメインを欠失してイソメラー
ゼを融合蛋白質合成、溶解度およびイソメラーゼ活性の測定で用いる機能的可溶
性蛋白質に変換を試み；（２）イソメラーゼ天然プロモーターの制御下にあるイ
ソメラーゼ−Ｈｉｓタグ融合遺伝子を含めた、天然プロモーターおよび非天然誘
導性または構成的プロモーターを共に用いてL. reuteriにおけるイソメラーゼの
生産のための構築体を開発し；（３）L. reuteri ATCC23272におけるイソメラー
ゼ遺伝子発現の制御のためのエリスロマイシン抵抗性遺伝子からプロモーターを
クローニングし；次いで（４）天然L. reuteri PYR8株中の野生型リノール酸イ ソメラーゼ遺伝子をノックアウトし、該株をクローン化イソメラーゼ遺伝子で形
質転換することによって活性を回収すること含む。この第４の戦略において、プ
ラスミドを生成させて、選択マーカーとしてのエリスロマイシン抵抗性遺伝子に
よって中断された非機能的イソメラーゼ遺伝子を含有する野生型遺伝子をノック
アウトしてある。
【０１５２】 実施例８ 以下の実施例はBacillusにおける本発明のリノール酸イソメラーゼの発現を記
載する。
【０１５３】 Bacillus subtilisおよびBacillus licheniformisにおいて実施例５に記載し たL. reuteri PYR8リノール酸イソメラーゼ遺伝子を発現させるために、２つの オリゴヌクレオチドを合成してL. reuteriゲノムＤＮＡからのイソメラーゼコー
ディング配列を増幅した。順方向プライマー（配列番号：４０）はｎＣＬＡ７１ １３ （配列番号：２６）のヌクレオチド位置３６７８ないし３７０６に対応し、
５’末端にＡＴＧ開始コドンを含有するＮｄｅＩ部位がある（下側ケース）： ５’ｃａｔＡＴＧＴＡＴＴＡＴＴＣＡＡＡＣＧＧＧＡＡＴＴＡＴＧＡＡＧＣ−
３’。
【０１５４】 逆方向プライマー（配列番号：４１）は配列ｎＣＬＡ７１１３のヌクレオチド
位置５５７９ないし５６０２（配列番号：２６）に対応し、５’末端にＢｃｌＩ
部位がある（下側ケース）： ５’ｔｇａｔｃａＴＣＴＡＴＡＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＣＴＧＴＣＡＴＧ−３。
【０１５５】 １．９ｋｂのＰＣＲ産物をＳｒｆＩ部位において平滑末端としてｐＰＣＲ−Ｓ
ｃｒｉｐｔ Ａｍｐ ＳＫにクローンし、E. coli株ＮｏｖａＢｌｕｅの細胞に 形質転換した。この宿主におけるｄａｍメチル化はＢｃｌＩ消化を妨げるので、
組換えプラスミドE. coli株ＧＭ２１６３の細胞に形質転換し、これはｄａｍマ イナス株である。組換えプラスミドＤＮＡを制限酵素ＮｄｅＩおよびＢｃｌＩで
消化し、ＮｄｅＩおよびＤａｍＨｉで消化してあるベクターｐＢＨＡＩに連結し
た。組換えプラスミドＤＮＡをＳａｃＩで消化して該ベクターのE. coli部分を 除去し、再度環状化し、B. subtilis 23856に形質転換した。
【０１５６】 この構築体において、イソメラーゼコーディング配列はＨｐａＩＩプロモータ
ーの制御下に置かれ（図１２、＃１構築体）、その天然リボソーム−結合部位は
ベクター中のカウンターパートによって置き換えられた。形質転換体のクローン
を中期対数相まで増殖させ、次いで、リノール酸の生物変換のために収穫した。
脂肪酸のヘキサン抽出物中でのＧＣ分析によってＣＬＡは検出されなかった。し
かしながら、１時間、２時間および３時間のインキュベーション後に、リノール
酸のレベルは減少し、３時間のインキュベーション後には約４０％であった。全
ての１６のテストしたB. subtilisクローンで同一の結果が観察された。リノー ル酸の使用はクローン化されたイソメラーゼ遺伝子の存在に依存する。というの
はリノール酸のレベルは、プラスミドを含まないB. subtilis野生型細胞および 空のベクターで形質転換した細胞のインキュベーションの間に一定だったからで
ある。イソメラーゼ構築体をB. lichenifornis T399に形質転換すると、同一結 果が観察された。
【０１５７】 リノール酸が使用されてしまう間になぜＣＬＡが蓄積しないかを調べるために
実験を行った。１つの可能性は、リノール酸がＣＬＡに変換され、これが迅速に
代謝されまたは分解されたのではないかということである。これは、B. subtili
sおよびB. licheniformis細胞がＣＬＡを代謝する能力を有することを意味した 。この仮説を検定するために、Bacillus野生型細胞およびイソメラーゼ遺伝子構
築体で形質転換した細胞をL. reuteri PYR8細胞を用いて生物変換で生産された 単一９，１１異性体と共に、および９，１１および他のＣＬＡ異性体を含有する
化学的に構成されたＣＬＡと共にインキュベートした。Bacillus細胞はＣＬＡを
代謝できなかった。粗製細胞抽出では同一の結論が引き出せた。
【０１５８】 更に、イソメラーゼ遺伝子を含有する細胞での生物変換のＧＣスペクトル上で
未知生成物のピーク（保持時間＝２０分）が観察された。また、リノール酸の変
換および未知の産物の形成は１：１の比率であるように見えた。予備的ＧＣ−Ｍ
Ｓ分析は、この産物がヒドロキシル化リノール酸誘導体のそれと合致する分子量
を有することを示した。異なる方法による更なる構造分析は、産物の同一性を決
定するのを助けることができる。
【０１５９】 理論に拘束されるつもりはないが、本発明者らは、この未知の産物がリノール
酸共役の中間体であり得ると信じる。しかしながら、この産物をL. reuteri PYR
8細胞または粗製酵素抽出物と共にインキュベートすると、それはＣＬＡに変換 できなかった。該中間体は共役の間に酵素または膜と結合されているはずであり
、一旦それが放出されると共役は完了できないという可能性がある。
【０１６０】 更なる実験は、Ｈｉｓタグを含む利点を探求するためにベクターｐＬＡＴ１０
に基づいた一連の構築体を開発することを含む（図１２）。ｐＬＡＴ１０はB. s
ubtilisおよびB. licheniformisを直接的に形質転換するのに使用することがで きるプラスミドである。それはα−アミラーゼをコードするＬＡＴ遺伝子のプロ
モーター、コーディング配列およびターミネータ−を有する。また、蛋白質をBa
cillus膜にまたは該膜を横切って移動させるためのシグナルペプチド配列が存在
する。構築体＃２において、イソメラーゼコーディング配列を、そのシグナルペ
プチドへの融合としてアミラーゼプロモーター制御下に置いた。通常、ＬＡＴで
シグナル配列は蛋白質を膜中へまたは膜を横切るように仕向ける。可溶性蛋白質
は、典型的には、培養ブロスにまたはプロセス中に分泌され、シグナルペプチド
は特異的プロテアーゼによって除去される。膜蛋白質は膜まで移動しそれに取り
込まれるであろう。イソメラーゼペプチドの疎水性ドメインはL. reuteriにおい
て未切断シグナル配列および膜貫通セグメント双方として機能できるので、蛋白
質のかかるドメインがBacillusにおいて分泌マシーナリーの適切な機能と干渉し
、ＬＡＴシグナルーイソメラーゼが、適切な立体配座に折り畳まれ得るか否かは
知られていない。構築体＃３において（図１２）、イソメラーゼ遺伝子の全コー
ディング配列はＣ−末端においてＨｉｓタグに融合されており、他方、構築体＃
４において、疎水性ドメインを含まないイソメラーゼ配列がＨｉｓタグに融合さ
れている。構築体＃５および＃６において、分泌シグナルペプチドは除去される
。これらの新しい構築体では、イソメラーゼ蛋白質がＢａｃｉｌｌｕｓ細胞で合
成されるか否か、および何れの細胞画分において蛋白質が位置するかを決定する
ことができる。
【０１６１】 実施例９ 以下の実施例はPropionibacterium acnesからのリノール酸イソメラーゼの精 製を記載する。
【０１６２】 P. acnes ATCC6919はリノール酸から直接ｔ１０，ｃ１２−ＣＬＡを生産する ことが知られている唯一の微生物である。全細胞を用いる実施例１に記載された
実験から、この生物における１０，１２−リノール酸イソメラーゼの存在が確認
された。酵素抽出物はフレンチプレスによって調製された。図１４はP. acnesの
全細胞を用いるリノール酸からのｔ１０，ｃ１２−ＣＬＡの形成を示す。培養を
複合ブレインハートインヒュージョン培地中で静止相まで嫌気的に増殖させ、収
穫し、５００ｐｐｍリノール酸を含有する同培地に再懸濁させた。細胞を雰囲気
温度で震盪しつつ好気的にインキュベートした。リノール酸のレベルは２４時間
中に約５０％減少した。この失われたリノール酸の約半分はｔ１０，ｃ１２−Ｃ
ＬＡとして検出できた。ｃ９，ｔ１１−ＣＬＡは観察されなかった。延長された
インキュベーションではｔ１０，ｃ１２−ＣＬＡのレベルはわずかに変化し、他
方、ほとんど全ての残りのリノール酸は消失した。現在、リノール酸がどのよう
にしてこの生物で代謝されるかは明らかではない。他の実験において、ｔ１０，
ｃ１２−ＣＬＡは濃度が上昇したが、リノール酸の全てがそうであったように後
に完全に消失した（結果は示さず）。これは、ｔ１０，ｃ１２−ＣＬＡが恐らく
はレダクターゼによって更なる代謝に付されることを示唆する。また、リノール
酸はイソメラーゼ以外の酵素に対する基質であり得る。
【０１６３】 酵素抽出物はフレンチプレスによって調製し、図１５に概説したように抽出物
を分画した。画分Ａ中の全イソメラーゼ活性を１００％とすると、９３％を超え
る活性が可溶性蛋白質画分（Ｄ）で検出できた。１％未満のイソメラーゼ活性は
洗浄したペレットまたは膜画分（Ｃ）で見出された。ペレット洗浄および遠心工
程後には、活性のほぼ２％は緩衝液画分（Ｄ）に位置した。かくして、P. acnes
イソメラーゼは、現在までに調べられているL. reuteri PYR8および他の株にお けるイソメラーゼ活性とは異なり明らかに膜蛋白質ではない。
【０１６４】 粗製可溶性酵素調製物を用い、イソメラーゼ活性は一晩の透析によって有意に
は影響されなかった。ＮＡＤ、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰ、ＮＡＤＰＡＨ、ＦＡＤ、Ｆ
ＭＮ、ＡＤＰ、ＡＴＰおよびグルタチオンを含めた、多数の可能な補因子をイソ
メラーゼ活性に対するその効果につきテストした。これらの化合物の何れかでの
６０分検定では有意な効果は観察されなかった。また、カルシウムおよびマグネ
シウムは効果を有しなかった。イソメラーゼ活性は、キレーターＥＤＴＡ（５ｍ
Ｍ）または１，１０−フェナントロリン（１ｍＭ）、またはスルフヒドリル試薬
ｐ−クロロメルクリベンゾエート（５μＭ）またはＮ−エチルマレイミド（１０
０μＭ）によって阻害されなかった。
【０１６５】 粗製抽出物中の酵素活性に対するｐＨの影響を調べた。イソメラーゼ活性は６
．８を中心としたｐＨ最適を呈する（図１６）。
【０１６６】 ＣＬＡの形成は２３４ｎｍの吸光度を測定することによって決定された。図１
７は酵素源として粗製イソメラーゼ抽出物を用いる典型的な経時実験を示す。一
般的に、イソメラーゼは室温での３０ないし６０分間のインキュベーション後に
終点検定を用いて検定した。図１８（異なるリノール酸レベルにおける経時検定
）および図１９（異なるリノール酸レベルにおける終点検定）は、リノール酸の
形成に対する増大する基質濃度の効果を示す。これらのデーターは、P. acnes中
の酵素が、C. sporogenes、L. reuteriおよびB. fibrisolvensのリノール酸イソ メラーゼで観察された同一タイプの基質阻害には従わないことを示唆する。
【０１６７】 イソメラーゼ活性に対する温度の効果は限られた程度しか調査されていない。
該酵素は４℃では非常にゆっくり働き、室温においてかなり良好な活性を示す。
ＣＬＡ形成は室温において３７℃と実質的に同一であった（データは示さず）。
これらの結果は、再度、特定のL. reuteriイソメラーゼで観察されたものとは有
意に異なる。
【０１６８】 P. acnesにおけるリノール酸イソメラーゼの精製を開始した。遠心した粗製抽
出物の調製に続き、試料を幾つかのカラムに適用して適用性および適当な条件を
決定した。これらのパイロット実験の幾つかについての典型的なクロマトグラム
を、各々、ＤＥＡＥおよび疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）につき
図２０および図２１に示す。最初の精製トライアルはＤＥＡＥ、続いてのＨＩＣ
およびゲル濾過クロマトグラフィーよりなるものであった。しかしながら、これ
らの３つのカラム後には、複数のバンドがＳＤＳ ＤＡＧＥで見られた。
【０１６９】 精製におけるこの最初の試みは、分離条件を最適化する必要性を明らかに強調
した。ＤＥＡＥ工程は、塩グラジエントプログラムを改変することによって更に
最適化した。０．１７５Ｍ ＮａＣｌへの直線グラジエントに続き、塩レベルを
７０ｍｌにつきこのレベルに保持した。イソメラーゼはこの時点で溶出し、その
時点後、グラジエントを継続して他の蛋白質を溶出させた。
【０１７０】 イソメラーゼはフェニルＨＩＣカラムに非常にしっかりと結合し、エチレング
リコールで放出されるに過ぎない。しかしながら、非常に多数の他の蛋白質は２
０％エチレングリコールへの段階的暴露でも放出された。ＨＩＣクロマトグラフ
ィー工程は５ないし３０％のエチレングリコールグラジエントの使用によって改
変された。この結果、以前に得られたもの（結果は示さず）よりもイソメラーゼ
につき幾分鋭い溶出プロフィールが得られた。
【０１７１】 ＤＥＡＥおよびＨＩＣクロマトグラフィー後に、クロマトフォーカシングを使
用した。この方法は等電点に基づいて分子を分離する。蛋白質を高いｐＨの弱い
アニオン交換カラムに適用し、より低いｐＨの「Polybuffer」の適用によってｐ
Ｈが減少するに従い溶出させた。予備的実験は、６．５から４．０のｐＨグラジ
エントの結果、４．４あたりのｐＨでイソメラーゼが溶出されることを示した。
明らかに、イソメラーゼはかなり酸性の蛋白質である。
【０１７２】 ＨＩＣクロマトグラフィーに続き、高イソメラーゼ活性を含有する単一の画分
を、２０ｍＭビス−トリス（ｐＨ６．５）で平衡化させたPharmacia Monopクロ マトフォーカシングカラムに適用した。ｐＨグラジエントは１０％Polybuffer74
（ｐＨ４．０）を用いて形成した。結果を図２２に示した。イソメラーゼ活性は
ｐＨ４．５あたりで鋭いピークにて溶出した。活性を含有する３つの画分をＳＤ
Ｓ ＰＡＧＥによって純度につき調べた。画分３２は５０ｋＤａの質量を持つ単
一蛋白質バンドとして１２．５％および２０％ゲル上に出現した。
【０１７３】 この物質をアミノ酸配列決定のために供した。試料をＳＤＳ ＰＡＧＥゲルで
泳動させた後、単一のバンドを移し、UW Medical College of WisconsinでＮ− 末端配列決定を行った。驚くべきことに、幾つかのシグナルが得られ、これは複
数のペプチドの存在を示すか、あるいはペプチドのＮ−末端部分がこの見掛けの
単一バンド中でかなり分解した（というのでもない）ことを示す。精製されたイ
ソメラーゼの引き続いての分析により更に（後記するごとく）蛋白質のＮ−末端
がブロックされたと判断された。
【０１７４】 精製スキームを更に修飾して純粋なイソメラーゼを得るために、従前に使用さ
れたプロトコルを改善し、改良して精製を増強した。前記したごとく、可溶性粗
製抽出物を細胞破壊によって調製した。ＤＥＡＥクロマトグラフィーを用いてこ
の物質を分画した。有意なイソメラーゼ活性を含有する幾つかのランからの画分
をプールし、透析し、同一カラムに再度適用した。活性画分をプールし、（ＮＨ ４ ）２ＳＯ４中で１モラーとし幾つかのランにおいてフェニル疎水性カラムに適
用した。活性画分を濃縮し、要すれば、ＳＤＳ ＰＡＧＥクロマトグラフィーに
よって分析した。高イソメラーゼ活性を有する画分は、この段階で非常に多数の
蛋白質バンドを呈した。ＨＩＣカラムからの選択された画分をプールし、濃縮し
、透析し、クロマトフォーカシングカラムに適用した。蛋白質溶出は、５．５な
いし４．０の以前に使用されたものよりも狭いｐＨグラジエントで達成された。
イソメラーゼ活性は約ｐＨ４．２において鋭いピークとして溶出した。活性画分
はＳＤＳ ＰＡＧＥによって純度につき調べた。この時点において、幾つかの画
分はサイズがほぼ５０ｋＤａの単一バンドを含有するように見える（データーは
示さず）。この物質は現在均一性につき注意深くチェックされている。他の活性
画分は３ないし４の更なるバンドを呈した。これらの画分は、もし更なる精製が
必要であればゲル濾過カラムに適用されるであろう。
【０１７５】 P. acnes リノール酸イソメラーゼのＮ−末端配列決定は完了している。Ｎ− 末端アミノ酸はブロックされており、従って、Ｎ−末端配列は直接的には決定す
ることができない。プロテアーゼでの断片化後に、内部断片はクロマトグラフィ
ーにより分離され、アミノ酸配列が決定されるであろう。該配列が得られると、
実施例５においてL. reuteriリノール酸イソメラーゼにつき記載された、および
後記する方法を用いて、全リノール酸イソメラーゼ核酸およびアミノ酸配列が得
られるであろう。
【０１７６】 Proprionidactium acnesからの１０，１２リノール酸イソメラーゼ遺伝子をク
ローニングするための調製において、ゲノムＤＮＡライブラリが創製されつつあ
る。グラム陽性菌からのＤＮＡ単離のための修飾されたプロトコルを用い、良好
な質のゲノムＤＮＡがP. acnesから単離された。小規模のテストの後、ゲノムＤ
ＮＡをＳａｕ３ＡＩで部分的に消化し、ｄＧＴＰおよびｄＡＴＰで部分的に満た
し、アガロースゲルを通す電気泳動によってサイズ選択し、電気溶出によってア
ガロースゲルから精製した。この精製されたＤＮＡ消化物をBlueStarファージベ
クターのＸｈｏＩ半部位アームに連結されるであろう。ライブラリーの質（組換
えファージの力価およびパーセント）がテストされるであろう。P. acnesリノー
ル酸イソメラーゼの内部断片配列の決定に基づいてオリゴヌクレオチドプローブ
が創製され、それを用いてライブラリをスクリーニングし、配列分析のために１
以上のクローンを単離するであろう。
【０１７７】 実施例１０ 以下の実施例はClostridium sporogenesからのリノール酸イソメラーゼの精製
および特徴付けを記載する。
【０１７８】 本発明者らおよび他の者による従前の仕事は、C. sporogenesがかなりの量の リノール酸をＣＬＡに変換できることを示している。C. sporogenesからのリノ ール酸イソメラーゼは L. reuteri PYR8のそれと非常に同様の活性レベルおよび
特徴を有するようである。以下の実験は、実施例５においてL. reuteriにつき記
載されているごとく、このイソメラーゼ遺伝子をクローンすることを目標とし、
この微生物からのリノール酸イソメラーゼの精製および特徴付けを記載する。次
いで、クローン化C. sporogenesイソメラーゼ遺伝子の活性および機能性が組換 えL. reuteriと比較されるであろう。
【０１７９】 C. sporogenes ATCC25762を嫌気性条件下でブレインハートインヒュージョン ブロス（ＢＨＩ）培地中で増殖させた。細菌増殖は分光光度計にて６００ｎＭで
測定した。細胞を３７℃、ｐＨ７．５で増殖させると、６時間のインキュベーシ
ョン後に静止相に到達した。更にインキュベートした結果、培養が迅速に溶解さ
れた。従って、約６時間の増殖後に培養を収穫した。細胞をペレットを１５ｍＭ
ＮａＣｌを含有する０．１Ｍトリス、ｐＨ６．０で洗浄した。
【０１８０】 ＣＬＡの生物学的形質転換は、２００ｐｐｍリノール酸を含有する新鮮な増殖
培地に収穫された細胞を再懸濁させることによって行った。インキュベーション
後、脂肪酸をヘキサンで抽出し、２１５℃での１４分間の等温プロブラムを用い
てガスクロマトグラフィーによって分析した。図２３Ａ−ＤはC. sporogenesに よるリノール酸の生物変換の経時を示す。再懸濁した細胞を室温（ＡおよびＢ）
または３７℃（ＣおよびＤ）で好気性（図２３ＡおよびＣ）または嫌気性（Ｂお
よびＤ）条件下で増殖させた。リノール酸の同時減少に伴うｃ９，ｔ１１−ＣＬ
Ａの迅速な生産が、全てのテストした条件下で３０分以内に観察された。更にイ
ンキュベートすると、ｃ９，ｔ１１−ＣＬＡを犠牲としてｔ９，ｔ１１−ＣＬＡ
が蓄積した。拡大されたインキュベーション（１５−２０時間）に際して、ｃ９
，ｔ１１−ＣＬＡが消失した。明らかに、ＣＬＡは代謝された。同様の量のＣＬ
Ａが好気性および嫌気性条件下で形成された。
【０１８１】 細胞を図２４に記載したごとくに調製して４つの主要な画分を得た。表１およ
び２は、各々、凍結した細胞からの低塩（１０ｍＭ ＮａＣｌ）で、および新鮮
な細胞からの高塩（５００ｍＭ ＮａＣｌ）で調製された画分におけるイソメラ
ーゼ活性の分布および蛋白質濃度を示す。酵素活性は全ての画分で検出された。
最高の活性は４５ｋ／０．３％ＯＴＧＰ可溶性画分で見出された。洗剤は膜蛋白
質の効果的な可溶化のために高濃度の塩を必要とすることが報告されている。抽
出物緩衝液にＮａＣｌを添加した結果、特異的活性が増大し（表２）、これは高
塩の有効性を示す。特異的活性は低塩洗剤可溶性画分（表２）におけるよりも高
塩洗剤可溶性画分における方が（表３）少なくとも５０倍高かった。活性培養が
貯蔵された条件は活性に影響し得た。これらの結果は、C. sporogenesリノール 酸イソメラーゼがL. reuteri PYR8膜−会合酵素と同様の特性を有することを示 唆した。
【０１８２】
【表１】
【０１８３】
【表２】
【０１８４】 粗製抽出物での温度最適化は４℃、室温、（〜２５℃）および３７℃で行った
。イソメラーゼ活性に対する最良の温度は室温であった（図２５）。イソメラー
ゼ活性は４℃における最適の７３％および３７℃における最適の６３％まで減少
した。最適ｐＨは、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴおよび４０ｐｐｍリノ
ール酸を含む０．１Ｍトリス緩衝液を用いｐＨを５．０から９．０に調整するこ
とによってモニターした。最適ｐＨは、各々、４℃、室温および３７℃でのイン
キュベーションに対し７．５、８．０および９．０であることが判明した（図２
５）。
【０１８５】 リノール酸の濃度は０ないし１００ｐｐｍでテストした（図２６）。リノール
酸についての最適濃度は４０ｐｐｍであると決定された。経時実験は、活性が２
０分内に直線的に応答することを示し、最適ｐＨ、温度および基質濃度における
６０分間のインキュベーションに際してわずかな減少を示した（図２７）。
【０１８６】 別法として、C. sporogenesイソメラーゼを０．１Ｍトリス，ｐＨ７．５、１ ０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴおよび１０％グリセロール中での音波処理に
よって抽出した。この抽出はフレンチプレスによるものよりも高い効率のもので
あった（約２０％）。これはL. reuteriから単離されたイソメラーゼとは異なり
、ここに、音波処理の結果、活性の全てが喪失されたことが観察された。イソメ
ラーゼ活性はトリス緩衝液、ｐＨ７．５におけるよりもリン酸緩衝液、ｐＨ７．
５における方が高かった（図２８）。酵素はリン酸緩衝液中で最も安定であった
。
【０１８７】 洗剤可溶性画分は後出の方法Ａ、ＢまたはＣによって更に精製した。
【０１８８】 方法Ａ ＤＥＡＥ−５ＰＷクロマトグラフィーによるイソメラーゼの精製のための実験
条件は確立されている。これらの条件下で、イソメラーゼの７５％が回収された
。図２９はＯＴＧＰ可溶化蛋白質からのイソメラーゼの精製の外観を与える。こ
れらの実験は同様の結果にて行った：C. sporogenesイソメラーゼは０．５Ｍ ＮａＣｌによってカラムから溶出した。ピーク画分（＃４８ないし＃５１）はカ
ラムに負荷されたイソメラーゼの６０％を含有し、その結果、３２の平均特異的
活性に対して６−倍精製された。カラムを更に１Ｍ ＮａＣｌで溶出させ、ＵＶ
分析によって推定酵素活性を検出し（リノール酸（ＬＡ）はＣＬＡと同一のスペ
クトルを持つ生成物に明らかに変換された）。しかしながら、ＧＣによるこれら
の画分の分析は、変換の主要生成物が１３分の保持時間を有し、他方、ｃ９，ｔ
１１−ＣＬＡの保持時間は約１０分であることを示した。このピークは０．５Ｍ
ＮａＣｌによって溶出されたピークと比較して少量であるが、このデータは、
C. sporogenes細胞がＣＬＡの他の異性体を生成させる能力を有し得ることを示 唆した。新たに調製された抽出物を使用してイオン交換クロマトグラフィーによ
ってイソメラーゼ活性の高い回収を達成することが観察された。何故ならば、洗
剤可溶化蛋白質は活性を失う傾向にあり、あるいはそれは３日を超えての４℃の
貯蔵後に沈殿するからである（データは示さず）。
【０１８９】 （共役脂肪酸結合ならびに他のＵＶ吸収性化合物を検出する）ＯＤ２３４にお
いて吸光度を測定するＣＬＡについての迅速な分光高度法アッセイを用いて、カ
ラム溶出物画分におけるＣＬＡ濃度を見積もった。ＯＤ２３４吸収性物質は更な
る精製を試みる前はＣＬＡであったことを確認するのは重要であった。ガスクロ
マトグラフィーをこの目的で使用した。ＯＤ２３４データーとガスクロマトグラ
フィーによって得られた結果との比較は良好な相関を示し、これは、収集された
「活性」画分が所望のイソメラーゼ活性を含有することを示す。
【０１９０】 イソメラーゼをＤＥＡＥで部分的に精製し、前記したごとく活性は許容される
ように最小の喪失であった。しかしながら、４℃での一晩の貯蔵後にはプールさ
れた酵素画分の活性は５０％だけ減少した。幾つかの実験において、ＤＥＡＥ精
製後には活性は検出されなかった。従って、精製を継続するには酵素活性を維持
するのが重要であろう。
【０１９１】 C. sporogenesリノール酸イソメラーゼは膜蛋白質であることが示された。洗 剤オクチル−チオグリコピラノシド（ＯＴＧＰ）はイソメラーゼを可溶化するの
に成功して用いられてきた。生憎と、ＯＴＧＰ（および可溶化された酵素）は４
℃での精製の間にゆっくりと沈殿した。非変性洗剤である高い塩濃度を持つトリ
トンＸ−１００を通常は用いて末梢および内在性膜蛋白質の間を区別する。１％
トリトンＸ−１００および０．３％ＯＴＧＰの間の可溶化の効率では有意な差異
は見出されなかった。０．１％トリトンＸ−１００および０．３％ＯＴＧＰの混
合物では合計してより少ない全蛋白質が可溶化された。１Ｍ ＮａＣｌ単独によ
る多様化の効率は非常に低く、これは、イソメラーゼが内在性膜蛋白質であるこ
とを示す。
【０１９２】 方法Ｂ C. sporogenesイソメラーゼの活性および安定性を改良するのが明らかに必要 であった。２つの異なる培地ＢＨＩおよびＮＲＳをテストした。結果を図３０に
示す。ｐＨ７．０においてはより高い合計蛋白質が得られたが、より少量のイソ
メラーゼがＭＲＳ培地で生産された。何れかの培地において生産されたイソメラ
ーゼの安定性に差異はなかった。プロテアーゼ阻害剤、ＰＭＳＦ（０．１−１．
０ｍＭ）、ヨードアセトアミド（１ｍＭ）およびペプスタチンＡをイソメラーゼ
の安定性に対するその効果につきテストした。測定可能な利点を与えるものはな
かった。
【０１９３】 リゾホスファチジルコリン（ＬＰＣ）の存在下における可溶化は高い洗剤濃度
が使用されることを可能とし、かくして、より完全な膜蛋白質の可溶化を可能と
する。ＣａＣｌ２は幾つかのヌクレアーゼのごとき酵素を活性化できる。添加さ
れたＣａＣｌ２＋ＬＰＣは洗剤可溶化ナトリウムチャンネル膜蛋白質を可溶化す
ることが示されている。これらの正の効果の何れもリノール酸イソメラーゼで観
察されなかった。更に、ＣａＣｌ２はトリスおよびリン酸緩衝液系の双方におい
て酵素活性を低下させた。３７℃より高い温度において、ＣａＣｌ２は活性に対
して効果を有しないが、イソメラーゼ活性は４２℃および６０℃の温度で５０％
まで低下した（図３１）。
【０１９４】 図３２は酵素活性および安定性に対する鉄−キレート化剤、フェナントロリン
およびＥＤＴＡの効果を示す。粗製抽出物中の酵素はフェナントロリンによって
保護されたようである。１ｍＭ ＥＤＴＡは負の効果を有したが、この保護は、
１ｍＭのフェナントロリンを１ｍＭ ＥＤＴＡと組み合わせた場合により効果的
であった。対照的には、鉄−キレート化剤化合物の洗剤緩衝液への添加の結果、
酵素調製の間に活性が喪失したが、安定性はわずかに増加した（図３３）。
【０１９５】 C. sporogenesから９，１１−リノール酸イソメラーゼを更に精製する努力に 先立って、粗製抽出物および洗剤可溶画分における酵素の安定性を増加させて精
製に必要な手順を完了させることができるように努力がなされた。
【０１９６】 抽出効率および酵素安定性に対する酵素抽出の間に使用されたｐＨおよび緩衝
液のタイプの効果を調べた。粗製抽出物はｐＨ５．０−９．０の０．１Ｍトリス
緩衝液で調製した。抽出の間のｐＨは抽出効率および酵素安定性双方に対して強
力なインパクトを有した。イソメラーゼの抽出のための最適ｐＨは７．５であり
（図３４）、このｐＨにおいて、イソメラーゼの半減期はｐＨ８．０における１
日から１週間に延長された（図３５）。
【０１９７】 また、緩衝液のタイプの効果は有意であった。トリス緩衝液、リン酸カリウム
緩衝液およびＨｅｐｅｓ緩衝液を比較し、結果を図３６に示す。リン酸緩衝液は
イソメラーゼの抽出および可溶化で最も効果的であった。この緩衝液は得られた
活性において区別される増加を生じた。粗製抽出物において、活性はトリスで得
られたものの約２倍であり、洗剤可溶性画分において、４倍ないし７倍の増加が
測定された。更なる改良（図３７）が、ＮａＣｌ（活性の２０％増加）およびグ
リセロール濃度（３０％増加）を増加させることによって得られた。
【０１９８】 酵素安定性をｐＨ７．５で比較した。一般に、イソメラーゼは洗剤可溶化画分
におけるよりも粗製抽出物でより安定であった（図３８）。１０、１１および１
３日の半減期が、各々、トリス、リン酸およびＨｅｐｅｓ粗製抽出物で測定され
た。増大したグリセロールおよび塩濃度は安定性に対して主な改良を与え、その
結果、活性は１週間ほとんど十分に保持された。しかしながら、洗剤可溶化イソ
メラーゼの半減期は、各々、トリスおよびリン酸緩衝液では３日および６日にす
ぎなかった。
【０１９９】 小規模な精製は、前記したごとく０．３％オクチル−チオグリコピラノシド（
ＯＴＧＰ）で可溶化した酵素と共にPharmacia社のDEAE Mono Qカラムを用いて行
い、リン酸緩衝液が前に使用されたトリスを置き換えた。ほぼ２５０ｍＭ Ｎａ
Ｃｌで溶出する活性の単一ピークが得られた（図３９）。この工程後の特異的活
性は２．５倍増加した。この結果は再現性があり、反復可能であった。このカラ
ムからの蛋白質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ほぼ７０ｋＤａの分子量に対応する
バンドを示した（データーは示さず）。分子量はL. reuteriの９，１１−イソメ
ラーゼのそれと同様であり、これは、２つのイソメラーゼが同様の特徴を有し得
ることを示唆する。
【０２００】 ＯＴＧＰはイソメラーゼを可溶化するのに成功して用いられてきた。しかしな
がら、洗剤（および可溶化酵素）は４℃でゆっくりと沈殿する。この沈殿の結果
、透析による酵素溶液の脱塩の後に活性が５０％を超えて喪失したが、より重要
なことには、それはイオン交換カラムを閉塞し、それを使用不可能にする。
【０２０１】 したがって、沈殿の問題を回避しつつイソメラーゼを効果的に可溶化すること
ができる洗剤が求められた。トリトンＸ−１００はイソメラーゼについての可溶
化剤として良好な性能を有し、可溶化された蛋白質の量はトリトンＸ−１００濃
度が増加するに従って増加した。また、イソメラーゼ抽出は高塩濃度（５００ｍ
Ｍ ＮａＣｌ）で増強された。しかしながら、酵素活性はイオン交換前に溶液を
透析すると完全に失われると判断された。低塩濃度の使用の結果、膜ペレットか
ら抽出された蛋白質は少なくなるが、同様の酵素活性となり、脱塩工程の必要性
を排除する。
【０２０２】 ＯＴＧＰで得られたものと同様の抽出効率が、５０ｍＭリン酸緩衝液中の２％
トリトンＸ−１００を用いて達成された。２つの洗剤系における可溶性蛋白質お
よび特異的活性の比較を表４に示す。酵素安定性はＯＴＧＰに関してトリトンで
低下し、これはこの新しい洗剤系の１つの残りの不利である。しかしながら、該
条件は多数工程のクロマトグラフィーによって酵素を精製するための実行可能な
タイムフレームを依然として与えるであろう。イソメラーゼについての継続した
精製スキームは、実施例５および９で記載したイソメラーゼについてなされたよ
うに、ＤＥＡＥクロマトグラフィー、続いてのクロマトフォーカシングである。
【０２０３】
【表３】
【０２０４】 第３の非イオン性洗剤であるオクチルグリコシド（ＯＧ）はC. sporogenesリ ノール酸イソメラーゼを可溶化するその能力につきテストした。ＯＧはイソメラ
ーゼを効果的に可溶化し、可溶化された酵素の活性は安定であった。１．５％に
おけるＯＧ（２×臨界ミセル濃度）は、ＯＴＧＰ可溶化イソメラーゼのそれより
も約２０％高いイソメラーゼ特異的活性を生じた。透析後には可溶化膜蛋白質試
料では沈殿は観察されなかった。
【０２０５】 方法Ｃ ＯＧを用いてリノール酸イソメラーゼを可溶化することができるが、この洗剤
は余りにも高価で大規模なイソメラーゼ精製では使用することができない。リノ
ール酸イソメラーゼを可溶化するプロトコルを修飾してまずＯＧでイソメラーゼ
を可溶化し、次いで、該酵素をＯＴＧＰで可溶化された状態に保った。膜画分を
１５℃の５０ｍＭリン酸カリウム緩衝液中の１．５％ＯＧで可溶化した。２０ｍ
Ｍでリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭジチオス
レイトールおよび０．３％ＯＴＧＰに対してＯＧ可溶化蛋白質を透析した。４５
，０００ｇにおける３０分間の４ラウンドの遠心の後、低塩緩衝液（２０ｍＭ
ビス−トリスｐＨ７．５、１０ｍＭ ＮａＣｌ、０．３％ＯＴＧＰ、１ｍＭジチ
オスレイトール、１ｍＭ ＥＤＴＡおよび１μＭペプスタチンＡ）で平衡化した
ＤＥＡＥ５ＰＷカラムに可溶化蛋白質を適用し、１６℃で０ないし０．５ＭのＮ
ａＣｌの直線グラジエントで溶出した。
【０２０６】 該ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムクロマトグラフィーは４倍の精製を達成した。イソ
メラーゼ活性の２つの区別されるピークが明らかとなった（図４０）。より高い
イオン強度で溶出したピークＩＩが全ての以前のＤＥＡＥクロマトグラフィー実
験で観察された。より低いイオン強度（０．１８Ｍ ＮａＣｌ）で溶出したピー
ク１が最初に観察された。両方のピークは、メチルエステル生成物のＧＣ分析に
よって測定すると、リノール酸からｃ９，ｔ１１−ＣＬＡへの異性化を触媒した
。更なる精製のためにピークＩＩを選択した。
【０２０７】 ＤＥＡＥピークＩＩからの活性な画分（画分４３−４７）をプールし、濃縮し
、０．３％ＯＴＧＰを含有する２５ｍＭビス−トリス、ｐＨ７．１に対して透析
し、次いで、Ｍｏｎｏ−ｐクロマトフォーカシングゲルカラムに負荷した。溶出
は１００ｍｌの１０％ Polybuffer 74で行い、最終ｐＨを３．５まで低下させた
。イソメラーゼ活性はカラムに保持された。Polybuffer 74グラジエントの完了 に続き、イソメラーゼ活性は５０ｍＭビスートリス、ｐＨ７．１中の１Ｍ Ｎａ
Ｃｌで溶出した（図４１）。このクロマトフォーカシング工程は更に２ないし６
倍精製を達成した（表５）。酵素活性を保有するクロマトフォーカシング画分の
ＳＤＳ ＰＡＧＥによる調査は２つの主要なバンドを明らかとした。
【０２０８】
【表４】
【０２０９】 このプロトコルを用いて十分な C. sporogenesリノール酸イソメラーゼ蛋白質
を精製してイソメラーゼについてのＮ−末端配列を決定し、前記したL. reuteri
リノール酸イソメラーゼについて記載したごとく、全酵素を引き続いてクローン
化し配列決定した。
【０２１０】 実施例１１ 以下の実施例はL. reuteri PYR8についての増殖条件の最適化を記載する。
【０２１１】 L. reuteri PYR8についての増殖条件の最適化に発酵作業を集中した。細胞増 殖およびイソメラーゼ生産を終始一貫して支持することができ、かくして、以前
に観察されたばらつきを排除する発酵培地を求めた。
【０２１２】 ＭＲＳ培地で行って、主として細胞増殖に対していくらかの効果を有した培地
組成および滅菌手法により、リノール酸イソメラーゼ活性が変動可能であると判
断された。接種段階の数および接種サイズは最終の細胞濃度に影響しなかった。
培地中のガスバランスに影響すると疑われる混合−対−静的増殖は重要な変数で
あるとは見えなかった。培地の豊富性を仮定すると、幾つかの化合物の特性濃度
は変動についての可能な理由として疑われた。しかしながら、ＭＲＳの異なる希
釈の結果、比例したより低い細胞密度となると測定され（データーは示さず）、
それは倍地中の栄養的限界を示す。加えて、２つのバッチの同一培地を用いると
高い変動性が観察された。
【０２１３】 １リットルおよび１０リットルの発酵器で行った実験は、ＭＲＳと同様な組成
を持つが、より高い酵母エキスペプトンおよびアセテート濃度を持ち、ビーフエ
キスを含まない異なる培地（ＡＶ）は、細胞増殖およびイソメラーゼ活性双方に
関してＭＲＳよりも発酵器で終始一貫して良好な結果を与えた。本発明者らは、
更なる研究のために我々の基礎培地としてこの培地を採用した。その比較を表６
に示す。
【０２１４】
【表５】
【０２１５】 ビタミン混合物はリボフラビン、パントテン酸、ピリドキサール、ニコチン酸
、葉酸、塩化コリン、ビオチンおよびチアミンを含有した。
【０２１６】 十分な因子実験をボトル中で行い、この培地を７つのカテゴリー（酵母エキス
、ペプトン、アセテート、グルコース、Ｔｗｅｅｎ８０、塩およびビタミン）に
分け、以下のごとく各カテゴリーにおける２つの濃度の成分のインパクトを調べ
た：２．５および１０ｇ／ｌ酵母エキス、１０および２０ｇ／１１ペプトン、１
０および２０ｇ／１グルコース、５および１０ｇ／１アセテート、０．５および
１ｍｌ／１ Ｔｗｅｅｎ８０、０．５×および１×塩濃度およびビタミンの添加
無し−対添加有り。この実験は、酵母エキス濃度、続いてグルコースおよびグル
コースおよび酵母エキスの組合せ効果が増殖に対して最も重要なインパクトを有
することを明瞭に示した。ペプトンの効果はわずかであり、その他の成分は増殖
に影響しなかった。Ｔｗｅｅｎ８０の濃度は、リノール酸からＣＬＡへの変換に
よって測定したごとくイソメラーゼ活性に影響するようであった。
【０２１７】 Ｄｉｆｃｏ酵母エキスはＫＡＴ酵母エキスによって首尾よく交換され、幾つか
の産業タイプの窒素源をペプトン＃３の代替としてテストした。これらは表７に
まとめる。
【０２１８】
【表６】
【０２１９】 これらの窒素源のほとんどは L. reuteri PYR8の増殖を支持したが、イソメラ
ーゼ活性は常には検出されなかった。最も有望なもの、Ｎ−Ｚ−アミンＡ、アン
バーフェルム２２３４、アンバーフェルム４０１５、アミソイおよびＨｙ−ソイ
を更に発酵器でテストした。Ｈｙ−ソイはペプトンに対する良好な代替品ではな
く、ペプトンよりも現実には増殖を改良すると判断された。
【０２２０】 ラクトース、フラクトースおよびガラクトースを可能な炭素源としてのグルコ
ースと比較した。生物はフラクトースおよびラクトースでは増殖せず、ガラクト
ースはグルコースよりも優れた何れの利点も供給しなかった。
【０２２１】 ペプトンおよび２０ｇ／ｌまでの増大するレベルの酵母エキスで行った発酵は
、１０ｇ／ｌを超える酵母エキス濃度が以前として役に立つことを示した。発酵
器中での十分な因子実験にて更なる最適化を進行させ、ここに、２つのレベルの
酵母エキス（２０および３０ｇ／ｌ）、Ｈｙ−ソイ（１０および２０／ｌ）およ
びグルコース（２０および３０ｇ／ｌ）の効果を比較した。４．８におけるｐＨ
制御を採用して、より高いグルコース濃度からのより高い酸生産による低いｐＨ
阻害を回避した。これらの発酵からの増殖結果は、条件間に統計学的に有意な差
異がたとえなくても、より高い酵母エキス発酵器の結果、わずかに高い光学密度
が得られる（データーは示さず）ことを示した。高レベルの３つの成分を含む倍
地中での培養はより速く増殖し、より高い細胞密度に到達した。
【０２２２】 ３０ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌ Ｈｙ−ソイおよび３０ｇ／ｌグルコース
を含む培地を更なる最適化工程のために選択した。
【０２２３】 増殖温度およびＴｗｅｅｎ８０濃度の効果を実験した。発酵は１１および１．
５ｍｌ／ｌ Ｔｗｅｅｎ８０および３７℃、４０℃および４３℃で行った。２０
ｇ／ｌにおけるＨｙ−ソイを含む培地を３７℃および４３℃で比較した。増殖お
よび変換結果は、より高い温度が増殖およびイソメラーゼ活性のために役に立つ
ことを明瞭に示した（データーは示さず）。Ｔｗｅｅｎ８０濃度の増加はリノー
ル酸変換に有意にはインパクトを与えなかったようであるが、より高い変換率が
より高いＴｗｅｅｎ８０濃度にて４３℃で観察された。
【０２２４】 ４０℃の温度が好ましい増殖温度として採用され、３０ｇ／ｌ酵母エキス、１
０ｇ／ｌ Ｈｙ−ソイ、３０ｇ／ｌグルコースおよび１．５ｍｌ／ｌ Ｔｗｅｅ
ｎを含有する培地が新しい基礎培地として採用された。発酵のもう１つの組にお
いて、プロセスの再現性を３連発酵器でテストした。また、より高い濃度の酵母
エキス、Ｈｙ−ソイおよびグルコースを４０℃で比較した。
【０２２５】 結果は、最終の細胞密度およびイソメラーゼ活性に関して、良好な再現性がこ
の培地および増殖条件で得ることができることを示した（データーは示さず）。
主要成分の濃度の更なる増加は細胞増殖に好都合であった。１０単位を超える光
学密度が４０ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌ Ｈｙ−ソイおよび４０ｇ／ｌグル
コースで得られた。特異的酵素活性および細胞当たりの活性は全てのこれらの異
なる条件下で同様であった。従って、細胞密度の増加の結果、イソメラーゼ活性
が増加した。
【０２２６】 ３０ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌ Ｈｙ−ソイおよび３０ｇ／ｌグルコース
＋前記したＡＶ培地の更なる成分を含む培地の結果、ＭＲＳで得られたものの２
倍高い細胞密度（ＯＤおよびＤＣＷで測定）、およびかなり信頼のできる性能と
なった。これらの条件では、発酵は静的ボトルにおけるよりも発酵器における方
が終始一貫して良好に行われた。培養を２４および３０時間収穫して、培養年代
の関数としてのイソメラーゼ活性を測定した。テストした培地の何れかに対して
の異なる年代の細胞の間でリノール酸からＣＬＡへの変換速度に差異は見出され
なかった。より短い発酵時間はより高温におけるこの培地でのより速い増殖によ
る。２４時間において、培養は既に静止相に到達していた。
【０２２７】 幾つかの物質を９，１１リノール酸イソメラーゼの可能なインデューサーとし
てテストした。テストした物質はラウリル酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、パ
ルミトイル酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、オレイン酸ステアリルエ
ステル、リノレイルアルコール、リノール酸メチルエステル、リノール酸エチル
エステル、ステアリン酸およびリノール酸メチルエステルを含んだ。それらは１
００ｍｇ／ｌレベルで増殖培地に添加した。何れの化合物でも正の効果は見出さ
れず、それらの幾つかはイソメラーゼの発現および／または活性に対して有害で
あった。正の効果の存在の決定は、それ自体がインデューサーであり得るが、増
殖に必要なので排除することができないＴｗｅｅｎ８０の必要な存在によって曖
昧となり得る。
【０２２８】 実施例１２ 以下の実施例は酵素の安定性および性能を改良するための条件の決定および生
物変換のプロセスの制限をテストすることを記載する。L. reuteri PYR8の全細 胞を後記する全ての生物変換実験で用いた。
【０２２９】 酵素活性の維持の１つの態様は、収穫直後の細胞の取扱いおよび適当な貯蔵条
件の決定である。異なる緩衝液中で維持した細胞における活性の維持を調べ、２
０ｍＭシステインまたは２０ｍＭ ＤＴＴを含むＴＫＭ／ＥＤＴＡ／ＮＡＣｌ（
５０ｍＭトリス・ＨＣｌ、２５ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１．２５ｍ
Ｍ ＥＤＴＡ、０．１ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）のごとき還元された緩衝液
が他の緩衝液または培養培地よりもかなり良好にイソメラーゼ活性を保持すると
判断された。１０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールおよび２ｍＭ ＤＴＴを
含む１００ｍＭビスートリス、ｐＨ５．８（破壊緩衝液）中で維持した細胞は４
８時間以内に何れの活性も喪失しなかった。また、この緩衝液中で測定した生物
変換速度は、反応を行うための好ましい培地として使用された培養培地（ＭＲＳ
）中で測定したものと非常に似ていると判断された。
【０２３０】 イソメラーゼ活性は細胞ペーストを凍結することによっても調製するこができ
た。ＭＲＳまたは破壊緩衝液何れかで洗浄してまたは洗浄することなく収穫した
直後に、細胞ペーストを凍結した。差異は観察されなかった。収穫しまたは収穫
することなく細胞を直接的に培養中で保持すると、幾つかの興味ある結果が得ら
れた。収穫直後の細胞、収穫され、かつ４℃で２４時間細胞ペーストとして（洗
浄なし）維持した細胞、培養ブロスにおいて収穫することなく４℃で２４時間保
持した細胞、および室温で２４時間保持した細胞ブロスからの細胞における活性
の間で比較を行った。リノール酸のＣＬＡへの変換は各場合で非常に似ており、
室温で１日維持された細胞でわずかな減少が観察されたに過ぎない。
【０２３１】 もう１つの実験において、イソメラーゼ活性は収穫後に種々の方法で取り扱わ
れた細胞で追跡した。細胞をＭＲＳ、破壊緩衝液または培養上清（５．８に調整
されたｐＨ）に再懸濁した。１００ｐｐｍリノール酸の変換と比較した、イソメ
ラーゼ活性は収穫直後、４℃で２４時間保持した後、および２２℃での４時間、
続いて４℃での２０時間後において細胞で測定した。これらの異なる実験からの
結果は、細胞を厳格に非増殖条件下で維持した場合に酵素活性が良好であること
を示した（データは示さず）。幾つかの反復実験において、ＭＲＳに再懸濁した
細胞は破壊緩衝液に再懸濁した細胞よりも変動する結果を与えた。ＭＲＳ中の細
胞を室温に維持した場合、劣化が顕著でさえあった。破壊緩衝液は良好な酵素安
定性のため生物変換を行うための選択培地として選択した。また、細胞は発酵の
終わりに到達した低ｐＨにおける培養ブロスにおける収穫に先立って維持できる
。
【０２３２】 調べた生物形質転換のもう１つの態様は油、水相および膜結合酵素の間の質量
移動制限の可能な存在であった。実験はリノール酸の添加の異なる方法を用い、
異なる撹拌速度で撹拌されたジャー中で異性化反応を行うことによって行った。
【０２３３】 プロピレングリコール（１００ｍｇ／ｍｌ溶液）に溶解させた、または０．５
、５または３０％レシチンに乳化させた９９％ＬＡとして添加した。エマルジョ
ンは、リノール酸およびレシチンを細胞の添加前に反応培地とブレンドすること
によって調製した。リノール酸は１０００および２０００ｐｐｍにて添加した。
結果は、純粋な酸またはプロピレングリコール溶液の間に有意な差異はなく、酸
をレシチンで乳化した場合に反応はわずかにブロスよりも速かったことを示した
（データは示さず）。高レベルのレシチンは最終変換に負に影響するようであっ
た。
【０２３４】 ２つの生物変換反応は３００ｍｌの反応培地内で撹拌されたジャー中で行った
。元の培養密度に対して１０倍まで細胞を濃縮した。反応はＭＲＳ中、６℃およ
び８℃の間で行い、リノール酸をプロピレングリコールに溶解させて添加した。
１０００ｐｐｍを時間０およびもう１つの１０００ｐｐｍにて２時間において添
加した。撹拌を１つのリアクター中にて２００ｐｐｍ、および他のリアクター中
にて１０００ｐｐｍにて維持した。結果は、２つの条件の間で有意な差異はなか
ったことを示した。これらの実験は、質量移動制限はこの酵素で実行する場合に
主要な問題がないことを示した。
【０２３５】 酵素効率に対する基質および生成物の効果も調べ、ならびに細胞をリサイクル
する可能性も調べた。反応に対するＣＬＡの効果は、異なる濃度の異性体の混合
物（Ｓｉｇｍａ物質、ほぼ４１％９，１１異性体および４８％１０，１２ＣＬＡ
）、または丁度９，１１ＣＬＡ（Ｍａｔｒｅｙａ物質、ほぼ７７％９，１１ＣＬ
Ａ）何れかを添加することによって実験した。５００ないし３０００ｐｐｍの濃
度をテストした。また、L. reuteri PYR8での以前の生物変換反応からのブロス をリサイクリングして、幾つかの実験を行い、その結果、７００ｐｐｍあたりの
初期ＣＬＡ濃度となった。各場合において、１０００ｐｐｍリノール酸を添加し
た。ＳｉｇｍａおよびＭａｔｒｅｙａ ＣＬＡ双方にて、反応はテストした最低
濃度でさえ完全に阻害され、リノール酸およびＣＬＡは反応が続く４時間にわた
って一定のままであった。同一期間において、リノール酸のほとんど完全な変換
は外因性ＣＬＡなくしての制御で得られた。しかしながら存在するＣＬＡがリサ
イクルされた反応ブロスに由来する場合は効果は得られなかった。この場合、Ｃ
ＬＡ存在無しおよび７００ｐｐｍの間には変換速度に差異はなかった。結果は、
化学的に生産されたＣＬＡに存在する不純物のいくらかが産物それ自体よりも９
，１１イソメラーゼのより強い阻害であり得ることを示し得る。
【０２３６】 ３つの別々の実験を行い、ここに、最初の生物変換工程後に細胞をリサイクル
した。最初の実験において、１０００ｐｐｍリノール酸での生物変換工程はＭＲ
Ｓおよび破壊緩衝液双方において３時間以内に完了した。リノール酸の９８−９
９％は９，１１ＣＬＡに変換された。遠心によって細胞を回収し、同一培地に再
懸濁し、１０００ｐｐｍリノール酸を添加し、反応を更に３時間進行させた。非
常に良好な変換が各場合に得られた（データは示さず）。
【０２３７】 第２の実験において、細胞サイクルは異なるレベルのリノール酸で生物変換を
行った細胞につき実験した。細胞を収穫し、１０倍濃度の破壊緩衝液に再懸濁し
、リノール酸を１０００、１５００、２０００、２５００および３０００ｐｐｍ
レベルで添加した。より高いリノール酸を仮定すると、反応は６時間進行させた
。その時点において、細胞を遠心によって回収し、緩衝液で洗浄して未反応のリ
ノール酸およびＣＬＡを（少なくとも部分的に）除去し、全ての細胞を匹敵する
条件下に置いた。１０００ｐｐｍリノール酸を添加し、反応を４時間続けた。最
初の段階の間で得られた変換およびＣＬＡ濃度は、良好な活性を持つ細胞では、
基質阻害は３０００ｐｐｍリノール酸までは検出されなかったことを示した。よ
り高いリノール酸での反応は７時間以内までには完了に達しなかったが、ＣＬＡ
の形成速度は異なる基質濃度において非常に似ていた。しかしながら、細胞をリ
サイクルし第２段階でリノール酸を供給すると、それが暴露されたリノール酸レ
ベルにはかかわらず、反応は起こらず、かつ何れの細胞においてもイソメラーゼ
活性は検出されなかった。リノール酸に暴露されなかった同一ロットからの細胞
は２４時間後に十分な活性を維持した。
【０２３８】 これらの結果は、観察された活性の喪失に関して反応混合物への暴露の長さを
調査する必要性を促進した。反応を行わなかった細胞において活性が失われなか
ったので、何れかの基質、または最もありそうなのは産物が酵素と相互作用し、
その活性に影響し得ることが明らかである。
【０２３９】 第３のリサイクル実験において、細胞を通常に濃縮し、反応は２０００ｐｐｍ
で開始した。反応が進行する間、２時間ないし８時間までごとにアリコットを採
取し、１つの最終試料は２５時間において採取した。各アリコットからの細胞を
遠心によって回収し、緩衝液に再懸濁させた。１０００ｐｐｍリノール酸を添加
した。ついで、反応を３時間続けた。結果は、活性が細胞においてゆっくりと失
われてつつあることを明瞭に示した。反応は第１段階で経時的に遅くなり、細胞
を新鮮な反応培地に入れた場合には活性は回収されなかった。２時間後のリサイ
クルした細胞は非常に良好な活性を有し、１０００ｐｐｍのリノール酸をＣＬＡ
にすばやく変換できたが、８時間のちにリサイクルした細胞は活性を有しなかっ
た。再度、２５時間後に対照（反応無し）において十分な活性は維持されなかっ
た。
【０２４０】 この実験は、酵素が反応の間に不活化されるか、あるいは基質に接近できなく
なるという明瞭な証拠を提供した。理由は明らかではないが、生成物との相互作
用が示唆される。というのは活性は生成物が蓄積すると共に失われるようだから
である。もしこの時点でこの相互作用の性質は明らかではなく、またそれが酵素
または細胞の物理的条件に直接的に関連するかは明らかではない。この効果をも
っと理解するためには固定化酵素での実験が必要であろう。
【０２４１】 実施例１３ 以下の実施例は好ましい生物変換プロトコルを記載する。
【０２４２】 Lactobacillus reuteri（またはリノール酸イソメラーゼ遺伝子を担うもう１ つの生物）の細胞を、４０ｇ／ｌ酵母エキス、２０ｇ／ｌ Ｈｙ−ソイおよび４
０ｇ／ｌグルコースを含む修飾されたＡＶ培地（または他の生物のための他の適
当な培地）中で約３−４ｇ／ｌ乾燥細胞重量の細胞密度まで増殖させる。細胞が
静止相に到達すると、それを収穫し、１リットル当たり５および２０ｇの間の乾
燥細胞重量の濃度の破壊緩衝液に再懸濁させた。生物変換反応は、好ましくは、
４℃および８℃の間で行って酵素活性を維持すべきである。リノール酸は９９％
油として、もう１つの油の成分として、油相として添加することができるか、あ
るいはプロピレンングリコールのごとき共溶媒に溶解させることができる。それ
は０．５および４ｇ／ｌの間の濃度で添加することができる。添加は、好ましく
は、より少量の幾つかの工程で行うべきである。より高いＣＬＡ濃度を得るには
、反応が進行する間に順次の工程で細胞を添加することもできる。これらの条件
下、かつこれらのリノール酸濃度において、８０％および１００％の間のリノー
ル酸からＣＬＡへの変換が２ないし８時間以内に予測される。
【０２４３】 実施例１４ 以下の実施例はP. acnes全細胞でのリノール酸から１０，１２ＣＬＡへの生物
変換を記載する。
【０２４４】 これらの実験の目的は１０，１２リノール酸イソメラーゼの挙動の特徴付けを
開始し、その性能を増強させる条件を決定することであった。
【０２４５】 P. acnesは現在使用されている培地中での増殖が非常に貧弱である厳格な嫌気
性生物である。幾つかの以前の実験は、P. acnesが１０，１２ＣＬＡを更に代謝
できないことを示唆した。新しい実験はこれが当てはまるが、反応の条件に依存
し得る遅いプロセスのようであることを示した。培地で達成される現在の細胞濃
度、および細胞の９，１１ＣＬＡ異性体の生産で使用される同一の生物変換プロ
トコル（１０倍濃度の細胞、緩衝液への再懸濁、プロピレングリコールに溶解さ
せたリノール酸の添加）では、反応は９，１１イソメラーゼのそれよりもかなり
低い速度で進行し、かなり遅い変換が達成されることに注意しなければならない
。
【０２４６】 反応は異なる温度において、空気の存在および不存在において、培養培地−対
−破壊緩衝液中で比較した。温度は反応速度に強力な効果を有した。反応は４℃
では非常に遅く進行し、該速度は室温から３７℃への温度に伴って増加した。増
殖培地または緩衝液の使用、あるいは反応が進行するのを可能とするタイムフレ
ーム（３０時間）の間における酸素の存在または不存在の間で有意な変換の差異
は見出されなかった（データーは示さず）。
【０２４７】 異なる細胞および基質濃度での更なる実験は、反応が４８時間を超えて進行し
た場合にＣＬＡ濃度の明らかな減少を示し、他方、リノール酸からのＣＬＡの形
成はその時点で停止したようであった。
【０２４８】 当業者であれば、本発明の好ましい実施形態に対して多数の変形および修飾を
なすことができ、かかる変形および修飾は本発明の精神を逸脱することなくなす
ことができるのを認識するであろう。従って、添付の請求の範囲は本発明の真の
精神および範囲内にある全てのかかる同等の変形を網羅することを意図する。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａは好気性条件下でのClostridium sporogenes ATCC25762によるリノール
酸からのＣＬＡの全細胞生物変換を示す線グラフである。 図１Ｂは嫌気性条件下でのClostridium sporogenes ATCC25762によるリノール
酸からのＣＬＡの全細胞生物変換を示す線グラフである。
【図２】 図２Ａは好気性条件下でのC. bifermentans ATCC638によるリノール酸からの ＣＬＡの全細胞生物変換を説明する線グラフである。 図２Ｂは嫌気性条件下でのC. bifermentans ATCC638によるリノール酸からの ＣＬＡの全細胞生物変換を説明する線グラフである。
【図３】 図３ＡはPropionibacterium jensenii ATCC14073によるリノール酸からのＣＬ
Ａの全細胞生物変換を示す線グラフである。 図３ＢはP. acnes ATCC6919によるリノール酸からのＣＬＡの全細胞生物変換 を示す線グラフである。
【図４】 図４はP. aciditropionici ATCC25562によるリノール酸からのＣＬＡの全細胞
生物変換を証明するグラフである。
【図５】 図５はL. reuteri PYR8によるリノール酸からのＣＬＡの全細胞生物変換を説 明する線グラフである。
【図６】 図６はL. reuteri PYR8による洗剤可溶化イソメラーゼのＤＥＡＥクロマトグ ラフィーを示す線グラフである。
【図７】 図７はL. reuteri PYR8によるイソメラーゼ活性のヒドロキシアパタイトクロ マトグラフィーを示す線グラフである。
【図８】 図８はL. reuteri PYR8によるリノール酸イソメラーゼ活性のクロマトフォー カシングを示す線グラフである。
【図９】 図９はL. reuteri PYR8におけるリノール酸イソメラーゼ遺伝子およびフラン キングオープンリーディングフレームの模式図である。
【図１０】 図１０はリノール酸イソメラーゼ遺伝子における推定転写ターミネーターの模
式図である。
【図１１】 図１１はE. coliにおけるリノール酸イソメラーゼ発現のための幾つかの構築 体の説明図である。
【図１２】 図１２はBacillusにおけるリノール酸イソメラーゼ発現のための幾つかの構築
体の説明図である。
【図１３】 図１３は組換えリノール酸イソメラーゼを発現したE. coliの異なる蛋白質画 分の調製用の実験プロトコルのフローダイアグラムである。
【図１４】 図１４はP. acnesの全細胞を用いるリノール酸からのｔ１０，ｃ１２−ＣＬＡ
の形成を示す線グラフ出有る。
【図１５】 図１５はP. acnes ATCC6919のための細胞分画プロトコルを示すフローダイア グラムである。
【図１６】 図１６はP. acnes ATCC6919の粗製抽出物中のリノール酸イソメラーゼ活性に 対するｐＨの効果を示す線グラフである。
【図１７】 図１７はP. acnes ATCC6919の粗製抽出物におけるＣＬＡ形成の経時を示す線 グラフである。
【図１８】 図１８は異なるレベルのリノール酸におけるP. acnes ATCC6919の粗製抽出物 におけるＣＬＡの形成についての経時を示す線グラフである。
【図１９】 図１９は異なるレベルのリノール酸におけるP. acnes ATCC6919の粗製抽出物 におけるＣＬＡの形成についての終点を示す線グラフである。
【図２０】 図２０はP. acnes ATCC6919からの全可溶性蛋白質のＤＥＡＥイオン交換クロ マトグラフィーを説明するグラフである。
【図２１】 図２１はP. acnes ATCC6919からの全可溶性蛋白質の疎水性相互作用クロマト グラフィーを説明するグラフである。
【図２２】 図２２はP. acnes ATCC6919からのイソメラーゼ活性のクロマトフォーカシン グを説明するグラフである。
【図２３】 図２３Ａは室温での好気性条件下におけるC. sporogenes ATCC25762によるＣ ＬＡ形成の経時を示すグラフである。 図２３Ｂは室温での嫌気性条件下におけるC. sporogenes ATCC25762によるＣ ＬＡ形成の経時を示すグラフである。 図２３Ｃは３７℃での好気性条件下におけるC. sporogenes ATCC25762による ＣＬＡ形成の経時を示すグラフである。 図２３Ｄは３７℃での嫌気性条件下におけるC. sporogenes ATCC25762による ＣＬＡ形成の経時を示すグラフである。
【図２４】 図２４はC. sporogenes ATCC25762についての抽出プロトコルを示すフローダ イアグラムである。
【図２５】 図２５はC. sporogenes ATCC25762におけるリノール酸イソメラーゼの最適ｐ Ｈおよび温度を示す線グラフである。
【図２６】 図２６はC. sporogenes ATCC25762リノール酸イソメラーゼについての最適リ ノール酸濃度を示す線グラフである。
【図２７】 図２７はC. sporogenes ATCC25762リノール酸イソメラーゼによるＣＬＡ形成 についての経時を示すグラフである。
【図２８】 図２８はトリスおよびリン酸緩衝液中でのC. sporogenes ATCC25762リノール 酸イソメラーゼの安定性を示す棒グラフである。
【図２９】 図２９はＤＥＡＥ−５ＰＷからの新鮮なC. sporogenes ATCC25762リノール酸 イソメラーゼ抽出物の溶出プロフィールである。
【図３０】 図３０はC. sporogenes ATCC25762増殖およびリノール酸イソメラーゼ活性に 対する培養培地の効果を示す棒グラフである。
【図３１】 図３１はC. sporogenes ATCC25762リノール酸イソメラーゼ活性に対するＣａ Ｃｌ２の効果を示す棒グラフである。
【図３２】 図３２はC. sporogenes ATCC25762に対するキレート化剤の効果を示す棒グラ フである。
【図３３】 図３３はリノール酸イソメラーゼの安定性に対するキレート化剤の効果を示す
棒グラフである。
【図３４】 図３４はC. sporogenes ATCC25762におけるリノール酸イソメラーゼの抽出効 率に対するｐＨの効果を説明する線グラフである。
【図３５】 図３５はC. sporogenes ATCC25762におけるリノール酸イソメラーゼの半減期 −対−ｐＨを示す線グラフである。
【図３６】 図３６はC. sporogenes ATCC25762におけるリノール酸イソメラーゼの活性に 対する緩衝液系の効果を示す棒グラフである。
【図３７】 図３７はC. sporogenes ATCC25762におけるリノール酸イソメラーゼの粗製抽 出物の安定性に対するグリセロールおよび塩濃度の効果を説明する線グラフであ
る。
【図３８】 図３８はC. sporogenes ATCC25762における洗剤可溶化リノール酸イソメラー ゼの安定性を示す線グラフである。
【図３９】 図３９はＤＥＡＥ Ｍｏｎｏ Ｑに対するC. sporogenes ATCC25762リノール 酸イソメラーゼの溶出プロフィールである。
【図４０】 図４０はＤＥＡＥ−５ＰＷカラムでのC. sporogenes ATCC25762洗剤可溶化リ ノール酸イソメラーゼの溶出プロフィールである。
【図４１】 図４１はクロマトフォーカシングによる部分的に精製されたC. sporogenes AT
CC25762リノール酸イソメラーゼの分離を示す溶出プロフィールである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 11/00 Ｃ１２Ｎ 13/00 ４Ｂ０６５ 13/00 Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｚ ４Ｈ０４５ Ｃ１２Ｐ 1/04 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 グランド、アラン・ディー アメリカ合衆国、ウィスコンシン州 54220 マニトウォック、リンドバーグ・ ドライブ 3213 (72)発明者 デン、ミン−デ アメリカ合衆国、ウィスコンシン州 54220 マニトウォック、ウエスト・ホワ イトテイル・コート 4725 (72)発明者 サンチェズ−リエラ、フェルナンド アメリカ合衆国、ウィスコンシン州 54220 マニトウォック、エヌ・シックス ティーンス・ストリート 1309 Ｆターム(参考） 4B024 AA03 AA05 BA07 CA03 CA06 DA05 DA06 DA07 EA04 FA01 GA11 GA19 HA01 HA12 4B026 DC05 DG01 DG02 DG04 DG05 DG06 DG08 DG09 DG10 DG14 DL09 4B033 NA01 NA12 NA35 NA39 NB22 NB25 NB26 NB34 NB36 NB48 NB50 NB54 NB57 NB58 NC05 NC06 NC07 ND01 ND09 ND11 4B050 CC04 DD02 EE10 FF11E LL02 LL05 4B064 AD87 CA02 CA19 CA21 CB28 CC21 CC24 CD07 DA10 4B065 AA01X AA01Y AA19X AA23X AA23Y AA26X AA30X AA30Y AB01 AC14 BA02 BB10 BB26 BC41 BC43 BC45 BC47 CA13 CA27 CA41 4H045 AA11 BA10 CA11 DA75 DA76 DA89 FA73 FA74 GA23

Claims (99)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離されたリノール酸イソメラーゼ。
  2. 【請求項２】 該リノール酸イソメラーゼがLactobacillus、Clostridium、
    Propionibacterium、ButyrivibrioおよびEubacteriumリノール酸イソメラーゼよ
    りなる群から選択される請求項１記載のリノール酸イソメラーゼ。
  3. 【請求項３】 該リノール酸イソメラーゼがLactobacillus reuteri、Clost
    ridium sporogenes、Propionibacterim acnes、Butyrivibrio fibrisoves、Prop
    ionibacterium acidipropionici、Propionibacterium freudenreichiiおよびEub
    acterium lentumのリノール酸イソメラーゼ類よりなる群から選択されるリノー ル酸イソメラーゼ。
  4. 【請求項４】 該リノール酸イソメラーゼがLactobacillus reuteriリノー ル酸イソメラーゼである請求項１記載のリノール酸イソメラーゼ。
  5. 【請求項５】 該リノール酸イソメラーゼがClostridium sporogenesリノー
    ル酸イソメラーゼである請求項１記載のリノール酸イソメラーゼ。
  6. 【請求項６】 該リノール酸イソメラーゼがPropionibacterium acnesリノ ール酸イソメラーゼである請求項１記載のリノール酸イソメラーゼ。
  7. 【請求項７】 該リノール酸イソメラーゼがリノール酸およびリノレン酸を
    ＣＬＡに変換する請求項１記載のリノール酸イソメラーゼ。
  8. 【請求項８】 該リノール酸イソメラーゼがリノール酸およびリノレン酸を
    （シス、トランス）−９，１１−リノール酸に変換する請求項１記載のリノール
    酸イソメラーゼ。
  9. 【請求項９】 該リノール酸イソメラーゼが約６７ｋＤａである請求項８記
    載のリノール酸イソメラーゼ。
  10. 【請求項１０】 該リノール酸イソメラーゼがリノール酸およびリノレン酸
    を（トランス、シス、）−１０，１２−リノール酸に変換する請求項１記載のリ
    ノール酸イソメラーゼ。
  11. 【請求項１１】 該リノール酸イソメラーゼが約５０ｋＤａである請求項１
    ０記載のリノール酸イソメラーゼ。
  12. 【請求項１２】 該リノール酸イソメラーゼが約６．８のｐＨ最適値を有す
    る請求項１０記載のリノール酸イソメラーゼ。
  13. 【請求項１３】 該リノール酸イソメラーゼが少なくとも約１０００ナノモ
    ルｍｇ−１分−１の特異的リノール酸異性化活性を有する請求項１記載のリノー
    ル酸イソメラーゼ。
  14. 【請求項１４】 該リノール酸イソメラーゼがリノール酸につき約８．１μ
    ＭのＫｍ；約７．５のｐＨ最適値；およびオレイン酸につき約８０μＭを有する
    請求項１記載のリノール酸イソメラーゼ。
  15. 【請求項１５】 該リノール酸イソメラーゼの初期速度が約６０μＭリノー
    ル酸において減少する請求項１記載のリノール酸イソメラーゼ。
  16. 【請求項１６】 該リノール酸イソメラーゼが膜結合酵素である請求項１記
    載のリノール酸イソメラーゼ。
  17. 【請求項１７】 該リノール酸イソメラーゼが可溶性酵素である請求項１記
    載のリノール酸イソメラーゼ。
  18. 【請求項１８】 該リノール酸イソメラーゼが更に液体物質を含む請求項１
    記載のリノール酸イソメラーゼ。
  19. 【請求項１９】 該リノール酸イソメラーゼが、ストリンジェントハイブリ
    ダイゼーション条件下で配列番号：４、配列番号：８、配列番号：１０、配列番
    号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：
    ２６よりなる群から選択される相補体を含む核酸分子にハイブリダイズする核酸
    分子によってコードされるアミノ酸配列を含む請求項１記載のリノール酸イソメ
    ラーゼ。
  20. 【請求項２０】 該リノール酸イソメラーゼが、核酸配列：１７との１００
    ％同一性を有する少なくとも２４個の隣接ヌクレオチドを含む核酸配列を含む核
    酸分子によってコードされる請求項１記載のリノール酸イソメラーゼ。
  21. 【請求項２１】 該リノール酸イソメラーゼが、配列番号：４、配列番号：
    ８、配列番号：１０、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列
    番号：１７および配列番号：２６よりなる群から選択される核酸配列を含む核酸
    分子によってコードされる請求項１記載のリノール酸イソメラーゼ。
  22. 【請求項２２】 該リノール酸イソメラーゼが核酸配列：１７を含む核酸分
    子によってコードされる請求項１記載のリノール酸イソメラーゼ。
  23. 【請求項２３】 該リノール酸イソメラーゼが、配列番号：１、配列番号：
    ５、配列番号：９、配列番号：１１および配列番号：１８よりなる群から選択さ
    れるアミノ酸配列との少なくとも約７０％同一性を持つアミノ酸配列を含む請求
    項１記載のリノール酸イソメラーゼ。
  24. 【請求項２４】 該リノール酸イソメラーゼが配列番号：１、配列番号：５
    、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１８よりなる群から選択されるア
    ミノ酸配列、および配列番号：１、配列番号：５、配列番号：９、配列番号：１
    １、配列番号：１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列の相同体を含み、該
    同一性が配列番号：１８に対して１００％同一性を持つ少なくとも８個の隣接ア
    ミノ酸を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１記載のリノール酸
    イソメラーゼ。
  25. 【請求項２５】 該リノール酸イソメラーゼがアミノ酸配列：１８を含む請
    求項１記載のリノール酸イソメラーゼ。
  26. 【請求項２６】 該リノール酸イソメラーゼが固体支持体に結合した請求項
    １記載のリノール酸イソメラーゼ。
  27. 【請求項２７】 該固体支持体が有機支持体、生体ポリマー支持体および無
    機支持体よりなる群から選択される請求項２６記載のリノール酸イソメラーゼ。
  28. 【請求項２８】 請求項１記載の単離されたリノール酸イソメラーゼに選択
    的に結合した単離された抗体。
  29. 【請求項２９】 リノール酸およびリノレン酸よりなる群から選択される化
    合物を含む油を、単離されたリノール酸イソメラーゼ酵素と接触させて該化合物
    の少なくとも一部をＣＬＡに変換することを特徴とするＣＬＡの製法。
  30. 【請求項３０】 該化合物がトリグリセリドの形態であり、ここに、該方法
    が更に該油を加水分解酵素と接触させて該トリグリセリドの一部を遊離脂肪酸に
    変換する請求項２９記載の製法。
  31. 【請求項３１】 該加水分解酵素がリパーゼ、ホスホリパーゼおよびエステ
    ラーゼよりなる群から選択される請求項３０記載の製法。
  32. 【請求項３２】 更に該ＣＬＡを除去することを含む請求項２９記載の製法
    。
  33. 【請求項３３】 該ＣＬＡが（シス，トランス）−９，１１−リノール酸で
    ある請求項２９記載の製法。
  34. 【請求項３４】 該ＣＬＡが（トランス，シス）−１０，１２−リノール酸
    である請求項２９記載の製法。
  35. 【請求項３５】 該油がヒマワリ油、サフラワー油、トウモロコシ油、亜麻
    仁油、ヤシ油、菜種油、イワシ油、ニシン油、カラシ種子油、落花生油、ゴマ油
    、シソ油、綿実油、大豆油、脱水ヒマシ油およびクルミ油よりなる群から選択さ
    れる請求項２９記載の製法。
  36. 【請求項３６】 該リノール酸イソメラーゼ酵素がレリール酸につき約８．
    １μＭのＫｍ；約７．５のｐＨ最適値；およびオレイン酸につき約８０μＭのＫ
    ｉを有する請求項２９記載の製法。
  37. 【請求項３７】 該リノール酸イソメラーゼ酵素が、ストリンジェントハイ
    ブリダイゼーション条件下で配列番号：４、配列番号：８、配列番号：１０、配
    列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および配列番
    号：２６よりなる群から選択される配列の相補体を含む核酸分子にハイブリダイ
    ズする核酸分子によってコードされるアミノ酸配列を含む請求項２９記載の製法
    。
  38. 【請求項３８】 該リノール酸イソメラーゼ酵素が配列番号：４、配列番号
    ：８、配列番号：１０、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配
    列番号：１７および配列番号：２６よりなる群から選択される核酸を含む核酸分
    子によってコードされた請求項２９記載の製法。
  39. 【請求項３９】 該リノール酸イソメラーゼ酵素が配列番号：１７の核酸を
    含む核酸分子によってコードされた請求項２９記載の製法。
  40. 【請求項４０】 該リノール酸イソメラーゼ酵素が配列番号：１、配列番号
    ：５、配列番号：９、配列番号：１１および配列番号：１８よりなる群から選択
    されるアミノ酸配列との少なくとも約７０％同一性を持つアミノ酸配列を含む請
    求項２９記載の製法。
  41. 【請求項４１】 該リノール酸イソメラーゼが配列番号：１、配列番号：５
    、配列番号：９、配列番号：１１および配列番号：１８よりなる群から選択され
    る請求項２９記載の製法。
  42. 【請求項４２】 該リノール酸イソメラーゼがアミノ酸配列配列番号：１８
    を含む請求項２９記載の製法。
  43. 【請求項４３】 該リノール酸イソメラーゼ酵素が固体支持体に結合した請
    求項２９記載の製法。
  44. 【請求項４４】 該固体支持体が有機支持体、生体ポリマー支持体および無
    機支持体よりなる群から選択された請求項４３記載の製法。
  45. 【請求項４５】 固定化されたLactobacillus、Clostridium、Propionibact
    erium、ButyrivibrioおよびEubacterium細胞よりなる群から選択され、ここに、
    該細胞がリノール酸イソメラーゼの作用を増加させる遺伝的修飾を含む固定化細
    菌細胞。
  46. 【請求項４６】 該遺伝的修飾の結果、該細菌細胞によってリノール酸イソ
    メラーゼが過剰生産される請求項４５記載の固定化細菌細胞。
  47. 【請求項４７】 該遺伝的修飾が該細胞をリノール酸イソメラーゼをコード
    する組換え核酸分子で形質転換することを含み、ここに、該組換え核酸分子が転
    写制御配列に作動可能に結合した請求項４５記載の固定化細菌細胞。
  48. 【請求項４８】 該組換え核酸分子がリノール酸イソメラーゼの相同体をコ
    ードする核酸配列を含む請求項４７記載の固定化細菌細胞。
  49. 【請求項４９】 該相同体がアミノ酸配列配列番号：１８に対して１００％
    同一性を持つ少なくとも８個の隣接アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む請求項
    ４８記載の固定化細菌細胞。
  50. 【請求項５０】 該組換え核酸分子が、配列番号：４、配列番号：８、配列
    番号：１０、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１
    ７および配列番号：２６よりなる群から選択される配列の相補体を含む核酸分子
    にストリンジェントハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸配
    列を含む請求項４７記載の固定化細菌細胞。
  51. 【請求項５１】 該組換え核酸分子が配列番号：４、配列番号：８、配列番
    号：１０、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７
    および配列番号：２６よりなる群から選択される核酸配列を含む請求項４７記載
    の固定化細菌細胞。
  52. 【請求項５２】 該組換え核酸分子が核酸配列配列番号：１７を含む請求項
    ４７記載の固定化細菌細胞。
  53. 【請求項５３】 該組換え核酸分子が、配列番号：１、配列番号：５、核酸
    分子：９、配列番号：１１および核酸分子：１８よりなる群から選択されるアミ
    ノ酸配列と少なくとも約７０％同一性を持つアミノ酸配列を含む蛋白質をコード
    する請求項４７記載の固定化細菌細胞。
  54. 【請求項５４】 該組換え核酸分子がアミノ酸配列配列番号：１８を含む蛋
    白質をコードする請求項４７記載の固定化細菌細胞。
  55. 【請求項５５】 該組換え核酸分子が該細菌細胞のゲノムに組み込まれた請
    求項４７記載の固定化細菌細胞。
  56. 【請求項５６】 リノール酸イソメラーゼをコードする該組換え核酸分子が
    該リノール酸イソメラーゼの作用を増加させる遺伝的修飾を含む請求項４７記載
    の固定化細菌細胞。
  57. 【請求項５７】 該遺伝的修飾が該リノール酸イソメラーゼの基質阻害を減
    少させる請求項４５記載の固定化細菌細胞。
  58. 【請求項５８】 該遺伝的修飾が該リノール酸イソメラーゼの産物阻害を減
    少される請求項４５記載の固定化細菌細胞。
  59. 【請求項５９】 該遺伝的修飾の結果、該リノール酸イソメラーゼの少なく
    とも１つのアミノ酸残基の欠失、挿入、逆位、置換および誘導体化よりなる群か
    ら選択される少なくとも１つのアミノ酸が修飾され、該少なくとも１つのアミノ
    酸修飾の結果、リノール酸イソメラーゼ作用が増加する請求項５６記載の固定化
    細菌細胞。
  60. 【請求項６０】 該細胞が溶解されてるものである請求項４５記載の固定化
    細菌細胞。
  61. 【請求項６１】 該細胞が、二官能性または多官能性架橋剤で架橋すること
    によって固定化されている請求項４５記載の固定化細菌細胞。
  62. 【請求項６２】 該架橋剤がグルタルアルデヒドである請求項６１記載の固
    定化細菌細胞。
  63. 【請求項６３】 リノール酸およびリノレン酸よりなる群から選択される化
    合物を含む油を、固定化されたLactobacillus、Clostridium、Propionibacteriu
    m、ButyrivibrioおよびEubacterium細胞よりなる群から選択された固定化細菌細
    胞と接触させて、該化合物の少なくとも一部をＣＬＡに変換させることを含み、
    ここに、該細胞はリノール酸イソメラーゼを含むことを特徴とするＣＬＡの製法
    。
  64. 【請求項６４】 該細胞がリノール酸イソメラーゼの作用を増加させる遺伝
    的修飾を含む請求項６３記載の製法。
  65. 【請求項６５】 該遺伝的修飾が、リノール酸イソメラーゼをコードする組
    換え核酸分子での該細胞の形質転換を含み、ここに、該組換え核酸分子が転写制
    御配列に作動可能に連結した請求項６３記載の製法。
  66. 【請求項６６】 該化合物がトリグリセリドの形態であり、ここに、該製法
    が更に該油を加水分解酵素と接触させて該トリグリセリドの少なくとも一部を遊
    離脂肪酸に変換することを含む請求項６３記載の製法。
  67. 【請求項６７】 該加水分解酵素がリパーゼ、ホスホリパーゼおよびエステ
    ラーゼよりなる群から選択される請求項６６記載の製法。
  68. 【請求項６８】 更に該ＣＬＡを回収する工程を含む請求項６３記載の製法
    。
  69. 【請求項６９】 該ＣＬＡが（シス，トランス）−９，１１−リノール酸で
    ある請求項６３記載の製法。
  70. 【請求項７０】 該ＣＬＡが（トランス，シス）−１０，１２−リノール酸
    である請求項６３記載の製法。
  71. 【請求項７１】 該油がヒマワリ油、サフラワー油、トウモロコシ油、亜麻
    仁油、菜種油、イワシ油、ニシン油、カワシ油、落花生油、ゴマ油、シソ油、綿
    実油、大豆油、脱水ヒマシ油およびクルミ油よりなる群から選択される請求項６
    ３９記載の製法。
  72. 【請求項７２】 該リノール酸イソメラーゼ酵素がリノール酸についての約
    ８．１μＭのＫｍ；約７．５のｐＨ最適値；およびオレイン酸についての約８０
    μＭのＫｉを有する請求項６３記載の製法。
  73. 【請求項７３】 該油から該ＣＬＡを生産する該工程が該ＣＬＡに対する該
    油の少なくとも５０％変換を供する請求項６３記載の製法。
  74. 【請求項７４】 該細菌細胞がLactobacillus reuteri、Clostridium sporo
    genes、Propionibacterim acnes、Propionibacterium freudenreichii、Propion
    ibacterium acidipropionici、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Bacillu
    s lichenformis、Butyrivibrio fibrisovesおよびEubacterium lentumよりなる 群から選択される請求項６３記載の製法。
  75. 【請求項７５】 該細菌細胞がLactobacillus reuteriである請求項６３記 載の製法。
  76. 【請求項７６】 該細菌細胞がEscherichia coliである請求項６３記載の製
    法。
  77. 【請求項７７】 該細菌細胞がBacillus subtilisである請求項６３記載の 製法。
  78. 【請求項７８】 該細菌細胞がBacillus licheniformisである請求項６３記
    載の製法。
  79. 【請求項７９】 （ａ）配列番号：１、配列番号：５、配列番号：９、配列
    番号：１１および配列番号：１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有す
    る蛋白質をコードする核酸配列を含む核酸分子；（ｂ）（ａ）の該アミノ酸配列
    の何れかの相同体をコードする核酸分子、ここに、該相同体は配列番号：１、配
    列番号：５、配列番号：９、配列番号：１１および配列番号：１８よりなる群か
    ら選択される該アミノ酸配列におけるアミノ酸と１００％同一性を有する少なく
    とも８個の隣接アミノ酸を含み；（ｃ）（ａ）の該アミノ酸配列の何れかをコー
    ドする核酸分子の天然に生じる対立遺伝子変異体を含む核酸分子；および（ｄ）
    （ａ）、（ｂ）または（ｃ）の該核酸分子の何れかに対して相補的である核酸分
    子よりなる群から選択される単離された核酸分子。
  80. 【請求項８０】 該核酸分子がリノール酸イソメラーゼをコードする請求項
    ７９記載の単離された核酸分子。
  81. 【請求項８１】 該核酸分子が、ストリンジェントな条件下で、配列番号：
    ４、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番
    号：１６、配列番号：１７、配列番号：２６よりなる群から選択される核酸配列
    を有する核酸分子、および配列番号：４、配列番号：８、配列番号：１０、配列
    番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７、配列番号：２
    ６よりなる群から選択される核酸配列の相補体にハイブリダイズする請求項７９
    記載の単離された核酸分子。
  82. 【請求項８２】 該核酸分子が配列番号：４、配列番号：８、配列番号：１
    ０、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および
    配列番号：２６よりなる群から選択される核酸配列との少なくとも約７０％同一
    性を持つ核酸配列を含む請求項７９記載の核酸分子。
  83. 【請求項８３】 該核酸分子が核酸配列配列番号：１７と１００％同一性を
    有する少なくとも２４個の隣接ヌクレオチドを有する核酸配列を含む請求項７９
    記載の核酸分子。
  84. 【請求項８４】 該核酸分子がストリンジェントハイブリダイゼーション条
    件下でｎＣＬＡ８７、ｎＣＬＡ５９６、ｎＣＬＡ１７０９、ｎＣＬＡ３５５１、
    ｎＣＬＡ１７７６およびｎＣＬＡ７１１３よりなる群から選択される核酸分子と
    ハイブリダイズする請求項７９記載の単離された核酸分子。
  85. 【請求項８５】 該核酸分子がアミノ酸配列配列番号：１８を含む蛋白質を
    コードする請求項７９記載の単離された核酸分子。
  86. 【請求項８６】 該核酸分子が配列番号：４、配列番号：８、配列番号：１
    ０、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６、配列番号：１７および
    配列番号：２６よりなる群から選択される配列を有する核酸分子よりなる群から
    選択される請求項７９記載の単離された核酸分子。
  87. 【請求項８７】 該核酸分子が核酸配列配列番号：１７を含む請求項７９記
    載の単離された核酸分子。
  88. 【請求項８８】 該核酸分子がLactobacillus、Clostridium、Propionibact
    erium、ButyrivibrioおよびEubacteriumリノール酸イソメラーゼ核酸分子よりな
    る群から選択される請求項７９記載の単離された核酸分子。
  89. 【請求項８９】 該核酸分子がLactobacillus reuteri、Clostridium sporo
    genes、Propionibacterim acnes、Butyrivibrio fibrisoves、Propionibacteriu
    m acidipropionici、Propionibacterium freudenreichiiおよびEubacterium len
    tumリノール酸イソメラーゼ核酸分子よりなる群から選択される請求項７９記載 の単離された核酸分子。
  90. 【請求項９０】 該核酸分子がLactobacillus reuteri核酸分子を含む請求 項７９記載の単離された核酸分子。
  91. 【請求項９１】 転写制御配列に作動可能に連結した請求項７９記載の単離
    された核酸分子を含む組換え分子。
  92. 【請求項９２】 請求項７９記載の単離された核酸分子を含む組換えウイル
    ス。
  93. 【請求項９３】 請求項７９記載の単離された核酸分子を含み、ここに該細
    胞が該核酸分子を発現する組換え細胞。
  94. 【請求項９４】 該細胞がLactobacillus reuteri、Clostridium sporogene
    s、Propionibacterim acnes、Propionibacterium freudenreichii、Propionibac
    terium acidipropionici、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Bacillus li
    cheniformis、Butyrivibrio fibrisolvens、およびEubacterium lentumよりなる
    群から選択される微生物である請求項９３記載の組換え細胞。
  95. 【請求項９５】 該細胞がEscherichia coli、Bacillus subtilisおよびBac
    illus licheniformisよりなる群から選択される微生物である請求項９３記載の 組換え細胞。
  96. 【請求項９６】 リノール酸およびリノレンよりなる群から選択される化合
    物を含む油を、請求項７９記載の単離された核酸分子によってコードされる単離
    されたリノール酸イソメラーゼ酵素と接触させて、該化合物の少なくとも一部を
    ＣＬＡに変換することを特徴とするＣＬＡの製法。
  97. 【請求項９７】 リノール酸イソメラーゼをコードする単離された核酸分子
    で形質転換した組換え細胞を培養することを特徴とするリノール酸イソメラーゼ
    の製法。
  98. 【請求項９８】 該組換え細胞がLactobacillus reuteri、Clostridium spo
    rogenes、Propionibacterim acnes、Propionibacterium freudenreichii、Propi
    onibacterium acidipropionici、Escherichia coli、Bacillus subtilis、Bacil
    lus licheniformis、Propionibacterium、Butyrivibrio fibrisoves、およびEuba
    cterium lentumよりなる群から選択される微生物からのものである請求項９７記
    載の方法。
  99. 【請求項９９】 該組換え細胞がEscherichia coli、Bacillus subtilisお よびBacillus licheniformisよりなる群から選択される微生物からのものである
    請求項９７記載の方法。
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